báo cáo thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TPHCM
KHOA MT & CNSH


BÁO CÁO THỰC HÀNH
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LUỢNG
THỰC PHẨM
Giáo Viên Hướng dẫn:

Ths. Phạm Minh Nhựt

Nhóm thực hiện:
Tên

MSSV

Lớp

1. Nguyễn Thị Như Yến

0851110308

08DSH4

2. Nguyễn Thị ThanhTrang

0851110262

08DSH4

3. Nguyễn Thanh Tòan

0851110254

08DSH4

4. Cao Tuấn Vũ

0851110303

08DSH4


Tháng 5/ 2011

BÀI SỐ 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT
HIẾU KHÍ ( TPC)
1.1

Định nghĩa
 Vi sinh vật hiếu khí là những VSV tăng truởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiện diện trong
mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

1.2. Nguyên tắc
 Tổng số VSV hiếu khí đuợc đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí
ở 300C/72h ± 6h hoặc 370C/ 48h ± 6h.
1.3. Môi truờng sử dụng

Môi truờng pha lõang mẫu: Saline Pepton Water (SPW) hoặc Buffer


Pepton Water (BPW)
Môi truờng nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA)

1.4. Dụng 25g mẫu + 225ml BPW đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng
cụ
10-1
 Đĩa petri
 Ống nghiệm
 Tủ ấm 300C.
-2
-3
-4
Pha loãng trong nước
1.5. Quy trình phân tích mẫu muối sinh lý
độ pha loãng 10 ,10 ,10

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vơ trùng. Sau đó
đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược đem ủ ở nhiệt độ
300C trong 72h

Đọc kết quả các kết quả từ 25-250 khuẩn lạc

Tính tốn kết quả:
2
A=


1.6. Thuyết minh quy trình

1.6.1. Chuẩn bị mẫu
• Lấy mẫu:
 Tên mẫu: Thịt heo bằm
 Thời gian lấy mẫu: 6h sáng ngày 9/5/2011
 Địa điểm lấy mẫu: Chợ Bà Chiểu
 Nhận xét mẫu: mẫu thịt màu đỏ, băm nhuyễn, có nhiều mỡ trắng, mẫu để
trên bàn cao.
 Cân chính xác 25 g mẫu thịt heo, bằm nhỏ rồi cho vào bao PE vơ trùng, sau
đó thêm vào 225 ml BPW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng tay trong thời
gian 30 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vơ
trùng. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1..
 Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng
micropipette vô trùng chuyển 1 ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch
nước muối sinh lý


đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục

thực hiện tương tự để có được các độ pha lỗng cần thiết là 10-3, 10-4, 10-5.
1.6.2. Đỗ đĩa
 Chọn 3 độ pha loãng liên tiếp là 10-3,10-4,10-5. Dùng micropipette với các
đầu típ vơ trùng để chuyển 1 ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vơ trùng.
Tương ứng với mỗi độ pha lỗng cấy trên 2 đĩa. Sau khi cấy, đỗ vào mỗi đĩa
10-15 ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45- 500C. Trộn đều
mẫu vào môi trường bằng cách xoay trịn đĩa petri xi và ngược chiều kim
đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng nằm ngang cho thạch đông đặc.
1.6.3. Ủ
 Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủ ở 300C trong 72 giờ.
1.6.4. Đọc kết quả
 Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ, ta có kết quả như sau:
3

Độ pha lỗng
Đĩa 1
Đĩa 2

10-3
302
322

10-4
180
165

10-5
54
43

1.6.5. Tính tốn kết quả
 Ta tiến hành chọn các đĩa có từ 25-250 khuẩn lạc để tính tốn kết quả.
 Có 4 đĩa được chọn tính kết quả: hai đĩa ở độ pha lỗng 10 -4 và hai đĩa ở độ
pha loãng 10-5.
 Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1 g mẫu được tính như sau:

A (CFU/g) =
Trong đó:
A: số tế bào vi khuẩn ( khuẩn lạc ) trong 1 g mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
n : số lượng đĩa cấy tại các độ pha lỗng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mơi trường

f : độ pha lỗng tương ứng
Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu phân tích là:
A=

= 1.105x108 (cfu/g)

1.6.6. Kết luận
 Mật độ tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 25g mẫu thịt heo phát hiện được là
1.105x108 (cfu/g).
 Dựa vào chỉ tiêu đánh giá TPC cho phép trong thực phẩm tươi sống là 106, thì
thực phẩm phân tích trên có mật độ tổng vi sinh vật tương đối cao (1.105x108
cfu/g)

BÀI SỐ 2: ĐỊNH LUỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS
TRONG THỰC PHẨM
2.1 Định Nghiã Coliforms
 Coliforms là những trực khuẩn, gram âm, không sinh bào tử kỵ khí tuỳ nghi ,có
khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 c trong vào 24-48 h .Nhóm
coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên trong, ruột người và động vật
4


Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị :số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm ,nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả
năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.
2.2 Nguyên Tắc
 Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch
chọn lọc thích hợp chứa lactose . Sau khi ủ 370C± 10C trong 24-48 h ,đếm số
lượng khuẩn lac Coliforms điển hình .Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng
.Môi trường chọn lọc coliforms là môi trường chứa lactose ,đây là nguồn

cacbon duy nhất ,đồng thời môi trường còn chứa muối mật như tác nhân chọn
lọc và các tác nhân chỉ thị như neutral red, crystal violet.Khẳng định các dòng
khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.
2.3 Mơi Trường Sử Dụng
• Mơi trường Triptone Soya Agar (TSA)
• Violet Red Bile Agar (VRB)
• Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)
2.4 Dụng Cụ
• Đĩa petri
• Ớng nghiệm
• Ớng durnham
• Chai thuỷ tinh 250 ml
• Tủ ấm 370C
2.5 Quy Trình Phân Tích
25g mẫu + 225ml spm -> đồng nhất trong 30 giây -> độ pha loãng 10-1

Từ một độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng.Sau đó đổ môi
trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút.

5


Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA

Ủ nhiệt độ 370C trong 24h

Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm , có quầng tủa
muối mật, đường kính > 0.5 mm

Ở mỗi đĩa chọn 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL

Ủ 370C ± 0,5 trong 24h

Tỉ lệ xác nhận R :
R=( số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) : (số khuẩn lạc đã cấy)
R

Tổng số coliforms ( cfu/g)
A=( N : nVf )* R

2.6. Thuyết Minh Quy Trình
2.6.1. Chuẩn Bị Mẫu
 Sử dụng mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng
quá trình pha loãng mẫu sao cho 1ml dung dịch pha loãng mẫu < 100 khuẩn lạc.
2.6.2. Cấy Mẫu

6


 Cấy chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy
vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa
xuất hiện từ 10 -100 khuẩn lạc.
 Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm
nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri
xuông và ngược theo chiều kim đồng hồ .Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1-2
h để phục hồi khả năng của Coliforms .Đỗ thêm 10ml môi trường VRB. Chờ
môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 h.
2.6.3. Đọc Kết Quả
 Kết quả cho thấy không có khuẩn lạc đặc trưng của trực khuẩn Coliforms .
2.6.4. Khẳng Định

 Quy trình khẳng định được thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên
đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh
BGBL và ủ ở 370C trong vòng 24 h. Phản ứng (+) khi vi sinh vật sinh khí ở ống
Durnham .Tỉ lệ xác nhận là tỉ số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc
khẳng định.
2.6.5. Tính Toán Kết Quả
 Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ xác định tính mật độ của Coliforms
theo công thức:
Trong đó:
A (CFU/g hay CFU/ml) = ( N : (n1vf1 +…+ nivfi )) * R
N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi chỗ pha loãng
v : thể tích cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỉ lệ xác nhận
Số ống BGBL (+)
R= số ống (+) : số ống thử nghiệm
Tổng số BGBL thử nghiệm
2.7. Kết Luận Và Nhận Xét
 Trong mẫu đã thử nghiệm không có sự hiện diện của trực khuẩn Coliforms .
7


BÀI SỐ 3 : ĐỊNH TÍNH E.COLI
3.1. Định nghĩa :
 Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử kỵ khí tùy nghi có
khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37°C trong 24-48giờ
 Coliforms chịu nhiệt là coliforms có khả năng lên men lactose , sinh acid và
sinh hơi ở nhiệt độ 44°C trong 24-48 giờ
 Coliforms phân ( faecal Coliform) là coliform nhiệt có thử nghiệm Indol trong

mơi trường trypton dương tính
 E.Coli là coliform phân có nghiệm pháp IMVic lần lượt là (+), (+), (-), (-)
3.2. Nguyên tắc :
 Phương pháp này dung để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định
 Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh ( BGBL) , kiểm tra trên môi trường phân lập
(EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp ( nghiệm pháp
IMViC)
3.3. Môi trường sử dụng :


Môi trường TSA



Canh BGBL



Môi trường EMB



Canh Trypton



Canh MR-VP



Thạch Simmon Citrate



Thuốc thử Kovac’s



Thuốc thử Methyl Red



Thuốc thử α- naphtol 5%



KOH 40%

3.4.Dụng cụ :


Đĩa Petri
8




Ống nghiệm , ống Durnham



Bể điều nhiệt 44°C



Tủ ấm 37°C

3.5.Quy trình phân tích :
25 g mẫu + 225ml SPW , đồng nhất mẫu trong 30giây
 độ pha loãng 10-1

Lấy 1ml mẫu ở độ pha lỗng 10-1 mơi trường BGBL

Ủ ở 44°C ± 0,5 trong 24 giờ

Các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB
Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E.Coli

Ủ ở 37°C ± 0,5 trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên EMB : tròn , dẹt đường kính < 0,5 mm ,
có ánh kim tím

Cấy chuyển sang TSA  Ủ ở 37°C ± 0,5 trong 24giờ

Cấy vào môi trường 1Trypton , 2 MR-VP , 1 Simmons Citrate

9

Ủ ở 37°C ± 0,5 trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC

Kết luận : phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 25g mẫu

3.6. Thuyết minh quy trình :
3.6.1. Chuẩn bị mẫu :
• Lấy mẫu:
 Tên mẫu: thịt bằm
 Địa điểm mua: Chợ Bà Chiểu
 Thời gian lấy mẫu: 6h sáng ngày 9/5/2011
 Nhận xét về mẫu: màu đỏ, có nhiều mỡ trắng, mẫu để ở trên bàn cao.
 Cân chính xác 25g mẫu thịt bằm cho vao bao PE vô trùng , sau đó thêm vào
225ml dung dịch pha lỗng mẫu . Tiến hành đồng nhất mẫu không quá
2,5phút Tất cả các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng .
Khi đó , ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1.
 Tiếp tục chuẩn bị như bài 1.
3.6.2. Tăng sinh :
 Cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml
canh BGBL, ủ 44°C trong 24giờ.
3.6.3. Phân lập :
 Sau 24 giờ , chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính ( mơi trường
đục và có sinh hơi ) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB . Ủ ở
37°C trong 24 giờ
 Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli : khuẩn lạc trịn , màu tím , có bờ đều , đường
kính 0,5mm có ánh kim tím.
10

Hình 3.1. Khuẩn lạc trên mơi truờng EMB
3.6.4.Khẳng định :
 Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh
hóa ( thực hiện nghiệm pháp IMViC )
 Chọn ít nhất 2 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang
môi trường rắn không chọn lọc (TSA) , ủ ở 37°C trong 24 giờ.
 Các thử nghiệm sinh hóa được dùng để khẳng định E.Coli như sau :
1.Thử nghiệm Indole
2. Thử nghiệm Methyl Red
3. Thử nghiệm Voges- Proskauer
4. Thử nghiệm Citrate

STT

Thử nghiệm sinh hóa

Kết luận

1

Indol

+

2

Methyl Red

+

3

Voges Proskauer

-

4

Khả năng sử dụng citrate

-

3.6.5.Báo cáo kết quả :
3.6.5.1. Quan sát khuẩn lạc trên đĩa Petri ở môi trường EMB
 Ta thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc tròn, dẹt, có tâm đen, có ánh kim tím
=> Có khả năng khuẩn lạc trên là E.coli.
11


3.6.5.2.Thử nghiệm sinh hóa
a. Thử nghiệm Indole :
 Cấy khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào môi trường Trypton.
 Sau đó cho thuốc thử Kovac’s vào ống Trypton
=> xuất hiện vịng trịn màu đỏ => dương tính ( + )
b. Thử nghiệm Methyl Red :
 Cấy khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào mơi trường MR-VP
 Sau đó cho thuốc thử Methyl red vào ống nghiệm chứa môi trường MR
=> xuất hiện vòng tròn màu đỏ => dương tính ( + )
c. Thử nghiệm Voges Proskauer :

 Cấy khuần lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào môi trường MR-VP
 Cho vào ống nghiệm dung dịch KOH 40%
 Rồi cho thêm α- naphtol lắc đều rồi chờ khoảng 10phút
=> mơi trường khơng đổi màu => âm tính (- )
d. Thử nghiệm Citrate :
 Cấy khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào mơi trường Citrate
 Sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ rồi quan sát
=> mơi trường có màu xanh dương => dương tính (+)
Kết quả thực hiện nghiệm pháp IMViC :

STT

Thử nghiệm sinh hóa

Kết quả

1

Indole

+

2

Methyl Red

+

3

Voges Proskauer

-

4

Khả năng sử dụng Citrate

+

12


 Kết luận : Trong 25g mẫu thịt bằm có sự hiện diện của vi khuẩn Coliform chịu
nhiệt nhưng không có sự hiện diện của vi khuẩn E.Coli

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
4.1. Nguyên tắc
 Cấy trang là một luợng mẫu xác định trên bề mặt môi truờng thạch chọn lọc.
Sau khi ủ và đếm những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng và không đặc
trưng của 25g mẫu + 225ml SPW khuẩn nhấtđã đếm30 giây độ pha loãng 10-1
S.aureus. Xác nhận các đồng lạc trong bằng phản ứng coagulase
và các đặc trưng khác. Kết quả đuợc xác định bằng số khuẩn lạc đã đếm, thể
tích cấy, nồng 1ml mẫu ở độvà hệlỗng 10-1 cho vào đĩa mơi trường BP có bổ
Lấy độ pha lõang pha số xác nhận.
sung egg yolk cấy trang
4.2. Môi truờng sử dụng
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48h



Môi truờng BP



Môi truờng TSA



Huyết tuơng thỏ
Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên BP: trịn, lồi, có tâm đen và
có quầng sáng bao quanh

4.3. Quy trình phân tích mẫu
Chọn 4 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyền trên môi trường TSA

Cấy chuyền vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ

Ủ ở 370C và theo dõi sau 24 giờ. Xác định tỷ lệ ngưng kết R

Tổng số S.aureus (cfu/g)

13

S=


4.4. Thuyết minh quy trình
4.4.1 Chuẩn bị mẫu

• Lấy mẫu:
 Tên mẫu: thịt bằm
 Địa điểm mua: Chợ Bà Chiểu
 Thời gian lấy mẫu: 6h sáng ngày 9/5/2011
 Nhận xét về mẫu: màu đỏ, có nhiều mỡ trắng, mẫu để ở trên bàn cao.
o Dùng kéo cắt và cân chính xác 25 g mẫu thịt heo cho vào bao PE vơ trùng,
sau đó thêm vào 225 ml dung dịch pha loãng mẫu BPW. Thao tác trên ta
thực hiện trong tủ cấy. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng tay. Thời gian đồng
nhất mẫu khoảng 30 giây. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10 -1.
4.4.2 Cấy mẫu
o Dùng micropipette chuyển 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng vào môi trường BP.
Dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô. Thực hiện lặp
lại 3 đĩa BP ở mỗi nồng độ pha loãng, ủ ở 370C trong 48 giờ đối với môi
trường BP
4.4.3. Đọc kết quả
14


o Sau 48 giờ, trên môi trường Baird Parker khuẩn lạc S. aureus có đường kính
khoảng 0,5-1mm, lồi, đen bóng, có vịng sáng rộng khoảng 1-2mm bao
quanh. Một số khuẩn lạc có tâm đen q lớn bít kín khuẩn lạc
o Có tâm đen là do mơi trường BP có gốc S mà S.A có enzyme
desunfuehydrase có khả năng phân giải S, tác dung với Fe trong môi trường
tạo nên FeS có màu đen
o Quầng sáng có trong mẫu là do BP có bổ sung egg yolk tellurite mà egg
yolk có lecithin, vi khuẩn có lecithin nase sẽ phân giải lecithin tạo ra quầng
sáng
=> Kết quả: Khuẩn lạc thu đuợc tròn, lồi, có tâm đen nhưng khơng có quầng sáng
xung quanh.

Hình 4.1. Khuẩn lạc trên môi truờng BP
4.4.4. Khẳng định
Trên môi truờng BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng
từ môi truờng BP cấy vào môi truờng TSA. Ủ ở 370C trong 24h. Cấy sinh khối vi sinh
vật vào ống nghiệm chứa môi truờng huyết tuơng thỏ. Ủ ở 370C. Theo dõi phản ứng
đông tụ huyết tuơng trong 2,4,6,8,24 h. Tính tỷ lệ khẳng định trên các khuẩn lạc đặc
trưng.
=> Kết quả: khơng có sự đông tụ huyết tuơng trong môi truờng TSA  Không có
sự hiện diện vi khuẩn Staphylocosccus aureus.

15


Hình 4.2. Thử nghiệm đơng tụ huyết tuơng trên mơi truờng TSA
4.5. Kết luận :
 Trong mẫu thịt heo phân tích khơng có Staphylococcus aureus

BÀI SỐ 5: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA
5.1. Ngun tắc
 Phát hiện có hay khơng có Salmonella trong khối luợng mẫu xác định. Quy
trình phát hiện Samonella trong thực phẩm đuợc thực hiện qua 4 buớc:
o Tiền tăng sinh
o Tăng sinh chọn lọc
o Phân lập
o Khẳng định
5.2. Môi truờng sử dụng


Môi truờng canh RV



Môi truờng XLD



Môi truờng TSI



Môi truờng Mannitol Phenol Red broth



Môi truờng Urea broth



Môi truờng LDC

5.3. Quy trình thực hiện
16


25g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây 
độ pha lõang 10-1

Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h

Lấy 0,1ml canh truờng cho vào 10ml môi truờng RV

Ủ ở 420C ± 0,5 trong 24h

Cấy chuyền trên môi truờng XLD và ủ ở nhiệt độ 370C, 24h

KL đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen
đơi khi tâm đen q lớn bao trùm của KL, môi truờng quanh chuyển sang
màu đỏ

Cấy chuyển sang môi truờng TSA

Ủ ở 370C trong 24h

Cấy chuyển vào môi truờng thử nghiệm sinh hóa: mơi truờng
TSI, Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC broth

Ủ ở 370C trong 24h

Biểu hiện đặc trưng của Samonella: Trên TSI: đỏ/vàng/H2S (+)/gas (+);
Mannitol (+); Urea (-); LDC (+)

Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Samonella trong 25g mẫu
17


5.4. Thuyết minh quy trình
5.4.1. Tiền tăng sinh
Tiền tăng sinh các loại mẫu thơng thuờng:
• Lấy mẫu:
 Tên mẫu: thịt bằm
 Địa điểm mua: Chợ Bà Chiểu

 Thời gian lấy mẫu: 6h sáng ngày 9/5/2011
 Nhận xét về mẫu: màu đỏ, có nhiều mỡ trắng, mẫu để ở trên bàn cao.
 Cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng. Thêm 225ml dung dịch pepton đệm và
đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu trong 30 giây. Ủ 370C trong 24h.
5.4.2. Tăng sinh chọn lọc
 Trộn môi truờng sau khi đã ủ 24h truớc khi cấy chuyển 0,1ml sang môi
truờng tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian
24h.
5.4.3. Phân lập
 Dùng que cấy vịng lấy một vịng sinh khối VSV từ mơi truờng tăng sinh
chọn lọc RV cấy ria lên môi truờng chọn lọc cho Samonella như:
XLD,BPLS, BSA, HE… Cuờng độ chọn lọc mức độ đặc trưng và hình thái
biểu hiện của khuẩn lạc Samonella trên từng mơi truờng khác nhau.
 Trong thí nghiệm này sử dụng môi truờng XLD.
+ Môi truờng XLD: khuẩn lạc Samonella trịn, lồi,có tâm đen, mơi trường xung quanh
có màu hồng, có tâm đen. Một số dịng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn
lạc. Môi truờng XLD chuyển sang màu hồng.
=> Kết quả quan sát khuẩn lạc trên mơi trường XLD: Khuẩn lạc trịn, lồi, khơng
có tâm đen, mơi trường xung quanh có màu hồng.
 Tất cả các đĩa môi truờng sau khi cấy đuợc ủ ở nhiệt độ 370C/24h. Sau khi ủ,
chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để khẳng định bằng các thử
nghiệm sinh hóa và thử nghiệm các đặc tính kháng nguyên.
5.4.4. Khẳng định

18


 Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải đuợc kiểm tra sinh hóa và kháng
huyết thanh. Từ mỗi mơi truờng phân lập, cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc
nghi ngờ sang môi truờng không chọn lọc (môi truờng TSA), ủ ở 370C trong

24h, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi truờng này đuợc sử dụng để thử
nghiệm sinh hóa.
• Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa.
 Các thử nghiệm sinh hóa chính đuợc sử dụng cho Samonella là lên men
glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, Indol, VP, ODC, LDC, Mannitol. Các
chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau:
STT
1

Thử nghiệm sinh hóa
Thử nghiệm trên mơi truờng TSI

Kết quả
- Nghiêng đỏ,sâu vàng => chỉ sử dụng
nguồn đuờng glucose.

2
3
4

Thử nghiệm LDC
Thử nghiệm Urea
Thử nghiệm lên men Mannitol

- Có sinh H2S, có sinh hơi.
(+)
(-)
(+)

5.4.5. Báo cáo kết quả

a. Thử nghiệm trên môi truờng TSI:
o

Nghiêng vàng, sâu vàng => sử dụng 2 nguồn đường là glucose và lactose.

o

Mơi trường dưới phần đáy ống nghiệm có màu đen => có sinh H2S.

o Có làm nứt thạch => có sinh hơi
b. Thử nghiệm LDC (+):
o Sau khi ni cấy, mơi trường chuyển thành màu tím.
c. Thử nghiệm Urea (-):
o Sau khi nuôi cấy, không tạo ra sản phẩm kiềm =>không làm thay đổi màu
chất chỉ thị => có màu vàng.
d. Mannitol (+):
o Sau khi ni cấy,tạo ra sản phẩm acid => làm thay đổi màu chất chỉ thị =>
màu vàng.

19


Hình 5.1. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Samonalle (từ trái qua): thử nghiệm
TSI, thử nghiệm LDC (+), thử nghiệm Urea (-), thử nghiệm Mannitol (+)
Kết quả thử nghiệm
STT
1

Thử nghiệm sinh hóa
Thử nghiệm trên mơi truờng TSI

Kết quả
- Nghiêng vàng, sâu vàng =>sử dụng 2
nguồn đuờng là glucose và lactose.

2
3
4

Thử nghiệm LDC
Thử nghiệm Urea
Thử nghiệm lên men Mannitol

- Có sinh H2S, có sinh hơi.
(+)
(-)
(+)

=> Kết luận: Khơng có Samonella trong 25g mẫu thịt bằm trên.

BÀI SỐ 6: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH
PHẨM MÀU ĐỘC VÀ KHÔNG ĐỘC
6.1. Nguyên Lý
 Phẩm màu kiềm tính (chromobase ) dẫn xuất từ than đá có tính chất độc hại không
được phép sử dụng trong thực phẩm .Phẩm màu acid dẫn xuất từ than đá được
phép sử dụng.
 Phẩm màu dẫn xuất than đá có tính kiềm tan được trong nước hay trong cồn.
 Dung dịch phẩm màu này nếu cho tác dụng với 1 chất kiềm mạnh (NH3) sẽ làm
giải phóng chất màu của kiềm phẩm.
 Có 2 loại phẩm màu kiềm tính.

20


o

Chromobase : sản phẩm chiết có màu sẽ hoà tan được trong ether và nhuộm
màu ether.

o

Leucobase : sản phẩm chiết không màu hoà tan được trong ether và không
nhuộm màu ether.

 Dung dich ether có chứa chất màu kiềm tính nếu cho tác dụng với acid loãng
(acid acetitc) chất màu ban đầu lại chuyển sang dung dịch acid và nhuộm màu
dung dịch acid (cả laucobase và chromobase ).
6.2. Hoá Chất Và Dụng Cụ
a) Hoá Chất

Acid Acetitc 5 %



Ether Ethylic
Dung dịch hỗn hợp:cồn 75 + NH4OH đặc(1 : 1) hoặc nước cất +
NH4OH đặc (1:1)

b) Dụng Cụ


Ống nghiệm có nắp: 3 cái


Đũa thuỷ tinh có đầu bẹt

6.3 Tiến Hành


Chuẩn bị mẫu: kẹo Sugus.



Đánh số thứ tự 3 ống nghiệm: 1,2,3



Cho vào ống 1: 5 ml dung dịch hỗn hợp cồn 75 + NH4OH đặc (1:1)



Ống thứ 2: 5ml ether ethylic



Ống thứ 3: 5ml acid acetitc 5 %



Cân 3g mẫu (kẹo) cắt hoặc nghiền nhỏ mẫu cho vào ống 1. Đậy nút
lắc kĩ để yên



Gạn nước ống 1 vào ống 2. Lắc nhẹ ,đậy nút, để yên phân lớp



Gạn lớp ether ở trên (ống 2) sang 3.lắc đều , để yên và quan sát

6.4 Kết Quả
 Dung dich acid acetitc dưới không màu: phẩm màu acid được cho phép dùng.

BÀI SỐ 7: KIỂM NGHIỆM THỊT TƯƠI
21


7.1 Yêu cầu kiểm nghiệm
 Dựa trên trạng thái bên ngồi của thịt, gan, tủy…muốn biết đuợc thịt tuơi hay
khơng cần xác định trạng thái cảm quan
 Dựa trên tính chất thịt tuơi bao giờ cũng hơi acid, cần acid, cần xác định pH của
thịt và của nuớc thịt.
 Dựa trên thành phần dinh duỡng chính của thịt là protid. Nếu lên men thối sẽ cho
ra NH3 và H2S, cần định tính và định luợng những chất này.
7.2. Phương pháp kiểm nghiệm:


Xác định trạng thái cảm quan : xác định trạng thái bên ngoài vết cắt , độ rắn



và độ đàn hồi , nước canh đun sôi để lắng..
Phản ứng giấy quỳ : dùng dao không rỉ cắt một vết trong miếng thịt ,cho vào

vết cắt hai miếng giấy quỳ , 1 xanh, 1 đỏ cặp lại vết cắt trong 20 phút

Mở vết cắt ra đọc kết quả: nếu cả 2 miếng đều đỏ thịt có phản ứng acid, nếu
cả 2 miếng đều xanh thịt có phản ứng kiềm , nếu 2 miếng giữ nguyên màu thịt
có phản ứng trung tính

pH của nước thịt : thịt đã loại bỏ các liên kết, mỡ

Định tính NH3: nếu trong thịt có NH3 tự do , ở môi trường HCl , NH3 sẽ kết
hợp với HCl tạo thành NH4Cl hình thành 1lớp sương mù trắng xung quanh
miếng thịt
7.2 Dụng cụ, hóa chất
 Đo pH của mẫu:

Cốc thủy tinh

 Định tính NH3:

Bình tam giác có nắp đậy
Thuốc thử Eber (1HCl : 3 cồn : 1ether)

 Định tính H2S:

Bình tam giác có nắp đậy
Dung dịch H3PO4 5%
Giấy lọc tẩm chì acetate

7.3 Mẫu
 Tên mẫu: thịt bò
 Địa chỉ lấy mẫu: hẻm 21, đường kha vạn cân, phường hiệp bình chánh, quận
thủ đức
 Khối lượng mẫu: 200g
22


 Thời gian lấy mẫu: 6 h ngày 4/5/2011
7.4 Tiến hành
 Đo pH:
- Cân 10g mẫu thịt bò, băm nhỏ, ngâm với 100ml nước cất đun sôi để nguội
- Ngâm trong 10 phút, lắc đều ,lọc qua giấy lọc ,xác định p H
 Định tính NH3:
- Cho vào bình tam giác 10ml dung dịch thuốc thử Eber.
- Cắt mẫu thịt khoảng 5g, dùng dây treo trong bình tam giác, cách dung dịch thuốc
thử khoảng 1,5cm, đậy nắp bình.
 Định tính H2S:
- Cân 20g mẫu thịt bò, bằm nhỏ, cho vào bình tam giác có nắp đậy.
Thêm vài giọt H3PO4 vào mẫu thịt.
- Treo miếng giấy lọc tẩm chì acetate trong bình mẫu, khơng chạm mẫu, đậy nắp
bình và để n trong 30 phút.
7.5 Kết quả
 Đo pH: pH mẫu xác định bằng phương pháp so màu khoảng 6
 Định tính NH3: Quan sát bằng mắt thường thấy miếng thịt bình thường , khơng
có xuất hiện lớp khói xung quanh miếng thịt.
 Định tính H2S: Mẫu để sau 30 phút khơng thấy xuất hiện màu đen trên giấy lọc
tẩm chì acetate.
7.6 Kết luận
 Mẫu thịt bò chưa bị hư hỏng.

 pH mẫu nằm trong khoảng pH tiêu chuẩn cho thịt tươi (5.4-6.4)
 Định tính NH3: khơng quan sát thấy.
 Định tính H2S: trên giấy lọc không xuất hiện màu đen , chứng tỏ không sinh
ra H2S

BÀI SỐ 8: PHUƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH
NITRIT
23


8.1. Nguyên lý
 Do yêu cầu chỉ xác định (phát hiện) định tính Nitrit có trong sản phẩm là có hay
khơng nên có thể áp dụng phuơng pháp khử Nitrit trong nuớc uống theo Codex
Medicamentarius Gallicus. Phuơng pháp này giống hệt phuơng pháp xác định
Nitrit trong TCVN- 2658- 1978, cũng dùng thuốc thử Griess nhưng bỏ qua giai
đọan so màu bằng thang màu chỉ cần quan sát sự xuất hiện màu hồng có hay
khơng sau khi cho thuốc thử vào sản phẩm, với mục đích chỉ để phát hiện định
tính sự có mặt của Nitrit mà thơi.
 Ngun lý
của phuơng pháp: ở pH=2 đến pH=2,5 Nitrit sẽ diazơ hóa acid
Sulfanilic và sau đó kết hợp với Anpha Naphthylamin cho hợp chất
Naphthylamino Azobenzen Sulfonic có màu đỏ khơng bền ( bền ở 150C , không
bền ở nhiệt độ cao )
o Phản ứng rất nhạy với màu đỏ ngay tức thời ở nồng độ 1 10-5 và sau 5
phút ở nồng độ 1 10-8. Nếu khơng có Nitrit phản ừng khơng có màu
đỏ.
HNO2 + HSO3

NH2

HSO3

Acid sulfanilic
HSO3

N

N

NOH + H2O

Acid diazomium

NOH +

NH2

HNO3

α Naphthylamin

N

N

NH2

Naphthylamin Azobenzen Sulfonic

( Phức màu hồng)
 Trong khi đó tiêu chuẩn vệ sinh ban hành kèm theo Quyết định: 505/BYT-QĐ

thì đồ uống, nuớc uống, thực phẩm lỏng khơng đuợc có Nitrit nghĩa là bằng mắt
thuờng sau 10-15 phút khơng có phản ứng cho màu đỏ xảy ra.
8.2. Phạm vi áp dụng
 Nuớc ăn uống, đồ uống , nuớc giải khát không màu. Khả năng thể hiện phản
ứng tức thời ở nồng độ 1 10-5 và sau 5 phút ở nồng độ 1 10-8.

24


8.3. Dụng cụ- thuốc thử
8.3.1. Dụng cụ
 Ống nghiệm hay cốc thủy tinh 20ml 1 chiếc.
8.3.2. Thuốc thử
 Thuốc thử Griess A: Cân 0,5g acid Sulfanilic hòa vào 150ml axit acetic 30%.
Khuấy đều bảo quản trong lọ màu nút mài. Khi sử dụng rót vào lọ nhỏ giọt
bằng PE để tiện dùng và bảo quản.
 Thuốc thử Griess B: Cân 0,1g Anpha Naphthylamin hòa vào 20ml nuớc cất,
khuấy đều, để lắng gạn lấy phần nuớc trong không màu. Thêm vào dung dịch
này 150ml acid acetic 5%. Trộn đều và bảo quản trong lọ màu nút mài. Khi sử
dụng rót vào lọ nhỏ giọt bằng PE để tiện dùng và bảo quản.
8.4. Tiến hành thử nghiệm
 Lấy 5ml sản phẩm lỏng mẫu là nước ngọt 7UP lon cho vào ống nghiệm. Thêm
5 giọt thuốc Griess A (acid Sulfanilic). Thêm tiếp 5 giọt thuốc thử Griess B
(Anpha Naphthylamin). Lắc đều và quan sát so sành với một ống nghiệm mẫu
nuớc cất (không có Nitrit) được tiến hành song song trong những điều kiện như
nhau.
8.5. Đánh giá
 Nếu thấy xuất hiện màu đỏ sau 10-15 phút: Có mặt của Nitrit, vi phạm giới hạn
tối đa cho phép hiện hành quy định về Nitrit trong đồ uống, thực phẩm lỏng.
 Nếu không xuất hiện màu đỏ sau 10-15 phút: khơng có mặt của Nitrit, đảm bảo

giới hạn tối đa cho phép hiện hành quy định về Nitrit trong đồ uống, thực phẩm
lỏng.

 Chú ý: Nếu nuớc uống có Clo họat động sẽ làm màu đỏ thay đổi, trong truờng hợp
này phải cho thuốc thử Griess B (Anpha Naphthylamin) truớc, sau đó cho thuốc thử
Griess A vào sau.
8.6. Báo cáo kết quả:
 Mẫu nước cất khơng có màu.

25