tổng quan về enzyme ngoại bào bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
o0o



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


TỔNG QUAN VỀ ENZYME NGOẠI
BÀO BACILLUS SUBTISLIS



Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành : C73



GVGD: Th.S. Trịnh Thị Lan Anh
SVTH : Tống Ngọc Triêm
LỚP : 07CSH
MSSV : 207111066


Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KTCN TPHCM
KHOA MT & CNSH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HỌ VÀ TÊN: Tống Ngọc Triêm
MSSV: 207111066
NGÀNH: Công nghệ Sinh học
LỚP: 07CSH
1. Đầu đề khóa luận tốt nghiệp:
“
Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”.
2. Nhiệm vụ:
− Định hướng tên đề tài tốt nghiệp.
− Tìm kiếm thông tin và đọc tài liệu tham khảo có liên quan đến lĩnh vực
nghiên cứu.
− Xây dựng đề cương định hướng cho đề tài tốt nghiệp đã chọn.
− Thu thập, tổng hợp và trình bày khóa luận theo đề tài nghiên cứu
3. Ngày giao khóa luận tốt nghiệp: 05 - 04 – 2010
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28 - 06 - 2010
5. Họ tên người hướng dẫn: Ph
ần hướng dẫn
Th.S. Trịnh Thị Lan Anh Toàn bộ khóa luận
Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã được thông qua Bộ môn.
Ngày 07 tháng 07 năm 2010
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)



PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ):
Đơn vị:
Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC


NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Th.S. Trịnh Thị Lan
Anh đã động viên, giúp đỡ hướng dẫn tôi hoàn thành bản khóa luận tốt nghiệp
này.
Tôi cũng xin cảm ơn cô Bùi Thị Việt Hà (Khoa Sinh trường đại học khoa
học tự nhiên Hà Nội), cô Nguyễn Hoàng Mỹ, đã giúp đỡ và cung cấp những tài
liệu, kiến thức bổ ích giúp tôi thực hiện tốt các nhiệm vụ được giao.
Tôi cũng xin cảm ơn Quý Thầy Cô khoa Môi tr
ường & Công nghệ Sinh
học đã tận tình dạy dỗ tôi trong những năm học tại trường
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người
thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả
như ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quý báu đó!

Tp.HCM, ngày 28 tháng 06 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Tống Ngọc Triêm



Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH viii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME NGOẠI BÀO
CỦA VI SINH VẬT 3
1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào 3
1.1.1 Định nghĩa 3
1.1.2. Phân loại 3
1.1.3. Đặc điểm - tính chất 4
1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật 8
1.2.1. Enzyme amylase 8
1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của α-amylase 9
1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase 12

1.2.1.3. Đặc tính và cơ chế xúc tác của glucoamylase 14
1.2.1.4. Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase 17
1.2.1.5. Đặc tính và cơ chế xúc tác của oligo-1,6-glucosidase 17
1.2.1.6. Đặc tính và cơ chế xúc tác của transglucosyldase 18
1.2.2. Enzyme protease 20
1.2.2.1. Phân loại và đặc tính của protease vi sinh vật 21
1.2.2.2. Cơ chế xúc tác của protease vi sinh vật 24
1.2.3. Enzyme pectinase 25
1.2.3.1. Đặc điểm và tính chất của pectinase vi sinh vật 25
1.2.3.2. Phân loại và cơ chế xúc tác của pectinase ngoại bào 26
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


iii
1.2.4. Enzyme cellulase 30
1.2.4.1. Phân loại và đặc điểm của cellulase vi sinh vật 30
1.2.4.2. Cơ chế xúc tác của cellulase vi sinh vật 31
1.3. Ưu điểm - nhược điểm của enzyme ngoại bào so với
enzyme nội bào của vi sinh vật 33
1.3.1. Ưu điểm 33
1.3.2. Nhược điểm 33
CHƯƠNG 2: ENZYME NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS
SUBTILIS 35
2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis 35
2.1.1. Lịch sử phát hiện 35
2.1.2. Phân loại 35
2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis 36
2.1.3.1. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên 36
2.1.3.2. Đặc điểm hình thái 37
2.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa 37

2.1.3.4. Đặc điểm nuôi cấy 38
2.1.3.5. Bộ gen của Bacillus subtilis 39
2.1.3.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử 39
2.2. Hệ enzyme của Bacillus subtilis 40
2.2.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis 40
2.2.2. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis 41
2.2.2.1. Enzyme amylase: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) 41
2.2.2.2. Enzyme protease 50
2.2.3. Thu nhận và tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis 58
2.2.3.1. Thu nhận và tách chiết các enzyme α-amylase của Bacillus subtilis 59
2.2.3.2. Thu nhận và tách chiết các enzyme protease của Bacillus subtilis 63
CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME NGOẠI BÀO
BACILLUS SUBTILIS 65
3.1. Ứng dụng trong thực phẩm 65
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


i
v
3.1.1. Trong công nghệ sản xuất bia 65
3.1.2. Trong công nghệ chế biến thủy sản 67
3.2. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 68
3.3. Ứng dụng trong công nghiệp dệt 69
3.4. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa 69
3.5. Ứng dụng trong môi trường 70
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72
4.1. Kết luận 72
4.2. Kiến nghị 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


v



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Các chữ viết tắt Các chữ viết đầy đủ
A. niger Aspergillus niger
Asp. oryzae Aspergillus oryzae
Ala Alanine

Asp Aspartic
CHLB Cộng Hòa Liên Bang
CMC Carboxylmethyl cellulose
Cys Cysteine
Da Dalton
DEAE - cellulose Diethylamino - ethyl - cellulose
DNME Diazoacetyl norleucine methyl ester
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid
Glu Glutamic
Gly glycine
HEC Hydroxylethyl Cellulose
His Histidine
Leu Leucine
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


vi
Met Methionine
PCMB p-chloromercuribenzoate
Phe Phenylalanine
pI hay pH
I
Isoelectric point (điểm đẳng điện)
R. delemar Rhizopus delemar
Ser Serine
Thr Threonine
Trp Trytophan
TSA Trypticase Soy Agar
TSB Trypticase Soy Broth
Tyr Tyrosine

V
dung môi
/V
ban đầu
Thể tích dung môi/thể tích ban đầu
Val Valine








Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


vii




DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số nguồn thực phẩm giàu protein 24
Bảng 2.1. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis 38
Bảng 2.2. Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc
tính và phản ứng thủy phân 41
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của Ca
2+

lên hoạt tính của amylase từ Bacillus
subtilis 42
Bảng 2.4. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi thay đổi
các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy 56
Bảng 2.5. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi phối hợp
nguồn nitrogen khác nhau trong môi trường nuôi cấy 57
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase 61
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của (NH
4
)
2
SO
4
lên khả năng tủa α-amylase 62










Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc không gian của α-amylase 10
Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase 11
Hình 1.3. Cấu trúc không gian của β-amylase 13
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của glucoamylase 15
Hình 1.5. Cấu trúc không gian của enzyme pullulanase 17
Hình 1.6. Cấu trúc không gian của oligo-1,6-glucosidase 18
Hình 1.7. Quá trình thủy phân tinh bột dưới sự xúc tác của một số loại
enzyme amylase 20
Hình 1.8. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân protein 20
Hình 1.9. Cấu trúc không gian của enzyme protease 21
Hình 1.10. Cấu trúc không gian của pectinase 26
Hình 1.11. Sơ đồ tác dụng pectinesterase lên hợ
p chất pectin 26
Hình 1.12. Sơ đồ tác dụng của Endo-glucosidase-
polymethylgalacturonase kiểu I lên hợp chất pectin 28
Hình 1.13. Sơ đồ tác dụng của Exo-glucosidase-
polymethylgalacturonase kiểu III lên hợp chất pectin 29
Hình 1.14. Sơ đồ tác dụng của Endo-glucosidase-
polymethylgalacturonase kiểu II lên hợp chất pectin 29
Hình 1.15. Sơ đồ tác dụng của Exo-glucosidase-
polymethylgalacturonase kiểu IV lên hợp chất pectin 29
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm


ix

Hình 1.16. Cơ chế chuyển hóa cellullose dưới xúc tác của hệ enzyme
cellulase 32
Hình 2.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi 37
Hình 2.2. Cấu trúc của phân tử amylose và amylopectin 44

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 1 -
LỜI MỞ ĐẦU


I. Đặt vấn đề
Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công
nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ
Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau,
là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuấ
t ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết
trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng
năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn
với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phả
n ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã
cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá
thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động x
ấu tới

môi trường.
II. Lý do chọn đề tài
Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi
khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu
nhiều. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng
dụng rộng rãi ở qui mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả
năng sinh tổng hợp các enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những
vi sinh vật khác.
Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứ
ng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào
từ Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 2 -
sản xuất ở qui mô công nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế
quốc dân.
III. Mục đích của đề tài
Để tìm hiểu về một số vấn đề như:
• Tổng quan về enzyme ngoại bào của vi sinh vật.
• Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis.
• Các điều kiện hoạt động của enzyme ngoại bào và quá trình sinh
tổng hợp các enzyme này ở vi sinh vật.
• Qui trình tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis.
• Khả năng ứng dụng chúng vào đời sống cũng như sản xuất ở
qui
mô công nghiệp.
Đó là những cơ sở và tính cấp thiết mà tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”.
IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn Bacillus subtilis.

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan về enzyme ngoại bào của
Bacillus subtilis.
V. Phương pháp nghiên cứu
Đọc tài liệu tham khảo các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi
khuẩn Bacillus subtilis.
Tổng hợp, phân tích các công trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học về vi
khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải
quyết các mục đích đề ra.
Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài.




Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 3 -
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT

1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào
1.1.1. Định nghĩa
Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh
tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa)
các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho
quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Vì thực tế bên ngoài môi trường xung quanh,
các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các
hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên c
ần có các

enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các
hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào. Các enzyme được
tổng hợp và tham gia các phản ứng ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ
có ở vi sinh vật.
1.1.2. Phân loại
Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các
enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm
phụ:
• Nhóm 1: Oxydroreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản
ứng oxy hóa khử.
• Nhóm 2: Transpherase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng
chuyển vị.
• Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy
phân (sự phân giải có mặt của H
2
O tham gia).
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 4 -
• Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên
kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H
2
O tham gia; hoặc loại H
2
O tạo thành
nối đôi hoặc kết hợp phân tử H
2
O vào nối đôi.
• Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng
phân hóa.

• Nhóm 6: Lygase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho
phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP
hoặc các nucleoside triphosphate khác.
Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme
thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase.
Phương trình phản ứng: R
1
– R
2
+H
2
O R
1
OH + R
2
H

Ví dụ: Tinh bột + H
2
O Dextrin + Maltose + Glucose
Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme:
amylase, cellulase, protease và pectinase…
1.1.3. Đặc điểm - tính chất
Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một
enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa:
• Về bản chất enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của
một protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do
phân tử lượng lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào .
• Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do
có nhóm -COOH và -NH

2
trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid
chúng sẽ bị phân ly như sau:

Protein -COOH Protein -COO- + H
+



Protein -NH
2
Protein -NH
+
+ H
+


α-amylase
Kiềm
Acid
Acid
Kiềm
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 5 -
• Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và
chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ
hữu cực khác. Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết
hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo
thành lớp vỏ hydrate. Lượng nước hydrate hóa khá lớn và có vai trò quan trọng

trong các phản ứng sinh hóa.
• Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt
độ cao. Enzyme bị biến tính thì mất kh
ả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của
enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid
mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại
enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110
o
C như: α-amylase từ vi khuẩn ưa
nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt
độ 110
o
C. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt còn có
khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH
kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi
khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid
2,1…
• Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương
đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme.
Trong trung tâm hoạt độ
ng của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme
(trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease,
cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim
loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca
2+
.
• Là những enzyme chuyên biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ
đặc hiệu với cơ chất.
• Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui
luật cảm ứng cơ chất. Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích

thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn sử dụng
được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích
thước nhỏ hơn để
có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế
bào. Như vậy, khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 6 -
hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không
có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp
này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và
thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng
được gọi là cơ chất cảm ứng.
• Là những enzyme cảm ứng v
ới cơ chất nên quá trình tổng hợp
enzyme rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ. Cơ chất cảm ứng thường được
coi là yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng
tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượ
ng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá
trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu
cơ chất gây ra. Như vậy, muốn điều khiển và kiểm soát quá trình này cần phải
chú ý hai điểm:
− Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nào
đó thì phải cho cơ chất mà enzyme đó có thể phân hủy vào môi tr
ường, ví dụ:
sinh tổng hợp amylase thì bổ sung vào môi trường tinh bột; protease thì bổ sung
protein; pectinase thì bổ sung pectin và cellulase thì bổ sung cellulose…
− Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều
lượng nhất định nào đó. Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ

giảm. Do đó, không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng
cao.
• Enzyme có thể tham gia xúc tác các phả
n ứng trong và ngoài cơ thể
từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các
hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi
phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO
2
, H
2
O,
một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản
phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau.
• Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra
ở ngoài tế bào.
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 7 -
• Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi
đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi
hỏi năng lượng rất lớn.
Ví dụ: Trong quá trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose
− Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân
tử gam.
− Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử
gam.

Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose
− Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000
cal/phân tử gam.

Ph
ương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose
• Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen
quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một
hoặc một số phản ứng sinh hóa.
• Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản
ứng.
• Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xả
y ra ở
điều kiện không có enzyme.
• Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc
độ của phản ứng.
• Có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động
vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, trên môi trường lên men rẻ
tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành ph
ần enzyme
dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như
chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá
thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế
phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động
v
ật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ
S
acchara
se
Aci
d
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 8 -
như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận
enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ
vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì
số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi
sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng
enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có kh
ả năng chuyển hóa một khối
lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý,
thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công
nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất.
1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật
Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng.
Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và
ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp.
1.2.1. Enzyme amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân
tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH OH – RH + R’OH
Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme
nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (α-
dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới
h
ạn và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của
chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay γ-

amylase). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide.

Amylase
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 9 -
1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan
glucanhydrolase)
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau,
mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một
protein giàu tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), acid glutamic (Glu) và acid aspartic
(Asp). Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid
cấu thành nên phân tử enzyme:
α-amylase có ít methionine (Met) và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine (Cys).
Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống
nhau. Trọng lượng phân tử của α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng
45.000
- 60.000 Da, trong khi α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 -
100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher và Stein,
1960).
α-amylase có chứa các nhóm -COOH và NH
3
trong trung tâm hoạt động.
α-amylase kết tủa trong dung dịch (NH
4
)
2
SO
4

25 - 30%, α-amylase dễ tan
trong nước, trong dung dịch muối và tan trong ethanol loãng nhưng kết tủa ở
ethanol 60%.
Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951).
Giá trị pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường là ở
vùng acid yếu, giữa 4,8 và 6,9. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ, chẳng hạn như α-
amylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu là 3,5 còn củ
a enzyme từ
Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0.
Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60
-70
o
C, nhưng cũng có thể tới 80 - 90
o
C đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt.
α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Trong mỗi phân tử α-
amylase đều có chứa 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6
nguyên tử gam Ca/mol. Ca
2+
tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc
3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca
2+
còn
có vai trò duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các
tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 10 -
α-amylase bị loại bỏ hết Ca

2+
thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân
cơ chất. Theo Wallerstein (1969), các ion Ca
2+
có tác dụng ổn định hoạt tính của
α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp. Với nồng độ ion Ca
2+
0,1
nguyên tử gam/lít sẽ có tác dụng làm giảm hằng số vận tốc vô hoạt K của malt
đại mạch xuống 1500 lần trong điều kiện pH 4,0; còn đối với nấm mốc hằng số
này chỉ giảm 13 lần. Khi nồng độ tăng quá 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm
rõ rệt. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Người ta cho rằng đặc
tính này của α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca
2+
trong phân tử (α-amylase
của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca
2+
hơn nấm mốc khoảng 3 - 4 lần nên
nó bền nhiệt hơn). Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như
Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
và các ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase
theo thứ tự Cl
-
< Br
-

< F
-
< I
-
. Một số kim loại như: Li
+
, Na
+
, Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
,
Co
2+
và Sn
2+
không ảnh hưởng lắm đến α-amylase.


Hình 1.1. Cấu trúc không gian của α-amylase

Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn
khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên
kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc
glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 11 -
Giai đoạn dextrin hóa
Giai đoạn đường hóa
Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen
Maltotetrose, maltotriose và maltose
chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với
tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều
giai đoạn:











Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase

• Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất
bị thủ
y phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt
của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
• Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp
tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với
iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và
monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh

thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì v
ậy, người ta cho rằng α-
amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1).
• Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose.
• Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose
chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 12 -
cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở
chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản
phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có
dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường
α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không
cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là
tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm
nhanh độ nhớt của tinh bột. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là
amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân
tinh bột của enzyme α-amylase:
• Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
• Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra Trimaltose Di & monosaccharide
Amylose Oligosacharide Poliglucose
Maltose Maltotriose Maltotetrose
1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4 glucan-

maltohydrolase)
Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng. Nhiều nhà khoa
học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt
động của β-amylase. Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C
1
của
glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal. Ester này tiếp đó
sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải
phóng ra β-maltose và nhóm carboxyl của enzyme lại được phục hồi.
Phân tử β-amylase chỉ gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử
60.000 Da.
Enzyme β-amylase có pH hoạt động tối ưu giữa 5 và 6, β-amylase khá
bền trong môi trường acid ở pH = 3 - 4, nhiệt độ tố ư
u là 50 - 65
o
C. β-amylase bị
α-amylase

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 13 -
bất hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ ở nhiệt độ 70
o
C. Thường β-amylase có nguồn gốc
từ vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn β-amylase có nguồn gốc từ thực vật.
β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên vẹn, chỉ tác dụng lên tinh
bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không
có Ca
+2
.

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của β-amylase

Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase là một enzyme đường hóa,
phân cắt được các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử amylose cũng như trong
amylopectin, bắt đầu từ bên ngoài đầu không khử giải phóng maltose dưới dạng
β. Tác dụng của enzyme này sẽ bị dừng lại khi gặp liên kết α-1,6. Enzyme β-
amylase thủy phân hoàn toàn amylose, ngược lại nó chỉ thủy phân được 54 - 58%
amylopectin thành β-amylose. Phần amylopectin còn lạ
i là một β-dextrin giới hạn
có khối lượng phân tử cao và có chứa toàn bộ các liên kết α-1,6 của phân tử ban
đầu. Quá trình này xảy ra ở phần thẳng của mạch và dừng lại ở vị trí phân nhánh.
• Enzyme β-amylase có thể thủy phân lần lượt nhiều liên kết
glucoside của cùng một chuỗi trước khi được giải phóng trở lại vào môi trường.
Số lần tác dụng trên một chuỗi α-glucan phụ thu
ộc vào chiều dài của chuỗi,
thường là 4 lần đối với chuỗi ngắn và nhiều lần đối với chuỗi dài.
• Theo phương pháp sản xuất truyền thống β-amylase được thu nhận
từ malt, tuy nhiên ở các nước phương Đông nó có thể được thu nhận từ đậu
tương hoặc khoai lang. Các loại thực vật nói trên không chỉ chứa β-amylase mà
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Tống Ngọc Triêm

- 14 -
còn chứa cả α-amylase. Điều kiện thích hợp của β-amylase malt đại mạch là 60 -
65
o
C, pH 5,4 - 5,6 (trong dung dịch tinh bột). Vùng pH thích hợp cho β-amylase
hoạt động hẹp hơn so với α-amylase. Trước đây, β-amylase được coi là nguồn
enzyme chỉ có trong hệ thực vật. Ngày nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại vi

sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra loại enzyme này và ứng dụng vào sản xuất.
Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp β-amylase là Bacillus circulans,
Bacillus polymyxa, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces sp. và
Pseudomonas. Đặc biệt là Bacillus cereus
và mycoides có thể đồng thời tạo ra cả
pullulanase.
1.2.1.3. Đặc tính và cơ chế xúc tác của glucoamylase (α-1,4 glucan-
glucohydrolase)
Cũng giống như các enzyme khác, glucoamylase từ các nguồn gốc khác
nhau có những đặc tính, cấu tạo và tính chất khác nhau. Khối lượng phân tử của
chúng thường nằm giữa 27.000 và 112.000 Da.
Nói chung khối lượng phân tử glucoamylase của nấm mốc lớn hơn so với
nấm mem. Theo Pazur (1959) khối lượng phân tử của glucoamylase từ
Aspergillus awamori là 62.000 Da. Trong khi đó khối lượng phân tử của
glucoamylase từ Endomycopsis sp. 20-9 là 53.000 Da (Gratrova và Sadova,
1959) và từ Endomycopsis sp. IFO.011 là 55.000 Da.
Trong cấ
u tạo phân tử của các glucoamylase đều chứa gốc Met, Trp và
một nửa gốc Cys trong trung tâm hoạt động. Các glucoamylase của nấm mốc là
những glucoprotein chứa từ 5 đến 20% glucid cao phân tử của glucose, manose
và glucosamin.
Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không
đồng nhất. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ Aspergillus niger là 6,5; từ
Aspergillus awamori là 7,5; Rhizopus delemar là 7,4; Endomyces sp.IFO.0111 là
4,8 - 5,5.