đánh giá đặc điểm nông sinh học và so sánh trình tự gen ltp của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM


TRỊNH XUÂN THẮNG


ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ SO SÁNH
TRÌNH TỰ GEN LTP CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CÓ
NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC







Thái Nguyên - 2011


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM


TRỊNH XUÂN THẮNG


ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ SO SÁNH
TRÌNH TỰ GEN LTP CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CÓ
NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC

Chuyên nghành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu





Thái Nguyên - 2011


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực, chưa được ai công bố.


Tác giả



Trịnh Xuân Thắng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, KTV Hoàng Hà ( Phòng công nghệ tế
bào thực vật- Viện công nghệ sinh học). Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện
khoa học sự sống- Đại học Thái Nguyên và ThS. Hoàng Văn Mạnh đã tạo
điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện các nghiên cứu đề tài luận văn. Tôi cảm
ơn ThS. Bùi Hồng Xuyến đã cung cấp hạt của các dòng đậu xanh có nguồn
gốc từ mô sẹo chịu mất nước.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm,
Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh- KTNN, Ban Giám hiệu Trường THPT Phú
Lương, các đồng nghiệp, sự động viên của gia đình và bạn bè trong suốt thời
gian tôi học tập và làm luận văn.
Tác giả




Trịnh Xuân Thắng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ i
Lời cam đoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các từ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình vẽ viii
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. CÂY ĐẬU XANH 4
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây đậu xanh 4
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu xanh 4
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của đậu xanh 8

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam 9
1.2. GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 11
1.2.1. Hạn và cơ sở hoá sinh, sinh học phân tử của tính chịu hạn 11
1.2.2. Protein vận chuyển lipid và gen LTP (Lipid Transfer Protein) 13
1.3. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN
GIỐNG CÂY TRỒNG 15
1.3.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 15
1.3.2. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma 17
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. VẬT LIỆU, HA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 18
2.1.1. Vật liệu 18
2.1.2. Các hóa chất chuyên dụng 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
2.1.3. Thiết bị 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1. Nghiên cứu ngoài đồng ruộng 19
2.2.2. Thống kê sinh học 19
2.2.3. Phân tích hóa sinh 20
2.2.4. Phân tích sinh học phân tử 21
2.2.5. Địa điểm nghiên cứu 27
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÒNG ĐẬU XANH CHỌN
LỌC VÀ GIỐNG GỐC 28
3.1.1. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đậu xanh chọn lọc có nguồn gốc
từ mô sẹo chịu mất nước ở thế hệ R2 28
3.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng
đậu xanh ở thế hệ R3 31

3.2. CHẤT LƯỢNG HẠT CỦA CÁC DÒNG ĐẬU XANH C NGUỒN
GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƯỚC 34
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN LTP 35
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 35
3.3.2. Kết quả nhân gen LTP từ hệ gen của dòng D15 và giống gốc 36
3.3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biế n E.coli DH5α 37
3.3.4. Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp 38
3.3.6. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen LTP 40
3.3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP của các dòng đậu xanh
nghiên cứu 42
3.3.8. Kết quả so sánh trình tự amino acid của các dòng đậu xanh nghiên cứu 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid
ASTT Áp suất thẩm thấu
DNA Deoxyribose nucleic acid
RNase Ribonuclease
Bp Base pair
EDTA Ethylene Diamin Tetraacetic acid
CTAB Cetyl Trymethyl Amonium Bromide
IPTG Isopropylthio- beta-D- glactoside
LB Luria Bertani
LTP Lipid transfer protein
OD Optical densyti

PCR Polymerase chain Reaction
TAE Tris- acetic acid- EDTA
X- gal 5- brom- 4- chlobo- 3- indolyl- β-D- galactosidase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi

DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Danh mụ c cá c thiế t bị sử dụ ng 18
Bảng 2.2. Thành phần của PCR 22
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR 23
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng 25
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợpbằ ng enzym BamHI 26
Bảng 3.1 Đặc điểm và mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học
và yếu tố cấu thành nên năng suất 29
Bảng 3.2. Đặc điểm, mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và
yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 32
Bảng 3.3. Hàm lượng protein, lipid của các dòng đậu xanh và giống gốc 34
Bảng 3.4. Trình tự mồi nhân gen LTP 36
Bảng 3.5. Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP ở VC1973A và D15 42
Bảng 3.6. Vị trí sai khác trình tự nuclotide của gen LTP ở hai mẫu đậu
xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố trên GenBank . 44
Bảng 3.7. Vị trí sai khác amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh
VC1973A, D15 với các trình tự đã công bố trên Genbank 46


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vii

DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 19
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT 24
Hình 3.1. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô seo chịu mất nước thế hệ R2 28
Hình 3.2. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước thế hệ R3 33
Hình 3.3. Quả và hạt của hai dòng D15 và D40 33
Hình 3.4. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ mô lá của giống đậu
xanh VC1973A và dòng D15 35
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP 36
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc 37
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR 38
Hình 3.8. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP 39
Hình 3.9 . Kết quả điện di sản phẩm căt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme 39
Hình 3.10. Trình tự nucleoitde của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh D15 và
VC1973A 41
Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh VC1973A
và D15 với các trình tự đã công bố 43
Hình 3.12. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các trình tự gen LTP 44
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid gen LTP của hai mẫu đậu xanh
VC1973A và D15 45
Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh
VC1973A và D15 so với các mẫu trên Genbank 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là cây công nghiệp ngắn ngày
trồng lấy hạt giữ vị trí quan trọng của nhiều nước châu Á và Việt Nam. Hạt
đậu xanh chứa nhiều chất dinh dưỡng như: protein chứa khoảng 23%- 28%,
1.3% lipid, 4.79% chất sơ, 64.12% hydratcacbon, các loại Vitamin A, B
1
, B
2
,
C. Một số nguyên tố khoáng và hàm lượng chất sắt rất cao. Nước ta trồng
nhiều đậu xanh, hạt đậu xanh dùng làm thực phẩm, bột đậu xanh rang chín
hòa với nước sôi là loại nước uống rất bổ dưỡng. Ngoài ra hạt đậu xanh còn là
một loại dược liệu quí có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh tiểu đường,
bệnh phù thũng, giải nhiệt hà khí. Đặc biệt đậu xanh còn có tác dụng giải độc
do thuốc và các chất kim loại. Trồng đậu xanh ngoài thu hạt ra các phụ phẩm
còn được dùng làm thức ăn cho gia súc và trồng đậu xanh có tác dung cải tạo
đất do rễ cây có những nốt sần chứa vi khuẩn cố định nitơ Rhizobium.
Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng lâu đời và phân bố ở nhiều vùng
khác nhau trong cả nước, nhưng năng suất chưa cao. Quá trình biến đổi khí
hậu toàn cầu đã dẫn đến những hiện tượng thời tiết cực đoan và làm cho khí
hậu ngày càng diễn biến phức tạp. Việt nam, cũng là một trong những quốc
gia chịu nhiều ảnh hưởng của biến đổi khí hậu. Sự thay đổi về lượng mưa
trong năm và sự phân bố lượng mưa không đồng đều giữa các vùng, hiện
tượng hạn hán kéo dài cùng với các yếu tố bất lợi khác đã ảnh hưởng nghiêm
trọng đến sự sinh trưởng và phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây
trồng, trong đó có cây đậu xanh. Cây đậu xanh thuộc nhóm cây chịu hạn
kém, vì vậy nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trong
điều kiện khí hậu hiện nay là một yêu cầu cấp thiết. Chọn dòng biến dị soma

trong công nghệ tế bào thực vật là một trong các biện pháp công nghệ hiện đại
được áp dụng để cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu xanh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Tính chịu hạn của thực vật liên quan đến sản phẩm biểu hiện của nhiều
gen, trong đó có gen LTP (Lipid transfer protein). Gen mã hóa LTPs thuộc họ
gen pathogenesis – relate, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình
vận chuyển phospholipid tới màng. LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc
lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi
của môi trường. Ở cây trồng, LTP tham gia vào việc hình thành cutin,
chống lại các tác nhân gây bệnh và quá trình thích nghi của cây đối với các
điều kiện khác nhau của môi trường sống. Khi gặp các điều kiện bất lợi của
môi trường các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con
đường truyền tín hiệu sẽ điều khiển gen LTP hoạt động tổng hợp protein
và tăng cường vận chuyển phospholipid tới màng, tăng tính bền vững của
thành tế bào và khả năng giữ nước của màng nhằm giúp cây trồng chống lại
điều kiện khô hạn của môi trường.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu cho
luận văn là: “Đánh giá đặc điểm nông sinh học và so sánh trình tự gen LTP
của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Chọn được dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ưu
việt về một số đặc điểm nông sinh học và chất lượng hạt.
Xác định được sự sai khác trong trình tự gen LTP của dòng đậu xanh
thuộc nhóm chịu hạn tốt và chịu hạn kém.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích di truyền số lượng của một số đặc tính nông sinh học của
các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước ở các thế hệ R2, R3.

- Đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh của một số dòng
đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
- Nhân bản gen LTP bằng kỹ thuật PCR từ các dòng đậu xanh có nguồn
gốc từ mô sẹo chịu mất nước.
- Tách dòng và xác định trình tự gen LTP từ các dòng đậu xanh có
nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước.
- So sánh trình tự gen, trình tự amino acid giữa các dòng đậu xanh
nghiên cứu và các trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây đậu xanh
Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), có bộ NST 2n = 22, là loại cây
đậu ăn hạt, thân thảo. Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng
rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các nước Đông và Nam Á sau
đó được trồng phổ biến ở nhiều khu vực trên thế giới.
Phân loại khoa học của cây đậu xanh:
- Giới (regnum): Plantae
- Ngành (division): Magnolyophita
- Lớp (class): Magnolyopsida
- Bộ (order): Fabales

- Họ (Familia): Fabaceae
- Chi (genus): Vigna
- Loài (species): V. Radiata
Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ đậu, bao gồm 7 chi phụ.
Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang những đặc
điểm điển hình cho Vigna. Ceratotropic phân bố khắp các vùng nhiệt đới và á
nhiệt đới của châu Á, Ôxtrâylia và các nước khác thuộc châu Á Thái Bình
dương. Dạng hoang dại của Vigna radiata được tìm thấy tại Madagasca và bờ
biển phía đông châu Phi [12]
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu xanh
Bộ rễ cây đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ.
Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể
ăn sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
cm, phân bố chủ yếu trên tầng mặt. Trên rễ phụ có nhiều lông hút làm nhiệm vụ
hút các chất dinh dưỡng từ đất bộ rễ của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các
cây đậu đỗ khác nên khả năng chịu hạn của cây đậu xanh tương đối kém. Trên rễ
cây đậu xanh có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cổ định đạm Zhizobium. Số lượng
nốt sần ở cây họ đậu không nhiều như một số cây đậu đỗ khác, trung bình có 20-
30 nốt sần. Số lượng và khả năng hoạt động của nốt sần là đảm bảo cho cây
được cung cấp lượng đạm nhiều do đó có năng suất cao [5].
Thân và cành cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, là cây hàng năm., hình
trụ, phân đốt, cao khoảng 40 - 70 cm. Thân có màu xanh hoặc tím. Thân có 3
dạng: đứng thẳng, đứng nghiêng, bò lan trên mặt đất. Dạng bò lan thường chỉ
gặp ở vùng đồi núi của Ấn Độ và Mianma Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có một
lớp lông màu nâu sáng bao bọc. Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là
lóng. Độ dài của các lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác

nhau. Các lóng dài khoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm. Từ các đốt
mọc ra các cành, trung bình có 1 - 5 cành. Cây đậu xanh ít phân cành và
thường phân cành muộn. Cành mọc từ nách lá thứ 2, 3 trên mỗi cành có từ 2-
3 mắt, từ đó mọc ra các chùm hoa [5], [12].
Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi
thân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá
đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên
và dưới của lá đều có lông bao phủ. Tốc độ hình thành lá kép phụ thuộc vào
thời vụ, giống và kĩ thuật chăm sóc. Vị trí của lá kép trên thân hoặc trên cành
thường mọc so le tại các phần giữa các đốt thân hay cành. Kích thước của
phiến lá và độ dài của cuống lá thay đổi tùy thuộc vào vị trí của tầng lá. Điều
này biểu hiện sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây đậu xanh [5].
Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, hình thành trên các trục hoa, trên
mỗi trục hoa có thể phát triển thành một hàng hoa mọc đối nhau . Các chùm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư,
còn ở các cành thì tất cả các mắt đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây
mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa hình thành , sau 35 - 40 ngày thì nở hoa. Trong
một chùm hoa, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày.
Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10 cm và có từ 10 - 125 hoa. Khi mới hình thành hoa
có hình cánh bướm, màu xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt. Trong
tự nhiên, hoa đậu xanh thường nở rải rác thành từng đợt khác nhau. Căn cứ
vào thời gian nở hoa các giống đậu xanh có thể chia làm 3 nhóm:
- Nhóm ra hoa tập trung: hoa nở kéo dài dưới 16 ngày.
- Nhóm ra hoa trung gian: hoa nở kéo dài trong thời gian 16-30 ngày.
- Nhóm ra hoa không tập trung: hoa nở liên tiếp trên 30 ngày.
Quả non được hình thành sau khi hoa thụ phấn 2-3 ngày. Quả đậu xanh

thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 -
6 mm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong,
khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen,
đen, nhưng phổ biến hơn cả là màu đen và màu nâu, gặp nắng rễ bị tách vỏ. Một
cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, có chiều dài trung bình 8cm - 10cm, quả
dài nhất là 15cm. Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn [5].
Hạt đậu xanh xanh nhạt. Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình
thoi và có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh
nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của
quả. Ruột hạt màu vàng, xanh. Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày,
lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng. Màu sắc của vỏ hạt tương quan tương đối
chặt chẽ với vùng địa lí phân bố. Số lượng hạt trung bình trong 1 quả là một
trong những yếu tố quyết định năng suất của đậu xanh. Trung bình mỗi quả có
8 - 9 hạt. Quả lớn nhất có đến 18 hạt [5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh: Có 2 giai đoạn sinh trưởng
và phát triển chủ yếu ở đậu xanh:
- Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng: Được bắt đầu bằng thời kỳ
SDm, là lúc hạt đậu xanh nảy mầm. Tiếp theo là thời kỳ SDl, lúc này cây bắt
đầu xuất hiện lá mầm. Các thời kì tiếp theo là SD2, SD3 tương ứng với thứ
tự hình thành các đốt trên cây. Kết thúc giai đoạn SDn tương ứng với số đốt
cuối cùng trên cây. Số đốt hình thành trên cây đậu xanh thay đổi tùy thuộc
vào đặc điểm của giống.
- Các giai đoạn sinh trưởng sinh thực: Được chia thành 8 thời kì bắt đầu
từ ST1 đến ST8, tương ứng với các thời kì hình thành hoa, quả, hạt đậu. Cây
đậu xanh có đặc điểm sinh trưởng vô hạn hoặc bán vô hạn, nên việc xác định
các thời kì sinh trưởng sinh thực thường gặp nhiều khó khăn, vì trên một cây

đồng thời vừa có cả nụ, hoa, quả non và quả chín. Vì vậy, thời kì sinh thực
của đậu xanh chỉ mang tính chất tương đối [5], [12].
Bên cạnh những cây lương thực có giá trị kinh tế như lúa, lạc, ngô, đậu
tương thì đậu xanh cũng được coi là loại cây trồng đem lại giá trị kinh tế cao
cho nông dân. Trong hạt đậu xanh có nhiều các chất dinh dưỡng quan trọng
như protein, lipid, các loại vitamin, khoáng chất. Protein của đậu xanh có
nhiều các amino acid không thể thay thế cho nên đậu xanh được dùng để làm
thực phẩm rất bổ dưỡng và chế biến thành các món ăn đặc sản của nhiều địa
phương được ưa chuộng ở trong nước và ngoài nước. Đậu xanh còn được
dùng trong các bài thuốc cổ truyền có tác dụng chữa bệnh rất tốt. Ngoài ra,
trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ hệ rễ đậu
xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có khả
năng cố định nitơ từ khí trời. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi
xốp và giàu dinh dưỡng hơn [12].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của đậu xanh
Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12%
nước, các vitamin B1, B2, C… ,các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K ….
Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá
chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh
trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm
lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm Trong đó,
hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự
phát triển của cây là protein và lipid.
Protein
Protein đậu xanh chiếm đầy đủ các loại amino acid không thay thế, là
nguồn cung cấp đạm bổ dưỡng và dễ tiêu hóa cho con người và động vật.

Protein đậu xanh có đầy đủ các tính chất tốt và có ích của các loại protein
nói chung. Trong hạt đậu xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28%
và được chia thành hai nhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức
tạp. Trong nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%,
còn lại là albumin và một số loại khác. Chức năng chính của protein dự trữ
là cung cấp amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt [12]. Ngoài
ra, protein của đậu xanh còn có một số đặc tính tốt khác như khả năng hút
nước, hòa tan chất đạm của nó trong nước. Bột đậu xanh và protein của nó
còn có khả năng tạo nhũ tương.
Lipid
Lipid là một thành phần cơ bản trong cơ thể thực, động vật, là thành
phần cấu tạo cơ bản lên màng sinh học và là nguồn cung cấp năng lượng quan
trọng cho cơ thể. Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng
cho sự nẩy mầm của hạt. Lipid không hoà tan trong nước nhưng tan trong các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
dung môi hữu cơ không phân cực như ether, petroleum ether, benzen. Hàm
lương lipid trong hạt đậu xanh tương đối thấp, trung bình 1.3% nhưng ảnh
hưởng lớn đến chất lượng hạt và phát triển của cây.
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
Theo kết quả điều tra của của Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau
quả châu Á (AVRDC), hàng năm trên thế giới có ít nhất 23 nước sản xuất đậu
xanh. Hiện nay, đậu xanh là cây đậu đỗ quan trọng của Thái Lan, Sri lanka,
Ấn Độ. Đậu xanh cũng được trồng nhiều ở Ôxtrâylia, Trung Quốc, Hàn Quốc,
Hoa kỳ. AVRDC cũng cho biết diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh
của thế giới đang tăng qua các năm [5].
Tại Srilanka trong những năm 1965-1986 diện tích, sản lượng đều tăng
nhanh, tuy nhiên, từ năm 1997-2001 tình hình sản xuất đậu xanh có xu hướng

giảm về diện tích trồng. Trung Quốc cùng là một trong những nước chính sản
xuất đậu xanh của thế giới. Trong những năm 1957, diện tích gieo trồng là 1,64
triệu ha và sản lượng là 800 000 tấn và năng suất vẫn còn thấp chỉ vào khoảng
488kg/ha, và suy giảm qua các năm tiếp theo. Bắt đầu từ năm 1980 đến 2000,
do sự thay đổi trong chính sách của chính phủ và áp dụng các biện pháp khoa
học kỹ thuật thì sản xuất đậu xanh lại được phục hồi và hiện nay, hàng năm
Trung Quốc xuất khẩu đậu xanh tới hơn 60 nước và khu vực trên thế giới.
Năm 2000, thị trường xuất khẩu đậu xanh lớn nhất của Trung Quốc có thể kể
đến là Nhật Bản (40000 tấn/ 88000 tấn), sau đó là Hoa kỳ (8144 tấn), Việt
Nam (7645 tấn), Hàn Quốc (7199 tấn), Đài Loan (4466 tấn), Anh (2479 tấn),
Canada (2495 tấn), Pháp (1289 tấn)… [12].
Đậu xanh là một trong những loại cây trồng truyền thống ở Việt Nam.
Trên cơ sở các điều kiện khí hậu, đặc điểm sinh thái của từng vùng mà các
vùng trồng đậu xanh của nước ta như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
+ Vùng núi phía Bắc: các tỉnh ở vùng này trồng nhiều đậu xanh gồm:
Sơn La, Lai Châu, Cao Bằng, Hà Giang. Vùng này khí hậu có mùa đông lạnh
từ tháng 11 đến tháng 2, các tháng còn lại nóng ẩm, cây đậu xanh cũng được
gieo trồng vào dịp này. Đậu xanh trồng ở vùng này ít được thâm canh, năng
suất trung bình 600-700kg/ ha [5].
+ Vùng Đồng bằng và Trung du Bắc bộ: Đậu xanh trồng ở vùng này
thường được chăm sóc đầy đủ hơn, thâm canh cao hơn và tưới tiêu hợp lý
hơn, tăng năng suất. Thực hiện luân canh 3-4 vụ/ năm, năng suất trung
bình 8- 10 tạ/ ha [5].
+ Vùng Duyên Hải Nam Trung bộ: Đây là vùng có diện tích trồng đậu
xanh lớn, sản lượng cao do ít chịu ảnh hưởng của mùa đông. Khí hậu thuận
lợi phân chia rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Đậu xanh có triển vọng phát triển

mạnh ở vùng này [5].
+ Vùng Đông Nam bộ: Cây đậu xanh ở vùng này có diện tích lớn nhất,
chiếm 26% diện tích gieo trồng của cả nước. Mặc dù vậy năng suất trung bình
chưa cao, chỉ đạt 5 tạ/ ha. Nguyên nhân do sử dụng các giống đậu xanh kém
chất lượng, các giống cũ, năng suất thấp, không có điều kiện thâm canh [5].
Hiện nay, có một số giống đậu xanh trồng phổ biến như: ĐX044,
V123,HL- 115 Giống ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng đồng bằng và
trung du Bắc bộ; giống V123 (3V123) năng suất 1800 - 2000 kg/ha, thâm
canh có thể đạt 2000 – 7000 kg/ ha, có thể trồng 3 vụ/ năm; T135 năng suất
2900 kg/ha, 28% protein, ruột vàng thơm ngon, trồng ở các tỉnh phía Bắc;
giống V91 – 15 (VC3528A) năng suất từ 1200 – 1400 kg/ ha, cây cứng, ít đổ,
ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhều loại đất ở các tỉnh phía Nam;
giống HL – 115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ ha trong vụ hè và 1400 – 2200
kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
1.2. GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH
1.2.1. Hạn và cơ sở hoá sinh, sinh học phân tử của tính chịu hạn
Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng thiếu nước của thực vật do môi
trường gây nên, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật
[10]. Có 3 dạng hạn đối với thực vật là: hạn đất, hạn không khí và hạn sinh lý.
- Hạn đất
Khi lượng nước dự trữ trong đất trở lên cạn kiệt thì xảy ra hạn đất. Do
đó cây không thể lấy nước từ đất cung cấp đủ cho hoạt động sống dẫn đến
mất cân bằng nước. Hạn đất thường xảy ra ở các vùng có lượng mưa trung
bình thấp và mùa khô kéo dài.
- Hạn không khí
Khi độ ẩm trong không khí quá thấp sẽ xảy ra hạn không khí, dẫn đến

làm cho quá trình thoát hơi nước ở cây mạnh có thể làm mất cân bằng nước.
Hạn không khí thường xảy ra ở các vùng có gió khô nóng như gió Tây nam ở
miền trung.
- Hạn sinh lý
Khi trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút nước từ đất, mặc
dù trong môi trường nước không thiếu nước. Rễ cây không lấy được nước
trong khi đó quá trình thoát hơi nước ở lá vẫn diễn ra cũng làm mất cân bằng
nước trong cây.
Mỗi cây trồng đều có một giới hạn đối với các nhân tố sinh thái của
môi trường. Nếu ngoài giới hạn đó sẽ gây hại cho cây trồng như: giảm năng
suất, giảm khả năng sinh trưởng và phát triển. Khi tình trạng hạn xảy ra cây sẽ
phản ứng lại bằng cách đóng khí khổng, giảm thoát hơi nước, giảm quang
hợp, tăng tích lũy ABA, prolin, manitol, sorbitol [47].
Đối với thực vật, nước là một yếu tố rất quan trọng liên quan đến năng
suất. Nước là sản phẩm trung gian và cuối cùng của quá trình chuyển hóa, là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
môi trường để các phản ứng hóa sinh xảy ra trong tế bào. Đậu xanh là một cây
chịu hạn kém nên thiếu hụt nước sẽ ảnh hưởng đến sự phân cành, ra hoa, kết
quả, chất lượng hạt. Thiếu hụt nước nặng sẽ dẫn đến thay đổi tính chất lý hóa
của hệ thống keo nguyên sinh, chuyển từ dạng sol sang dạng gel, quá trình
quang hợp bị giảm sút.
Đặc tính chịu hạn ở thực vật đã được nghiên cứu và khẳng định có sự
liên quan đến sự phát triển bộ rễ, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu,
abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease [10]. Theo
nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng hút nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ.
Những cây có bộ rễ dài, to, khỏe có khả năng đâm sâu vào tầng đất để hút
nước, cho nên khi gặp hạn những cây này vẫn phát triển. Trong điều kiện hạn

thì khả năng hấp thụ nước của bộ rễ được xem là chỉ tiêu đánh giá khả năng
chịu hạn. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT): trong điều kiện khô
hạn lượng nước trong đất rất ít, vì vậy ASTT tăng lên giúp tế bào có thể hút
nước từ đất. ASTT liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của bộ rễ
đối với đất, qua đó thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ. Điều chỉnh
ASTT liên quan đến một số chất: ion K
+
; các amino acid như prolin, estonine;
các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol và các chất khác như
glycine betain, - alanin betain. Các chất này có khả năng điều chỉnh áp suất
thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự
xâm nhập của ion Na
+
[20]. Mộ t trong cá c chấ t liên quan đế n á p suấ t t hẩ m
thấ u là proline . Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng proline có thể
tăng từ 10 đến 100 lầ n ở thự c vậ t dướ i tá c độ ng củ a ASTT.
Axit Abscisic (ABA): là một hormone ức chế sinh trưởng của thực
vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với
môi trường của thực vật khi gặp stress. Khi gặp hạn ABA sinh ra ở rễ cây nhờ
gen cis-epoxycarotenoids với sự tham gia của enzyme 9-cis-epoxycarotenoid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
dioxygenase. ABA điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất
nước làm cây thích nghi với đời sống khô hạn. Ngoài ra ABA còn đóng
vai trò then chốt trong nhiều hoạt động sống của thực vật. Cơ chế tác
động của ABA cho rằng làm biến đổi điện thế hoá qua màng và do đó
điều tiết sự tiết ion K
+

[34].
Nghiên cứu về cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu hạn ở thực
vật người ta chú ý đến các gen mã hoá các loại protein liên quan đến khả năng
chịu hạn, bao gồm các loại protein chức năng và protein điều hoà. Các loại
protein chức năng trực tiếp liên quan đến sự biểu hiện khả năng chịu hạn, ví
dụ như: P5CS, LTP, LEA, PLC, HSP, cystatin… và protein điều hoà như chất
môi giới phân tử, nhóm protein DREB, các nhân tố protein tham gia vào quá
trình biểu hiện của nhóm gen chịu hạn.
1.2.2. Protein vận chuyển lipid và gen LTP (Lipid Transfer Protein)
LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyển
lipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật.
LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình
vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước. LTP được
gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm
như một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP -
linoleic acid đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều
kiện gây hạn nhân tạo [35].
LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các
lớp màng của tế bào. LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp
biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của
môi trường [26], [29].
Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro các phân tử cellulose
xuloglucan của thành tế bào thực vật có thể được gây ra do các LTP. Mặc dù

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
chưa có bằng chứng in vitro song khám phá này chắc chắn sẽ đem lại câu hỏi
thú vị về cơ chế mở rộng thành tế bào thực vật. LTP còn liên quan đến quá
trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu

và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn. Bên cạnh đó LTP còn tham
gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật, các nghiên cứu trên cây lúa, cây đậu
đã được nghiên cứu.
LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử. Dạng
thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối
lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo
thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [33].
Gen LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra
protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Khi gặp
các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá
trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP
hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng nhằm giúp cho
cây tăng khả năng chống chịu.
Các phân tử protein do gen LTP tổng hợp thường có nhiều đặc điểm
chung như: điểm đẳng điện cao, và với sự có mặt của 8 phân tử cystein làm
nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối dissulfide. Khi gặp những điều cực đoan của môi
trường , các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường
truyền tín hiệu sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tăng tổng hợp lên các
sản phẩm protein tăng cường vận chuyển photpholipid tới màng, tăng khả
năng giữ nước của màng tế bào nhằm giúp cho cây tăng khả năng stress hạn.
Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn:
- Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein đã được cô
lập và biểu hiện ở trong quả.
- Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein được biểu
hiện trong hạt.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
- Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein được biểu hiện

trong mô lá.
- Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptide
được cô lập và biểu hiện trong hoa [33], [39].
Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực
vật như: Arabidopsis thaniana L. [23], Zea mays L. [41], Vigna radiata L.
[36], Triticum L. [38],, Nicotiana tabacum L. [37], [40], Oryza sativa L. [45],
Valencia orange [46], Lycopesium esculentum [43]. Liu K.H. và cs (2003) đã
phân lập thành công hai dạng khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và
Vrltp2 [36]. Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai
đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật. Trong hạt đậu xanh ở
giai đoạn nảy mầm, nhóm nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn
trong mô sinh dưỡng thì mRNA của cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và
thân, không có ở chóp rễ. Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất
lợi như stress hạn hay muối hoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ
làm tăng tốc độ phiên mã của mRNA Vrltp1 và Vrltp2. Từ đó đưa ra giả
thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng rõ rệt tới sự phát triển các mô non và rất
có thể đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện
khô hạn.
1.3. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI
TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.3.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những đặc điểm của tế bào thực vật đó là tính toàn năng, từ
một mô sống bất kỳ của tế bào thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm,
thân, cành ) nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp sẽ phát triển
thành một cây hoàn chỉnh và có khả năng sinh trưởng bình thường. Các mô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
ngoài khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh còn có khả năng phát triển

thành các mô sẹo. Mô sẹo là các loại tế bào phân chia liên tục và có khả năng
phát triển thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh.
Các mô hoặc quần thể tế bào thực vật được nuôi cấy với số lượng lớn
và không đồng nhất, cho nên khi tái sinh cây sẽ xuất hiện nhiều đặc điểm về
kiểu hình, kiểu gen do ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và các chất điều
hòa sinh trưởng. Các tế bào nuôi cấy in vitro thường có biến dị với tỉ lệ cao vì
vậy có thể chọn được các cá thể xuất hiện nhiều biến dị và thời gian cũng
giảm đáng kể so với các phương pháp chọn giống thông thường.
Hiện nay, các kỹ thuật nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy chọn dòng
tế bào soma bao gồm:
- Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối mô thực vật gồm các tế bào chưa
phân hóa, có khả năng phân chia liên tục và tính biến động di truyền cao.
Trong nuôi cấy in vitro mô sẹo được tạo ra từ các bộ phận sinh dưỡng của cây
(lá, thân ) với môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ phát triển thành cây hoàn
chỉnh. Những cây phát triển từ mô sẹo có biến đổi di truyền phong phú có ý
nghĩa quan trọng đối với quá trình chọn giống.
- Nuôi cấy tế bào huyền phù: Là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm
nhỏ tế bào trong môi trường lỏng, các tế bào này cũng tạo ra từ các tế bào mô
sẹo có nguồn gốc khác nhau.
- Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ lớp thành tế bào bao
bọc bên ngoài còn lại khối nguyên sinh chất gọi là tế bào trần.Các tế bào trần
nuôi cấy trong môi trường thích hợp sẽ phát triển thành mô sẹo và tái sinh
thành cây hoàn chỉnh. Nhìn chung, nuôi cấy tế bào trần ở thực vật tỉ lệ tái sinh
ở cây thấp, cho nên ứng dụng của tế bào trần chủ yếu tạo cây lai tế bào thông
qua dung hợp tế bào trần.