khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

LỜI CAM ĐOAN
Kết thúc khóa học 2008-2011 chuyên nghành Công Nghệ Sinh Học của Trường
Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Trong quá trình học tập, em đã hoàn
thành tốt khóa học của mình, nay được vinh dự làm bài khóa luận tốt nghiệp để hoàn tất
chương trình học của mình và ra trường. Em rất tự hào khi mình là người được thực hiện
bài khóa luận này, do đó em thấy mình phải có trách nhiệm thực hiện tốt bài khóa luận
này, không sao chép nội dung bài khóa luận của người khác dưới bất kỳ hình thức nào.
Những số liệu trong bài của em là trung thực chứ không phải sao chép của bất kỳ ai khác.
Vì những lý do trên, em thấy mình phải có trách nhiệm thực hiện đúng với những gì
đã cam đoan như trên, thực hiện đúng và không có bất cứ sai phạm gì.
TP HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011

Sinh viên thực hiện


Nguyễn Trần Nhật Minh

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

LỜI CẢM ƠN
Tôi Xin Chân Thành Cảm Ơn :
 BGH Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM và các thầy cô ở Bộ môn
Công Nghệ Sinh học đã tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ,
quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 3 năm qua, và các thầy cô đã
cố gắng tạo mọi điều kiện để chúng em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
 Các anh chị trong phòng Thí Nghiệm Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ
TP.HCM đã cung cấp cho tôi những số liệu mà tôi cần, khi tôi làm về qui trình
thực nghiệm.
 Tất cả các bạn trong lớp 08csh thân yêu đã an ủi động viên tôi hoàn thành tốt bài
khóa luận này.
 Và con xin cám ơn cha, mẹ, chị hai, những người thân đã luôn động viên con, giúp
con có nghị lực để con có thể hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này.

TP HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Nhật Minh







Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
i
MỤC LỤC
Danh sách các từ viết tắt v
Danh sách các bảng vi
Danh sách các hình vii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào 3
2.2. Giới thiệu về Trichoderma Reesei 4
2.2.1. Lịch sử nguyên cứu Trichoderma 4
2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma Reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì 5
2.2.3. Hình thái của Trichoderma Reesei 5
2.2.4. Đặc điểm 6
2.2.5. Ứng dụng 8
2.2.5.1. Lương thực và nghành dệt 8
2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học 8

2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 8
2.2.5.4. Nguồn gen sử dụng trong chuyển gel 8
2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ 9
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme 10
2.4. Giới thiệu sơ lược về protease 12
2.4.1. Ứng dụng của protease 13
2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma Reesei 15
2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 16
2.5.2. Tính chất hóa lý của enzyme cellulase 18
2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase 19
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
ii
2.5.4. Các nguồn thu nhận enzyme

19

2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô 19
2.7. Cố định enzyme 20
2.7.1. Định nghĩa cố định enzyme 20
2.7.2. Ưu nhược điểm của cố định enzyme 20
2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định 21
2.7.4. Phương pháp cố định enzyme 21
2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định 22
2.7.5.1. Trong công nghiệp 22
2.7.5.2. Trong y học 22
2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học 23
2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường 23
2.7.6. Tình hình nguyên cứu trong và ngoài nước 24
2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước 24
2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước 24

CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 26
3.1. Thiết bị và hóa chất 26
3.1.1. Thiết bị 26
3.1.2. Hóa chất 28
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô 28
3.2.1. Thuyết minh quy trình 29
3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 31
3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Baradford 31
3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulase 33
3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ
pH tối thích đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35
3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 36
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
iii
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 37
3.4.4. Xác định độ pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 37
3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp enzymecellulase 38
3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 38
3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hoặc polymer 38
3.5.2. Tủa enzyme bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
ở các nồng độ khác nhau 39
3.5.3. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ 39
3.5.4. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính 39
3.5.5. Tủa protein-enzyme bằng điểm đẳng điện 40

3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel 40
3.7. Tinh sạch enzyme 41
3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 41
3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị 41
3.7.1.2. Hóa chất 41
3.7.1.3 Tinh sạch enzyme 41
3.8. Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide 43
3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide 43
3.8.2. Vật liệu 44
3.8.2.1. Dụng cụ và thiết bị 44
3.8.2.2. Hóa chất 45
3.8.3. Phương pháp 46
3.8.3.1. Đổ gel 46
3.8.3.2. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 48
3.8.3.3. Xác định trọng lượng phân tử của protein 48
3.9. Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase trên Natrialginate 49
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
4.1. Kết Luận 51
4.2. Đề Nghị 51
Tài Liệu Tham Khảo 52
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

iv
Phụ lục 54

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NTG: Nitrosoguanidine.
BM: Bã mía.
CM: Cám mì.
CMCase: Carboxymethyl cellulase.

FBU: Filter Paper Unit.
CBB: Coomassie Brilliant Blue.
DNS: Acid-2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic.
CMC: Sodium carboxymethyl cellulose.
TEMED: Tetramethylethylenediamine.
SDS Sodium Dodelcyl Sulfate.
PAGE: Polyacrylamide GelElectrophoresis.
DTT: Dithiotheitol.
PEG: polyethylene glycol.
HL: Hàm lượng.
HS: Hiệu suất.
DVHT E: Đơn vị hoạt tính enzyme.
APS: Ammoniumpersulfate.











Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào 3

Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất 25
Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn 31
Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase 34
Bảng 3.3 Thành phần môi trường thí nghiệm theo phần trăm 36
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng 49




















Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm
Trichoderma reesei. 5
Hình 2.2 Hình thái nấm Trichoderma Reesei 6
Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei 7
Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma 10
Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-) 12
Hình 2.6 Cấu trúc không gian của protease 13
Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 16
Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 17
Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulae 17
Hình 3.1 Máy đo pH 27
Hình 3.2 Cân phân tích 27
Hình 3.3 Máy đo quang UV 27
Hình 3.4 Máy ly tâm 27
Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 28
Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm 30
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng 50










Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực
phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có
thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm
hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất
phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất
thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme
cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và
môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có
trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và
trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa
trình phân giải này.
Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí
thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm
như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một
lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm. Nấm Trichoderma
spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác.
Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có
khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất
hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát
triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống.
Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm
Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả
nhất mà giá thành lại rẻ.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
2

Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đã
thực hiện khóa luận này: “Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm

Trichoderma Reesei”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
 Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei.
 Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
 Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei.
 Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton.
 Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase.
 Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate.
 Tinh sạch enzyme cellulase.













Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào
Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase,

nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với số
lượng lớn. Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme
cellulase.
Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào
STT

Tên chủng


Tên phân loại
Hoạt tính
celulase (unit/ml)
Thuộc
nhóm
1 B26 Bacillus subtilis 5,20
Vi khuẩn
2 B505 Bacillus subtilis 9,95
3 CFd - 7,71
4 CFh - 1,45
5 MSM 04 - 0,90
6 MSM 11 - 0,92
7 Li Bacillus lichenformis 9,76
8 A-62 Streptomyces sp 0,90 Xạ khuẩn
9 Y-519
Sarcharomyces
fibuligera
1,35
N
ấm men 10 Y-529
Sarcharomyces

fibuligera
2,67
11 Y-32
Sarcharomyces
capsularis
1,81
12 F273 Aspergillus niger 1,08
N
ấm mốc
13 708 Tricoderma konigii 0,89
N
ấm sợi
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
4

14 1’ - 1,32
-
15 V2 - 0,93
16 V3 - 1,10
17 V4 - 1,07
(-): chưa phân loại
2.2. Giới thiệu Trichoderma reesei
2.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma
Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được
biết là Trichodermaviride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà
phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học
khác. Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện
tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương.
Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM
6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này.

Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM
6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người
đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick
với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế
phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma
reesei này và các thể đột biến trên chủng đó.
Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và
Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của
Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần
đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không
tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng
nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một
phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
5

trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh
giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế
giới.

Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm
Tricoderma reesei. Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu
đỏ trong khi chất chitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu
xanh dương. (Ảnh: Mari Valkonen, VTT Finland)
2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì
Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ
chất bã mía kết hợp với cám mì. Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm
ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma. reesei VTT-D-
80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn.

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
6

2.2.3. Hình thái của nấm Trichoderma reesei
Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ
khuẩn ty. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối
nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không
màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình
elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng
xanh, lục xỉn đến lục đậm.

Hình 2.2 Hình thái Trichoderma Reesei
2.2.4. Đặc điểm
Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một
số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Nấm
Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số
giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào

trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc
với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Vì vậy, khi
được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt
rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và còn
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
7

hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năng
này.
Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh
và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất
là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công
các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển
của cây. Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng
của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển bởi nhiều
gen và sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm,
kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các điều kiện bất
lợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinh
dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh.
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ
chế sinh sản vô tính. Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhận
nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát
sinh học. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủ
yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa
trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng. Hiện nay nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài.

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
8

2.2.5. Ứng dụng
2.2.5.1. Lương thực và ngành dệt
Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả
cao. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme
khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng
trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích
tương tự.
2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học
Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được đăng
ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản
xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử
dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho
cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây.
2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng
Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm
qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích
thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường.
Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong
thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng
có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu
này giúp các loài cây như: bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán.
Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm
Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây
không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ.
2.2.5.4. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen
Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá
các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
9

nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong
chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được
thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển.
2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ
Hiện nay, việc bón phân hữu cơ cho cây cao su hầu như chưa được bà con nông
dân chú trọng dẫn đến mất cân bằng sinh thái môi trường đất. Hệ vi sinh vật suy giảm
đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển
và phát tán rất nhanh trong mùa mưa.
Vì vậy, việc bón phân hữu cơ là một trong những giải pháp quan trọng cần được
quan tâm thúc đẩy. Trong khi bệnh vàng lá, rụng lá đang có chiều hướng lây lan nhanh
việc bón phân hữu cơ có chứa nấm đối kháng Trichoderma là một giải pháp rất hữu
hiệu. Ngoài việc giúp cho bộ rễ cây phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng
Trichoderma sẽ tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có
trong đất.
Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán cây cũng là một
giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi trong môi trường
của vườn cao su tạo nên một hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài.
Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây
thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, do vậy nấm Trichoderma đã
được khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở tỉnh
Lâm Đồng những năm qua.

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
10


Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme
Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có
trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa

học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế
bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc
tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.
Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra
trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay
kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp
nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng
(37
0
C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…).
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
11

Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng
xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu
phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.
Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận
enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào
động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn
khác nhau.
 Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:
 Động vật (hạn chế).
 Thực vật (hạn chế).
 Vi sinh vật (phổ biến).
 Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn
nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn
chế.
 Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
 Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.
 Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú.

 Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả
năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng
trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất
cao.
 Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh.
 Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có
thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có
thể điều khiển dễ dàng các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể
thu được hiệu xuất cao trong sản xuất.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
12

 Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô
công nghiệp.


Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-)
2.4. Giới thiệu sơ lược về protease
Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase): Xúc tác quá trình thủy phân liên kết
peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng la acid
amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển
acid amin.
Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo
trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm 6 nhóm chính:
- Serine proteases.
- Threonine proteases.
- Cysteine proteases.
- Aspartic acid proteases.
- Metalloproteases.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

13

- Glutamic acid proteases.
Hiện nay, chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận
protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và vi rut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê).
So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt,
protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau
về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể
đồng nhất, do đó protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm có
tính thủy phân triệt để và đa dạng.









Hình 2.6 Cấu trúc không gian của protease
2.4.1. Ứng dụng của protease
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất như:
Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt
tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P.
roquerti, B. mesentericus được dùng trong sản xuất pho mát.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh

14

Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy…. Protease làm giảm thời gian
trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có
vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào
dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định - phương pháp này phổ biến và thuận
lợi nhất).
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường
thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất
nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản
xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực
vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị
của nước mắm.
Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm
tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để
thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công ngiệp thuộc da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy
phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị
cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định,
tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta
dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các
protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus)
và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại
nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác
như:
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
15

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực
phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp
enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn
nuôi gia súc và gia cầm.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,
kháng sinh….
- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản
xuất mỹ phẩm.
2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, 4-O-
glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ
gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4-
glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase
hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21).
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ
có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh
16


Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase
2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase
Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase,
β-glucosidase. Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các
liên kết ở bên trong phân tử cellulose.

Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử
cellulose.
β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose.