Tuyển chọn, tách dòng và xác định trình tự gen cry1c mã hóa Protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. aizawai phân lập từ một số mẫu đất tỉnh Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM





LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG





TUYỂN CHỌN, TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN
cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH
VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP
TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG




TUYỂN CHỌN, TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN
cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH
VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP
TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH




Thái Nguyên - 2012


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu
và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công
trình nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn


Lê Thị Ngọc Thương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự
giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm
ơn tất cả những tình cảm quý báu đó.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS. TS Ngô Đình Bính, người thầy đã
tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới CN Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ
phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập.
Bên cạnh đó, sự tạo điều kiện và hỗ trợ của Khoa Sau đại học, BCN Khoa và
các đồng nghiệp tại Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
cũng là động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn của mình.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi
trong suốt thời gian qua!


Tác giả luận văn




Lê Thị Ngọc Thương


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt iii
Danh mục các bảng iv
Danh mục các hình v
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới 3
1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam 5
1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7
1.2.1. Vị trí phân loại 7
1.2.2. Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8
1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9
1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10
1.3.1. Độc tố Cry 11
1.3.2. Độc tố Cyt 11
1.3.3. Độc tố Vip 12
1.3.4. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 12
1.3.5. Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể 14
1.4. Gen mã hóa protein độc tố tinh thể 16
1.4.1. Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17
1.4.2. Phân nhóm gen mã hóa độc tố 17
1.5. Tổng quan về dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai và gen cry1C 19

1.5.1. Một số đặc điểm của dưới loài Bta 19
1.5.2. Gen cry1C 20
1.6. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
1.6.1. Sâu tơ (Plutella xylostella) 22
1.6.2. Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 23
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHP 26
2.1. Vật liệu 26
2.2. Hóa chất và thiết bị 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 28
2.3.1. Phương pháp phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt 28
2.3.2. Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis bằng phản ứng huyết thanh 28
2.3.3. Phương pháp định lượng mật độ bào tử 29
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính trên đối tượng sâu xanh và sâu tơ 29
2.3.5. Phương pháp tách DNA plasmid 30
2.3.6. Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1C 31
2.3.7. Phương pháp tách dòng gen cry1C 31
2.3.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotid của đoạn gen tách dòng 34
2.4. Địa điểm nghiên cứu 35
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang
gen cry1C có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua) 36
3.1.1. Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis
nghiên cứu 36
3.1.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh 38
3.1.3. Thử hoạt tính của các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai

trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 40
3.1.4. Kết quả khuếch đại gen cry1C ở các chủng Bacillus thuringiensis
subsp. aizawai bằng phương pháp PCR 43
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 44
3.2.1. Tách dòng gen cry1C 44
3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1C 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii

DANH MỤC CC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT


STT
Viết tắt
Viết đầy đủ
1
Amp
Ampicillin
2
bp
Base pair
3
Bt
Bacillus thuringiensis
4
Bta

Bacillus thuringiensis subspecies aizawai
5
DNA
Deoxyribonucleotide acid
6
E . coli
Escherichia coli
7
EDTA
Ethylene diamine tetra- acetic acid
8
OD
Optical density- mật độ quang học
9
PCR
Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi
10
SDS
Sodium dodecyl sulphate
11
Sol
Solution
12
TE
Tris EDTA
13
X- gal
5- Bromo- 4 Cloro- 3 indolyl ß- d galactoside
14
kDa

Kilo Dalton
15
dH
2
O
Nước deion
16
cs
cộng sự




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
DANH MỤC CC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37
Bảng 3.2. Kết quả phân loại dưới loài của các chủng Bt sinh tinh thể 39
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm 41
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta 42
sau 3 ngày thử nghiệm 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC CC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS) 7

Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với kháng
nguyên lông roi H [6] 8
Hình 1.3. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24] 9
Hình 1.4. Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi quang học khi
nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS) 10
Hình 1.8. Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42] 12
Hình 1.6. Các block bảo thủ có mặt ở các loại độc tố Cry [26] 14
Hình 1.7. Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26] 14
Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc tố tới côn trùng đích [24] 16
Hình 1.9. Hình ảnh sâu tơ và (Plutella xylostella) thiệt hại do sâu tơ gây ra [10] 23
Hình 1.10. Vòng đời của sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [10] 25
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trường
MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 28
0
C 36
Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của chủng TN1.12 và TN 36.3 37
Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng 4J4 (A) và TN 6.12 (B) với typ huyết
thanh H7 dưới kính hiển vi quang học 39
Hình 3.4. Thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu 41
Hình 3.5. Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta
nghiên cứu 42
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu 44
Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh và trắng trên đĩa thạch LBA sau 14 giờ nuôi cấy 45
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13 46
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ một số
dòng khuẩn lạc trắng 47
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ
hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C –
TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 48

1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Thái Nguyên là tỉnh trung du miền núi phía Bắc, nông nghiệp chiếm tỷ
trọng lớn trong cơ cấu kinh tế. Cũng như nhiều vùng nông nghiệp khác, sâu
hại cây trồng, đặc biệt là các loài thuộc bộ Cánh vảy như sâu tơ (Plutella
xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)…là một trong những nhân
tố gây thiệt hại lớn tới năng suất và phẩm chất nông sản. Việc sử dụng thuốc
trừ sâu hóa học để diệt côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) là biện pháp có
hiệu quả tức thời nhưng lại gây ra những tác hại rất lâu dài cho môi trường
sinh thái, đồng thời việc tồn dư thuốc trừ sâu trong nông sản gây ngộ độc cho
người và động vật, là những nguyên nhân khiến thuốc trừ sâu sinh học được
coi như một giải pháp hiệu quả để dần thay thế thuốc trừ sâu hóa học trong
nông nghiệp. Trên thị trường thuốc trừ sâu sinh học hiện nay, các chế phẩm
có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chiếm thị phần gần như tuyệt
đối [8], [39].
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, trong giai đoạn sinh bào tử
có khả năng tạo ra các protein tinh thể gây độc một cách đặc hiệu với các côn trùng
thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh cứng
(Coleoptera) …. Các tinh thể là hỗn hợp của một hay nhiều loại protein thuộc 2
nhóm độc tố Cry và độc tố Cyt. Các độc tố có tính đặc hiệu với côn trùng đích
nhưng không gây độc cho người, động vật có xương sống, thực vật. Các độc tố tinh
thể được mã hóa bởi các gen cry nằm trên các plasmid [39].
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) là một trong 82 dưới loài của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis, có khả năng sinh nhiều loại protein tinh thể có tác dụng
diệt côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau. Protein tinh thể độc Cry1C là một loại protein
do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ
Cánh vảy rất mạnh.

Việc sàng lọc và tuyển chọn dưới loài Bacillus thuringiensis có khả năng tiêu
diệt nhiều loại côn trùng đích cũng như tiếp tục nghiên cứu về trình tự các gen cry


2
là những hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam
quan tâm.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Tuyể n chọ n, tách dng
và xác định trì nh tƣ̣ gen cry1C mã ha protein tinh thể diệ t côn trù ng bộ Cánh
vảy tƣ̀ vi khuẩ n Bacillus thuringiensis subsp. aizawai phân lậ p tƣ̀ mộ t số mẫ u
đấ t tỉnh Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Tuyển chọn được các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da lá ng
(Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) cao.
- Xác định được trình tự gen cry1C từ các chủng Bta đã tuyển chọn.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Thu thập các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus phân lập tại một
số địa điểm tại Thái Nguyên.
- Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai bằng phương
pháp huyết thanh học.
- Xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta đã phân loại được.
- Sàng lọc các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng (Spodoptera
exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) cao.
- Phát hiện gen cry1C từ các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh
(Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella).
- Tách dòng, đọc trình tự gen cry1C và so sánh với các trình tự đã công bố
trên ngân hàng gen quốc tế.

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới
Khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis đã được biết đến từ rất
lâu. Nhiều nghiên cứu còn cho rằng người Ai Cập cổ đã biết và sử dụng loại vi
khuẩn này để tiêu diệt nhiều côn trùng gây hại. Tuy nhiên Bacillus thuringiensis
mới chỉ được phân lập năm 1901 bởi Sigetane Ishiwata khi ông nghiên cứu bệnh
dâu tằm, gọi là bệnh “sotto”. Năm 1915, vi khuẩn này được mang tên Bacillus
thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringien của Đức [29].
Trải qua hơn 100 năm phát triển, lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis
đã trải qua nhiều dấu mốc quan trọng, tập trung vào một số hướng chính như:
Tìm kiếm và phát hiện các dưới loài Bacillus thuringiensis mới có khả năng
diệt côn trùng thuộc nhiều bộ côn trùng khác nhau, từ đó sản xuất các loại chế phẩm
sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Năm 1930, Bacillus thuringiensis lần đầu được đưa vào thử nghiệm để chống
sâu đục thân ở ngô tại vùng Ostrinia Nubilalis ở châu Âu. Năm 1938, thuốc trừ sâu
sinh học Bt đầu tiên đã được bán trên thị trường Pháp. Năm 1957, công ty Sandoz
(Thụy Sĩ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với số lượng lớn từ Bacillus thuringiensis
var. kurstaki. Công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu Bt thực sự phát triển mạnh với
việc phát hiện thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 (1970)
và Bacillus thuringiensis var. israelensis diệt ấu trùng thuộc bộ Hai cánh (1977).
Năm 1983, Krieg và cs phát hiện dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis

diệt bọ Cánh cứng (Coleoptera) hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ. Các phát
hiện này chứng tỏ hoạt tính diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis không chỉ giới
hạn trong bộ Cánh vảy (Lepidoptera) như quan niệm trước đây [15].
Phổ tác dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis tiếp tục được mở rộng
với các phát hiện về Bacillus thuringiensis diệt giun tròn thực vật (1988),


4
Bacillus thuringiensis diệt be, vét, mạt thuộc bộ Hrematoda hay Bacillus
thuringiensis diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đặc biệt năm 2003, Sakai và cs
đã công bố protein tinh thể của Bacillus thuringiensis diệt tế bào ung thư ở
người. Năm 2005, Ohba M., và Binh, N.D. đã phát hiện ra protein của 4 dưới
loài Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thư cổ tử cung
của người [5], [7], [20].
Protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis cũng đã được nghiên cứu
một các chi tiết đến mức độ phân tử. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra
thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh
hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử. Bằng kỹ thuật tia X và
các kỹ thuật sinh học phân tử khác, trình tự amino acid và cấu trúc của các protein
tinh thể độc tố đã được làm sáng tỏ. Qua đó góp phần làm rõ cơ chế tác động của
độc tố Bacillus thuringiensis tới các côn trùng đích [26], [31].
Gen mã hóa độc tố tinh thể của Bacillus thuringiensis là hướng được tập
trung nghiên cứu và đạt được nhiều kết quả. Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể
diệt sâu đầu tiên được tách dòng và đọc trình tự. Từ đó, số lượng gen mã hóa
protein tinh thể của Bt được tách dòng và nghiên cứu đặc tính không ngừng tăng
lên. Những gen này chủ yếu thuộc 2 họ gen cry và cyt, được phân loại trong 30
nhóm khác nhau theo trình tự amino acid của protein mà chúng mã hóa. Năm 1996,
Estruch và cs đã phát hiện ra gen mã hóa protein Vip3A và Vip3B, sinh tổng hợp ở
tế bào sinh dưỡng. Crick More và cs đã xây dựng khóa phân loại gen mã hóa độc tố
của vi khuẩn Bt, danh sách các gen cry, cyt được cập nhật từ các nghiên cứu trên khắp

thế giới, đồng thời liên kết với các trình tự công bố trên Gene Bank [36], [41], [42].
Những nghiên cứu về gen cry là cơ sở quan trọng cho công nghệ chuyển
gen, tạo ra hàng loạt các cây trồng biến đổi gen có mang gen Bacillus thuringiensis,
trong đó nhiều loại đã được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Năm 1985 các
gen cry1Ab và gen cry1Ac đã được chuyển thành công vào cây ngô và bông. Năm
1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất. Đến năm 2001,
tính riêng tại Mỹ, 26% tổng diện tích ngô, 69% tổng diện tích bông là giống cây


5
chuyển gen Bacillus thuringiensis. Năm 2005, ở Trung Quốc đã có 3,3 triệu ha
bông chuyển gen, đem lại nhiều lợi ích về kinh tế, môi trường, giảm thiểu việc sử
dụng thuốc trừ sâu hoá học [14], [29].
Tình hình dịch bệnh, sâu hại trong nông nghiệp diễn biến ngày càng phức tạp
với nhiều loại bệnh mới phát sinh, nhiều côn trùng biểu hiện kháng với các sản
phẩm Bacillus thuringiensis. Điều này đòi hỏi lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn
Bacillus thuringiensis phải có những thay đổi phù hợp. Dự báo trong những năm tới,
các nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis sẽ tập trung vào các vấn đề như:
- Nghiên cứu phát triển Bacillus thuringiensis thành một loại thuốc trừ sâu có
tác dụng bảo vệ kép (Dual control), vừa trừ sâu lại vừa chống bệnh cho cây trồng.
- Nghiên cứu sâu và có hệ thống hơn về cơ chế kháng của côn trùng với các
protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis, từ đó tạo ra các loại thuốc
Bacillus thuringiensis có độc lực mạnh hơn, cũng như khắc phục các loại chế phẩm
đã bị côn trùng kháng lại.
- Tiếp tục sàng lọc tuyển chọn thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis mới.
- Tiếp tục tách dòng và đọc trình tự các gen cry mới làm cơ sở phục vụ cho
công nghệ chuyển gen.
1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam
Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt
Nam được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác

giả như Nguyễ n Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu tiên
mở đường nghiên cứu về Bacillus thuringiensis tại Việt Nam [5].
1.1.2.1. Thời kỳ mở đầu nghiên cứu
Các công bố khoa học về nghiên cứu Bacillus thuringiensis ở thời kỳ này
còn rất ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất Bacillus
thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm
sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var.
thuringiensis, Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm Bacillus thuringiensis


6
này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết
quả tốt. Tuy nhiên từ năm 1984 đến năm 1993, việc sản xuất chế phẩm Bacillus
thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất ra
có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [5].
1.1.2.2. Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)
Ở thời kỳ này, các chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất theo phương
pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có
giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các trường
đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis theo phương pháp
lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [5].
1.1.2.3. Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay)
Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm Bacillus thuringiensis kém chất
lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng Bacillus thuringiensis bước vào
thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục
vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa học
đã chuyển việc nghiên cứu Bacillus thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các
chủng Bacillus thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi
lại việc sản xuất thuốc trừ sâu Bacillus thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển
gen Bacillus thuringiensis phục vụ sản xuất [5].

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng Bacillus
thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [2]. Năm
2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của
vi khuẩn Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được
22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [3], [13].
Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng
Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và
biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli
thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [4].


7
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào
cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ
cuối thế kỷ 20. Đã nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng có khả
năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông [7], [9], [12]. Năm 2003, Phan
Đình Pháp và cs đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng
súng bắn gen. Năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [15].
1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.2.1. Vị trí phân loại
Bacillus thuringiensis thuộc chi Bacillus, gồm hơn 20 loài khác nhau, trong
đó có nhiều loài rất quan trọng như Bacillus subtilis là nguồn cung cấp enzyme
trong công nghiệp, Bacillus cereus gây bệnh tiêu chảy và Bacillus anthracis, tác
nhân gây bệnh than. Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus hầu hết là Gram dương, có khả
năng tạo bào tử và thường sống trong đất [29], [49], [50].
Nhóm Bacillus cereus gồm có Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus
anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium. Khả năng sinh tinh thể là một đặc
điểm phân biệt Bacillus thuringiensis với các vi khuẩn khác thuộc nhóm Bacillus cereus

[29], [49], [50].

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc nhm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS)
1. B. mycoides 2. B. cereus 3. B. thuringiensis 4. B. megaterium 5. B. anthracis


8
1.2.2. Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Khóa phân loại vi khuẩn Bt được sử dụng phổ biến và được trung tâm
quốc tế Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng
cho tất cả các phòng thí nghiệm trên thế giới từ năm 1982 là khóa phân loại của
de Barjac và Bonnefoi [16],[17].
Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis của de Barjac và Bonnefoi dựa
vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể, các tác giả đã mô tả 27 typ huyết thanh
chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ Cánh vảy, Hai cánh, Cánh cứng…phương
pháp này được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao [16],[17].
Nguyên lý: Khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra
phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng ở đáy ống
nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học
có thể thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được [16], [17].
Ngày nay, phương pháp phân loại này đã được các nhà nghiên cứu Bacillus
thuringiensis và Bacillus subtilis công nhận và là điều kiện bắt buộc khi muốn công
bố một trình tự gen mới trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về Bacillus
thuringiensis và Bacillus subtilis.

Hình 1.2. Phản ứng ngƣng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
với kháng nguyên lông roi H [6]
Tế bào vi khuẩn với
kháng nguyên bề mặt
Phân tử kháng thể với
2 vị trí liên kết đặc
hiệu.
Phản ứng ngưng kết.


9
1.2.3
Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.3.1. Đặc điểm hình thái
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, tế bào dạng hình que, kích
thước 0,8-1,4 μm × 2,5 - 10μm, có thể tồn tại riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô
hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc
trên bề mặt tế bào [24]. (hình 1.3).
Mỗi tế bào Bacillus thuringiensis khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử
và tinh thể độc diệt côn trùng (hình 1.3). Bào tử hình thành trong điều kiện bất lợi
như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng…khi gặp điều kiện thuận lợi,

bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng. Bào tử có hình oval, kích thước
khoảng 0,5-1,2μm × 1,5 – 2,6μm, quá trình hình thành bào tử không làm biến đổi
hình dạng tế bào [24], [49].
Các tinh thể độc tố được tổng hợp trong quá trình tạo bào tử. Tinh thể có kích
thước 0,6-2μm, có nhiều hình dạng như hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương
hoặc có hình dạng không xác định … Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và
tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể được giải phóng ra
ngoài (hình 1.3). Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi
nhuộm tế bào Bacillus thuringiensis bằng thuốc nhuộm fushin base và quan sát dưới
kính hiển vi ta thấy tinh thể Bacillus thuringiensis bắt màu tím sẫm còn bào tử thì bắt
màu hồng nhạt (hình 1.4) [49].

Hình 1.3. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24]
Bào tử
Tinh thể


10

Hình 1.4. Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dƣới kính hiển vi quang học khi
nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phng DTVS)
1.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa
Bacillus thuringiensis có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao
động từ 15 – 45
0
C. Nhiệt độ tối ưu là 20-30
0
C.
Bacillus thuringiensis không lên men acid trong môi trường có chứa đường
arrabinose, xylose, manitol nhưng tạo acid trong môi trường có chứa glucose, có khả

năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa
0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà [49], [50].
Bacillus thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát
triển của Bacillus thuringiensis là pH = 7. Bacillus thuringiensis có khả năng oxy
hóa hydrocacbon đến acid hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden –
Meyerhoff – Panas [49], [50].
1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn Bacillus thuringiensis có
khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là độc tố Cry (Crystal δ
endotoxin), Cyt (Cytolytic) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein). Trong đó, độc
tố Cry và độc tố Cyt thuộc loại độc tố tinh thể. Dựa vào tính tương đồng của trình tự
acid min, các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khác nhau. Ngoài 3 họ độc
tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một số độc tố khác như hemolysin,
enterotoxin, chitinase, phospholipase…[19], [20], [24], [35].


11
1.3.1. Độc tố Cry
Đây là họ độc tố có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất, có bản chất là một
protein trong đó các amino acid như glutamic acid , asparaginic, chiếm trên 20% tổng
số amino acid trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân làm cho nội độc tố
có điểm đẳng điện thấp. Lượng cysteine nhỏ hơn 20% tổng số amino acid, quy định sự
không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine,
leucine, isoleucine. Xét về thành phần hóa học thì độc tố tinh thể chứa chủ yếu các
nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn,
Al, Cu, Mn, nguyên tố P hầu như không có [38], [26], [31].
Độc tố Cry không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi
trường có pH kiềm cao, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi đun nóng ở 65
0
C

trong 1 giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100
0
C trong 30 – 40 phút thì
protein tinh thể bị mất tính độc [38], [26], [31].
1.3.2. Độc tố Cyt
Độc tố Cyt có bản chất là protein và cũng hình thành tinh thể như độc tố Cry.
Tuy nhiên, tính tương đồng của trình tự amino acid giữa 2 nhóm độc tố Cry và Cyt
hầu như không đáng kể. Khi nghiên cứu 3 protein tinh thể: Cry3A, Cry1Aa và
Cyt2A thấy rằng Cry3A và Cry1Aa có tới 36% amino acid tương đồng trong khi
Cyt2A chỉ có độ tương đồng chưa đến 20% so với 2 độc tố Cry. Điểm khác biệt lớn
nữa giữa 2 nhóm độc tố thể hiện ở cấu trúc phân tử protein. Trong khi các độc tố
Cry có cấu trúc chung gồm 3 vùng, độc tố Cyt2A chỉ có 1 vùng đơn gồm có 2 chuỗi
xoắn α, bao bên ngoài là một tấm β [26].
Độc tố Cyt đầu tiên được Waallwijk phát hiện năm 1985 là Cyt1Aa1. Hiện
nay người ta đã phát hiện 40 độc tố Cyt thuộc 3 nhóm Cyt1, Cyt2 và Cyt3. Các độc
tố này có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa [42].
Độc tố Cyt được phát hiện chủ yếu ở các dưới loài B. isralensis, morrisoni,
medellin, terebrinois [41].


12
1.3.3. Độc tố Vip
Đây là nhóm độc tố không hình thành tinh thể, được tạo ra trong pha sinh
trưởng sinh dưỡng của tế bào. Các độc tố Vip có bản chất là protein ngoại bào. Độc
tố Vip được Estruch và cs phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996
[36], [37], [28].

Hình 1.8. Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42]

1.3.4. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể
Kết quả nghiên cứu của Hofte và Whiteley về trình tự amino acid tương đồng
giữa các độc tố cho thấy có 5 “vùng” (block) amino acid bảo thủ có mặt ở hầu hết các
độc tố Cry. So sánh các đầu tận cùng C ở các trình tự với trên 1000 “residues” cho thấy
còn có thêm 3 block nằm ngoài nhân độc (trung tâm hoạt động) của các độc tố [26], [31].
Cấu trúc không gian của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật
nghiên cứu tinh thể bằng tia X với những nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và
Cry1Aa, sau đó được mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có cấu trúc
chung gồm 3 vùng (domain) riêng biệt:
Vùng I gồm 1 bó 7 chuỗi α, trong đó chuỗi α-5 nằm ở trung tâm được bao
quanh bởi 6 chuỗi còn lại. 6 chuỗi α này có tính lưỡng cực và đủ dài để bắc cầu
xuyên qua lớp kị nước dầy 30 Å của màng kép và tạo nên kênh trên màng. Để tạo


13
được lỗ rò xuyên qua màng tế bào, những chuỗi α bên ngoài phải biến đổi đảo
ngược để mặt kị nước của nó tiếp xúc lớp màng photpholipid trong khi mặt ưa nước
kết hợp với vùng II tạo ra một lỗ rò không có tính đặc hiệu. Một số nghiên cứu gần
đây phát hiện ra những vị trí amino acid rất quan trọng trong hoạt động của nội độc
tố. Khi bị mất Glu-129, Arg-131, Asp-136 của chuỗi α-4 thì Cry1Aa không còn độc
tính với côn trùng, trong khi mất Arg-127 và Asn-138 thì độc tính không hề bị ảnh

hưởng [19], [26], [31].
Vùng II gồm 3 tấm β đối song song quấn quanh một lõi kị nước. Nhiều
nghiên cứu cho rằng vùng II đóng vai trò quan trong trọng việc gắn kết với thụ thể.
Có một sự tương đồng lớn giữa cấu trúc 3 tấm β này với 3 loại thụ thể glycoprotein
ở nhiều loài côn trùng (Amino peptidase N, Cadherin - like protein và Anionic
glycoconjugates). Những kết quả trên đưa đến giả thuyết các móc (loop) của vùng II
có thể tham gia gắn vào các thụ thể khác nhau, tương tự như vị trí liên kết kháng
nguyên - kháng thể [26], [30], [31].
Vùng III gồm 2 tấm β xoắn lại, nằm ở đầu C của phân tử độc tố, cấu trúc của
nó có thể bảo vệ độc tố Bacillus thuringiensis tránh khỏi sự phân giải quá mạnh của
protease ruột giữa côn trùng. Vùng III có thể còn tham gia vào quá trình nhận diện
thụ thể và điều khiển kênh ion. Chức năng của vùng III còn đang được nghiên cứu
thêm [26], [31], [38].
Nghiên cứu cho thấy, khi phân tử độc tố Cry1Ab chỉ có 2 vùng I, II thì vẫn
có khả năng gắn với thụ thể, nhưng chỉ là gắn thuận nghịch không bền vững, quá
trình gắn bền vững, không thuận nghịch yêu cầu phải có sự chèn của vùng I vào
màng biểu mô ruột giữa côn trùng [26].
Những nghiên cứu gần đây còn cho biết trình tự amino acid từ cuối vùng II
đến đầu vùng III liên quan chặt chẽ đến tính gắn của tinh thể độc vào niêm mạc ruột
côn trùng. Khi trình tự này biến đổi làm mất đi tính gắn đó côn trùng có hiện tượng
kháng thuốc. Vì thế vùng II và III được coi là vùng quyết định đến tính kháng thuốc
của côn trùng [26].


14


Hình 1.6. Các block bảo thủ c mặt ở các loại độc tố Cry [26]

Hình 1.7. Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26]
1.3.5. Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể
Cơ chế tác động của protein tinh thể là nguyên nhân tạo nên tính đặc hiệu
của Bacillus thuringiensis cũng như các chế phẩm từ Bacillus thuringiensis với côn
trùng đích. Cơ chế tác động của các độc tố tinh thể có thể được chia thành 3 giai


15
đoạn: Quá trình hòa tan của tinh thể độc tố, quá trình hoạt hóa độc tố, cuối cùng là
quá trình tạo kênh, lỗ rò trên màng ruột giữa của côn trùng [26], [31].
Quá trình hòa tan tinh thể độc tố: Khi côn trùng ăn phải tinh thể độc, tinh thể
sẽ được hoà tan nhờ pH kiềm cao trong môi trường ruột giữa. Sự khác biệt về độ
hòa tan đôi khi cũng giải thích sự khác biệt về độc tính giữa các loại tinh thể độc
khác nhau. Sự giảm độ hòa tan cũng có thể là một trong những cơ chế của hiện
tượng kháng thuốc Bacillus thuringiensis ở côn trùng [26], [31].
Quá trình hoạt hóa độc tố: sau khi hòa tan, nhiều độc tố phải được hoạt hóa
bởi hệ enzyme protease của ruột giữa côn trùng để trở thành độc tố hoạt động. Phần
lớn protease ở côn trùng bộ Cánh vảy là dạng trypsin hoặc chymotrypsin. Cũng có
những dẫn chứng cho thấy DNA cũng có liên quan đến quá trình phân giải protein
tinh thể [26], [29], [31].
Quá trình tạo kênh , tạo lỗ rò : Độc tố Cry ở dạng hoạt hóa có 2 chức năng
chính là gắn với thụ thể và hoạt động tạo kênh ion.
Quá trình gắn của độc tố với thụ thể đặc hiệu gồm có 2 bước: gắn thuận
nghịch và không thuận nghịch. Bước thứ 2 được cho là có liên quan đến sự gắn chặt
của độc tố với thụ thể và sự chèn của độc tố vào màng ruột. Các độc tố Cry có thể
có thụ thể đặc hiệu khác nhau. Ở Manduea sexta, thụ thể của Cry1Ab là dạng
protein màng cadeherin có khối lượng phân tử khoảng 210 kDa, trong khi Cry1Ac
và Cry1C lại có thụ thể đặc hiệu là APN (aminopeptidase N) với khối lượng phân tử
lần lượt là 120 kDa và 106 kDa [26], [31], [36].

16












Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc tố tới côn trùng đích [24]
Đặc điểm quan trọng nhất trong cơ chế tác động của độc tố lên côn trùng là
sự gắn kết của độc tố với thụ thể và hình thành lỗ rò (kênh ion). Độc tố Cry hoạt
động như một kênh ion thực sự trên màng lipid kép và biểu mô ruột giữa côn trùng.
Trong môi trường kiềm của ruột giữa, độc tố có chức năng như kênh cation do lợi
dụng graient K
+
cao có sẵn. Khi pH giảm do tế bào bị phá hủy, độc tố lại hoạt động
như kênh anion, tiếp tục gây tổn thương mạnh cho các tế bào biểu mô. Với một số
lượng lớn, độc tố Cry có thể tạo những lỗ rò rất lớn làm cho phá hủy tế bào, gây

thủng biểu mô ruột giữa côn trùng [26], [30], [31].
1.4. Gen mã ha protein độc tố tinh thể
Năm 1982, Held và cs đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ chữ Crystal
(tinh thể) để đặt tên các gen tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các chủng Bacillus
thuringiensis sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: Độc tố Cry (dạng chủ yếu – tinh thể
độc) được mã hóa bởi các gen cry, độc tố Cyt (độc tố phân huỷ tế bào) do gen cyt
mã hoá và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp.
Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể [11], [27].
Tinh thể
Tiêu hóa
Hòa tan tinh thể
Hoạt hóa độc tố
Tế bào ruột
giữa côn trùng
Độc tố gắn
với thụ thể
Độc tố chèn
vào màng và
tạo kênh, lỗ rò
Tế bào bị
chết