Phân lập SUS1 Promoter từ cây ngô và thiết kế vector biểu hiện chứa SUS1 promoter và Gen Cryia (C)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




NGUYỄN THỊ TÌNH



PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER
TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C)



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





THÁI NGUYÊN - 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ TÌNH


PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER
TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C)


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NÔNG VĂN HẢI



THÁI NGUYÊN - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và chƣa hề đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc
cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả


Nguyễn Thị Tình






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy PGS. TS. Nông Văn
Hải – Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Giám đốc phòng thí nghiệm
trọng điểm – Trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng đã tận tình chỉ dẫn, giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập thực hiện luận văn tại Viện công nghệ sinh học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS - NCS Huỳnh Thị Thu Huệ, TS. Lê
Thị Thu Hiền, CN. Dương Thị Thu Hà, cùng toàn bộ cán bộ, đồng nghiệp trong
phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, động viên
tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thí nghiệm trong
thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng
Công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm
2020 của Bộ Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn đã tạo điều kiện cho thực hiện
luận văn này trong khuôn khổ đề tài mã số CNSH. ĐT .03/06 -2010.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư
Phạm Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
tại khoa. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sư
Phạm, Đại học Thái Nguyên, Các thầy cô Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư
phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Sự tin
tưởng và khích lệ từ gia đình đã giúp tôi vững vàng, toàn tâm, toàn ý cho công việc.
Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người !
Thái Nguyên, ngày 22 tháng 9 năm 2011
Tác giả
Nguyễn Thị Tình


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các gen kháng sâu Bt trong tạo cây
trồng chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên 3
1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry 4
1.2.1. Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis 4
1.2.2. Một số nghiên cứu về gen Cry 5
1.2.3. Một số nghiên cứu về gen cryIA(c) 8
1.3. Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen 9
1.3.1. Cấu trúc của gen 9
1.3.2. Cấu trúc promoter 10

1.3.3. Vai trò điều khiển biểu hiện gen của promoter 12
1.3.4. Những nghiên cứu Sus1 promoter 15
1.4. Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 17
1.4.1. Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 17
1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 18
1.4.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T- DNA 19
1.4.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens 19
1.4.5 Tƣơng tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật 21
1.4.6 Một số phƣơng pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 22
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Nguyên liệu 24
2.2. PHƢƠNG PHÁP 27
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số mầm ngô 27
2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
2.2.3. PCR (Polymerase chain reaction) 30
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 31
2.2.5. Phản ứng nối ghép gen 32
2.2.6. Biến nạp plasmid 32
2.2.7. Tách chiết DNA plasmid 34
2.2.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột 35
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Phân lập Sus1 promoter từ mầm ngô 36
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngô 36
3.1.2. Tách dòng đoạn Sus1 promoter trong pJET 1.2/blunt 39

3.1.3. Trình tự đoạn Sus1 promoter 42
3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và
gen cryIA(c) 45
3.2.1. Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 46
3.2.2. Chuyển kết cấu biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) vào
pCB301 49
3.3. Chuyển kết cấu Sus1 promoter và cryIA(c) trong pCB301 vào A.
tumefaciens 50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
Amp
Ampicilin
Bp
Cặp base (base pair)
Bt
Bacillus thuringiensis
ddNTP
Dideoxy Nucleoside triphosphate
DNA
Deoxyribo Nucleoic acid
dNTP
Deoxy ribo Nucleoside triphosphate
EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid
EtOH
Cồn (Ethanol)
Kb
Kilo base (1kb = 1000bp)
kDa
KiloDalton
LB
Luria Broth
PCR
Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã ngược
Pcb
Vector pCB301 – Kan
pJET
Vector pJET 1.2/blunt
Rif
Rifamycin
RT- PCR
Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
Tm
Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature)
v/p
Vòng/phút
Đtg
Đồng tác giả

.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình Trang
Hình 1. 1: Cấu trúc một gen
10
Hình 1.2: Vị trí của promoter trong gen
10
Hình 1.3 : Bản đồ Ti - plasmid dạng octopin
19
Hình 1. 4 . Quá trình chuyển T - ADN vào tế bào thực vật
20
Hình 3.1 : DNA Tổng số tách từ mầm ngô
38
Hình 3.2 : Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter bằng cặp mồi F8
39
Hình 3.3. Điện di sản phẩm tách plasmid chọn dòng trong vector pJET
1.2/blunt
41
Hình 3.4 : Sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter từ vector pJET 1.2/blunt
42
Hình 3. 5: Kiểm tra các plasmid trong vector chọn dòng pJET1.2/blunt
42
Hình 3.6: So sánh trình tự đoạn Sus1 promoter từ ngô Q411
với trình tự MZESUS1 đã công bố
44, 45
Hình 3.7: Sơ đồ thiết kế vector pCB301 mang gen Cry1A(c) và Sus1
promoter
46

Hình 3.8: Ảnh điện di đồ các plasmid tái tổ hợp trong vector pRTRA7/3
48
Hình 3.9: PCR kiểm tra đoạn Sus1 promoter bằng cặp mồi Zsuc-PstIF và
Zsuc-NcoIR
53
Hình 3.10: Kiểm tra plasmid trong vector pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng
enzyme Pst I và NcoI
49
Hình 3.11: Kết cấu kiểm tra Sus1 promoter và gen cryIA(c) trong vector pCB301
bằng Hind III
50
Hình 3.12: Sản phẩm tách DNA từ A. Tumefaciens
52
Hình 13: Sản phẩm PCR từ chủng .Tumefaciens với cặp mồi Zsuc - PstI
và Zsuc - NcoIR
52


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 1.1 Một số trình tự thƣờng có ở promoter sinh vật nhân chuẩn
11
Bảng 2. 1. Các cặp mồi đƣợc sử dụng
25
Bảng 2. 2. Các hóa chất sử dụng
26
Bảng 2. 3. Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

28
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa nộng độ gel agarose và kích thƣớc đoạn DNA
cần phân tách
33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1

MỞ ĐẦU
Trong nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật, ngoài việc tìm kiếm
phân lập các gen quy định cho các tính trạng có giá trị thì việc tìm kiếm phân lập
các promoter cũng rất cần thiết để tăng cƣờng mức độ biểu hiện đặc hiệu của gen.
Trƣớc đây, các gen quan tâm thƣờng đƣợc điều khiển bởi các promoter cơ định
nhƣ: CaMV 35S - promoter, actin promoter, NOS promoter, Ubiquitin promoter
dẫn đến sản phẩm gen đƣợc biểu hiện hầu hết ở các mô và cơ quan. Xu hƣớng hiện
nay là sử dụng các promoter đặc hiệu để điều khiển gen ở những mô mong muốn
hoặc trong các giai đoạn phát triển nhất định của cây. Promoter của gen mã hóa
sucrose synthase1 (Sus1) của ngô đã đƣợc chứng minh trên cây thuốc lá chuyển gen
là một promoter đặc hiệu ở tế bào phloem. Vì vậy, Sus1 promoter của ngô có thể
đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen nhằm biểu hiện các tính trạng ở
phloem [74]. Ở Việt Nam, promoter của gen mã hóa sucrose synthase1 đã đƣợc
phân lập ở hai giống lúa Tám xoan và Dự thơm nhằm mục đích làm nguyên liệu cho
các nghiên cứu chuyển gen cho lúa [4].
Các gen cry đƣợc phân lập từ các chủng Bacillus thuringensis (Bt). Có
khoảng 150 gen mã hóa cho các protein tinh thể độc có tác dụng với một số loại
sâu. Trong số các nghiên cứu về độc tố cry, cryIA(c) là một trong những protein
đƣợc nghiên cứu kỹ, nổi bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng bộ
cánh vẩy. Trên thế giới, việc thiết kế vector chuyển gen thực vật mã hóa protein gây
độc cho côn trùng có nguồn gốc từ Bt đƣợc bắt đầu từ những năm đầu của thập kỷ

20. Đến năm 2002, cây trồng chuyển gen có khả năng sinh ra các độc tố kháng sâu
có nguồn gốc Bt đã đƣợc trồng trên 62 triệu hecta trên toàn thế giới [66]. Gen cry
đã chuyển vào nhiều cây trồng nhƣ: cryIA(b) vào cây thuốc lá, gen cryIA(c) vào cà
chua, đậu tƣơng, lúa, bông [38, [59], [70]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thiết kế
vector chứa gen kháng sâu đƣợc tiến hành khá nhiều. Gen cryIA(c) đã đƣợc chuyển
vào vector chuyển gen thế hệ mới dƣới sự điều khiển của Ubiquitin promoter phục
vụ nghiên cứu chuyển gen vào lúa [3] và đƣợc thiết kế trong vector pCB301 dƣới sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
điều khiển của 35S promoter để kiểm tra biểu hiện trên cây thuốc lá Nicotiana
benthaminana nhằm phục vụ nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp [7]. Tuy
nhiên với từng loại cây trồng thì việc thiết kế vector chuyển gen vẫn cần đƣợc thực
hiện để tối ƣu cho phù hợp với đặc điểm của mỗi loài. Đồng thời, khả năng kháng
sâu ở cây chuyển gen cũng cần phải có tính đặc hiệu cho phù hợp với tình trạng sâu
bệnh ở mỗi loại cây trồng [18].
Vì vậy, trong nghiên cứu này, với mục đích phân lập một promoter đặc hiệu
phloem phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cho cây ngô, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập Sus1 promoter từ cây ngô và thiết kế
vector biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c)”
1.1. Mục tiêu của đề tài
Tạo ra một vector biểu hiện thực vật mang đồng thời Sus1 promoter phân lập từ
ngô và gen cryIA(c) kháng côn trùng.
1.2. Yêu cầu của đề tài
- Nắm đƣợc cấu trúc Sus1 promoter, đặc điểm, cấu trúc của gen cryIA(c)
- Nắm đƣợc các nguyên lý, kỹ thuật và các phƣơng pháp thực hiện trong quá
trình tách dòng gen, gắn gen vào vector biểu hiện.
- Tạo đƣợc chủng Agrobacterium tumefaciens chứa Sus1 promoter và gen
cryIA(c).

1.3. Nội dung của đề tài
- Phân lập Sus1 promoter từ ngô
- Thiết kế vector biểu hiện thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và gen
cryIA(c) kháng côn trùng.
- Tạo chủng A.tumefaciens mang Sus1 promoter và gen cryIA(c) kháng côn trùng.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả của đề tài cung cấp nguyên liệu phục vụ các nghiên cứu chuyển
gen vào cây ngô và một số cây trồng nông nghiệp có giá trị khác. Nhằm tạo
cây chuyển gen kháng côn trùng có tính đặc hiệu phloem.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các gen kháng sâu Bt trong tạo cây
trồng chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên
Trong nông nghiệp, ngành trồng trọt chịu ảnh hƣởng của yếu tố thời tiết,
dịch bệnh. Yếu tố này là nguyên nhân dẫn tới giảm năng suất và chất lƣợng cây
trồng. Nghiêm trọng hơn, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học bừa bãi dẫn đến tình
trạng sâu kháng lại thuốc trừ sâu hóa học. Vấn đề này đã khiến các nhà quản lý và
ngƣời nông dân gặp khó khăn hơn trong hạn chế các tổn thất về năng suất cũng nhƣ
các lựa chọn đối tƣợng cây trồng và loại thuốc bảo vệ thực vật phù hợp. Sau khi các
loại protein thế hệ thứ nhất bao gồm các δ- endotoxin có khả năng kháng sâu của vi
khuẩn Bt nhƣ (Cry, Cyt) đƣợc phát hiện và nghiên cứu rộng rãi, nhiều loài cây trồng
biến đổi gen chứa các gen kháng sâu này đã mở ra triển vọng mới, thiết lập một nền
nông nghiệp sạch, an toàn. Ngay từ năm 2002, cây trồng chuyển gen có khả năng
sinh ra các độc tố kháng sâu có nguồn gốc Bt đƣợc trồng trên 62 triệu hecta trên
toàn thế giới [66]. Ƣu điểm nổi bật của cây trồng chuyển gen là khá bền vững trong

điều kiện tự nhiên và giúp cây trồng kháng đƣợc tƣơng đối nhiều sâu bệnh. Do đó,
nhiều loại cây trồng chuyển gen chứa một hoặc nhiều gen của Bt (ví dụ gen cry, cyt,
vip) đã đƣợc nghiên cứu, thƣơng mại hóa rộng rãi và đang là các loại cây trồng đóng
vai trò rất quan trọng trên thị trƣờng thế giới [59]. Tuy nhiên qua nhiều năm đƣợc trồng
đại trà ở Mỹ và một số nƣớc khác trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản. Các
cây trồng chuyển gen thuộc thế hệ này đã bộc lộ nguy cơ bị giảm khả năng kháng do
nhiều loài sâu bệnh đã tiến hoá và có khả năng kháng với độc tố đƣợc tiết ra trong cây
[41], [54]. Ngoài ra, việc biểu hiện các tính trạng kháng sâu không đặc hiệu hoặc không
ổn định do việc sử dụng promoter không đặc hiệu và biểu hiện không mạnh. Vì vậy,
việc nghiên cứu phát triển các loại protein diệt sâu đồng thời biểu hiện đặc hiệu ở
những bộ phận của cây trồng đƣợc quan tâm nghiên cứu ngày càng sâu, rộng. Năm
2001, ba gen kháng sâu là cryIA(c), cryIIA và gna (mã hoá lectin ở cây bạch đàn) cũng
đƣợc chuyển vào lúa (Oryza sativa) giống M7 và Basmati 370 [47]. Các protein

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
cryIA(c), cryIIA và gna đã đƣợc biểu hiện hoặc riêng lẻ hoặc cùng nhau
trong cây chuyển gen với các mức độ khác nhau, lần lƣợt chiếm 0,03 – 1%, 0,01 –
0,5% và 0,01 – 2,5% tổng số protein hòa tan thu đƣợc [27]. Các gen chuyển đều thể
hiện sự bền vững qua nhiều thế hệ cây và đã giúp các cây chuyển gen kháng hiệu Ở
Việt Nam, hƣớng nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang đƣợc tiếp cận, đầu tƣ
và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt. Các đề tài chuyển gen
thực vật chủ yếu tập trung hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen vào cây trồng thông
qua vi khuẩn Agrobacterium, thu thập và phân lập một số gen và promoter có giá trị
phục vụ cho nông nghiệp, đặc biệt phải kể đến nhóm gen kháng sâu cry. Nhiều cấu
trúc Ti – plasmid chứa gen cryIA(c), cryIA(b) đã đƣợc thiết kế [3,45] và biểu hiện ở
nhiều cây trồng khác nhau nhƣ đậu xanh (Vigna radiate) [11], cải bắp (Brassica
oleracea var capitata) [9], thuốc lá (N. tabacum và N. benthamina) [1], [7].
quả sự tấn công của ba loại sâu hại lúa quan trọng nhất là sâu cắn lá

(Cnaphalocrocis medinalis), sâu đục thân (Scirpophaga incertalas) và bọ nhảy
(Nilaparvata lugens). Năm 2008 gen cryIA(b) đã đƣợc chuyển vào bông [12].
1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry
1.2.1. Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis
Vi khuẩn Bt có thể tìm thấy ở nhiều nơi nhƣ đất rừng, bụi cát, phân dơi, nƣớc
biển, xác chết côn trùng. Bt là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram dƣơng, có khả
năng hình thành bảo tử trong điều kiện môi trƣờng bất lợi và sản sinh protein tinh
thể độc ở dạng ngoại bào (a, b,  exotoxin) và nội bào (-endotoxin). Trong đó, -
endotoxin là một họ protein tinh thể độc chính. Mặc dù đƣợc coi là thuốc trừ sâu vi
sinh hiệu quả, một số hạn chế nhất định về phƣơng diện sinh học nhƣ thời gian ảnh
hƣởng ngắn, không tiếp xúc đƣợc với côn trùng ẩn sâu dƣới lá, đất, đã phần nào
giảm mức độ sử dụng chế phẩm Bt. Những điểm bất lợi này hoàn toàn bị loại trừ
khi chuyển và biểu hiện gen cry vào cây trồng [10].
Trong chuyển gen, những protein độc có khả năng diệt sâu của Bt đã đƣợc sử
dụng để tạo nên các sản phẩm kháng côn trùng nhƣ ngô, bông, khoai tây, lúa Điểm
đặc biệt của Bt là protein tinh thể đƣợc hình thành trong quá trình hình thành bào tử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
[11]. Những phân tử protein này đƣợc biết đến là có tính độc đối với các ấu trùng và
những dạng côn trùng gây hại khác (nhƣ bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ hai cánh
(Diptera), bộ cánh vẩy (Lepidoptera) với hiệu lực khác nhau. Độc tố của Bt có tính đặc
hiệu rất cao, không gây độc cho động vật có vú và những côn trùng có ích khác [46].
1.2.2. Một số nghiên cứu về gen Cry
Hệ thống gen cry hầu hết đƣợc phân lập từ chủng Bt. Có khoảng 150 gen cry
mã hóa cho các protein tinh thể độc có tác dụng với một số loại sâu. Các gen cry tự
nhiên thƣờng nằm trên plasmid cỡ lớn có kích thƣớc 3 kb, trong đó chỉ có đoạn 2 kb
mã hóa protein tinh thể độc. Các plasmid này có mặt trong hầu hết các chủng Bt với
số lƣợng bản sao từ 2 đến 12 bản sao. Ngoài ra, các gen cry cũng nằm trên nhiễm

sắc thể ở một số chủng Bt nhƣ kurstaki HD - 1, entomocidus, aizawai 7.29…[21].
Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu phân lập các chủng
để sản xuất chế phẩm Bt. Một trong những hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học là
tính tác động chọn lọc và quy trình sản xuất cần có công nghệ hiện đại, để khắc
phục điều này việc thiết kế các vector mang gen cry chuyển vào cây trồng là việc
làm cần thiết. Các nhà khoa học của Việt Nam đã tiến hành phân lập hơn 3500
chủng. Qua so sánh với các chủng Bt trên thế giới, các chủng Bt của Việt Nam rất
đa dạng về cấu trúc tinh thể độc tố, hình tháp chiếm 63,1%, hình cầu 11,2%, hình
khối lập phƣơng 4,8% và đặc biệt đa dạng về gen mã hóa protein diệt côn trùng
cánh vẩy (Lepidoptera), cánh cứng (Coleoptera), hai cánh (Diptera), diệt tuyến
trùng hại cây nông, lâm, công, nghiệp. Trong đó, gen cryI (cryIAa, cryIAb, cryIAc,
cryIB, cryIC, cryIE, cryIF) chiếm 57 %, cryII chiếm 5%, cry4 (cryIVA, cryIVB)
chiếm 43%, cryVIII chiếm 8%. Ngoài ra, các gen cyt, gen vip, gen parasporin cũng
đƣợc phát hiện chiếm khoảng 1 - 5% [11].
Cho tới nay, có hàng trăm gen cry đã đƣợc công bố. Tuy nhiên, hầu hết
mối quan tâm đều tập trung vào nhóm gen cryI, cryIII, cryIV. Các chủng mang
gen cryI có kích thƣớc 490 – 980 bp. Các chủng mang gen cryIV có kích thƣớc
690 - 1290 bp. Còn các chủng mang gen cryIII có kích thƣớc 649 – 1060 bp.
Thành phần protein tinh thể của Bt không những quyết định hoạt lực diệt côn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
trùng mà còn liên quan đến sự tồn tại các lớp gen cry. Các protein 130 kDa, diệt
côn trùng cánh vảy do gen cryI mã hoá. Gen cryIII mã hóa protein có khối lƣợng
phân tử thấp hơn (66 -73 kDa), diệt côn trùng cánh cứng. Protein tinh thể diệt
côn trùng hai cánh đa dạng nhất bao gồm các protein 130 kDa, 128 kDa, 67 kDa,
28 kDa do gen cryIV, cryX, cryXI mã hóa. Thành phần protein của các chủng
cũng rất đa dạng. Trên gel polyacrylamide đã phát hiện protein 130 kDa của các
chủng Bt mang gen cryI, còn protein 130 kDa, 67 kDa và 28 kDa của Bt mang

gen cryIV và cryIII có protein 70 kDa [11], [12].
1.2.2.1. Phân loại gen cry
Cricmorore và đồng tác giả (1982) [26] là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng
chữ viết tắt “cry” (crystal) để chỉ các gen tạo tinh thể độc tố của Bt [3], [12], [12,
[26]. Dựa trên tính tác động chuyên biệt vào sâu mục tiêu và sự tƣơng đồng về trình
tự, gen mã hóa protein độc tố có thể đƣợc phân thành 6 nhóm chính:
(a) Các gen mã hóa tiền độc tố 130 - 140 kDa gây hại sâu cánh phấn đƣợc
xếp vào nhóm cryI - đƣợc phân loại sâu hơn (subclass) từ cryIA đến cryIG. Dựa trên
sự tƣơng đồng về trình tự amino acid (>80%), gen cryIA có thể đƣợc phân loại sâu
hơn nữa thành IA(a), IA(b), IA(c).
(b) Gen cryII mã hóa tiền độc tố 66 kDa gây hại sâu cánh phấn (cryIIB) hoặc
gây hại cả sâu cánh phấn và sâu hai cánh (cryIIA).
(c) Gen cryIII mã hóa protein 73 kDa gây hại sâu cánh cứng.
(d) Gen cryIV- phân lập từ chủng Bt (israelensis) mã hóa protein các loại
135, 128, 74 và 72 kDa có tác dụng gây hại sâu hai cánh.
(e) Gen cryV mã protein 80 kDa có tác dụng gây hại sâu cánh phấn và sâu
cánh cứng.
(f) Gen cryVI có hoạt tính gây hại tuyến trùng[29], [31], [48].
1.2.3.2. Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể độc
Cho đến nay, hơn 150 loại độc tố cry khác nhau đã đƣợc phân lập và kiểm
tra tính độc trên nhiều loại côn trùng [10]. Trong khi đó danh sách những gen hay
protein mới liên tục đƣợc kéo dài, những danh pháp mới cũng đƣợc đặt thêm, theo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
đó mỗi gen/ protein có tên dài gồm 4 chữ cái, dựa vào trình tự amino acid đƣợc xác
định [26]. Protein tinh thể độc có cấu trúc đặc thù. Các nghiên cứu về cấu trúc của
chúng thƣờng bắt đầu bằng những nghiên cứu về chức năng của những vùng cấu
trúc này. Đặc điểm điển hình trong cấu trúc của protein tinh thể độc là có các vùng

bảo thủ nằm xen kẽ những vùng biến đổi. Các vùng bảo thủ này đóng vai trò quan
trọng về mặt cấu trúc và chức năng. Bt và δ - endotoxins của nó đƣợc nghiên cứu ở
mức độ phân tử để có thể hiểu rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, hoạt
động của độc tố.
1.2.3.3. Cơ chế và hoạt động của protein tinh thể độc tố
Cơ chế tác dụng của tiền độc tố lên côn trùng đích đã đƣợc nghiên cứu khá
sâu. Đầu tiên tinh thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng theo thức ăn qua đƣờng
miệng. Sau đó dƣới tác động của môi trƣờng có độ pH > 10 ở ruột giữa của sâu
cùng với sự hoạt động của protease ruột sâu, tƣơng tự trypsin, các tiền độc tố đƣợc
hoạt hóa. Tiền độc tố cryI và cryIV với kích thƣớc 130 - 140 kDa khi đã đƣợc hoạt
hóa đã hình thành độc tố, kích thƣớc 65 - 75 kDa có hoạt tính bền vững. Trong khi
tiền độc tố cryII và III (70 - 75 kDa) sau quá trình biến đổi đã tạo ra độc tố kích
thƣớc 60 - 65 kDa. Sau khi đƣợc hoạt hóa, protein tinh thể độc đã liên kết ái lực
mạnh với các chất nhận glycoprotein tại những vị trí đặc hiệu nằm trên các vi nhung
mao của các tế bào biểu mô ruột giữa của ấu trùng. Chính mối liên kết của các độc
tố với các chất nhận ở vi nhung mao này đã quyết định tính đặc hiệu của các độc tố.
Ở những côn trùng không mẫn cảm, mối liên kết này rất lỏng lẻo. Hiện nay, ngƣời
ta xác định đƣợc ba nhóm vị trí gắn. Một số vị trí có thể liên kết với một loại độc tố,
một số vị trí khác có thể liên kết với hai hay nhiều loại. Nhƣ vậy, một độc tố đặc thù
có thể liên kết với nhiều vị trí nhận trong ruột côn trùng. Sau khi gắn kết, protein
tinh thể độc tố đính trên bề mặt tế bào biểu mô ruột giữa, gây tổn thƣơng và phá hủy
tế bào, tiêu diệt côn trùng mẫn cảm. Độc tố Bt gắn vào glycoprotein niêm mạc ruột,
đặc biệt là đoạn giữa ruột làm cho ruột bị thủng, rò rỉ dịch tiêu hóa vào đƣờng dẫn
máu gây nên hiện tƣợng bị loãng dịch tiêu hóa và nhiễm trùng máu [24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
1.2.3. Một số nghiên cứu về gen cryIA(c)
Trong số các nghiên cứu về độc tố cry, cryIA(c) là một trong những protein

cry đƣợc nghiên cứu kỹ, nổi bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng
bộ cánh vẩy, đặc biệt đƣợc sử dụng trong việc bảo vệ nông nghiệp.
Tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của protein cryIA(c)
vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ và cần những nghiên cứu sâu hơn. Nghiên cứu về tinh thể
bào tử bao gồm mảnh DNA dị hợp 20 kb liên kết với tiền độc tố, nó có thể đóng
vai trò chìa khóa trong việc đảm bảo cấu trúc ổn định của những hạt tinh thể
cũng nhƣ sự hoạt hóa tinh thể độc tố trong ruột giữa của sâu đích. Tuy nhiên,
mối tƣơng tác tự nhiên của tiền độc tố Bt với DNA, trình tự và nguồn gốc của
DNA 20 kb còn lại đƣợc nghiên cứu kĩ. Học thuyết hiện đại nghiên cấu cấu trức
không gian 3 chiều của cryIA(c) đã đƣợc dự đoán khi nghiên cứu cầu trúc của
đồng đẳng của nó là cryIA(a), và sự khác biệt về cấu trúc giữa cryIA(a),
cryIIA(a), cryIIIA(a) và cryIVA(a). Cấu trúc của nó gồm 3 “domain” chính.
Domain 1 bao gồm 7 chuỗi xoắn alpha, trong đó chuỗi thứ 5 đƣợc bao quanh bởi
các chuỗi khác, tạo nên một bó xoắn. Domain 2 bao gồm 3 tấm β tạo nên cấu
trúc hình học Greek, đƣợc xếp trong 1 hình lăng trụ. Domain 3 đƣợc tạo ra bởi 2
tấm β không song song thành dạng bánh β - sandwich trong một cấu trúc hình
trụ. Đoạn gen cryIA(c) đầy đủ đƣợc phân lập và tách ra từ chủng Bt 4.0718, qua
plasmid biểu hiện pHTAc35 đƣợc cài gen cryIA(c).
Tinh thể độc tố Bt đƣợc chuyển cùng với pHTAc35 và đƣợc biểu hiện thành
dạng tiền độc tố cryIA(c5) 130 kDa, trong những nghiên cứu trƣớc đây đã phát hiện
ra 20kb - DNA và cryIA(c) đƣợc tinh sạch, mối tƣơng tác của chúng đƣợc phân tích
bằng cách sử dụng phép thử huỳnh quang. Những vùng liên kết đều nằm trong 3
phần domain chính. Trong đó nhận thấy so với cấu trúc DNA thông thƣờng, DNA
20 kb có liên kết rất chặt chẽ. Bên cạnh có cấu trúc chung giống với tất cả các phân
tử DNA khác, độc tố có thể là do các trình từ Nucleotide đặc hiệu tạo nên thể hiện
trong nhiều đoạn của phân tử DNA 20kb. Phân tử đƣợc mô phỏng sử dụng cryIA(c)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9

và một đoạn của 20 - bp DNA chứa một vài vị trí liên kết với 3 domain của
cryIA(c). Vị trí liên kết Ser283 -Ala284 - Gln285, Ser440 - Ser441 - Ser442 DNA
Ser555 - Leu556 - Asn557 đƣợc tạo nên nhờ liên kết tƣơng tác hidro. Đó là tƣơng
tác hidro giữa phân tử phosphor trên đoạn DNA với 3 phân tử amino acid (Arg209,
Asn212 DNA Gly339) của cryIA(c). Phần thêm của phân tử 20 kb - DNA hoạt hóa
cryIA(c) trong điều kiện in vitro đã làm giảm độc tính của Bt dƣới điều kiện có
trypsin và tia cực tím đã chỉ ra rằng sự tồn tại của 20 kb - DNA trong những phân tử
độc tố đóng vai trò bảo vệ tính độc.
Một trong những điều mà các nhà khoa học quan tâm là vấn đề sau khi các
gen cry mã hóa protein tinh thể độc chuyển vào thực vật thì mức độ nó biểu hiện là
cao hay thấp. Nhờ kỹ thuật di truyền thì hiện nay trình tự gen cry đã đƣợc cải thiện
rất nhiều để nó có thể biểu hiện ở mức độ cao nhất đảm bảo cho hoạt lực kháng sâu.
Các nghiên cứu của Perlak và đtg đã nghiên cứu cải biến gen cryIA(b) và cryIA(c)
bằng cách thay thế các trình tự Adenin/Timin bằng trình tự Guanin/Cytonin mà vẫn
giữ nguyên trình tự acid amin của protein [2]. Các gen cải biến này đƣợc đặt dƣới
sự điều khiển của đoạn khởi động mạnh đã đƣợc chuyển vào giống bông Coker với
mức độ biểu hiện protein tăng 100 lần [3]. đã thiết kế vector thế hệ mới mang gen
kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào cây thuốc lá.
1.3. Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen
1.3.1. Cấu trúc của gen
Cấu trúc của một gen mã hóa cho một protein (gen sẽ đƣợc phiên mã thành
mRNA) thƣờng bao gồm 3 vùng: (1) Vùng 5’ là vùng mang các trình tự điều khiển
biểu hiện của gen và các trình tự tăng cƣờng promoter; (2) Vùng đƣợc phiên mã (gen
cấu trúc) bao gồm các trình tự intron và exon; Exon là trình tự có mặt trong mRNA ở
trong tế bào chất, thƣờng tƣơng ứng với phần mã hóa của gen và sẽ đƣợc dịch mã
thành protein; Intron là trình tự đƣợc phiên mã nhƣng sẽ bị loại bỏ trong quá trình
trƣởng thành của mRNA. Trình tự này không thấy ở sinh vật nhân sơ; (3) Vùng có
chức năng polyadenyl hóa (terminator) [6, 30]. Ở một số gen, vùng này mang các trình
tự điều hòa chuyên biệt. Vùng 5’ và vùng 3’ không đƣợc phiên mã Hình 1.1 [61].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10

Hình 1. 1: Cấu trúc chung của một gen
1.3.2. Cấu trúc promoter
Các gen cấu trúc có thể biểu hiện đƣợc thành protein cần sự có mặt của các
trình tự điều khiển thích hợp ở những vị trí nhất định. Trình tự tham gia tích cực
vào quá trình điều khiển biểu hiện gen là đoạn điều khiển biểu hiện gen (promoter).
Promoter, bao gồm trình tự nucleotide nằm ngƣợc phía trên đầu 5’ so với vị trí khởi
đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS). Tùy thuộc vào khoảng cách từ
TSS, các thuật ngữ “promoter gần” hay “promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm
nucleotide quanh vùng TSS) (proximal promoter hay minimal promoter) và
“promoter xa” (hàng nghìn nucleotide ở phía trên TSS) (distal promoter) có thể
đƣợc sử dụng. Cả hai loại promoter gần và xa đều chứa rất nhiều yếu tố tham gia
vào quy trình phức tạp của các nhân tố điều hòa phiên mã đặc hiệu tế bào, mô, cơ
quan, giai đoạn phát triển và môi trƣờng Hình 1. 2 [61].

Hình 1.2: Vị trí của promoter trong gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11

Về mặt cấu trúc, promoter có tổ chức phức tạp và chứa rất nhiều yếu tố đặc
trƣng có chức năng bám, gắn với các nhân tố protein tham gia vào quá trình phiên
mã gen. Các yếu tố điều hòa (regulatory elements) nằm trên promoter và cùng một
sợi với vùng mang mã của gen đƣợc gọi là yếu tố cis (cis elements) [20]. Mỗi yếu tố
đƣợc đặt tên trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng. Yếu tố cis cơ bản nhất là hộp
TATA, đƣợc tìm thấy ở hầu hết các gen của sinh vật nhân chuẩn, nằm ở vị trí đƣợc

xác định là + 1). Ở sinh vật nhân sơ, hộp TATA thƣờng nằm ở quanh vị trí – 10.
Hộp này chịu trách nhiệm đảm bảo cho quá trình gắn RNA polymerase chính xác
vào vị trí khởi đầu phiên mã. Một gen vẫn có thể gắn RNA polymerase vào
promoter với một TATA cải biến nhƣng hiệu quả của quá trình khởi đầu phiên mã
có thể bị ảnh hƣởng rất nhiều. Hầu hết các gen cảm ứng (inducible genes) thƣờng
có chứa hộp TATA và ít nhất là hai yếu tố cis khác. Trong khi đó, các “gen giữ
nhà” (housekeeping gene) có các yếu tố cis ít đa dạng hơn và thậm chí có thể chứa
hộp TATA. Hộp TATA thƣờng nằm ngay cạnh một yếu tố cis cơ bản khác là hộp
CCAAT cung cấp vị trí gắn cho RNA polymerase. Một số trình tự thƣờng gặp ở
promoter của sinh vật nhân chuẩn đƣợc trình bày ở Bảng 1.1:
Bảng 1.1: Một số trình tự thƣờng có ở promoter sinh vật nhân chuẩn
Promoter
Vị trí
Nhân tố phiên mã
Trình tự đặc trƣng
Vị trí khởi đầu
phiên mã
+1
TBP
PyPyA + 1N
(T/A)PyPy
Hộp TATA
- 35 ̴ - 20
TBP
TATAAA
Hộp CCAAT
- 200 ̴ - 70
CBF, NF1, C/EBP
CCAAT
Hộp GC

- 200 ̴ - 70
SP1
GGGCGG
Trong đó: Py là C hoặc T, N là nucleotide là nucleotide bất kỳ, T/A là T hoặc A.
CBF = Protein bám CCAAT, C/EBP = CCAAT/Protein bám vùng tăng
cƣờng (enhancer binding protein). TBP = Protein bám TATA. Hộp CCAAT và GC
nằm ở vị trí – 200 và - 70.
Ở thực vật, hộp TATA thƣờng nằm ở vị trí từ - 35 đến – 25 bp trƣớc vị trí
khởi đầu. Hộp CCAAT nằm ở vị trí giữa -70 và -100 bp trƣớc vị trí khởi đầu. Hộp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
này có thể có trình tự khác nhau và đƣợc gọi là hộp AGGA [20]. Promoter của
nhiều gen thực vật cảm ứng bởi môi trƣờng còn mang một số yếu tố cis là các trình
tự đặc trƣng khác nhƣ hộp G (G – box). Hộp G đƣợc phát hiện đầu tiên nhƣ là một
trình tự 11 bp (5’ C/AACACGTGGCA3’) nằm ở phía trƣớc của rất nhiều gen mã
hóa cho tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate carboxylase. Từ đó đến nay, các
yếu tố cis chứa hộp G hoặc các tiết tấu (motif) trình tự liên quan với lõi
hexanucleotide CACGTG đã đƣợc xác định trong các promoter của nhiều gen
không liên quan, nhƣ gen đƣợc cảm ứng bởi ánh sáng, bởi abscisis acid (ABA), khi
bị tổn thƣơng, trong điều kiện kị khí [28].
Ngoài các trình tự đặc trƣng nhƣ TATA và CCAAT, một số trình tự DNA
ngƣợc dòng về phía trên vùng 5’ của hầu nhƣ tất cả các promoter của sinh vật
nhân chuẩn đƣợc nghiên cứu cho đến nay có chứa các yếu tố điều hòa khác [38].
Những trình tự điều hòa ngƣợc dòng này đƣợc biết rộng rãi nhƣ là các vùng tăng
cƣờng (enhancers) hay các trình tự hoạt hóa ngƣợc dòng (ups tream activating
sequences). Những trình tự này rất đa dạng về chiều dài, có thể dao động từ
khoảng – 100 bp đến 100 bp hoặc ngƣợc khá xa về phía đầu 5’ của vị trí khởi
đầu phiên mã với những cấu trúc là các trình tự lặp lại. Các vùng tăng cƣờng

cũng có thể đƣợc tìm thấy ở vùng 3’ không đƣợc dịch mã và thậm chí ở cả các
intron [20]. Mỗi vùng tăng cƣờng có thể có chức năng độc lập nhƣ là một yếu tố
cis và nằm trên cùng một sợi với các gen đƣợc tác động. Vùng tăng cƣờng
thƣờng đặc thù cho từng gen hoặc từng nhóm gen, có thể có vai trò điều hòa đặc
hiệu, điều khiển gen biểu hiện ở những mô hoặc cơ quan cụ thể. Vai trò này
thƣờng đƣợc duy trì khi vùng tăng cƣờng đƣợc cắt và đƣa vào một gen khác để
điều khiển biểu hiện một gen mới trong một cơ thể chủ.
1.3.3. Vai trò điều khiển biểu hiện gen của promoter
Các gen cấu trúc muốn biểu hiện đƣợc thành protein, trƣớc tiên gen đó cần
thực hiện quá trình phiên mã. Quá trình này chịu sự điều khiển của nhiều yếu tố nhƣ
các protein tham gia quá trình phiên mã, đoạn promoter, các trình tự tăng cƣờng,
đoạn kết thúc gen [71]. Trong đó, đoạn promoter, có vai trò chính trong quá trình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
biểu hiện gen. Về cơ bản, promoter đóng vai trò nhƣ một công tắc bật gen. Tất cả
các gen cần một promoter để hoạt động hoặc bắt đầu biểu hiện. Nhƣng promoter
không chỉ đơn giản nhƣ một công tắc điện, ví dụ chỉ có hai chiều, bật hoàn toàn
hoặc tắt hoàn toàn. Thay vào đó, promoter có rất nhiều module khác nhau hoạt động
nhƣ các cảm biến (sensor) và cho phép chúng có thể phản ứng theo những cách mà
hiện nay chúng ta chƣa hiểu đƣợc hoàn toàn, đối với những tín hiệu khác nhau từ
những gen khác hoặc từ môi trƣờng, định rõ khi nào thì khởi động và khởi động ở
đâu, với cƣờng độ và thời gian nhƣ thế nào. Trong điều kiện nhất định, promoter có
thể không hoạt động và khi đó thì gen hoàn toàn không đƣợc khởi động. Nói chung,
vai trò của promoter của một gen bình thƣờng trong một sinh vật là cho phép gen
hoạt động đúng trong các chu trình điều hòa hết sức phức tạp của sinh vật. Promoter
liên quan đến các gen thuộc từng sinh vật đƣợc thích ứng với gen đó trong khi toàn
bộ các gen của sinh vật đƣợc thích ứng để tồn tại và hoạt động cùng nhau qua hàng
triệu hay hàng trăm triệu năm [70].

1.3.3.1. Phân loại promoter
- Promoter cơ định: Là loại promoter tham gia điều khiển biểu hiện gen ở tất cả
hoặc hầu hết nhƣ tất cả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu nhƣ mọi giai
đoạn phát triển của sinh vật.
- Promoter đặc hiệu: Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gen
giới hạn ở một hoặc một vài mô (hạn chế về không gian – spatial limitation) và hoặc
ở một hoặc vài giai đoạn phát triển (đặc hiệu thời gian – temporal limitation).
+ Promoter cảm ứng: Trong điều kiện stress (hạn, nhiệt độ cực đoan, oxy hóa
cao…), các gen chống chịu thƣờng biểu hiện với tốc độ nhanh. Vì vậy vấn đề khởi
động sự phiên mã cũng nhƣ cấu trúc promoter của chúng và các promoter tham gia
vào việc điều khiển biểu hiện gen đƣợc đặc biệt quan tâm.
+ promoter đặc hiệu ở mô
Promoter chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô đặc hiệu, ví dụ promoter
đặc hiệu bó mạch ở thực vật điều khiển biểu hiện gen ở bó mạch. Promoter này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
chứa các trình tự đặc trƣng của một promoter nhƣ hộp TATA, hộp CCAAT và các
trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc hiệu ở bó mạch nhƣ hộp ASL,
hộp GATA [74]. Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển biểu hiện gen
mã hóa sucrose synthase đặc hiệu ở bó mạch. Sucrose synthase là một trong những
enzyme quan trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào. Chúng xúc tác cho
phản ứng thuận nghịch: Sucrose + UDP = Fructose + UDP – glucose. Nhờ quá trình
chuyển hóa này, cơ chất UDP – glucose đƣợc cung cấp cho quá trình tổng hợp tinh
bột và thành tế bào. Ở lúa, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 3 gen cùng mã hóa cho
sucrose synthase
1.3.3.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật
Về cơ bản việc chuyển gen ngoại lai vào sinh vật nhận để tạo sinh vật biến
đổi gen cần phải tiến hành một số bƣớc bắt buộc, trong đó có bƣớc phân lập các gen

riêng lẻ kiểm soát các tính trạng cụ thể, các gen này đƣợc nhân lên và gắn một
promoter vào trƣớc các gen này nhằm đảm bảo chúng có thể hoạt động tốt trong các
sinh vật đích (nếu không có bƣớc ghép với promoter thì gen ngoại lai cần chuyển sẽ
không hoạt động). Promoter và gen cấu trúc đƣợc điều khiển biểu hiện đính kèm tạo
thành một kết cấu biểu hiện gen hay kết cấu gen (gene – expression cassette hay
gene construct ). Gen và promoter có thể đƣợc phân lập từ các nguồn sinh vật khác
nhau nhƣ từ thực vật, vi khuẩn và virus. Một số kết cấu gen biểu hiện đƣợc kết nối
với nhau thành chuỗi trong vector, một hoặc vài gen trong số đó sẽ là gen kháng
kháng sinh, giúp cho việc chọn lọc các tế bào tái tổ hợp. Sau đó, các kết cấu gen này
đƣợc chuyển vào trong sinh vật đích.
Tìm kiếm và phân lập các loại promoter trong tự nhiên dạng cơ định cũng
nhƣ đặc hiệu là một trong những hƣớng chính trong tạo giống cây trồng biến đổi
gen. Nhờ các promoter này, gen quan tâm có giá trị đƣợc biểu hiện ở những loại mô
nhất định, ở những giai đoạn phát triển nhất định của cây, dƣới sự tác động của từng
loại môi trƣờng hoặc chỉ biểu hiện ở nơi tế bào, mô bị tổn thƣơng. Chẳng hạn,
ngƣời ta thƣờng sử dụng Ubiquitin promoter của ngô hoặc Actin promoter của lúa
để điều khiển biểu hiện gen ở cây một lá mầm, promoter của gen mã hóa sucrose

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
sythase để điều khiển gen đặc hiệu ở bó mạch. Để diệt bọ cánh cứng Colorado
(Leptinotarsa decemlineata) hại khoai tây, promoter đặc hiệu lá đã đƣợc sử dụng
thay thế cho promoter đặc hiệu ở củ. Trong công nghệ gen thực vật, hiện nay, rất
nhiều loại promoter đƣợc sử dụng để điều khiển biểu hiện các gen có giá trị trong
cây trồng. Các nghiên cứu chuyển gen thực vật thƣờng sử dụng CaMV19S
promoter [68], Ubiquitin của ngô [61]. Hiện nay promoter của gen mã hóa sucrose
synthase đƣợc phân lập và ứng dụng rộng rãi.
1.3.4. Những nghiên cứu Sus1 promoter
Ở cây một lá mầm, sucrose đƣợc mã hóa ít nhất bởi hai gen: có thể là SH1

hoặc Sus1 [44], [51], [74]. Ví dụ, ở lúa mạch có 2 gen sucrose synthase [22], lúa mì
có 2 gen [23], tulip có 2 gen [13], lúa gạo xuất hiện 3 gen [69], [72]. Ngô xuất hiện
3 gen sucrose synthase [22], [33], [36], [42], [51], [62], [73]. Trong số đó, SH1 và
Sus1 đƣợc nghiên cứu nhiều. Cả hai gen này đều nằm trên nhiễm sắc thể số 9 [49],
[51], [52], [53], [71], [75]. Khi so sánh trình tự gen DNA giữa SH1 và Sus1 đã thấy
rằng hai gen có hơn 70% trình tự nucleotide giống nhau [51]. Họ cũng tìm thấy các
intron cuối cùng của SH1 (intron 15, không có mặt trong Sus1) Còn lại vị trí của
intron 14 giống hệt nhau ở cả hai gen. Dựa trên các bằng chứng này và trình tự giống,
khác nhau trong 125 bp của intron15 và trong phần của exon 16, các nhà khoa học đề
xuất hai gen phát sinh thông qua đột biến độc lập [50], [65]. Gen Sus1 và SH1 mã
hóa các protein Sus1 (92,9 Kda) và SH1 (91,7Kda) mã hóa protein tƣơng ứng là SH1.
Hai loại protein giống nhau tới 79% chuỗi amino acid [63], [64], [69].
Tuy nhiên, đến nay các nhà khoa học đã chứng minh rằng SH1 có mặt trong
các mô ở ngô nhƣ: rễ, chồi và đƣợc biểu hiện rất mạnh [23], [51]. Ngƣợc lại Sus1
đƣợc biểu hiện phloem [23], [35], [54]. Sus3 đƣợc biểu hiện trong rễ, lá cây và mầm
hạt [22]. Nolte và đồng tác giả chứng minh sucrose synthase có mặt tất cả ở các tế
bào của vỏ cây, tế bào gân. Nhƣng trong ngô và cam quýt, những tế bào này trực
tiếp tham gia vào cấu tạo mô vỏ cây, mô gân. Sau khi nghiên cứu biểu hiện của
sucrose synthase ở Arabidopsis, tác giả kết luận rằng enzyme này hoạt động trong
quá trình trao đổi chất sucrose trong vỏ cây [58]. Tuy nhiên, Heinlein và đồng tác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
giả cho rằng không thể phát hiện sucrose synthase trong lá ngô nhập khẩu [25],
[35]. Mặc dù điều này mâu thuẫn với các công bố của nhiều tác giả khác. Các tác
giả khác cho rằng sucrose synthase có thể đƣợc biểu hiện mạnh trong mô vỏ cây,
trong bó mạch và mức độ ngày càng tăng trong lớp biểu bì ngoài cùng. Ngoài ra,
sucrose synthase cũng đƣợc xác định trong nhu mô xylem và trong một số vỏ tế
bào. Sau đó thí nghiệm xác định hàm lƣợng sucrose synthase trong nhân hạt ngô

đang phát triển đƣợc thực hiện bởi Heinlein và đồng tác giả [35]. Khi hạt trƣởng
thành, hoạt động trong nội nhũ cho thấy có sự thay đổi dần dần hàm lƣợng sucrose
synthase theo mức độ tăng dần [58].
Ngƣợc lại, hoạt động của sucrose synthase đo trong mô đƣợc Koch và đtg
cho rằng biểu hiện sucrose synthase trong các tế bào vỏ hạt cao hơn với các tế bào
lá mầm [33]. Những kết quả này trùng hợp với quan sát trƣớc đây [58]. Khi xác
định cấu tạo của các gen sucrose synthase (Sus3 và Sus4) ở khoai tây. Các gen Sus3
đƣợc biểu hiện cao nhất trong thân và rễ. Trong khi Sus4 biểu hiện và đƣợc giữ
trong các mô mạch của củ. Do đó, Sus3 đƣợc xem nhƣ là mạch máu của cây. Cho
đến nay, hai gen sucrose synthase cũng đã đƣợc phân lập ở mía [43]. Hai dạng
sucrose synthase đƣợc xác định trong rễ, lá, lóng ở ngô cho kết quả tƣơng tự.
Sucrose synthase có nhiều trong lóng với mức độ biểu hiện khác nhau đáng kể
trong các phần của lóng và ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây [33].
Trong lá non, sucrose synthase có xu hƣớng hoạt động mạnh trong khi đó ở
lá trƣởng thành sucrose synthase không hoạt động [23], [41]. Ở một số cây biểu
hiện của sucrose synthase là hằng số phát triển trong lá [44]. Biểu hiện synthase
sucrose đƣợc thay đổi ở các mô và tế bào [41], [42], [43].
SH1 và Sus1 phản ứng khác nhau trong điều kiện dinh dƣỡng khác nhau
đƣợc biểu hiện rõ ở ngô, mRNA SH1 đƣợc biểu hiện tối đa ở lƣợng đƣờng thấp
0,2% glucse. Trong khi đó, Sus1 biểu hiện cao nhất ở nồng độ đƣờng glucse 2%.
Các loại đƣờng metabolizable khác có tác dụng tƣơng tự trên quy định biểu hiện
của scrose synthase [41].