Xây dựng quy trình tái sinh giống sa nhân tím (Amomun Longiligulare T.L.Wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô

Số hóa bởi trung tâm học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




ĐÀO DUY HƢNG



XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN

TÍM (Amomum Longiligulare T.L.Wu) BẰNG PHƢƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
















Thái Nguyên - 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu

®¹i häc th¸i nguyªn
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



ĐÀO DUY HƢNG



XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM
(Amomum Longiligulare T.L.Wu) BẰNG PHƢƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Mã số

: 60420201




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. Ngô Xuân Bình








Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu
i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện.
Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chƣa đƣợc
công bố trong bất kỳ công trình hay tạp chí nào khác ở trong nƣớc cũng nhƣ ở
nƣớc ngoài.

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 8 năm 2013
Học viên


Đào Duy Hƣng













Số hóa bởi trung tâm học liệu
ii

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Ngô Xuân
Bình là thầy trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cám ơn:
- Tập thể các anh chị đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ tế bào - Viện
Khoa học Sự sống đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành công
việc nghiên cứu của mình.
- Tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Khoa học sự sống, trƣờng Đại học

khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
thời gian sinh hoạt học tập tại Bộ môn.
Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những ngƣời thân
trong gia đình đã luôn khuyến khích, động viên cũng nhƣ chia sẻ những khó
khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình.

Xin chân thành cảm ơn!
Học viên


Đào Duy Hƣng







Số hóa bởi trung tâm học liệu
iii
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về cây sa nhân 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sa nhân 3
1.1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây sa nhân 3
1.1.1.2. Phân loại cây sa nhân tím 4
1.1.2. Đặc điểm thực vật học 4
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái 4

1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái 6
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý 7
1.1.3. Tiêu chuẩn chất lượng và giá trị 9
1.1.3.1.Tiêu chuẩn chất lƣợng 9
1.1.3.2. Giá trị 9
1.2. Tình hình nghiên cứu về cây sa nhân 11
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô
trên thế giới 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô
ở Việt Nam 11
1.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
1.3.1. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
1.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14
1.3.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào 15
1.3.4. Một số công trình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật ở trong nước 17
CHƢƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20

Số hóa bởi trung tâm học liệu
iv
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Nội dung nghiên cứu 20
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 21
2.2.2.1. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 21
2.2.2.2. Giai đoạn tái sinh chồi 23
2.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi 25
2.2.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 27

2.2.2.5. Giai đoạn vƣờn ƣơm 29
2.2.3. Xử lý số liệu 30
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 30
2.2.4.1. Thí nghiệm in vitro 30
2.2.4.2. Thí nghiệm thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 30
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất đến khả năng vô trùng
mẫu sa nhân tím làm vật liệu khởi đầu 31
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của H
2
0
2
20% đến khả năng vô trùng
mẫu 31
3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl
2
0,1% đến khả năng vô
trùng mẫu 33
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng
đến khả năng tái sinh chồi cây sa nhân tím (Sau 45 ngày nuôi cấy) 35
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả năng tái sinh chồi 35
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh
chồi 37
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng
đến hiệu quả nhân chồi cây sa nhân tím 38
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân
chồi 41

Số hóa bởi trung tâm học liệu

v
3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu
quả nhân chồi 43
3.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu
quả nhân chồi 45
3.3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu
quả nhân chồi 47
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng
đến khả năng ra rễ chồi sa nhân tím 49
3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa
nhân tím 49
3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa
nhân tím 51
3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa
nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

Số hóa bởi trung tâm học liệu
vi


BAP
6-benzylaminopurine
CT
Công thức
ĐC
Đối chứng
Kinetin
furfurylaminopurine
MS
Murashinge and Skoog, 1962
NAA
α-Naphlene acetic acid
TN
Thí nghiệm
IBA
Indole – 3 – butyric acid
IAA
Indole-3-acetic acid
ND
Nƣớc dừa
GA
3
Gibberellin
KC
Knudson C, 1965
RE

Robert Ernst, 1979
VW
Vacin & Went, 1949
SH
Schenk, Hidebrandt, 1972












Số hóa bởi trung tâm học liệu
vii


Bảng

Trang
Bảng 3.1.
Ảnh hƣởng của H
2
0
2
20% đến khả năng vô trùng mẫu

31
Bảng 3.2.
Ảnh hƣởng của HgCl
2
0.1% đến khả năng vô trùng
mẫu
33
Bảng 3.3.
Ảnh hƣởng BAP đến khả năng tái sinh chồi
35
Bảng 3.4.
Ảnh hƣởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi
37
Bảng 3.5.
Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi
39
Bảng 3.6.
Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi
41
Bảng 3.7.
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả
nhân chồi
43
Bảng 3.8.
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả
nhân chồi
45
Bảng 3.9.
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi

47
Bảng 3.10.
Ảnh hƣởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân
tím
49
Bảng 3.11.
Ảnh hƣởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân
tím
51
Bảng 3.12.
Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân
tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
53




Số hóa bởi trung tâm học liệu
viii
HÌNH


Hình
Hình
Trang
Hình 2.1
Sơ đồ nghiên cứu
21
Hình 3.1
Ảnh hƣởng của H

2
0
2
20% đến khả năng vô trùng mẫu
32
Hình 3.2
Ảnh hƣởng của HgCl
2
0.1% đến khả năng vô trùng mẫu
33
Hình 3.3
Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
35
Hình 3.4
Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi; A:
Công thức đối chứng; B: Công thức 5
36
Hình 3.5
Ảnh hƣởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi
37
Hình 3.6
Ảnh hƣởng của Kinetinđến khả năng tái sinh chồi cây
sa nhân tím; A: Công thức đối chứng ; B: Công thức 5
38
Hình 3.7
Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi
39
Hình 3.8
Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi; A: công
thức đối chứng; B: Công thức 4

40
Hình 3.9
Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi
41
Hình 3.10
Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi; A:
công thức đối chứng; B: Công thức 5
42
Hình 3.11
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả
nhân chồi
44
Hình 3.12
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả
nhân chồi; A: Công thức đối chứng; B: Công thức 5
45
Hình 3.13
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả
nhân chồi
46

Số hóa bởi trung tâm học liệu
ix
Hình 3.14
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân
chồi; A: công thức đối chứng; B: công thức 2
47
Hình 3.15
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi

48
Hình 3.16
Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi; A: công thức đối chứng; B: Công thức 3
48
Hình 3.17
Ảnh hƣởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân
tím
50
Hình 3.18
Ảnh hƣởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân
tím
51
Hình 3.19
Ảnh hƣởng riêng rẽ của NAA và IBA đến hiệu quả ra
rễ chồi sa nhân tím; A: Bổ sung 0,6 mg NAA/l; B: Bổ
sung 0,6 mg/l IBA
52
Hình 3.20
Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân
tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
53
Hình 3.21
Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân
tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên; A: Giá thể đất
phù sa (ĐC); B: Giá thể đất phù sa + trấu hun (4:1)

54

Số hóa bởi trung tâm học liệu
1
MỞ ĐẦU
Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc chi sa nhân
(Amomum), họ gừng (Zingiberaceae) [11]. Đây là một cây thuốc quý, có
trong danh mục thực vật rừng quý hiếm ban hành kèm theo nghị định số 18-
HĐBT ngày 17/01/1992 [7]. Theo tài liệu cổ, sa nhân có vị cay, tính ôn vào
các kinh tỳ, thận và vị, có tác dụng hành khí, điều trung, hòa vị, làm cho tiêu
hóa đƣợc dễ dàng [11].
Quả sa nhân chứa tinh dầu với nhiều hợp chất hóa học giá trị nhƣ:
camphen, β-pinen, limonen, camphor; borneol, saponin [12]. Tinh dầu sa
nhân có tác dụng kháng khuẩn và nấm [21], [26], [30], [36]. Sa nhân đƣợc sử
dụng trong nhiều bài thuốc đông y nhƣ: Chữa có thai bị lạnh bụng, đầy
hơi, tiểu tiện không thông; chữa tiêu chảy; chữa ăn không tiêu, nôn mửa, đau
bụng; chữa đau nhức răng; chữa tê thấp…[11]. Ngoài ra, sa nhân đƣợc biết
đến là loại gia vị đắt thứ ba trên thế giới sau Saffron và vanilla [22].
Cây sa nhân đang bị khai thác tự do nên ngày càng bị thu hẹp về diện
tích, giống sa nhân tím cũng bị mất dần và thoái hóa. Nếu không kịp thời
trồng mới, khoanh nuôi bảo vệ và tác động những biện pháp tích cực thì
những nguồn gen cây trồng có giá trị cao cũng dần bị mất. Hiện nay, Việc
trồng và phát triển diện tích cây sa nhân tím đang đƣợc triển khai ở nhiều địa
phƣơng tạo đƣợc thu nhập cao cho ngƣời nông dân. Với giá 8.000 – 10.000

đ/kg quả sa nhân tƣơi, sau khi phơi là 150.000 - 200.000 đ/kg quả khô thì sau
trồng 2 năm đã cho thu nhập 6 - 8 triệu đồng/ha và những năm tiếp theo còn
cao hơn [15].
Để giải quyết vấn đề phát triển cây dƣợc liệu, khắc phục những khó
khăn trên đòi hỏi phải có một hệ thống giải pháp toàn diện về quản lý, quy
hoạch vùng nguyên liệu, qui trình công nghệ Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào cho hệ số nhân giống cao mà các phƣơng pháp nhân giống khác

Số hóa bởi trung tâm học liệu
2
khó có thể đạt đƣợc, cây giống đồng đều, sức sinh trƣởng cao và sạch bệnh
[25], [31] đã thực sự trở thành giải pháp cần thiết trong công tác giống cây
trồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn cây dƣợc liệu.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy
trình tái sinh giống Sa Nhân tím (Amomum Longiligulare T.L.Wu) bằng
phương pháp nuôi cấy mô”
Mục đích nghiên cứu
Xây dựng thành công quy trình tái sinh giống sa nhân tím có năng suất
cao bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhằm góp phần bảo tồn tài nguyên di
truyền thực vật và làm cơ sở cho việc nhân nhanh loài cây dƣợc liệu này,
cung cấp nguồn cây giống chất lƣợng cao để mở rộng vùng dƣợc liệu sa nhân
trong nƣớc.
Ý nghĩa của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học
+ Kết quả nghiên cứu đƣa ra một số quy trình kỹ thuật vi nhân nhân
giống cây sa nhân tím bằng phƣơng pháp in vitro. Từ đó, đánh giá đƣợc
tác động của một số chất điều tiết sinh trƣởng trong nhân giống cây sa
nhân tím.
+ Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và
sản xuất giống sa nhân tím thƣơng phẩm có năng suất cao.

- Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống
cây sa nhân tím nhằm bảo tồn nguồn gen cây dƣợc liệu và cung cấp giống với
số lƣợng lớn, chất lƣợng đảm bảo, đồng thời giữ đƣợc đặc tính di truyền của
cây chọn lọc.


Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây sa nhân
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sa nhân
1.1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây sa nhân
Nhìn chung các loài sa nhân (trong đó có sa nhân tím) chỉ thấy ở
vùng có khí hậu nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Á.
Theo cách phân chia tiểu vùng khí hậu theo quan điểm địa lý thực vật
thì sa nhân tím mọc tự nhiên ở Việt Nam (chủ yếu ở các tỉnh phía Nam)
nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, với hai mùa mƣa và khô
khá rõ rệt. Mùa mƣa tập trung vào vụ hè hay vụ hè – thu, mùa khô ở các
điểm có sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía Nam thƣờng trùng
với các tháng là mùa đông và xuân ngoài miền Bắc. Trong tổng số 4 –
5 tháng mùa khô đó, có 2 – 3 tháng hoàn toàn không có mƣa, nhƣng do
sống trong môi trƣờng rừng ẩm, Sa nhân tím vẫn sinh trƣởng phát triển
tốt. Đặc biệt là vụ hoa cuối tháng 3 đầu tháng 4, do không bị mƣa, trời
luôn có nắng nên tỷ lệ đậu quả của cây khá cao.
Từ năm 1992 đến nay, sa nhân tím đã đƣợc thu thập đƣa ra trồng ở
một số địa phƣơng ở các tỉnh phía Bắc (Tân Lạc- Hoà Bình, Chân Mộng -
Đoan Hùng – Phú Thọ, huyện Bảo Thắng và thị xã Lào Cai – Lào Cai,
Đại

Từ – Thái Nguyên). Mặc dù cây đƣợc trồng ở môi trƣờng khí hậu –
thời tiết hơi khác với nơi mọc tự nhiên, nhƣng sa nhân tím vẫn sinh
trƣởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều.
Đặc
trƣng khí hậu ở những địa điểm trồng sa nhân tím kể trên là:
Khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, có mùa đông lạnh, mƣa tập
trung vào mùa hè – thu và mỗi năm cũng có 1 – 2 tháng đƣợc coi là

Số hóa bởi trung tâm học liệu
4
khô hạn. Tuy nhiên mức độ khô hạn ở đây không đến mức cực đoan
nhƣ ở các tỉnh phía Nam.
Tóm lại, đặc điểm cơ bản về khí hậu đối với sa nhân tím là nền khí
hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, nhiệt độ trung bình năm vào khoảng
trên 23
0
C. Cây đem trồng ở các tỉnh phía Bắc mặc dù có mùa đông lạnh
tƣơng đối kéo dài, nhƣng vẫn sinh trƣởng phát triển tốt. Điều đó chứng tỏ,
sa nhân tím có khả năng thích nghi khá cao với điều kiện thời tiết ở các
vùng tiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm tại Việt Nam [17].
1.1.1.2. Phân loại cây sa nhân tím
Cây sa nhân tím có tên khoa học là Amomum longiligulare T.L.Wu
thuộc:
Giới: Plantae
Ngành: Tracheophyta
Lớp: Liliopsida
Bộ: Zingerberales
Họ: Zingiberaceae
Chi: Amomum
Loài: longiligulare [29].

1.1.2. Đặc điểm thực vật học
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Sa nhân, cây thân thảo cao 1,5 - 2,5m. Thân trên mặt đất (thân kí
sinh) hình trụ, đƣờng kính 0,7 – 1,0 cm, nhẵn. Sa nhân sinh sản bằng
thân ngầm bò ngang dƣới mặt đất, mang vẩy và rễ phụ. Từ thân ngầm
mọc lên các thân kí sinh, quả mọc từ gốc cây mẹ. Thân ngầm mọc bò
ngang trên mặt đất, gồm nhiều đốt, đƣờng kính 0,6 - 0,8 cm, bao bọc bởi

Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
các lá vảy màu nâu. Lá mọc so le, xếp thành 2 dãy, mọc xiên hƣớng lên
phía trên. Lá gần nhƣ không có cuống, mọc so le, xếp thành hai dãy. Phiến
lá hình elip dài 20 – 40 cm, rộng 5 - 8 cm, gốc lá hình nêm, mặt trên màu
lục đậm, mặt dƣới nhạt hơn, nhẵn, cuống lá dạng bẹ, dài 5 – 10 cm hoặc
hơn. Lƣỡi bẹ nhỏ, hình mác nhọn dài 1,5 – 4,0 cm, màu nâu nhạt hoặc xám
trắng, mỏng.
Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc; cuống cụm hoa dài 3 – 6
cm, gồm nhiều đốt, có vảy màu nâu. Có 5 – 8 hoa trên một cụm, màu trắng;
cuống hoa rất ngắn. Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 – 2,5 cm,
rộng 0,8 cm, mép nguyên; lá bắc trong dạng ống, màu nâu nhạt, dài
1,5cm, đầu chia thành 2 thuỳ nông.
Đài
hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn,
màu trắng hồng, đầu xẻ 3 thuỳ. Tràng hoa hình ống, dài 1,6 – 1,7 cm, mặt
ngoài có lông thƣa, gồm 3 thuỳ, thuỳ giữa dài 1,6 cm, rộng 0,4 cm, lớn hơn
2 thuỳ bên. Cánh môi hình thìa, dài 1,7 - 1,8 cm, rộng 2,0 – 2,2 cm, đầu
cánh môi thƣờng cuộn ra phía sau; vệt giữa cánh môi màu vàng, kéo dài lên
đến đầu cánh môi, có 3 sọc tím hồng. Bộ nhị dạng bản, dài 0,6 – 0,7 cm,
rộng 0,3 cm, nhẵn; bao phấn 2 ô; trung đới có mào, chia thành 3 thuỳ. Bầu
hình trứng thuôn, dài 0,4 – 0,5 cm; vòi nhuỵ mảnh (dạng chỉ) dài 2,0 – 2,5

cm; đầu nhụy dạng phễu.
Quả dạng quả nang, hình trứng hay gần hình cầu, dài 1,3 – 1,6 cm,
đƣờng kính 1,2 – 1,3 cm; chia thành 3 múi nông; vỏ ngoài có gai ngắn, dày;
màu tím nâu; khi già gai ngắn bớt và chuyển sang màu tím đen. Hạt nhiều gồm từ
13 – 28 hạt xếp thành 3 ô, có áo hạt màu trắng, vị hơi ngọt. Hạt hình đa cạnh,
màu nâu đen, cắn vỡ có vị cay, mùi thơm của tinh dầu [2], [4].




Số hóa bởi trung tâm học liệu
6
1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái
* Đặc điểm sinh thái chung của cây sa nhân tím: Cây ƣa ẩm, hơi
ƣa sáng và chịu bóng. Thƣờng mọc tụ tập thành đám dày đặc trên đất ẩm
ở ven rừng kín thƣờng xanh còn nguyên sinh hay đã trở nên thứ sinh; ven
bờ các khe suối hay trên các nƣơng rẫy thấp đã bỏ hoang, liền kề với rừng.
Sa nhân tím mọc tự nhiên trong các quần xã thứ sinh kể trên ở các
tỉnh phía Nam, thƣờng có độ tán che từ 10 – 60%; độ cao dƣới 600 m.
Thuộc vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình
khoảng hơn 23
0
C; lƣợng mƣa từ gần 1.600 đến 3.300 mm/năm; độ ẩm
không
khí trung bình trên 80%.

Cây sinh trƣởng phát triển gần nhƣ quanh năm, nhƣng mạnh nhất
vào mùa mƣa ẩm. Sa nhân tím ra hoa quả đều hàng năm. Tái sinh tự nhiên
chủ yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ.
Sa nhân tím là cây có biên độ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể

trồng đƣợc ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp đến trung du
và cả ở đồng bằng [17].
* Thổ nhưỡng đất đai: Sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía
Nam nhìn chung là ở trên loại đất nâu - đỏ phát triển trên bazan hoặc nâu
đỏ phát triển trên bazan có mùn tích tụ ở chân núi (K’Bang – Gia Lai,
Vĩnh Thạch – Bình Định, Sơn Hoà - Phú Yên…). Đặc điểm chung của loại
đất này là có tầng đất mặt sâu, tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nƣớc.
Tuy nhiên, sa nhân tím là cây thƣờng mọc ở chỗ đất thấp (ven rừng, thung
lũng, gần hành lang ven suối), nên ở đây loại đất nâu - đỏ bazan kể trên ít
nhiều đã có sự thay đổi, do quá trình thƣờng xuyên đƣợc tích luỹ thêm bởi
lớp thảm mục nên ở tầng đất mặt có màu nâu xám và nâu đen. Hàm lƣợng
mùn và lân tổng số khá cao, nhƣng kali lại thấp.
Sa nhân tím trồng ở Tân Lạc – Hoà Bình; Chân Mộng – Đoan Hùng

Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
– Phú Thọ; Quân Chu -
Đại
Từ – Thái Nguyên; ngoại ô thị xã Lào Cai –
Lào Cai… loại đất ở đây thuộc nhóm feralit vàng – đỏ hay đỏ – vàng. Về
cấu tƣợng cơ bản cũng có tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nƣớc, dễ bị
rửa trôi nhƣ loại đất đỏ – nâu hay nâu - đỏ trên bazan. Song điểm khác
biệt cơ bản của các loại đất ở các điểm kể trên thƣờng nghèo về mặt dinh
dƣỡng, với hàm lƣợng mùn, kali và lân tổng số thấp hơn (khoảng 30%) so
với đất nâu - đỏ hay đỏ – nâu trên bazan.
Ngoài ra, sa nhân tím đem trồng thí nghiệm trên đất phù sa sông
Hồng (Trung tâm Nghiên cứu Lâm
đặc
sản và Trung tâm Cây thuốc Hà Nội
ở Thanh Trì - thuộc Viện Dƣợc liệu), cây vẫn sinh trƣởng phát triển bình

thƣờng và ra hoa kết quả nhiều. Điều đó chứng minh, sa nhân tím cũng có
khả năng thích nghi cao đối với một số loại đất có quá trình lập địa khác nhau
[17].
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý
* Nhu cầu nước và độ ẩm: Nƣớc và độ ẩm không khí là một nhân
tố sinh thái quan trọng đối với quá trình sinh trƣởng phát triển của
cây sa nhân tím. Nhờ có nƣớc, rễ sa nhân tím mới hấp thụ đƣợc các chất
hữu cơ và chất khoáng hoà tan trong nƣớc để thực hiện quá trình đồng
hoá. Trong những tháng mùa khô ở các tỉnh phía Nam, cây sa nhân
mọc tự nhiên ở rừng vẫn thực hiện thoát hơi nƣớc để mát lá và sinh trƣởng
phát triển tốt là do nƣớc ngầm và độ ẩm trong không khí từ quần xã rừng
cung cấp.
Nhu cầu nƣớc đối với cây sa nhân khi mới trồng là rất quan trọng.
Nƣớc tƣới sẽ làm cho đất ở gốc đƣợc lèn chặt hơn (so với không tƣới).
Mặt khác, nƣớc làm cho đất ẩm, duy trì cho các nhánh sa nhân tím luôn
đƣợc tƣơi, tạo điều kiện ra rễ và mọc chồi. Sau khi cây sa nhân tím đã mọc
và cho đến suốt quá trình sinh trƣởng về sau, mặc dù không cần tƣới,

Số hóa bởi trung tâm học liệu
8
nhƣng do có hệ thống rễ chùm phát triển rất mạnh nên có khả năng hút
đƣợc nhiều nƣớc ngầm trong đất. Đặc biệt khi sa nhân tím đã phát triển
thành thảm dày đặc (sau 2 năm tuổi), chúng còn có khả năng giữ nƣớc cho
đất.
Tuy nhiên, cây sa nhân tím không chịu đƣợc ngập úng lâu ngày.
Vào thời kỳ ra hoa, nếu gặp trời mƣa sẽ ảnh hƣởng tới khả năng thụ
phấn và tỷ lệ kết quả. Điều đó có thể giải thích một phần tại sao vụ hoa
tháng 4 – 5 thu đƣợc nhiều quả gấp 4 lần so với vụ hoa tháng 7 – 8 có
mƣa nhiều (cây trồng ở các tỉnh miền Bắc).
* Nhu cầu ánh sáng: Ánh sáng đối với sa nhân tím cũng là

một nhân tố sinh thái cần và đủ. Có ánh sáng cây mới thực hiện đƣợc
quá trình quang hợp và đồng hoá. Trong môi trƣờng tự nhiên, sa nhân
tím thƣờng mọc xen dƣới tán những cây bụi và cây gỗ, với độ tàn che từ
10 – 60%; thậm chí có chỗ tới 70%. Tuy nhiên, ở độ tàn che trên
40% cây sinh trƣởng mạnh về chiều cao.
Ánh sáng là nhân tố cần thiết của cây. Song với độ tán che từ 10 –
20% (hoặc 30%) có lẽ là thích hợp nhất cho sa nhân tím sinh trƣởng phát
triển mạnh. Trong trƣờng hợp có những đám sa nhân tím mọc dày đặc,
không có cây che bóng trực tiếp mà vẫn sinh trƣởng phát triển tốt là do ở
xung quanh đó (ở đƣờng biên) có những cây gỗ hay cây bụi. Vấn đề quan
trọng nhất ở đây chính là môi trƣờng đất còn đủ ẩm. Vì thế chƣa bao giờ
thấy sa nhân tím xuất hiện ở những nơi đất khô cằn.
* Nhu cầu về dinh dưỡng khoáng: Cây sa nhân tím mọc tự
nhiên cũng nhƣ trồng đều cần các chất hữu cơ và chất khoáng để cho cây
sinh trƣởng và phát triển. Những chất này là do lớp thảm mục và các
sản phẩm thứ cấp từ động vật rừng cung cấp.
Vấn đề này còn phụ thuộc vào các nhân tố khác,
nhƣng chắc chắn nhu

Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
cầu
lân (P
2
O
5
) là quan trọng đối với
quá trình đậu quả và cho quả có hạt
chắc. Sa
nhân là cây trồng lấy quả, bởi vậy trong quá trình chăm sóc cần chú ý

cung cấp thêm các chất hữu cơ, chất khoáng trong đó không thể thiếu phân lân
[17].
1.1.3. Tiêu chuẩn chất lƣợng và giá trị
1.1.3.1. Tiêu chuẩn chất lượng
* Tiêu chuẩn chất lượng:
Theo dƣợc điển Việt Nam III (2002) [8].
- Hạt khô còn nguyên cả khối, hình trứng hay hình gần tròn, màu nâu
đen. Tỷ lệ hạt rời ra dƣới 10%. Độ ẩm còn lại dƣới 14%.
- Quan sát từng hạt rời riêng rẽ thấy bề mặt hạt nhẵn (nếu hạt lấy từ
quả non sẽ có bề mặt nhăn nheo), màu nâu đen; có vị cay, mùi thơm của tinh
dầu.
- Hàm lƣợng tinh dầu trong hạt đạt tỷ lệ trên 1,5%.
* Thành phần hoá học:
Trong sa nhân có chừng 2-3% tinh dầu. Thành phần chủ yếu của tinh
dầu là d.bocneola (19%), d.campho (33%), axetat bocnyla (26,5%),
d.limonen (7%), camphen (7%), phelandren (2,3%), parametoxyetylxinamat
(1%), pinen (1,8%), linalola, nerolidola ….Năm 1958, hệ dƣợc Viện y học
Bắc Kinh có nghiên cứu thấy loài sa nhân Amomum villosum Lour có
saporin với tỷ lệ 0,69% [11].
1.1.3.2. Giá trị
* Giá trị kinh tế:
Sa nhân là loại dƣợc liệu có giá trị sử dụng trong nƣớc và xuất
khẩu cao. Hàng năm, từ nguồn sa nhân mọc tự nhiên ở Việt Nam đã khai

Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
thác thu mua đƣợc khoảng 100-300 tấn (quả khô) sử dụng trong nƣớc và
vài trăm tấn xuất khẩu.
Giá thu mua sa nhân tại chỗ trung bình từ 30.000 đ đến
40.000 đ/kg quả khô (cả vỏ). Giá xuất khẩu 90.000đ đến 120.000 đ/ kg

khô (7/năm 2006) [17].
* Tác dụng dược lý:
Tinh dầu sa nhân (các loài trên) có tác dụng ức chế hoạt động của
các loại vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Dipcoccus
pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Protues vulgaris, Shigella
dysenteriae, Salmonella typhi; diệt amíp trên Entamoeba moshkowskii với
nồng độ ức chế thấp. Ngoài ra, sa nhân còn có tác dụng làm hạ sốt.
Theo quan niệm của y học cổ truyền (Lính nam bản thảo của Hải
Thƣợng Lãn Ông thế kỷ 18), sa nhân có vị cay, mùi thơm, tính ấm; tác
dụng vào 3 kinh thận, tỳ, vị; tác dụng ôn trung, hành khí, chỉ thống, khai
vị, tiêu thực, an thai.
* Công dụng làm thuốc:
Sa nhân đƣợc sử dụng nhiều để làm thuốc trong y học cổ truyền,
nhằm kích thích tiêu hoá; chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, đau dạ
dày, đau bụng do lạnh, ỉa chảy, kiết lỵ, sẩy thai, bệnh cao huyết áp, cao
cholesterol máu…
Lƣợng dùng 3 – 6 gam một ngày và thƣờng phối hợp với các vị
thuốc khác. Hiện đã thống kê đƣợc khoảng 60 bài thuốc khác nhau có sử
dụng sa nhân.
Ngoài ra, hạt sa nhân còn đƣợc dùng làm gia vị. Tinh dầu sa nhân
dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [2] [4], [5].


Số hóa bởi trung tâm học liệu
11
1.2. Tình hình nghiên cứu về cây sa nhân
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô
trên thế giới
Trên thế giới có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro
chi sa nhân (Amomum). Sajina và cộng sự (1997) bƣớc đầu đã xây dựng

quy trình nhân giống Amomum subulatum Roxb, đây là loài có giá trị kinh
tế quan trọng nhất ở Bengal - Ấn Độ [37]. Rao và đồng tác giả (2003) đã
nuôi cấy in vitro Amomum longiligulare T.L.Wu, kết quả số chồi thu đƣợc
tƣơng đối thấp, chỉ đạt 3,7 chồi/mẫu [35]. Một loài có giá trị khác thuộc chi
sa nhân là Amomum villosum Lour cũng đã đƣợc Ping (2004), Hong và Na
(2005) nhân giống in vitro từ chồi rễ [28], [33] . Amomum krervanh Pierre
ex Gagnep là cây dƣợc liệu phổ biến ở Thái Lan và Campuchia đã đƣợc
nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu nhân giống in vitro từ chồi nách [34],
[38]. Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire đã đƣợc Hongdong (2006)
nuôi in vitro và nhân nhanh từ chồi đỉnh [27].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô
ở Việt Nam
Ở Việt Nam, có rất ít công trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi
cấy in vitro cây sa nhân. Vịnh và cộng sự (2006) đã nghiên cứu áp dụng
công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong nhân nhanh sa nhân. Tuy nhiên
kết quả còn hạn chế[22]. Đặng Ngọc Phúc và cộng sự (2011) đã nghiên cứu
nhân giống in vitro cây sa nhân tím thu đƣợc kết quả cụ thể nhƣ sau: Đỉnh
sinh trƣởng và đoạn thân mang chồi nách từ thân rễ của cây tự nhiên đƣợc
khử trùng bằng HgCl
2
0,1% trong thời gian từ 5-18 phút. Thời gian khử trùng
12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trƣởng và
86,67% đối với đoạn thân. Mẫu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS bổ sung
riêng lẻ chất kích thích sinh trƣởng BAP, kinetin. Sau 8 tuần nuôi cấy, khả

Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
năng tái sinh chồi tốt nhất đạt đƣợc trên môi trƣờng bổ sung BAP 1,0 mg/l
(1,36 chồi/đỉnh sinh trƣởng;1,40 chồi/ đỉnh sinh trƣởng bổ đôi; 1,04
chồi/đoạn thân). Đoạn thân in vitro đƣợc cấy lên môi trƣờng nhân nhanh bổ

sung riêng lẻ hay kết hợp các chất kích thích sinh trƣởng BAP, kinetin và
NAA. Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trƣờng bổ sung BAP 1,5 mg/l kết hợp NAA
0,25 mg/l cho số chồi lớn nhất đạt 7,40 chồi/mẫu. Chồi in vitro đƣợc cảm
ứng rễ trên môi trƣờng MS bổ sung NAA hay IBA. Rễ đƣợc cảm ứng tốt nhất
trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA (18,42 rễ/chồi). Cây con in
vitro đƣợc huấn luyện thích nghi và trồng ở vƣờn ƣơm với tỷ lệ sống sót
93,14% [14].
1.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3.1. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh
mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là một công cụ cần thiết trong
nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học.
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô nhƣ: nuôi cấy mô phân sinh,
callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con ngƣời đã
thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự
nhiên. Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các
tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đƣa một giống
mới và sản xuất với quy mô lớn [10], [23].
Ngoài ra, dựa vào kĩ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản
đƣợc nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của
những loài thực vật sinh sản sinh dƣỡng. Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung
hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phƣơng
pháp lai giống cổ điển không thực hiện đƣợc. Bên cạnh đó, các nhà nghiên
cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn

Số hóa bởi trung tâm học liệu
13
định và ñộc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên "
mở ra triển vọng sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả
năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các hợp chất trên quy mô

công nghiệp " [9].
Ƣu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để
sản xuất các hợp chất thứ cấp:
+ Các tế bào thực vật có thể đƣợc nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo
mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần thiết để vận chuyển và
bảo quản một số lƣợng lớn các nguyên liệu thô.
+ Có thể kiểm soát chất lƣợng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ
những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, nhƣ là chất lƣợng của
nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hƣ hỏng trong quá
trình vận chuyển và bảo quản.
+ Một số sản phẩm trao đổi chất đƣợc sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền
phù có chất lƣợng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [10].
+ Phƣơng pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân
giống vô tính cổ điển nhƣ dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… một
kỹ thuật tiến bộ với những ƣu thế nhƣ tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống
cực kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa [1].
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là
mở ra những hƣớng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật nhƣ:
cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – đột biến, sinh lý dinh
dƣỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…[23].




Số hóa bởi trung tâm học liệu
14
1.3.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
* Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học ngƣời Đức Haberlandt, đã tiến
hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy,
mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình
phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ
chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp
điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh.
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham. Unio) đã thành công khi thực
nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế
bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô
tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [24].
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con ngƣời đã
hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào riêng rẽ.
* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Ví dụ:
Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm
nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nƣớc và chất dinh dƣỡng.
Quá trình phân hoá tế bào đƣợc biểu diễn ở sơ đồ sau:



Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chuyên hoá