Thiết kế vector chuyển gen GSHI nhằm nâng cao khả năng tích lũy asen trong thực vật

Số hóa bởi trung tâm học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN THU TRANG



THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GSH1 NHẰM NÂNG
CAO KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN TRONG THỰC VẬT





LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC





Thái Nguyên – 2013


Số hóa bởi trung tâm học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN THU TRANG



THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GSH1 NHẰM NÂNG
CAO KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN TRONG THỰC VẬT


Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 0201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN SƠN





Thái Nguyên – 2013
i

Số hóa bởi trung tâm học liệu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn, Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh
học , Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành khóa
luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà,
ThS. Bùi Phương Thảo, cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào
Thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều
kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian làm khoá luận.
Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo
sau đại học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn
bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và
góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận.
Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 10 năm 2013
Tác giả luận văn

Nguyễn Thu Trang


ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A.tumefaciens
As

BAP
Bp
DNA
dNTPs
EDTA
Gus
GSH
GSH1
IBA
kb
LB
MS
OD
PCR
RNase
Taq
Ti-plasmid
T-DNA
TP
Agrobacterium tumefaciens
Asen
6- benzenladenine
base pair (cặp bazơ)
Deoxyribonucleic Acid
Deoxy Nucleoside Triphosphate
Ethylene Diamine tetra- acetate Acid
Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase
Glutathione
Enzyme γ-glutamylcysteine synthetase
Indole-3-butyric acid

Kilo base
Môi trƣờng theo Luria và Bertani
Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
Optical density (mật độ quang học)
Polymerase Chain Reaction
ARN polimerase
Thermus aquaticus
Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u)
Transferred-DNA
Transit peptide




iii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
2.1
Trình tự mồi nhân bản gen GSH1………………………………
25
2.2
XbaI và SacI
26
2.3
Thành phần phản ứng ghép nối GSHI vào vector PBI121……
26
2.4

Thành phần phản ứng colony-PCR
28
2.5
Sol
29
2.6
Thành phần dung dịch tách chiết DNA………………………
32
2.7
Thành phần phản ứng PCR nhân gen GSHI…………………
33
3.1
Kết quả chuyển gen và chọn lọc in vitro trên cây thuốc lá K326
42
3.2
Kết quả phân tích dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp
PCR…………………

44
3.3
Kết quả đánh giá khả năng chống chịu As của các dòng thuốc
lá chuyển gen GSH1…………………………………………

44

Số hóa bởi trung tâm học liệu

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Mô hình hấp thụ các chất ở thực vật
8
1.2
Sơ đồ của sự hấp thụ As và sự trao đổi chất trong thực vật ……
12
1.3
Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật
21
2.1
Sơ đồ vector pBluesript II SK-GSH1……………………………
25
3.1
Kết quả xử lý vector pBluescript II SK-GSH1 bằng cặp enzyme
giới hạn XbaI và SacI …………………………………………….
36
3.2
Kết quả xử lý vector pBI121 bằng cặp enzyme giới hạn
36
3.3

Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch
37
3.4
E.coli
DH5α

38
3.5
Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi GSH1-
F1/GSH1-M1

39
3.6
Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI
và SacI

39
3.7
Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI
và SacI

40
3.8
Mảnh thuốc lá K326 trên môi trƣờng đồng nuôi cấy (A) và bắt
đầu cảm ứng tạo cụm chồi trên môi trƣờng GM +Km50 (B)

41
3.9
Sự phát triển của các mảnh lá trên môi trƣờng chọn lọc GM +
Km50 sau khoảng 3 tuần theo dõi

42
3.10
Cây con 2 tuần trên môi trƣờng ra rễ (A) và cây ra in vivo 1
tháng (B)………………………………………………………….

42
3.11
Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng thuốc lá …………….
43
3.12
Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá với cặp mồi
GSH1-F/GSH1-R…………………………………………………

43

Số hóa bởi trung tâm học liệu

v


MỤC LỤC


Lời cảm ơn
i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
ii
Danh mục các bảng
iii

Danh mục các hình
iv
Mục lục
v
MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Tình hình ô nhiễm As và các biện pháp xử lý
3
1.1.1.Tình hình ô nhiễm As
3
1.1.2. Tác hại của As đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời
5
1.1.3. Các phƣơng pháp xử lý truyền thống
6
1.1.4. Xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật (Phytoextraction)
7
1.1.4.1. Xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật “siêu tích tụ”
7
1.1.4.2. Thực vật biến đổi gen cho mục đích xử lý ô nhiễm kim loại nặng
10
1.2. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
14
1.2.1. Khái niệm về chuyển gen
14
1.2.2. Các phƣơng pháp chuyển gen thực vật
14
1.2.2.1. Các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp
14

1.2.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp
17
1.2.3. Các hệ thống vector dùng để chuyển gen
20
1.2.3.1. Hệ vector cùng xâm nhập (CXN)
20
1.2.3.2. Hệ vector nhị thể (Binary vector)
21

Số hóa bởi trung tâm học liệu

vi

1.3. Glutathione và gen GSH1
21

Số hóa bởi trung tâm học liệu

vi

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24
2.1. Vật liệu
24
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
24
2.1.2. Chủng vi khuẩn và các nguyên liệu DNA
24
2.1.3. Hóa chất
25

2.1.4. Thiết bị
25
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
25
2.2.1. Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen
25
2.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
30
2.2.3. Các phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen
32
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
35
3.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen
35
3.1.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GSH1
35
3.1.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp
pBI121/GSH1

39
3.2. Kết quả chuyển gen và chọn lọc in vitro giống thuốc lá K326
40
3.3. Kết quả phân tích cây chuyển gen
42
3.3.1 Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen bằng PCR
42
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu As của các dòng cây chuyển
gen

44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…
47
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………
48
PHỤ LỤC………………………………………………… ……………
54

Số hóa bởi trung tâm học liệu

1

MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Asen (As) là một trong những nguyên tố rất phổ biến trong thiên nhiên,
chiếm 1,1 – 4 % tổng số nguyên tử trong vỏ trái đất. As trong đất tồn tại ở pha
rắn chiếm tới 94% còn lại chỉ 6% tổng As tồn tại trong dung dịch đất, dễ dàng
di chuyển ra khỏi
. Nguồn phát thải
As trƣớc hết là từ các ngành công nghi
, chì (Pb), thủy ngân (Hg) và cadmium (Cd)
. Để xử lý
đất ô nhiễm As ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng pháp truyền thống nhƣ:
rửa đất; cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý; xử lý nhiệt; trao
đổi ion, ôxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm; đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi
đến những nơi chôn lấp thích hợp, Các phƣơng pháp này thƣờng rất tốn
kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích. Gần đây, nhờ
những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ kim loại
nặng của một số loài thực vật, ngƣời ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử
dụng thực vật để xử lý môi trƣờng nhƣ một công nghệ môi trƣờng đặc biệt.
Tuy nhiên các loài thực vật thƣờng đƣợc dùng lại có sinh khối thấp, vì vậy

yêu cầu đặt ra là phải tạo ra các giống có khả năng sinh trƣởng nhanh, sinh
khối lớn và có khả năng hấp thụ kim loại nặng. Cây trồng chuyển gen là giải
pháp cho vấn đề này.
Trong đề tài này chúng tôi lựa chọn gen GSH1 mã hóa enzyme γ-
glutamyl cysteine synthetase tham gia quá trình sinh tổng hợp glutathione
(GSH) - một trung gian giải độc quan trọng của kim loại nặng trong thực vật -
là gen mục tiêu. Khi để thực vật tiếp xúc với kim loại nặng quá nhiều sẽ tạo ra
các phản ứng oxy hóa (ROS) và tích lũy các ion kim loại (M
+
). GSH khử độc

Số hóa bởi trung tâm học liệu

2

ROS qua chu kỳ ascorbate-glutathione. Glutathione S-transferase xúc tác liên
hợp GSH với các ion kim loại và tích lũy chúng trong không bào [17], [41].
GSH cũng đƣợc sử dụng bởi phytochelatin synthase (PCS) trong sự tổng hợp
của phytochelatins (PCs). PCs tạo ra các phức với các ion kim loại trong tế
bào và vận chuyển đến không bào. Một số nghiên cứu gần đây trên thế giới
cũng đã cho thấy cây trồng khi đƣợc chuyển gen GSH1 có khả năng tăng
cƣờng tính chống chịu cũng nhƣ tích lũy As [27], [45] Xuất phát từ cơ sở
trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen GSH1 nhằm
nâng cao khả năng tích lũy Asen trong thực vật”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Thiết kế vector chuyển gen mang gen GSH1 mã hóa enzyme γ-
glutamylcysteine synthetase (γ-ECS) liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
GSH nhằm nâng cao khả năng tích lũy As trong thực vật.
- Tạo ra cây thuốc lá mang gen GSH1.
Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen GSH1.
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
- Chuyển gen GSH1 vào cây thuốc lá.
- Phân tích cây thuốc lá chuyển gen GSH1.










Số hóa bởi trung tâm học liệu

3

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ô nhiễm As và các biện pháp xử lý
1.1.1. Tình hình ô nhiễm As
As hay còn gọi là thạch tín, là một nguyên tố hóa học có số nguyên tử
là 33. As lần đầu tiên đƣợc Albertus Magnus (Đức) đề cập đến vào năm
1250. Khối lƣợng nguyên tử của nó bằng 74,92. As là một á kim gây độc khét
tiếng, hay tồn tại dƣới dạng hợp chất asenua và asenat. Trong đất As thƣờng
tồn tại ở dạng hấp thụ, hợp chất với Al, Fe, Ca và các hợp chất hữu cơ. Trên
94% As trong đất tồn tại ở pha rắn còn lại chỉ khoảng 6% tổng As tồn tại
trong dung dịch đất và ở dạng natriasenite dễ dàng di chuyển và ra khỏi đất.
Khi tồn tại ở dạng linh động, As đặc biệt nguy hiểm cho sinh vật và con ngƣời
Nhiễm độc As là một vấn đề toàn cầu và đang ảnh hƣởng đến nhiều

quốc gia nhƣ: Ấn Độ, Băng la đét, Trung Quốc, Mỹ, Ca na đa, Mê hi cô
Băng la đét đƣợc đánh giá là nơi có mức ô nhiễm cao trên thế giới với nguy
cơ gây tử vong hàng trăm nghìn ngƣời. Tại các nƣớc phát triển, As cũng
đƣợc tìm thấy trong đất, nƣớc và các hoạt động công nghiệp nhƣ khai khoáng.
Ô nhiễm As trong đất và nƣớc đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu nhiều trên thế
giới, trong đó có vụ ô nhiễm As trong nƣớc ngầm ở Băng la đét đƣợc coi là
vụ ngộ độc As lớn nhất trong lịch sử loài ngƣời [11]. Miền bắc Hoa Kỳ, bao
gồm các phần thuộc Michigan, Wisconsin, Minnesota và Dakota cũng có hàm
lƣợng As trong đất khá cao. Theo Peter Ravenscroft từ khoa Địa trƣờng Đại
học Cambridge khoảng 80 triệu ngƣời trên khắp thế giới tiêu thụ khoảng 10
tới 50 phần tỷ As trong nƣớc uống của họ. Phần lớn các hình thức tiếp xúc
của con ngƣời với As có hàm lƣợng cao chủ yếu thông qua việc sử dụng
nguồn nƣớc, ngoài ra là thông qua việc dùng thực phẩm và thuốc men mà vô
tình bị nhiễm bụi và đất. Ở nƣớc ta hiện nay nhiều khu vực đã trở thành nơi
tiếp nhận nƣớc thải đô thị và công nghiệp bao gồm nƣớc thải sinh hoạt, nƣớc
thải công nghiệp, đô thị và bệnh viện, các chất rò rỉ từ phƣơng tiện giao
thông, phân bón dùng trong nông nghiệp chƣa qua xử lý đã xả trực tiếp ra môi
trƣờng đất, các ao, hồ, sông gây ô nhiễm As nghiêm trọng [12].

Số hóa bởi trung tâm học liệu

4

Ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu và toàn diện về As
trong tự nhiên. Trƣớc đây, trong công tác lập bản đồ địa chất và tìm kiếm
khoáng sản thƣờng dùng phƣơng pháp phân tích quang phổ phát xạ với độ
nhạy rất thấp nên khó phát hiện As. Nồng độ khác nhau về hàm lƣợng As ở
mỗi vùng nghiên cứu, ngoài những điểm đặc trƣng riêng về điều kiện địa
chất, địa lý tự nhiên, đƣợc quyết định bởi tác động của các hoạt động kinh tế
dân sinh. Ở Việt Nam gắn với quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa là

trình trạng ô nhiễm môi trƣờng gia tăng, đặc biệt tại các trung tâm công
nghiệp, các khu vực khai thác mỏ và các thành phố lớn. Sự phát thải một
lƣợng lớn các kim loại nặng trong đó có As từ các khu công nghiệp tiềm ẩn
nguy cơ đe dọa đến sức khỏe của con ngƣời và hệ sinh thái xung quanh. Theo
kết quả phân tích môi trƣờng của Sở tài nguyên và môi trƣờng tỉnh Phú Thọ
cho thấy một số khu vực ở thành phố công nghiệp Việt Trì đã có hiện tƣợng ô
nhiễm As trong đất và trong nƣớc ngầm, đặc biệt là tại phƣờng Bạch Hạc -
vùng ô nhiễm As lớn nhất của thành phố Việt Trì[6].
Tình trạng ô nhiễm As cũng gia tăng nhanh chóng trong môi trƣờng.
Mức độ ô nhiễm As nghiêm trọng nhất vẫn là ở các thành phố lớn, các khu
dân cƣ, khu công nghiệp (KCN). Tại huyện Đông Anh, Hà Nội, hàm lƣợng
As, trong đất và nƣớc tại các khu vực trồng rau đều vƣợt tiêu chuẩn cho phép
(TCCP)
-
[4]. Tại thành phố Đà Nẵng, với 6 khu công nghiệp và
300 doanh nghiệp đang hoạt động, có tốc độ phát triển công nghiệp nhanh
nhƣng đi kèm với nó là dấu hiệu ô nhiễm môi trƣờng ngày một gia tăng [1].
Tại Thái Nguyên, kết quả phân tích mẫu đất cho thấy, mỏ than núi Hồng (xã
Yên Lãng) là điểm nóng về ô nhiễm As trong đấtvới hàm lƣợng từ 202-3.690
ppm, gấp 17-308 lần tiêu chuẩn Việt Nam về hàm lƣợng As trong đất. Mỏ
thiếc xã Hà Thƣợng (huyện Đại Từ) cũng bị ô nhiễm As nghiêm trọng, có nơi
hàm lƣợng As trong đất lên đến 15.146 ppm, gấp 1.262 lần quy định [9]. Có
thể nói rằng vấn đề ô nhiễm nói chung và ô nhiễm As trong đất nói riêng đã
và đang thách thức môi trƣờng Việt Nam. Ô nhiễm As trong đất ở Việt Nam
chƣa xảy ra trên diện rộng, tuy nhiên, đã có hiện tƣợng ô nhiễm cục bộ ở một

Số hóa bởi trung tâm học liệu

5

số khu vực đặt biệt là một số KCN và các làng nghề tái chế kim loại gây ảnh
hƣởng đến sức khỏe con ngƣời mà môi trƣờng xung quanh.
1.1.2. Tác hại của As đến môi trường và sức khỏe con người
Trong những năm gần đây, sự nhiễm độc As xuất hiện nhƣ một sự cố
môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đối với sức khỏe của dân cƣ thế giới.
Theo nhƣ các số liệu đã công bố, đã có khoảng 200.000 ngƣời ở Tây Bengal
(Ấn Độ) và hàng chục nghìn ngƣời ở Băng la đét bị nhiễm độc As. Ƣớc tính
hàng chục triệu ngƣời khác ở nhiều quốc gia trên thế giới đang sống trong
môi trƣờng có nguy cơ ô nhiễm As [15]. As là nguyên tố vi lƣợng tồn tại tự
nhiên trong môi trƣờng. As có thể thâm nhập vào môi trƣờng bằng nhiều con
đƣờng khác nhau, trong đó các hoạt động của con ngƣời đóng vai trò rất quan
trọng. Khi thâm nhập vào môi trƣờng chúng có thể gây ô nhiễm nguồn nƣớc,
ô nhiễm đất trồng. Điều đáng nói là nhiều kim loại nặng có khả năng tích tụ
trong đất, trong động thực vật và rất khó phân hủy hay đào thải. Điều đó có
thể ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời khi sử dụng nguồn thức ăn từ những
động, thực vật sinh trƣởng trong những vùng bị ô nhiễm.
As là một trong những chất có độc tính cao. Con ngƣời có thể bị phơi
nhiễm As qua hít thở không khí, hấp thu thức ăn và qua nƣớc uống. Một
lƣợng nhỏ As trong nƣớc có thể đe dọa đến sức khỏe con ngƣời bởi vì phần
lớn các hợp chất As trong nƣớc uống đều ở dạng vô cơ rất độc [10]. Hầu hết
sự nhiễm độc As đƣợc phát hiện sau quá trình phơi nhiễm As trong nƣớc
uống. Lý do chính cho tình trạng này là hầu hết các hợp chất As trong thức ăn
thƣờng ở dạng hữu cơ và ít độc hoặc không độc. Trong nhiều trƣờng hợp, sự
phơi nhiễm As từ nƣớc uống là phơi nhiễm với các hợp chất As vô cơ rất độc
và phơi nhiễm với nồng độ cao [52]. Hai dạng tồn tại chính của As vô vơ
đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng là Arsenite (As hóa trị 3 hay As(III)) và
Arsenate (As hóa trị 5 hay As(V)) [10].
Các biểu hiện nhiễm độc As đối với con ngƣời cũng rất đa dạng, từ sạm
da đến dày biểu bì, ung thƣ da, ung thƣ phổi hay các bệnh nan y khác.
Nguyên nhân gây ra bệnh tật nói trên là nồng độ As cao trong thức ăn, nƣớc

uống và các thành phần môi trƣờng bao quanh con ngƣời. Theo thức ăn, nƣớc

Số hóa bởi trung tâm học liệu

6

uống và sự tiếp xúc với môi trƣờng, As thâm nhập vào cơ thể ngƣời, tích lũy
tới mức độ nào đó sẽ tạo nên tác động bệnh lý cho cơ thể [3].
As là chất rất độc, nhiễm độc As có thể theo kiểu cấp tính (nhiễm một
lƣợng lớn) hay nhiễm độc trƣờng kỳ mãn tính (từng chút một). Ở ngƣời
nhiễm độc cấp tính, triệu chứng lúc đầu là khó thở, ho, tức ngực sau đó là đau
đầu mất thăng bằng; nếu lƣợng đủ lớn có thể gây tử vong trong vòng 20 phút;
nếu lƣợng nhỏ có thể gây nôn mửa, đau bụng trên, đau cơ. Còn nhiễm độc
trƣờng kỳ bắt đầu bằng biểu hiện bệnh lý ngoài da, đau, sƣng tấy da, đi lại
khó khăn, có những vết trắng ở móng tay, tiếp theo có thể đau bụng trên, nôn
mửa, viêm mũi, viêm họng, viêm thanh quản, xơ cứng gan bàn chân, ung thƣ
da, rối loại mạch máu, suy yếu chức năng gan, sạm da, mất sắc tố da, cuối
cùng là chết [8].
As gây độc cho ngƣời và vật nuôi, cây trồng nhƣng liều độc rất khó xác
định vì thay đổi tùy từng đối tƣợng. Chẳng hạn ở ngƣời liều độc của As
không giống nhau, nhất là với những ngƣời dùng thuốc As. As vào trong cơ
thể với hàm lƣợng 1.5- 50 g/kg trọng lƣợng cơ thể sẽ gây tử vong. Tiêu chuẩn
cho phép của Việt Nam số 5944:1995 thì hàm lƣợng As vào trong máu
khoảng 1-6.4 µg/l [50].
1.1.3. Các phương pháp xử lý truyền thống
Làm sạch đất ô nhiễm là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và
vốn đầu tƣ cao. Để xử lý đất ô nhiễm ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng
pháp truyền thống nhƣ: Phƣơng pháp đào và chuyển chỗ (Dig & Haul),
phƣơng pháp rửa đất (Soil washing), phƣơng pháp cố định các chất ô nhiễm
bằng hoá học hoặc vật lý; xử lý nhiệt; trao đổi ion, ôxi hoá hoặc khử các chất

ô nhiễm; đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp.
Tuy nhiên, hầu hết các phƣơng pháp đó rất tốn kém về kinh phí, giới
hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ
chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ kim loại nặng của một số loài
thực vật, ngƣời ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý
môi trƣờng nhƣ một công nghệ môi trƣờng đặc biệt. Khả năng làm sạch môi
trƣờng của thực vật đã đƣợc biết từ thế kỷ XVIII bằng các thí nghiệm của

Số hóa bởi trung tâm học liệu

7

Joseph Priestley, Antoine Lavoissier, Karl Scheele và Jan Ingenhousz [21].
Tuy nhiên, mãi đến những năm 1990 phƣơng pháp này mới đƣợc nhắc đến
nhƣ một loại công nghệ mới dùng đề xử lý môi trƣờng đất bị ô nhiễm bởi các
kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ.
1.1.4. Xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật (Phytoremediation)
Phytoremediation là một thuật ngữ mới đƣợc hình thành từ phyto, theo
tiếng Latin có nghĩa là thực vật, và remediation có nghĩa là phục hồi. Đây là
một trong những hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học
thực vật nhằm ám chỉ biện pháp sử dụng cơ thể thực vật trong công tác xử lý
môi trƣờng. Gần đây các nghiên cứu sử dụng thực vật trong xử lý kim loại
nặng đƣợc đặc biệt quan tâm. Nhiều loại thực vật đƣợc sử dụng để loại bỏ
kim loại nặng trong đất thông qua khả năng hấp thụ và tích lũy trong các phần
thân và lá cây trên mặt đất có thể thu hoạch đƣợc - Phytoextraction, hoặc lọc
kim loại nặng thông qua hệ thống rễ - Rhizofiltration, hoặc là phân hủy kim
loại nặng từ dạng độc (ion) sang dạng không tan ít độc hơn -
Phytostabilization, hoặc thông qua khả năng tạo kim loại nặng hoặc các hợp
chất của kim loại nặng ở dạng khí có khả năng giải phóng vào không khí một
cách từ từ thông qua lá - Phytovolatilization.

1.1.4.1. Xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật “siêu tích tụ”.
Tại các nƣớc công nghiệp phát triển nhƣ Anh, Mỹ và Úc, những nghiên
cứu về thực vật chống chịu kim loại đã đƣợc chú ý phát triển từ giữa thế kỷ
20. Trên cơ sở của các nghiên cứu cơ bản (điều tra, khảo sát, cơ chế hấp thụ
kim loại, tạo giống mới và các biện pháp nông hóa), nhiều loại công nghệ xử
lý ô nhiễm đã đƣợc ra đời và áp dụng vào cuộc sống. Hiện nay, hƣớng nghiên
cứu này vẫn đang đƣợc tiếp tục phát triển ở mức cao hơn nhƣ xây dựng cơ sở
dữ liệu, bảo tồn và phát triển nguồn gen và thƣơng mại hóa.
Năm 2001, Ma và cộng sự đã phát hiện ra loài dƣơng xỉ Pteris vittata
L. mọc trên vùng đất ô nhiễm As ở Florida [35]. Nó có khả năng chống chịu
nền đất có hàm lƣợng tới 1500mg/kg As và hàm lƣợng chất này trong cây đạt
tới 2,5% (25.000ppm, trọng lƣợng khô). Shelmerdine và cộng sự (2004) lại
nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng tới sự tích tụ As của Pteris vittata L [44].

Số hóa bởi trung tâm học liệu

8

Các tác giả đã thấy rằng, trong đất hàm lƣợng As cao thì cây có hàm lƣợng
phốt phát cao làm tăng khả năng hấp thụ As của cây.
Một đặc điểm đã đƣợc các nhà khoa học phát hiện là các loài thực vật
“siêu tích tụ” kim loại trong điều kiện ô nhiễm kim loại chúng là loài “ƣu
thế”. Đây là phát hiện mang tính phƣơng pháp luận quan trọng.
Bản chất các quá trình hấp thụ, vận chuyển và lƣu giữ các loại chất gây
ô nhiễm vô cơ và hữu cơ đã đƣợc nghiên cứu rất chi tiết. Ở thực vật nói
chung, quá trình hấp thụ các chất này đƣợc thực hiện với nhiều quá trình khác
nhau. Các chất ô nhiễm đƣợc cơ thể thực vật hấp thụ thông qua hệ thống rễ và
các chất này sẽ đƣợc chuyển hóa thành các dạng bay hơi an toàn [43], [18],
[19]. Các quá trình này đƣợc mô tả trong hình 1.1.

Hình 1.1. Mô hình hấp thụ các chất ở thực vật
Hai yếu tố quan trọng giúp cho cơ thể thực vật thực hiện tốt quá trình
này đó là khả năng tổng hợp sinh khối và hiệu quả tích lũy các chất đƣợc hấp
thụ vào cây. Các nghiên cứu cho đến nay đã chỉ ra cơ thể thực vật là hệ thống
hoàn chỉnh và tốt nhất để loại bỏ các hợp chất ô nhiễm không bị phân hủy từ
môi trƣờng đất và nƣớc. Hơn 400 loài thực vật đƣợc ghi nhận là có khả năng
này [36] trong số đó các họ thực vật chiếm ƣu thế về số loài này là họ Cúc
(Asteraceae), họ Cải (Brassicaceae), họ Cẩm chƣớng (Caryophyllaceae), họ
Cói (Cyperaceae), họ Hòa thảo (Poaceae), họ Hoa tím (Violaceae), họ Hoa

Số hóa bởi trung tâm học liệu

9

môi (Lamiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Mùng quân (Flacuortiaceae) và họ
Thầu dầu (Euphobiaceae) [13], [42]. Các nhà khoa học cũng đã phát hiện ra
nhiều loài dƣơng xỉ có khả năng tích tụ kim loại ở mức độ cao nhƣ loài Pteris
cretica, P. longifolia, P. vunbrosa,
Mặc dù số loài thực vật siêu tích tụ kim loại nặng đã đƣợc phát hiện,
nhƣng đến nay công nghệ xử lý ô nhiễm môi trƣờng bằng thực vật vẫn chƣa
đƣợc phổ biến ứng dụng vào thực tiễn. Lý do là các loài có khả năng tích lũy
kim loại cao thƣờng sinh trƣởng kém, cho sinh khối thấp và thời gian sinh
trƣởng dài [49]. Các nƣớc công nghiệp Âu-Mỹ đã khảo sát khá đầy đủ về khả
năng chống chịu và hấp thụ kim loại, nay đang tiếp tục phát triển để ứng dụng
vào thực tiễn. Tại các nƣớc châu Á, những nghiêm cứu về nhóm thực vật trên
có những bƣớc đi chậm hơn và kết quả thu đƣợc còn khiêm tốn. Tuy nhiên,
đây là những đối tƣợng nghiên cứu hiện đang đƣợc chú ý đặc biệt ở nhiều
quốc gia nhƣ Trung Quốc [16].
Những nghiên cứu về cây “siêu tích tụ” kim loại đã đƣợc phát triển ở

các nƣớc có hệ thực vật ôn đới, còn ở các nƣớc có hệ thực vật nhiệt đới nói
chung có điều kiện tự nhiên tƣơng đồng với Việt Nam, thì còn rất hạn chế.
Trong danh sách các loài có khả năng tích tụ kim loại đã đƣợc công bố trên
thế giới, ở Việt Nam chỉ có 26 loài, trong đó có 4 loài thực vật thủy sinh và 22
loài thực vật trên cạn [5].
Khoảng 20 năm gần đây các nhà khoa học Việt Nam đã quan tâm tìm
hiểu và nghiên cứu ảnh hƣởng ô nhiễm kim loại nặng lên các loài động thực
vật [1]. Năm 2005, Trần Công Tấu và cộng sự đã chứng minh khả năng tích
lũy kim loại Cd và Zn của một số cây cảnh nhƣ cúc su shi, ngũ gia bì. Nguyễn
Tiến Cƣ và cộng sự (2008) đã thấy khả năng chống chịu và tích lũy As ở cây
cỏ vetiver. Trần Văn Tựa và cộng sự (2007) đã chứng minh đƣợc khả năng xử
lý kim loại nặng trong đất của cây cải xanh và dƣơng xỉ [9]. Từ năm 2001,
mạng lƣới Vetiver Việt Nam đƣợc thành lập nhằm xử lý ô nhiễm môi trƣờng
kim loại nặng trong đất, nƣớc bằng cỏ vetiver [4]. Đây là kỹ thuật mới mẻ
nhƣng có tính khả thi cao và có thể áp dụng rộng rãi.
Một số công trình nghiên cứu đã sử dụng thực vật để xử lý kim loại
nặng trong môi trƣờng nƣớc, đất [6]. Bằng thực nghiệm các tác giả khác đã

Số hóa bởi trung tâm học liệu

10

chứng minh đƣợc vai trò của thực vật thủy sinh trong việc tích lũy các kim
loại nặng vào cơ thể chúng, nhƣ bèo tây [6], cải soong [7], [9], rong đuôi chó
và bèo tấm [2]. Gần đây nhất, các cán bộ Viện Công nghệ môi trƣờng đã
nghiên cứu hệ thống một số loài thực vật thủy sinh nhƣ bèo tây, bèo cái, rau
muống, bèo tấm, ngổ,…để đánh giá đặc điểm sinh học, tính chống chịu, và
khả năng loại bỏ N-NH
4
, N-NO

3
[9]. Đặng Đình Kim và cộng sự (2010) đã
nghiên cứu sử dụng 7 loài thực vật để xử lý kim loại nặng (As, As, Cd và Zn)
ở Thái Nguyên gồm có dƣơng xỉ (Pteris vittata), Pytirogramma calomelanos,
cỏ màn trầu, ngổ dại, cỏ voi lai, cỏ vetiver và cải xanh [4]. Ngoài ra, một số
tác giả khác đã nghiên cứu khả năng loại bỏ đồng thời amoni và As từ nƣớc
bằng cỏ thủy canh Typha, Canna và cỏ voi Elephant….
1.1.4.2. Thực vật biến đổi gen cho mục đích xử lý ô nhiễm kim loại nặng
Việc sử dụng thực vật để xử lý kim loại nặng (phytoremediation) là
công nghệ đã và đang đƣợc áp dụng ở rất nhiều nƣớc trên thế giới. Nó đã đem
lại hiệu quả lớn về công nghệ cũng nhƣ tiết kiệm tiền bạc. Cho đến nay, các
loài thực vật “siêu tích tụ” phát hiện ngoài tự nhiên thƣờng có sinh khối thấp.
Để khắc phục điều này đòi hỏi phải phát triển công nghệ sinh học để tạo ra
các loài thực vật biến đổi gen theo chiều hƣớng vừa có khả năng tích tụ, vừa
tạo ra sinh khối lớn.
Gần đây, công nghệ sử dụng thực vật để làm sạch kim loại trong đất ô
nhiễm hoặc trầm tích đã thu hút đƣợc sự chú ý nhờ các ƣu điểm nổi bật nhƣ
thân thiện với môi trƣờng và chi phí thấp. Các thành tựu thu đƣợc của thập kỷ
qua đã chứng minh công nghệ gen thực vật có thể đƣợc sử dụng vào việc
nâng cao khả năng xử lý kim loại của thực vật. Các nghiên cứu chuyển gen đã
thành công trong việc nâng cao khả năng hấp thụ và tích lũy kim loại nặng
(chủ yếu là Cd, Cu) và á kim (As, Se) từ đất bằng cách tích tụ các chất này ở
phần sinh khối trên mặt đất (thân và lá cây) thông qua cải biến các gen liên
quan đến vận chuyển kim loại, tăng cƣờng tổng hợp các enzyme trong chu
trình chuyển hóa lƣu huỳnh và tạo ra các phức hợp chất kim loại có khả năng
loại độc chelators-metallothioneins và phytochelatins. Thực vật đƣợc chuyển
gen mang gen mã hóa Hg-reductase và organomercurial lyase có nguồn gốc
từ vi khuẩn có thể chuyển hóa Hg dạng ion hoặc dạng hợp chất hữu cơ độc

Số hóa bởi trung tâm học liệu

11

hại thành dạng kim loại Hg và giải phóng vào không khí từ bề mặt lá.
Phytovolatization của các hợp chất selen đƣợc tăng cƣờng trong các cây
chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện các gen mã hóa enzyme tham gia vào quá
trình tạo ra khí methylselenide [31].
Trong tự nhiên As thƣờng tồn tại chủ yếu dƣới dạng ion asenate
(As(V)) và asenite (As(III)). As(V) và As(III) vào tế bào thực vật thông qua
các kênh vận chuyển tƣơng ứng là phosphatetranspoters và
aquaglyceroporins. Sau khi đƣợc vận chuyển vào tế bào, As(V) sẽ đƣợc khử
thành As(III) bằng enzyme Arsenate reductase, một enzyme thuộc họ protein
tyrosine phosphatase (PTPase). As(III) sau đó sẽ tạo phức với glutathione
(GSH) hoặc phytochelatins (PCs). As(III) hoặc phức hợp của As(III) sẽ đƣợc
vận chuyển qua màng không bào và đƣợc tích lũy trong không bào. As(III)
đƣợc vận chuyển từ rễ lên các mô thân và lá thông qua protein vận chuyển
nhƣ Lsi2 (đƣợc phân lập ở cây dƣơng xỉ). As(III) có thể đƣợc metyl hóa để
tạo thành hợp chất mono methyl Asate (MMAs(V)), dimethyl Asate
(DMAs(V)) và trimethy larsine oxide (TMAO(V)) trong cây và giải phóng
vào không khí qua lá (Hình 1.2)[54].

Hình 1.2. Sơ đồ của sự hấp thụ As và sự trao đổi chất trong thực vật và các thao tác
di truyền có thể đƣợc thực hiện để nâng cao hiệu quả xử lý As của thực vật [55]

Số hóa bởi trung tâm học liệu

12


Các nghiên cứu chuyển gen nhằm nâng cao khả năng xử lý As ở thực

vật cho đến nay chủ yếu tập trung vào một số hƣớng sau:
Tăng cường tích lũy As trong không bào
Các nghiên cứu theo hƣớng tăng cƣờng tích lũy và sinh tổng hợp GSH
hoặc PCs trong thực vật chuyển gen qua đó tăng cƣờng tích lũy As trong
không bào đƣợc nghiên cứu nhiều và đã đạt đƣợc nhiều thành công trong thời
gian vừa qua. Tăng biểu hiện của phytochelatin synthase (PCS)trong sinh
tổng hợp các PCs, đã làm tăng khả năng chống chịu và tích lũy As ở cây
chuyển gen. Gasic và Korban (2007) thấy rằng tăng cƣờng biểu hiện của PCs
trong cây mù tạt Ấn Độ chuyển gen làm tăng khả năng chống chịu với As
nhƣng không tăng cƣờng tích tụ As một cách đáng kể [25]. Việc thiếu các
phản ứng trong sự tích lũy có thể là do thực tế là tổng hợp PCs cũng bị hạn
chế bởi việc sản xuất các GSH. Có thể thấy là sự vận chuyển phức As(III)
hoặc As(III) tự do qua màng không bào có khả năng là bƣớc hạn chế tốc độ,
ảnh hƣởng tổng thể đến khả năng chống chịu và tích luỹ As của thực vật.
Song và cs (2010) đã phát hiện 2 ABCC-type phytochelatin transporter
(AtABCC1 và AtABCC2) liên quan đến khả năng chống chịu As của cây A.
thaliana, biểu hiện đồng thời AtABCC1 và AtPCS1 làm tăng cƣờng tính
chống chịu As ở cây chuyển gen [45].
Tăng cường khử Arsenate
Dhankher và cs (2002) đã cho thấy rằng tăng cƣờng biểu hiện gen
Arsenate reductase, arsC có nguồn gốc từ vi khuẩn Escherichia coli trong
A.thaliana dƣới sự kiểm soát của một promoter kích hoạt bởi ánh sáng (để nó
có thể chỉ biểu hiện ở các mô cây phía trên mặt đất) đã dẫn đến hiện tƣợng
mẫn cảm với As ở cây chuyển gen [20]. Mặc dù điều này dƣờng nhƣ là một
kết quả trái ngƣợc với dự kiến, các tác giả giải thích rằng các sản phẩm asenit
độc hại hơn nhiều so với cơ chất ban đầu là asenat, hơn nữa lƣợng GSH
không đủ để hình thành phức hợp As(GS)
3
. Vì lý do đó, gen mã hóa cho γ-

Số hóa bởi trung tâm học liệu

13

ECS có nguồn gốc từ vi khuẩn E. coli, enzyme làm tăng sinh tổng hợp GSH,
đƣợc biểu hiện đồng thời với arsC, kết quả các cây chuyển gen có khả năng
chống chịu và tích lũy As cao nhiều lần so với đối chứng.

Tăng cường vận chuyển As từ rễ lên thân
Một trong những đặc tính quan trọng của cây có khả năng tích lũy As
cao, cây dƣơng xỉ (P.vittata) là khả năng vận chuyển hiệu quả As từ rễ lên
thân [53] trong khi hầu hết các loại dƣơng xỉ không có khả năng hấp thụ As
khác thƣờng có khả năng vận chuyển As từ rễ lên thân thấp nhiều so với
P.vittata. Một bƣớc quan trọng trong sự chuyển As từ rễ lên thân là chuyển
As đến các mô xylem, một quá trình chƣa đƣợc hiểu rõ. Gần đây, Ma và cs
(2002, 2006) xác định đƣợc một gen mã hóa protein Lsi2, có vai trò cho vận
chuyển Arsenit vào mô xylem, nhƣ Arsenit là dạng tồn tại chính của As trong
mô xylem [33], [34]. Ở cây lúa đột biến mất gen Lsi2 dẫn đến kết quả giảm
gần 50% As tích tụ trong thân. Lsi2 là một protein tƣơng đồng với ArsB của
E.coli, một As(III) có vai trò trong việc vi khuẩn đề kháng Arsenit [39]. Vì
vậy việc tăng cƣờng biểu hiện Lsi2 trong cây chuyển gen có khả năng sẽ làm
tăng sự vận chuyển As từ rễ lên thân và qua đó tăng cƣờng sự tích lũy As
trong cây.
Tạo cây chuyển gen có khả năng phytovolatilization As
Rất nhiều loài sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và động vật có hiện
tƣợng metyl hóa Á. Các dạng metyl hóa của As đƣợc phát hiện ở nhiều loài
thực vật trong đó có lúa [51], [55]. Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy
rằng đây là kết quả của các quá trình metyl hóa của chính bản thân thực vật.
Sản phẩm cuối cùng của quá trình metyl hóa As là trimethylarsine
(TMAs(III)) tồn tại ở dạng khí có thể đƣợc giải phóng vào không khí từ lá

cây. Gần đây, Qin và cộng sự (2006, 2009) đã phân lập đƣợc gen mã hóa cho
enzyme As (III)-S-adenosylmethionine methyltransferase (arsM) từ một loài
vi khuẩn có tên Rhopseudomonas palustris, cũng nhƣ từ tảo Cyanidioschyzon
merolae (Cm arsM)[51]. Các tế bào biểu hiện CmArsM cũng nhƣ ArsC có
khả năng metyl hóa As thành TMAs(III) [33]. Các kết quả trên cho thấy triển

Số hóa bởi trung tâm học liệu

14

vọng của việc tạo thực vật chuyển gen có khả năng phytovolatilization As cho
mục đích làm sạch môi trƣờng cũng nhƣ tăng an toàn cho thực phẩm.
Từ các phân tích trên có thể thấy đã có các nghiên cứu thu đƣợc thành
công nhất định trong việc chuyển một hoặc một vài gen góp phần tăng cƣờng
chống chịu, hấp thụ và tích lũy As trong thực vật chuyển gen. Tuy nhiên có
thể thấy rằng để có thể tạo đƣợc một giống cây biến đổi gen có khả năng xử lý
As tốt, với hiệu quả cao có thể đem ứng dụng trong thực tế còn cần phải có
nhiều nghiên cứu hơn nữa. Đặc biệt để nâng cao hiệu quả xử lý As cần phải cải
biến nhiều quá trình khác nhau cùng một lúc, ví dụ nhƣ phải chuyển cùng lúc
nhiều gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GSH, PCs, vận chuyển từ rễ lên
thân, vận chuyển vào không bào,… Mặt khác cũng phải quan tâm đến đối
tƣợng thực vật lựa chọn phải sinh trƣởng nhanh, tạo nhiều sinh khối, có hệ rễ
đâm sâu và phát triển, về mặt này các loại cây gỗ là các đối tƣợng tiềm năng.
1.2. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
1.2.1. Khái niệm về chuyển gen
Chuyển gen là đƣa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ
thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và
đƣợc truyền lại cho thế hệ sau. Vì vậy khái niệm chuyển gen chỉ đƣợc sử
dụng cho thực vật và động vật.
Nấm men, tế bào vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA

ngoại lai và đƣợc gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào
biến nạp (transformed cell) [7].
1.2.2. Các phương pháp chuyển gen thực vật
Có nhiều phƣơng pháp khác nhau chuyển gen vào thực vật. Tuy nhiên, có
thể phân thành hai nhóm phƣơng pháp chính: Nhóm thứ nhất là các phƣơng
pháp chuyển gen trực tiếp: sử dụng súng bắn gen, chuyển gen bằng xung điện,
chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm, chuyển gen bằng phƣơng pháp hóa học,
chuyển gen trực tiếp qua ống phấn… Nhóm thứ hai là các phƣơng pháp chuyển
gen gián tiếp qua trung gian, thƣờng là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens).
1.2.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

Số hóa bởi trung tâm học liệu

15

Dựa vào hiện tƣợng vật lý và hóa lý để chuyển gen đặc tính tốt vào vật
liệu di truyền của tế bào hay của mô thực vật. Với phƣơng pháp này các nhà
khoa học phải sử dụng nhiều cách khác nhau nhƣ dùng hóa chất, tạo xung
điện (electro-poration), sử dụng súng bắn gen, tiêm trực tiếp DNA vào nhân
(microinjection).
* Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)
Nguyên lý: Ngâm những viên đạn nhỏ bằng vàng hoặc tungsten có kích
thƣớc cực nhỏ, đƣờng kính khoảng 0,5 - 1,5 μm với dung dịch có chứa đoạn
DNA ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này đƣợc làm khô
trên một đĩa kim loại mỏng có kích thƣớc 0,5 - 0,9 cm. Đĩa kim loại này đƣợc
gắn vào đầu một viên đạn lớn bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có
kích thƣớc vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên
đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một
lƣới thép mịn, còn các viên đạn nhỏvẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới

1300 m/s đến đối tƣợng bắn rồi rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các
mô, tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây.
Ƣu điểm: thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và
mô, các tế bào đƣợc biến nạp có tỷ lệ sống cao, cho phép đƣa các gen vào tế
bào ở vị trí mong muốn.
Nhƣợc điểm: thiết bị đắt tiền.
* Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
Nguyên lý: Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên
màng tế bào trần (protoplast) làm cho DNA bên ngoài môi trƣờng có thể xâm
nhập vào bên trong tế bào. Ngƣời ta chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ
hợp đã mang gen mong muốn cần chuyển vào thực vật. Dùng thiết bị Weing
điện tạo điện thế cao (200– 400V/cm) trong khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn
giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho
plasmid có thể xâm nhập và gắn vào hệ gen của thực vật. Quá trình này đƣợc
thực hiện trong cuvet chuyên dụng. Sau quá trình xung điện, đem protoplast
nuôi trong môi trƣờng nuôi cấy thích hợp, môi trƣờng chọn lọc để tách các

Số hóa bởi trung tâm học liệu

16

protoplast đã đƣợc biến nạp. Tiếp theo là nuôi cấy in vitro, tái sinh cây và
chọn lọc cây chuyển gen.
Ƣu điểm: có thể áp dụng đƣợc đối với nhiều loại thực vật.
Nhƣợc điểm: tỷ lệ các tế bào chuyển gen còn thấp, sức sống của tế bào
giảm đột ngột, khó phục hồi.
* Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)
Nguyên lý: Phƣơng pháp này sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để
đƣa DNA vào những tế bào nhất định, nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ
protoplast và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.

Ƣu điểm: đƣa các gen chính xác vào tế bào, tối ƣu hóa đƣợc lƣợng
DNA đƣa vào tế bào.
Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này cần thiết bị có độ chính xác cao, kĩ
thuật và kĩ năng ngƣời thực hiện cần chính xác.
* Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Nguyên lý: Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần
protoplast. Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ
hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu
âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3 mm.
Cho máy phát siêu âm với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp
khoảng 100 mili giây. Số nhịp khoảng từ 6 - 9 nhịp với tổng thời gian tác
động từ 600 - 900 mili giây. Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các
môi trƣờng thích hợp, chọn lọc để tách các protoplast đã đƣợc chuyển gen.
Nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đƣa ra trồng ở môi trƣờng
ngoài.
* Chuyển gen bằng phƣơng pháp hóa học
Nguyên lý: Chuyển gen bằng phƣơng pháp hóa học là phƣơng pháp
chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học nhƣ polyethylen glycol
(PEG). Khi có mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể
thu nhận DNA ngoại lai vào bên trong tế bào.