nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp agrobacterium tumefaciens kết hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
o0o




ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP


NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN VÀO
CÂY HOA CẨM CHƯỚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP SÓNG SIÊU ÂM

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành : 111


GVHD: TS. NGUYỄN THỊ THANH
SVTH : TRƯƠNG KHÁNH LINH
MSSV : 105111081



Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH SÁCH BẢNG BIỂU v

DANH SÁCH HÌNH VẼ vi

LỜI MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Công nghệ gen thực vật 1
1.1.1. Các phương pháp chuyển gen thực vật 1
1.1.1.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm 1
1.1.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 3
1.1.1.3. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens kết hợp sóng siêu âm. 9
1.1.2. Đoạn gen cần tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc 12
1.1.2.1. Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase) 12
1.1.2.2. Gen chỉ thị, gen chọn lọc 14
1.1.3. Các phương pháp phân tích cây chuyển gen 16
1.1.3.1. Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT
(phosphinothiricin) của cây tái sinh 16
1.1.3.2. Phương pháp thử GUS 16
1.1.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 17
1.1.3.4. Phương pháp phân tích điện di 18
1.1.3.5. Phương pháp Southern blot. 19

ii

1.2. Giới thiệu về cây hoa cẩm chướng 21

1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng 21
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng 26
1.2.3. Điều kiện ngoại cảnh 27
1.2.4. Nhân giống cây cẩm chướng 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Cẩm chướng 33
2.1.2. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp 34
2.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng 35
2.1.4. Điều kiện thí nghiệm 36
2.2. Sơ đồ qui trình và nội dung nghiên cứu 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu 38
2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt cẩm chướng 38
2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 40
2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine 40
2.3.4. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciences kết hợp sóng siêu âm 41
2.3.5. Phương pháp nhuộm GUS 42
2.3.6. Phương pháp tách chiết DNA thực vật 44
2.3.7. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 45
2.3.8. Phương pháp chạy điện di 46




iii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng hạt giống 48
3.2. Kết quả khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 52

3.3. Kết quả khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin 57
3.4. Kết quả chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển 61
3.5. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen chuyển 64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận 66
4.2. Đề nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC















iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
NAA -naphthaleneacetic acid
BA N
6

– Benzyladenine
MS Murashige and Skoog
LB Môi trường Luria-Bertania
B5 Môi trường B5
MSB5 Môi trường MS có thay vitamin môi trường MS bằng vitamin môi
trường B5.
DNA Deoxyribonucleic acid
T-DNA transfer-DNA
GFP Green fluorescent protein
GUSA β-Glucoronidase
PEG Polymethylen glycol
PCR Polymerase chain reaction
AS
acetosyringone
Hpt hygromycine phosphotransferase
Ipt isopentenyl transferase
Hyg Hygromycin






v

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Tham khảo thị trường xuất khẩu hoa cây cảnh tháng 04/2007 25
Bảng 1.2: Tham khảo mặt hàng hoa cây cảnh xuất khẩu trong 10 ngày cuối tháng
07/2007 25
Bảng 3.1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 1.5% 48

Bảng 3.2: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 3.0% 48
Bảng 3.3: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 5.0% 48
Bảng 3.4: Số lượng chồi tạo thành trung bình ở mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy 52
Bảng 3.5: Mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi trường tái sinh 53
Bảng 3.6: Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho việc chọn lọc dòng chuyển
gen 57
Bảng 3.7: Mức độ tương đương của các kết quả thử nồng độ hygromycin 59
Bảng 3.8: Số mẫu còn sống sót trên môi trường tái sinh chứa hygrmycin 12mg/l 61












vi

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Sóng siêu âm và hiện tượng cavitation 2
Hình 1.2: Hình vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi 4
Hình 1.3: Nốt sần gây ra bởi vi khuẩn Agrobacterium trên thực vật. 4
Hình 1.4: Sơ đồ vector Ti plasmid 5
Hình 1.5. Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật 6
Hình 1.6: Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen 8
Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt) 10

Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào vào trong tế bào nhờ sóng âm. 10
Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA 11
Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens kết
hợp với sóng âm 11
Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp
cytokinin isopentenyl transferase 13
Hình 1.12: Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot. 20
Hình 1.13: Hoa cẩm chướng 21
Hình 2.1: Hoa cẩm chướng 33
Hình 2.2: Hạt cẩm chướng (Dianthus caryophylus) 33
Hình 2.3: Cây cẩm chướng in vitro 33
Hình 2.4: Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen hpt),
gen gusA và gen ipt 34
Hình 2.5: Gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396 34
Hình 2.6: Sơ đồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen 37
Hình 2.7: Qui trình khử mẫu 39

vii

Hình 3.1: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nhiễm ở nồng độ javel 1.5%, 3.0%, 5.0% và thời
gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút. 49
Hình 3.2: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ javel 3.0%, 5.0% và thời gian
khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút 49
Hình 3.3: Sự phát triển của cây sau 13 ngày ở nồng độ javel 3.0% 50
Hình 3.4: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 10 ngày 51
Hình 3.5: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 5.0% sau 10 ngày 51
Hình 3.6: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 14 ngày 51
Hính 3.7: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi
trường tái sinh 53
Hình 3.8: Biểu đồ khảo sát số chồi tái sinh từ môi trường TS0 đến TS10. 54

Hình 3.9: Biểu đồ so sánh khả năng tạo chồi của nhóm môi trường có nồng độ NAA
0.1 mg/l và nhóm môi trường có nồng độ NAA 0.2 mg/l 54
Hình 3.10: Khảo sát môi trường tái sinh tử diệp cẩm chướng. 55
Hình 3.11: Sơ đồ khảo sát nồng độ hygromycin trong 28 ngày 57
Hính 3.12: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thử nồng độ
hygromycin 59

Hình 3.13: Mẫu tử diệp trên môi trường tái sinh với các nồng độ hygromycin khác
nhau 0 (đối chứng), 4, 8, 12, 16, 20 mg/l sau 4 tuần chọn lọc 60
Hình 3.14: Quá trình chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển trên môi trường tái
sinh chứa hygomycin 62

viii

Hình 3.15: Nhuộm GUS tử diệp cẩm chướng sau 6 ngày ủ với vi khuẩn. 64
Hình 3.16: Nhuộm GUS mô sẹo sau 3 tuần cấy chuyển trên môi trường chọn lọc
chứa 12mg/l hygromycin 64
Hình 3.17: Kết quả PCR đối với gen hyt ở D. caryophylus L. sau chọn lọc. 64


LỜI MỞ ĐẦU

Cây cẩm chướng du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60, chủ yếu được trồng
làm cây cảnh, trang trí. Về sau, đến những năm 80, các giống cây cẩm chướng từ các
nước Pháp, Hà Lan, Trung Quốc… du nhập vào nước ta. Hiện nay, cây hoa cẩm
chướng không chỉ được trồng để trang trí mà được sản xuất để phục vụ mục đích
kinh tế, sản xuất hoa cắt cành. Tuy nhiên, hoa do chúng ta xuất khẩu chưa thể cạnh
tranh được với các nước lớn do chất lượng và màu sắc hoa không phong phú bằng.
Để hướng tới mục đích kinh tế, cần cải thiện và nâng cao chất lượng giống hoa cẩm
chướng. Phương pháp khoa học ta có thể áp dụng là phục tráng, lai tạo và chuyển

các gen mang đặc tính tốt cho cây.
Một trong những yếu tố làm giảm chất lượng hoa là sự lão suy cành hoa sau
khi cắt. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khám phá ra sự lão suy cây có thể khắc
phục nhờ hợp chất cytokinin. Tuy nhiên xử lý ctytokinin từ bên ngoài có thể làm
chậm sự lão suy lá trong một số loại cây một lá mầm và hai lá mầm, chiến lược
chuyển gen sản xuất cytokinin tự điều chỉnh này được kỳ vọng có tiềm năng trong
việc làm chậm quá trình lão suy ở một phổ rộng các loại cây trồng. Đề tài “Nghiên
cứu chuyển gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Agrobacterium
tumefaciens kết hợp sóng siêu âm” với gen chuyển mục tiêu là gen ipt (isopentenyl
transferase) tổng hợp cytokinin hướng hẹn sẽ cải thiện và nâng cao chất lượng giống
cây hoa cẩm chướng.








CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU







Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

1

1.1. Công nghệ gen thực vật
1.1.1. Các phương pháp chuyển gen thực vật
Chuyển gen là tập hợp nhiều kỹ thuật khác nhau nhằm đưa một gen lạ (một
đoạn DNA) vào trong tế bào, gắn gen đó với bộ gen của tế bào làm cho gen lạ tồn tại
lâu dài, ổn định và được biểu hiện tạo nên các thể chuyển gen hay sinh vật biến đổi
gen (GMO – Genetically Modified Organism).
Các kỹ thuật chuyển gen được chia làm 2 nhóm phương pháp: chuyển gen
trực tiếp gồm các phương pháp dựa vào hóa học, vật lý và chuyển gen gián tiếp nhờ
vector mang gen chuyển.
1.1.1.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm
Gần đây, sóng âm được ứng dụng rộng rãi trong nhiểu lĩnh vực liên quan nhờ
khả năng thúc đẩy hiện tượng cavitation xảy ra. Sự tạo và vỡ bọt (cavitation) đóng
vai trò như một trung gian để nhận năng lượng và tập trung năng lượng của sóng âm,
chuyển năng lượng này sang dạng có ích cho hóa học. Hiện tượng cavitation có thể
gây tổn thương tế bào, làm chết tế bào hoặc tạo lỗ (kênh) trên màng tế bào tạm thời.
Sự tạo lỗ tạm thời trên màng bởi sóng âm được gọi là sonoporation.
Khả năng tạo nên các lỗ màng này giúp gen cần chuyển (các đoạn DNA) dễ
dàng vào trong tế bào, có thể tạo được các thể tái tổ hợp với bộ gen của tế bào chủ.
Cơ chế tạo các lỗ màng
Siêu âm trong môi trường lỏng sản sinh ra một năng lượng lớn do nó gây nên
một hiện tượng vật lý đó là cavitation (sự tạo và vỡ bọt), quá trình này phụ thuộc vào
môi trường phản ứng (môi trường đồng thể lỏng rất khác so với cavitation ở bề mặt
tiếp xúc rắn-lỏng).
Siêu âm được chiếu xạ qua môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, nó
gây ra áp suất chân không trong môi trường lỏng. Hiện tượng cavitation xảy ra khi áp
suất chân không vượt quá so với độ bền kéo của chất lỏng, độ bền này thay đổi tùy

theo loại và độ tinh khiết của chất lỏng (độ bền kéo là ứng suất tối đa mà chất lỏng
có thể chịu được khi kéo). Thông thường sự tạo-vỡ bọt bắt nguồn từ những chỗ yếu
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

2

trong chất lỏng như một lỗ hổng chứa khí phân tán lơ lửng trong hệ hoặc là những vi
bọt (microbubble) tồn tại thời gian ngắn trước khi sự tạo-vỡ bọt xảy ra. Những vi bọt
này qua sự chiếu xạ của siêu âm thì sẽ hấp thu dần năng lượng từ sóng và sẽ phát
triển. Sự phát triển của bọt phụ thuộc vào cường độ của sóng. Ở cường độ sóng cao,
những bọt này sẽ phát triển nhanh thông qua tương tác quán tính. Nếu chu kỳ giãn nở
của sóng đủ nhanh, bọt khí được giãn ra ở nửa chu kỳ đầu và nửa chu kỳ còn lại là
nén bọt, nhưng bọt chưa kịp nén thì lại được giãn tiếp, cứ thế bọt lớn dần lên và vỡ.
Ở cường độ âm thấp hơn bọt khí cũng hình thành theo quá trình chậm hơn.

Hình 1.1: Sóng siêu âm và hiện tượng cavitation
(Nguồn: />solids?set_language=en
,
Sonication of Biosolids)

Khi bọt phát triển tới kích thước không thể phát triển tiếp được (ở cả 2 trường
hợp cường độ sóng cao và thấp), bọt không hấp thu năng lượng được nữa, không tiếp
tục giữ được hình dạng của nó. Và dưới áp lực từ chất lỏng bên ngoài đẩy vào trong,
kết quả là bọt sẽ vỡ vào trong.
Đặc biệt trong môi trường lỏng-rắn, khi hiện tượng cavitation xảy ra gần bề
mặt phân cách lỏng - rắn thì nó khác so với trong hệ đồng thể. Ở hệ đồng thể, trong
quá trình vỡ bọt, bọt vẫn ở dạng hình cầu đối xứng. Tuy nhiên, ở ranh giới phân cách
rắn lỏng thì sự vỡ bọt ở dạng rất bất đối xứng và tạo ra một sự phun chất lỏng với tốc

độ rất cao.
Sự có mặt của bề mặt rắn là nguyên nhân của sự vỡ bất đối xứng, hình thành
một vòi chất lỏng bắn vào bề mặt rắn với tốc độ rất cao. Thế năng của sự giãn nở bọt
được chuyển thành động năng của vòi phun chất lỏng, nó hình thành và di chuyển
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

3

vào phía trong, đâm xuyên qua bóng khí. Những vòi này bắn vào bề mặt rắn với một
lực rất lớn, quá trình này tạo ra một lỗ thủng tại vị trí bị tác kích. Nhờ vậy mà sóng
âm có thể tạo lỗ trên màng tế bào tạo điều kiện cho các gen chuyển hay các vector
mang gen chuyển xâm nhập vào tế bào.
Sau quá trình chuyển gen, dựa vào các gen chỉ thị, thực hiện quá trình sàng
lọc để lựa chọn các thể chuyển gen (GMO – Genetically Modified Organism). Nuôi
cấy hoặc chăm sóc các thể chuyển gen và kiểm tra sự biểu hiện gen mới trong thể
chuyển gen, tiếp tục chọn lọc để tạo được các thể chuyển gen theo ý muốn có tính ổn
định di truyền.
Ngoài kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm kể trên, còn nhiều kỹ
thuật chuyển gen trực tiếp khác được sử dụng như kỹ thuật chuyển gen qua ống
phấn, chuyển gen bằng phương pháp sốc nhiệt, chuyển gen bằng phương pháp điện
xung, chuyển gen bằng kỹ thuật PEG (Polyethylen glycol), và hiện đại nhất là
chuyển gen bằng súng bắn gen …[3, 4, 5, 12, 28]
1.1.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Đây là hệ thống chuyển gen vào thực vật thành công lần đầu tiên vào năm
1983 bằng cách định vị và thao tác trên plasmid của loài vi khuẩn gây bệnh
Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes. Hệ thống chuyển gen này
đem lại việc chuyển gen một cách tự nhiên, sự biểu hiện gen trên đối tượng đích và
còn bao gồm hệ thống chọn lọc. Hiện nay, A. tumefaciens đã được xử lý để trở thành

công cụ chuyển gen tự nhiên đem lại hiệu quả bậc nhất.
Nguyên lý của phương pháp là Ti plasmid của vi khuẩn được cải biến cấu trúc
di truyền bằng cách cắt bỏ một đoạn dài chứa T-DNA, đồng thời gắn thêm vào một
đoạn của plasmid khác tạo nên các vector chuyển gen có kích thước phù hợp, mang
các gen giúp khả năng xâm nhiễm tự nhiên của vi khuẩn vào thực vật đồng thời
mang các gen chuyển mong muốn.
Agrobacterium tumefaciens (hình 1.2) thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hình
que, di động, không sinh bào tử, sống tự do trong đất. A. tumefaciens gây bệnh khối
u trên thân và rễ thực vật (hình 1.3).
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

4







Hình 1.2: Hình vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi
(nguồn: www.bio.davidson.edu/ /method/dsmeth/ds.htm)






Hình 1.3: Nốt sần gây ra bởi vi khuẩn Agrobacterium trên thực vật.

(nguồn: />Khả năng gây bệnh của vi khuẩn này dựa trên Ti plasmid. Khi cây bị nhiễm A.
tumefaciens qua các vết thương, các khối u được hình thành ngay trên chỗ lây nhiễm.
Sự hình thành khối u được tiếp diễn mà không nhất thiết cần sự có mặt của vi khuẩn,
do vi khuẩn đã chuyển một đoạn DNA của Ti plasmid (T-DNA) nhập vào bộ gen của
cây bị bệnh. Phân tích các khối u của cây cho thấy sự hình thành các chất mới như
nopaline, octopine và agropine gọi chung là opine (không tồn tại ở cây bình thường).
 Ti plasmide của vi khuẩn A. Tumefaciens
Ti plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật, có kích thước khoảng 200kp
và gồm có 3 vùng chủ yếu:
 Vùng T-DNA (transfer-DNA) mang hai hệ gen: (1) hệ gen gây khối u onc
(oncogenic), chứa ít nhất 3 gen chịu trách nhiệm tổng hợp các phytohormon
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

5

auxin và cytokinin nên liên quan đến việc sản sinh và duy trì sự phân chia tế
bào liên tục. (2) hệ gen mã hóa cho một số enzym điều khiển quá trình tổng
hợp các dẫn xuất của các acid amin hay đường, gọi là opine. Vùng T-DNA
được giới hạn tại hai đầu bởi một đoạn nucleotide dài 25bp được gọi là các T-
DNA borders (bờ T-DNA). Bờ trái thì không cần thiết nhưng bờ phải tuyệt
đối quan trọng cho việc chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật. Nhờ khả
năng sinh tổng hợp auxin và cytokinin mà các tế bào khối u của thực vật bị
nhiễm có khả năng tăng trưởng. Những chủng khác của A. tumefaciens chứa
các loại Ti plasmid khác nhau sẽ mã hóa cho sự sản xuất các opine khác nhau.
Opine là các amino acid bất thường (không có trong mô bình thường) được vi
khuẩn sử dụng như đài chất dinh dưỡng để sinh sản nhanh chóng.
 Vùng dị hóa opine (opine catabolism), sự dị hóa opine được kiểm soát bởi các
loci (noc đối với nopaline, occ đối với octapine) trên nhánh phải của Ti

plasmid.
 Vùng Vir (Virulence region) vùng độc, chứa các gen vir, giữ vai trò quan
trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen của tế bào thực vật.












Hình 1.4: Sơ đồ vector Ti plasmid
(nguồn: o/students/paaras/ti_plasmid.jpg)
Gen tạo khối
Sinh tổng hợp auxin
Khởi đầu sao chép
Vùng vir
Vùng dị hóa
opine
Vùng tiếp hợp
Sinh tổng hợp
cytokinin
Sinh tổng
hợp opine
Bờ trái
Bờ phải

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

6

 Hoạt động của Ti plasmid và cơ chế xâm nhiễm, chuyển gen vào tế bào thực
vật











Hình 1.5. Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật
(nguồn:

Việc phân tích di truyền A. tumefaciens đã được áp dụng để phân lập các thể
“determinant” đặc biệt của vi khuẩn. Gen định vị trên vùng vir của Ti plasmid cũng
như trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn đều quan trọng như nhau. Tiến trình gắn vào của
vi khuẩn và tiến trình di chuyển DNA có liên quan đến hiện tượng tiếp hợp của vi
khuẩn. Phân tử DNA di chuyển từ một tế bào vi khuẩn đến tế bào thực vật nhiều hơn
di chuyển từ vi khuẩn đến vi khuẩn.
Cơ chế chuyển Ti-plasmid từ vi khuẩn A. tumefaciens vào tế bào thực vật còn
chưa sáng tỏ. Bản thân vi khuẩn không bị tế bào nuốt chửng, mà khi tiếp xúc với tế

bào thực vật, T-DNA vòng từ Ti plasmid tiết ra rồi chuyển vào cây để gắn bền vững
với bộ gen (genome) của cây.
Ở giai đoạn đầu tiên, sự kết gắn giữa Agrobacterium và tế bào cây bị tổn
thương được kiểm soát bởi hai loci “virulence” của vi khuẩn (chvA và chvB) định vị
trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, không có trên Ti plasmid. Hiện nay người ta nhận ra
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

7

rằng các vi khuẩn này đáp ứng với các hợp chất phenol có tính chất tín hiệu nhất
định của thực vật như acetosyringon (AS) và α-hydroxyaxetosyringon (OH-AS)
trong trường hợp cụ thể đã được ghi nhận (Stachel và cs.1985) được tiết ra bởi các
cây bị thương mẫn cảm. Các phân tử nhỏ này gây cảm ứng gen độc (vir) được mã
hóa trên plasmid Ti.
Phân tích vùng vir (regulon) của Ti plasmid thấy rằng có 6 vùng (operon) cần
cho sự dịch chuyển T-DNA đến tế bào thực vật, các loci được đặt tên là virA, B, C,
D, E, và G. Sự điều tiết của vùng vir được thực hiện thông qua sự thể hiện gen có
tính cấu trúc của virA và virG. Protein virA cần di chuyển tín hiệu AS từ vị trí kế bên
mô cây bị thương xuyên qua màng tế bào vào tế bào của A. tumefaciens. AS hỗ trợ
với protein virG kích thích sự thể hiện virB, C, D, E. Sự thể hiện các gen này cần
phải cắt T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào cây.
Vai trò của các gen trong vùng vir như sau
 VirA mã hóa cho protein có chức năng như hóa thụ quan thực hiện vận
chuyển qua màng.
 VirG mã hóa cho protein điều hòa dương đóng vai trò thông tin đến loci của
những gen vir khác.
 VirC và virD giữ chức năng là những endonuclease tại vị trí đặc biệt trên
những trình tự lặp lại của T-DNA, tạo những sợi T-DNA mạch đơn (T-

strand).
 VirE bám bên ngoài, bảo vệ sợi T-DNA mạch đơn trong suốt quá trình vận
chuyển qua tế bào thực vật .
 VirB mã hóa cho protein chuyên chở trên bề mặt tế bào vi khuẩn, giúp T-
DNA được vận chuyển vào trong tế bào thực vật.
 Sự tích hợp vào bộ gen thực vật với cơ chế chưa xác định rõ và được xem là
xảy ra qua sự tái tổ hợp không đúng luật (illegitimate recombination)
(Gheysen và cs, 1991; Lehman và cs, 1994; Puchta, 1998).
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

8

Sau khi tích hợp vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện.
Sự sản xuất các cytokinin, các indoleacetic acid làm rối loạn sinh trưởng bình thường
của tế bào, gây ra sự tạo thành các khối u là một môi trường giàu dinh dưỡng cho vi
khuẩn. Bên cạnh đó, sự tổng hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các
opine (dẫn xuất acid amine đặc biệt) và agrocinopine (dẫn xuất đường được
phosphoryl hóa) cung cấp cho Agrobacterium nguồn dinh dưỡng mà không một vi
khuẩn nào khác có thể sử dụng được.[3, 4, 9, 10, 13, 14, 15]
Một tiến bộ trong phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium là
hoạt chất acetosyringone hỗ trợ cho quá trình chuyển gen.
Acetosyringone (tên hóa học: 1-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) ethanol),
công thức phân tử là C
10
H
12
0
4

, có tác dụng kích thích quá trình biến nạp gen của A.
tumefaciens vào tế bào mô vì acetosyringone là hợp chất được sản sinh khi tế bào bị
tổn thương. Đây là tín hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào
tế bào thực vật. Ở nồng độ cao, acetosyringone sẽ được nhận diện bởi protein virA-
receptor trên màng vi khuẩn. Đây là một protein cần thiết để chuyển phân tử tín hiệu
acetosyringone từ vị trí kế bên mô cây bị tổn thương, xuyên qua màng tế bào, vào tế
bào của Agrobacterium. Sau khi vào tế bào của Agrobacterium, acetosyringone hoạt
động như một nhân tố có tính chất hoạt hóa virA hỗ trợ với virG-protein để kích
thích sự thể hiện virB, virC, virD, virE. Sự thể hiện các gen này cần thiết cho việc cắt
T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào thực vật. [14, 19, 29]






Hình 1.6: Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen
(nguồn:

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

9

Nhờ hoạt chất acetosyringone mà hiệu suất chuyển gen cao gấp nhiều lần.
Trong bài báo cáo của Sheikholeslam SN, Weeks DP năm 1987 với đề tài
‘Acetosyringone promotes high frequency transformation of Arabidopsis thaliana
explants by Agrobacterium tumefaciens’ đã ghi nhận với việc bổ sung acetorycinone,
hiệu suất chuyển gen là 55 đến 63% thay vì bình thường là 2-3%.

Ngoài dùng vi khuẩn là vector chuyển gen thì virus cũng có thể là một dạng
vector. Nhiều virus như CaMV (Cauliflower mosacic virus), Geminivirus, virus đốm
thuốc lá… được dùng làm vector chuyển gen thực vật. Chuyển gen nhờ virus có một
số thuận lợi như virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và có thể mang
đoạn DNA lớn hơn so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên, khi sử dụng virus cần
một số lưu ý: hệ gen của virus phải là DNA, virus có thể chuyển từ tế bào này sang tế
bào khác qua các lỗ ở vách tế bào thực vật, virus có khả năng mang được đoạn DNA
mới, có khả năng xâm nhiễm vào nhiều loại cây, không có tác hại đáng kể cho thực
vật. Hiện nay, sử dụng virus chuyển gen thực vật còn ít vì DNA virus khó biến nạp
vào hệ gen thực vật. [ 3, 4, 13]
1.1.1.3 Phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp
sóng siêu âm.
Ứng dụng tạo lỗ tạm thời trên màng tế bào - sonoporation của sóng siêu âm
trong chuyển gen vào tế bào và mô phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây
đặc biệt là một số các dòng tế bào đã được chuyển gen thành công. Trong tế bào,
hiện tượng cavitation khởi động và điều khiển rất khó, tuy nhiên có thể điều chỉnh
nhờ sóng âm tác động đến các bọt khí. Tùy vào đối tượng chuyển gen mà thời gian
tạo sóng âm và tần số sóng âm được điều chỉnh.
Để tăng hiệu suất chuyển gen thì các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào
phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm
trong chuyển gen vào mô, tế bào thực vật (sonication-assisted Agrobacterium-
mediated transformation) được viết tắt là SAAT. Các bọt khí cực nhỏ (bubbles) được
ứng dụng để chuyển gen vào trong mô và tế bào thực vật.

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

10

Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt)















Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào.
A, B, C, D : những tế bào được xử lý sóng âm
E, F: tế bào không được xử lý sóng âm.

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

11

Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ sóng âm.
Sóng âm làm tăng hiện tượng cavitation, tạo lỗ (kênh) trên màng, các T-DNA
của A. tumefaciens plasmid sẽ qua lỗ màng vào trong tế bào thực vật dễ dàng và
nhanh chóng.











Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào
nhờ Agrobacterium tumefaciens kết hợp với sóng âm.
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

12

Sau khi T-DNA của A. tumefaciens vào được bên trong tế bào nó nhanh
chóng tích hợp vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện, sự tổng

hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các hợp chất mà ta mong muốn sẽ
được thực hiện.
Phương pháp SAAT mới được nghiên cứu và ứng dụng nhưng mang lại nhiều
thành công và hứa hẹn trong công nghệ chuyển gen nói chung và chuyển gen thực
vật nói riêng. [3, 12, 15, 28]
1.1.2. Đoạn gen tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc.
1.1.2.1 Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase)
Gen cần tách dòng hay còn gọi là gen cần thiết thường là những gen mã hóa
các protein, enzym hoặc gen mã hóa các đặc điểm quí (năng suất cao, khả năng
chống chịu bệnh…) cần thiết cho con người trong thực tiễn sản xuất hoặc trong
nghiên cứu.
Gen cần tách dòng có thể được chuẩn bị theo hai con đường: tách chiết từ bộ
gen vi sinh vật, động thực vật, con người, hoặc tổng hợp nhân tạo các oligonucleotid.
Trong thực tế, các gen mang đặc điểm quí thường được tách chiết từ vi sinh vật hay
các sinh vật bậc cao.
Trong thí nghiệm này, đoạn gen cần tách dòng là gen tổng hợp cytokinin
isopentenyl transferase (ipt). Nghiên cứu về sinh lý đã cho thấy là trong nhiều loài,
cytokinin có thể ức chế lão suy và mức độ cytokine nội sinh đó giảm đi cùng với tiến
trình lão suy (reviewed by Gan and Amasino, 1996). Biểu hiện của gen ipt sẽ dẫn
đến việc sản xuất cytokinin. Nhiều chiến lược (với các promoter khác nhau) đã được
thực hiện để điều khiển sự biểu hiện của gen ipt trong cây chuyển gene, gồm các
promoter cảm ứng nhiệt, vết thương, sáng và những promoter đặc hiệu. Hầu hết
những cây chuyển gen cấu trúc có chứa gen ipt đều biểu hiện chậm lão suy, cũng như
có những bất thường về phát triển và phát sinh hình thái. Điều này có thể do
cytokinin tác động mạnh đến quá trình phát triển ngoài lão suy, và việc sản xuất quá
mức cytokinin trước khi lão suy xảy ra sẽ can thiệp vào sự phát triển bình thường của
cây. Để tránh vấn đề này, promoter SAG12 đặc hiệu cao cho lão suy được dùng để
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

13

điều khiển biểu hiện của gen ipt (Gan and Amasino, 1995). Promoter này kích hoạt
biểu hiện của gen ipt tại thời điểm bắt đầu lão suy, dẫn đến tăng lượng cytokinin,
ngăn cản quá trình lão suy. Lượng cytokinin ức chế lão suy sẽ tăng đến một ngưỡng
nào đó và bắt đầu làm yếu đi promoter đặc hiệu lão suy, do đó ngăn cản được việc
tích trữ cytokinin ở một mức độ mà nó có thể can thiệp tới những mặt phát triển khác
của cây.[3, 9]






Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp
cytokinin isopentenyl transferase.
(Sự bắt đầu của lão suy kích hoạt promoter SAG 12 điều khiển sự sản xuất
của cytokinin. Cytokinin được tạo ra ức chế quá trình lão suy, và nếu lượng
cytokinin cao sẽ quay lại ức chế hoạt động promoter SAG để ngăn cản sự
sản xuất quá mức các cytokinin)

Những nghiên cứu chuyển gen ipt ở cây trồng
 Các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt của các tác giả Gan và cs, 1996; Wang và
cs, 1997 trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) cho thấy hàm lượng
cytokinin tăng lên trong cây chuyển gen và do đó làm chậm sự lão hoá của lá
và hoa.
 Năm 2001, công trình "Ảnh hưởng của biểu hiện gen ipt promoter SAG12 đối
với sự phát triển và lão suy ở cây cải xà lách (Lactuca sativa L. cv. ‘Evola’)
chuyển gen", tác giả Matthew S. McCabe và cộng sự thực hiện chuyển gen ipt

điều khiển bởi promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn A.
tumefaciens trên đối tượng lá mầm cây cải xà lách. Kết quả cho thấy hàm
lượng cytokinin tăng trong cây chuyển gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá
trong quá trình phát triển cây cũng như sau thu hoạch của cây chuyển gen.
Isopentenyl transferase
Lão suy
Cytokinin
SAG 12 promoter
Lượng Cytokinin cao
Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu

SVTH: Trương Khánh Linh

14

 Năm 2003, Công trình "Sản xuất thừa các cytokinins trong hoa cây thuốc lá
cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy
tràng hoa và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene". Hsiang Chang và cộng sự
đã nghiên cứu chuyển gen ipt được điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây
hoa Dã yên (Petunia hybrida cv. ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A.
tumefaciens. Kết quả cho thấy hoa của các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ
dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây chuyển gen kém mẫn cảm hơn
đối với ethylen ngoại sinh. Kết luận quan trọng của nghiên cứu này là có thể
sử dụng gen ipt trong nghiên cứu chuyển nạp gen tạo giống cây trồng tăng
tuổi thọ của hoa như hoa phong lan, cẩm chướng, lily…
 Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng
(Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão
suy SAG12" do Ornella Calderini và cộng sự thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng
tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc. Phương
pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens.

 Một nghiên cứu quan trọng gần đây nhất do hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và
Nhật Bản ( Rivero và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống
chịu được hạn hán bằng phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá. Các
nhà nghiên cứu hy vọng phát hiện này sẽ giúp giảm những thiệt hại về mùa
màng do hạn hán và cho phép sản xuất lương thực tại các vùng thiếu nước.

1.1.2.2

Gen chỉ thị, gen chọn lọc

Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA
plasmid, trong đó ngoài các promoter, các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho
DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai (gen cần tách dòng)… còn
có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm. Các gen được lắp ghép vào
DNA của plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị
sàng lọc.
Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme
chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi