Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis 04- nội dung đề tài

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

LỜI MỞ ĐẦU

I. Đặt vấn đề
Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công
nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ
Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau,
là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết
trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng
năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn
với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã
cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá
thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới
môi trường.

II. Lý do chọn đề tài
Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi
khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu
nhiều. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng
dụng rộng rãi ở qui mơ cơng nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả
năng sinh tổng hợp các enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những
vi sinh vật khác.

Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào
từ Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy

-1-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

sản xuất ở qui mơ cơng nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế
quốc dân.

III. Mục đích của đề tài
Để tìm hiểu về một số vấn đề như:
• Tổng quan về enzyme ngoại bào của vi sinh vật.
• Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis.
• Các điều kiện hoạt động của enzyme ngoại bào và quá trình sinh
tổng hợp các enzyme này ở vi sinh vật.
• Qui trình tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis.
• Khả năng ứng dụng chúng vào đời sống cũng như sản xuất ở qui
mơ cơng nghiệp.
Đó là những cơ sở và tính cấp thiết mà tơi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”.

IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn Bacillus subtilis.
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan về enzyme ngoại bào của
Bacillus subtilis.

V. Phương pháp nghiên cứu
Đọc tài liệu tham khảo các nghiên cứu trong nước và ngồi nước về vi
khuẩn Bacillus subtilis.
Tổng hợp, phân tích các cơng trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học về vi
khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải
quyết các mục đích đề ra.
Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài.

-2-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT
1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào
1.1.1. Định nghĩa
Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh
tổng hợp sau đó tiết ra ngồi tế bào và tham gia vào q trình thủy phân (dị hóa)
các hợp chất hữu cơ bên ngồi mơi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Các q trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho
quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Vì thực tế bên ngồi mơi trường xung quanh,
các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các
hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có các
enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các
hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào. Các enzyme được
tổng hợp và tham gia các phản ứng ngồi tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ

có ở vi sinh vật.

1.1.2. Phân loại
Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các
enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm cịn có các nhóm phụ, phân nhóm
phụ:
• Nhóm 1: Oxydroreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản
ứng oxy hóa khử.
• Nhóm 2: Transpherase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng
chuyển vị.
• Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy
phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia).

-3-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

• Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên
kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành
nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đơi.
• Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng
phân hóa.
• Nhóm 6: Lygase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho
phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP
hoặc các nucleoside triphosphate khác.
Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme
thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase.

Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O
Ví dụ: Tinh bột + H2O

α-amylase

R1OH + R2H
Dextrin + Maltose + Glucose

Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme:
amylase, cellulase, protease và pectinase…

1.1.3. Đặc điểm - tính chất
Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một
enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa:
• Về bản chất enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của
một protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do
phân tử lượng lớn nên chúng khơng thể đi qua màng tế bào .
• Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do
có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid
chúng sẽ bị phân ly như sau:
Kiềm
Protein -COOH

Protein -COO- + H+

Acid
Acid
Protein -NH+ + H+

Protein -NH2

Kiềm

-4-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

• Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và
chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung mơi hữu cơ
hữu cực khác. Khi hịa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết
hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo
thành lớp vỏ hydrate. Lượng nước hydrate hóa khá lớn và có vai trị quan trọng
trong các phản ứng sinh hóa.
• Enzyme khơng bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt
độ cao. Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của
enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid
mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại
enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110oC như: α-amylase từ vi khuẩn ưa
nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt
độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt cịn có
khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH
kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi
khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid
2,1…
• Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương
đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme.
Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như khơng có coenzyme
(trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease,

cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim
loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+.
• Là những enzyme chun biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ
đặc hiệu với cơ chất.
• Q trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui
luật cảm ứng cơ chất. Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích
thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn sử dụng
được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích
thước nhỏ hơn để có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế
bào. Như vậy, khi có mặt cơ chất trong mơi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng

-5-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi khơng
có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp
này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và
thúc đẩy nhanh q trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng
được gọi là cơ chất cảm ứng.
• Là những enzyme cảm ứng với cơ chất nên quá trình tổng hợp
enzyme rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ. Cơ chất cảm ứng thường được
coi là yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng
tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó q
trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu
cơ chất gây ra. Như vậy, muốn điều khiển và kiểm soát quá trình này cần phải

chú ý hai điểm:
− Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nào
đó thì phải cho cơ chất mà enzyme đó có thể phân hủy vào mơi trường, ví dụ:
sinh tổng hợp amylase thì bổ sung vào mơi trường tinh bột; protease thì bổ sung
protein; pectinase thì bổ sung pectin và cellulase thì bổ sung cellulose…
− Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều
lượng nhất định nào đó. Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ
giảm. Do đó, khơng phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng
cao.
• Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể
từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hồn tồn năng lượng dự trữ trong các
hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi
phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O,
một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản
phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau.
• Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra
ở ngoài tế bào.

-6-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

• Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi
đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường địi
hỏi năng lượng rất lớn.
Ví dụ: Trong q trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose
− Khi khơng có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân

tử gam.
− Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử
gam.
Phương trình phản ứng: Sucrose

Acid

Fructose + Glucose

− Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000
cal/phân tử gam.
Phương trình phản ứng: Sucrose

Saccharase

Fructose + Glucose

• Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen
quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một
hoặc một số phản ứng sinh hóa.
• Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản
ứng.
• Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở
điều kiện khơng có enzyme.
• Khơng làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc
độ của phản ứng.
• Có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động
vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, trên môi trường lên men rẻ
tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme
dễ dàng dự đoán và kiểm sốt, khơng chứa các chất độc gây hại cho người như

chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá
thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế
phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động
vật hay thực vật là mỗi lồi chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ

-7-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận
enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ
vi sinh vật thì ngược lại; từ một lồi vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì
số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi
sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng
enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối
lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý,
thời tiết như ni, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mơ cơng
nghiệp và kiểm sốt được q trình sản xuất.

1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật
Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng.
Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và
ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp.

1.2.1. Enzyme amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân

tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH

Amylase

OH – RH + R’OH

Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme
nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (αdextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới
hạn và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của
chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay γamylase). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide.

-8-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan
glucanhydrolase)
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau,
mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một
protein giàu tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), acid glutamic (Glu) và acid aspartic
(Asp). Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid
cấu thành nên phân tử enzyme:

α-amylase có ít methionine (Met) và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine (Cys).
Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống
nhau. Trọng lượng phân tử của α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng
45.000 - 60.000 Da, trong khi α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher và Stein,
1960).
α-amylase có chứa các nhóm -COOH và NH3 trong trung tâm hoạt động.
α-amylase kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 25 - 30%, α-amylase dễ tan
trong nước, trong dung dịch muối và tan trong ethanol loãng nhưng kết tủa ở
ethanol 60%.
Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951).
Giá trị pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường là ở
vùng acid yếu, giữa 4,8 và 6,9. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ, chẳng hạn như αamylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu là 3,5 cịn của enzyme từ
Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0.
Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60
-70oC, nhưng cũng có thể tới 80 - 90oC đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt.
α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Trong mỗi phân tử αamylase đều có chứa 1 - 30 ngun tử gam Ca/mol, nhưng khơng ít hơn 1 - 6
nguyên tử gam Ca/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc
3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca2+ cịn
có vai trị duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các
tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử

-9-


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hồn tồn bị mất hết khả năng thủy phân

cơ chất. Theo Wallerstein (1969), các ion Ca2+ có tác dụng ổn định hoạt tính của
α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp. Với nồng độ ion Ca2+ 0,1
ngun tử gam/lít sẽ có tác dụng làm giảm hằng số vận tốc vô hoạt K của malt
đại mạch xuống 1500 lần trong điều kiện pH 4,0; còn đối với nấm mốc hằng số
này chỉ giảm 13 lần. Khi nồng độ tăng quá 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm
rõ rệt. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Người ta cho rằng đặc
tính này của α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca2+ trong phân tử (α-amylase
của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca2+ hơn nấm mốc khoảng 3 - 4 lần nên
nó bền nhiệt hơn). Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như
Cu2+, Ag+, Hg2+ và các ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase
theo thứ tự Cl - < Br - < F - < I -. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+,
Co2+ và Sn2+ không ảnh hưởng lắm đến α-amylase.

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của α-amylase
Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn
khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên
kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc
glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không

- 10 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với
tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều
giai đoạn:

Giai đoạn dextrin hóa

Giai đoạn đường hóa

Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen

Maltotetrose, maltotriose và maltose
Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase
• Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất
bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt
của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
• Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp
tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với
iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và
monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh
thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng αamylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1).
• Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose.
• Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose
chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin

- 11 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

cũng xảy ra tương tự nhưng vì khơng phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở

chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản
phẩm cuối cùng, ngồi các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) cịn có
dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường
α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp khơng
cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là
tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm
nhanh độ nhớt của tinh bột. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là
amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của q trình thủy phân
tinh bột của enzyme α-amylase:
• Giai đoạn dextrin hóa:
α-amylase
Tinh bột
dextrin phân tử lượng thấp
• Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra

Trimaltose

Di & monosaccharide

Amylose

Oligosacharide

Poliglucose

Maltose

Maltotriose

Maltotetrose

1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4 glucanmaltohydrolase)
Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng. Nhiều nhà khoa
học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt
động của β-amylase. Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C1 của
glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal. Ester này tiếp đó
sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải
phóng ra β-maltose và nhóm carboxyl của enzyme lại được phục hồi.
Phân tử β-amylase chỉ gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử
60.000 Da.
Enzyme β-amylase có pH hoạt động tối ưu giữa 5 và 6, β-amylase khá
bền trong môi trường acid ở pH = 3 - 4, nhiệt độ tố ưu là 50 - 65oC. β-amylase bị

- 12 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

bất hoạt hồn tồn ở nhiệt độ ở nhiệt độ 70oC. Thường β-amylase có nguồn gốc
từ vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn β-amylase có nguồn gốc từ thực vật.
β-amylase khơng tác dụng lên tinh bột nguyên vẹn, chỉ tác dụng lên tinh
bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi khơng
có Ca+2.

Hình 1.3. Cấu trúc khơng gian của β-amylase

Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase là một enzyme đường hóa,
phân cắt được các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử amylose cũng như trong
amylopectin, bắt đầu từ bên ngồi đầu khơng khử giải phóng maltose dưới dạng
β. Tác dụng của enzyme này sẽ bị dừng lại khi gặp liên kết α-1,6. Enzyme βamylase thủy phân hoàn toàn amylose, ngược lại nó chỉ thủy phân được 54 - 58%
amylopectin thành β-amylose. Phần amylopectin còn lại là một β-dextrin giới hạn
có khối lượng phân tử cao và có chứa toàn bộ các liên kết α-1,6 của phân tử ban
đầu. Quá trình này xảy ra ở phần thẳng của mạch và dừng lại ở vị trí phân nhánh.
• Enzyme β-amylase có thể thủy phân lần lượt nhiều liên kết
glucoside của cùng một chuỗi trước khi được giải phóng trở lại vào môi trường.
Số lần tác dụng trên một chuỗi α-glucan phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi,
thường là 4 lần đối với chuỗi ngắn và nhiều lần đối với chuỗi dài.
• Theo phương pháp sản xuất truyền thống β-amylase được thu nhận
từ malt, tuy nhiên ở các nước phương Đông nó có thể được thu nhận từ đậu
tương hoặc khoai lang. Các loại thực vật nói trên khơng chỉ chứa β-amylase mà

- 13 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

cịn chứa cả α-amylase. Điều kiện thích hợp của β-amylase malt đại mạch là 60 65oC, pH 5,4 - 5,6 (trong dung dịch tinh bột). Vùng pH thích hợp cho β-amylase
hoạt động hẹp hơn so với α-amylase. Trước đây, β-amylase được coi là nguồn
enzyme chỉ có trong hệ thực vật. Ngày nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra loại enzyme này và ứng dụng vào sản xuất.
Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp β-amylase là Bacillus circulans,
Bacillus polymyxa, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces sp. và
Pseudomonas. Đặc biệt là Bacillus cereus và mycoides có thể đồng thời tạo ra cả
pullulanase.

1.2.1.3. Đặc tính và cơ chế xúc tác của glucoamylase (α-1,4 glucanglucohydrolase)
Cũng giống như các enzyme khác, glucoamylase từ các nguồn gốc khác
nhau có những đặc tính, cấu tạo và tính chất khác nhau. Khối lượng phân tử của
chúng thường nằm giữa 27.000 và 112.000 Da.
Nói chung khối lượng phân tử glucoamylase của nấm mốc lớn hơn so với
nấm mem. Theo Pazur (1959) khối lượng phân tử của glucoamylase từ
Aspergillus awamori là 62.000 Da. Trong khi đó khối lượng phân tử của
glucoamylase từ Endomycopsis sp. 20-9 là 53.000 Da (Gratrova và Sadova,
1959) và từ Endomycopsis sp. IFO.011 là 55.000 Da.
Trong cấu tạo phân tử của các glucoamylase đều chứa gốc Met, Trp và
một nửa gốc Cys trong trung tâm hoạt động. Các glucoamylase của nấm mốc là
những glucoprotein chứa từ 5 đến 20% glucid cao phân tử của glucose, manose
và glucosamin.
Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không
đồng nhất. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ Aspergillus niger là 6,5; từ
Aspergillus awamori là 7,5; Rhizopus delemar là 7,4; Endomyces sp.IFO.0111 là
4,8 - 5,5.

- 14 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

Hình 1.4. Cấu trúc không gian của glucoamylase
Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách
tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu khơng khử của mạch. Glucoamylase có
khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Vì thế, các nhà

nghiên cứu Nhật Bản (Ono và cộng sự, 1961) đề nghị đặt một tên phân loại khác
cho nó là α-1,4:1,6 glucan-4:6-glucohydrolase. Nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ đề
nghị này (Dobrolinxkai, 1965; Fenikxova và Ruza-kova, 1976). Glucoamylase
được các nhà khoa học Nhật tách lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katitara
và Kurushima, 1966). Sau đó nó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus
niger, Aspergillus oryzae rồi ở các nhóm vi sinh vật khác. Enzyme này cịn có
nhiều tên gọi khác nhau như: amyloglucosidase, taka-amylase Bac, γ-amylse,
matulase,…
Glucoamylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân
polysaccharide từ đầu khơng khử để tạo ra glucose. Khi thủy phân tinh bột cùng
với glucose cịn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài các liên kết α-1,4
và α-1,6 glucoside, glucoamylase cịn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2
và α-1,3 glucoside (Sawasaki 1960; Ueyama và cộng sự, 1965; Watanabe và
Fukimbara, 1965, 1966).
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose thành glucose (Azarova,
1981; Jerebtxov và Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia và Rodzevits, 1974; Logina
Karpukhina, 1978). Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh như amylopectin,

- 15 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

glucogen, β-dextrin) bị glucoamylase thủy phân với tốc độ khá nhanh. Khi thủy
phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy các
polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các cơ chất phân tử
thấp. Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”. Thể hiện hoạt

lực tối đa ở vùng pH 3,5 - 5,5; nhiệt độ tối ưu là 40 - 60oC. So với α-amylase,
glucoamylase bền đối với acid và khi có mặt các oligosaccharide trong mơi
trường sẽ làm cho enzyme bền hơn, nhưng kém bền dưới tác dụng của rượu
ethylic, aceton và không được bảo vệ khi có mặt Ca2+ mà sẽ bị Ca2+ ức chế
enzyme và làm cho enzyme dễ dàng biến tính. Glucoamylase thường tồn tại ở 2
hoặc 3 dạng đồng phân, trong đó đồng phân AM-1 (HM), AM-2 (LM) có phân tử
lượng tương ứng là 82.000 và 70.000 Da. Dạng đồng phân HM cắt mạch nhánh
mạnh hơn dạng LM.
Cơ chế tác dụng của glucoamylase cũng như cơ chế tác dụng của enzyme
amylase khác. Việc phân cắt liên kết glucoside được tiến hành thông qua việc tạo
thành một hợp chất Oxycacbonium trung gian, tiếp theo là sự nghịch đảo cấu
hình của carbon C1 của phân tử glucose được giải phóng ra. Các nhóm Tyr, Trp,
Histidine (His) và amin có vai trị gắn cơ chất vào, cịn các nhóm -COOH và
COO- thì tham gia vào q trình xúc tác hóa học. Việc thủy phân các liên kết α1,4 và α-1,6 một cách không phân biệt của enzyme là do các nhóm thực hiện việc
gắn cơ chất khơng phải do các nhóm tham gia vào q trình xúc tác hóa học.
Khi nghiên cứu các cơ chế của quá trình thủy phân một số oligosaccharide
và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Barker và cộng sự (1957)
thấy rằng quá thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế đa mạch.
Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme glucoamylase như sau:
Glucoamylase kiểu
Tinh bột hay oligosaccharide

Rhizopus delemar

100% glucose

(có liên kết α-1,4 và α-1,6 )
Glucoamylase kiểu
Tinh bột hay
oligosaccharide

Aspergillus niger
khác nhau

- 16 -

80 - 85% glucose + Oligosaccharide


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

1.2.1.4. Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase (α-dextrin 6glucosidase)
Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen,
pululan và các dextrin. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có
ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên
kết này. Do đó pullulan chính là cơ chất lý tưởng của pullulanase, vì nó là một
phân tử khơng phân nhánh cấu tạo bởi những đơn vị maltotriose (có hai liên kết
α-1,4) liên kết với nhau bằng cầu nối α-,6 glucoside.
Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi
các liên kết α-1,4. Nó cịn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp
chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng
hiệp đồng của α-amylase và pullulanase làm dextrin này bị thủy phân hồn tồn.
Pullulanase có pH tối ưu là 5 - 7, nhiệt độ tối ưu là 10 – 50oC. Ion Ca2+
hoạt hóa các enzyme này, trong khi đó các ion Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+ và Co2+ lại
có tác dụng kìm hãm.

Hình 1.5. Cấu trúc khơng gian của enzyme pullulanase

1.2.1.5. Đặc tính và cơ chế xúc tác của oligo-1,6-glucosidase hay
dextrinase tới hạn
Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose,
panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có
ở vi sinh vật đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy

- 17 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

mầm). Ngồi oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm
cịn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme và dextrin-1,6-glucoside hay
amylo-1,6-glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase. Hai loại enzyme này đều
thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase do đó trong dung dịch
thuỷ phân có nhiều maltose hơn.
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các dextrinase là 40oC và pH tối ưu là
5,1. Theo số liệu của Kirxanov và Pankratov (1969), hoạt tính của enzyme này từ
Rhizopus delemar được bảo vệ ở điều kiện nhiệt độ 30oC; pH 5,0 - 6,0 sau 96
giờ. Cũng ở pH này hoạt tính của enzyme này sẽ giảm 15% khi tăng nhiệt độ lên
tới 50oC sau 2 giờ.

Hình 1.6. Cấu trúc khơng gian của oligo-1,6-glucosidase

1.2.1.6. Đặc tính và cơ chế xúc tác của transglucosidase
Ở nhiều loài nấm sợi Aspergillus, enzyme transglucosidase ln ln
tương tác với glucoamylase. Transglucosidase có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt
tính thủy phân. Vì thế sự có mặt của transglucosidase trong dung dịch thường

gây nên sự nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase thực hiện
việc chuyển gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và oligosaccharide, xúc tác tạo
thành liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside. Pazur (1961) đã tách được enzyme này từ
Aspergillus niger bằng phương pháp sắc ký hấp phụ trên DEAE - cellulose và
cho biết cơ chế tác dụng của nó. Transglucosidase khơng những chỉ thủy phân
maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose; tức là có

- 18 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử
glucose khác nhau bằng liên kết α-1,6 để tạo thành panose hoặc izomaltose.
Rodzevit và Butova (1965) đã tìm thấy trong canh trường nuôi cấy nấm
sợi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và Aspergillus awamori có enzyme
transglucosidase, đồng thời cho biết enzyme này xúc tác sự tổng hợp các
oligosaccharide với các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose. Các tác giả
cho rằng, trong các vi sinh vật trên có hai hệ enzyme transglucosidase. Một hệ
tổng hợp các sản phẩm có liên kết α-1,4 glucoside kiểu maltose và chuyển các
gốc glucose từ maltose tới vị trí C4 của gốc glucose cuối: n-maltose-(1,4-αglucose)n + n-glucose. Một hệ chuyển các gốc glucose có vị trí C6 khi tổng hợp
các kiểu sản phẩm isomaltose: n-maltose-(1,6-glucose)n + n-glucose. Hệ thứ nhất
bền ở pH 8,5 còn hệ thứ hai thì bất hoạt hồn tồn ở pH này trong 2 giờ. Còn ở
pH 3,3 trong thời gian 1 giờ thì hoạt tính transglucosidase của cả hai hệ đều
khơng thay đổi. Transglucosidase của nấm sợi bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 1,9 2,0 sau 24 giờ. Ở các chủng nấm sợi khác nhau thì có khác biệt về hoạt tính
transglucosidase (Buger, 1956), các lồi Rhizopus có ưu thế hơn các lồi
Aspergillus là khơng tạo transglucosidase.
Sự có mặt của transglucosidase trong các chế phẩm amylase (dùng trong

công nghiệp sản xuất mật tinh bột, đường glucose và công nghiệp sản xuất
rượu...) là điều không mong muốn. Glucoamylase xúc tác sự thủy phân tinh bột,
còn transglucosidase lại tổng hợp các isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân
này, do đó làm giảm mức độ thủy phân sâu sắc tinh bột và làm cho dịch thủy
phân có vị đắng.

- 19 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

Hình 1.7. Q trình thủy phân tinh bột dưới sự xúc tác của một số loại
enzyme amylase

1.2.2. Enzyme protease
Nhóm enzyme protease (peptide - hydrolase E.C.3.4) xúc tác quá trình
thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide
đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid.

Hình 1.8. Mơ hình enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân protein

- 20 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng
từ vi sinh vật (virus, vi khuẩn và nấm) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Hình 1.9. Cấu trúc khơng gian của enzyme protease

1.2.2.1. Phân loại và đặc tính của protease vi sinh vật
Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Căn cứ vào cơ chế phản
ứng, dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động, pH hoạt động thích hợp… các
nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:
• Protease serine: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serine
trong trung tâm hoạt động. Các protease serine thường hoạt động ở pH kiềm và
có tính đặc hiệu tương đối rộng. Tính đặc hiệu thể hiện về phía gốc amino acid
chứa nhóm (-CO-) của liên kết peptide bị thủy phân. Nhóm (-OH) này có vai trị
đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Trong nhóm này có

- 21 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

enzyme subtilisin là enzyme protease kiềm quan trọng nhất và ứng dụng nhiều

nhất trong các ngành cơng nghiệp sản xuất chất tẩy rửa.
• Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của
amino acid cystein trong trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt
trong trung tâm hoạt động xúc tác của enzyme, vì nó có khả năng phản ứng cao,
tham gia nhiều biến đổi hóa học như: acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa… Vai
trị của nhóm thiol trong phân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt khác nhau như tạo
thành phức trung gian enzyme - cơ chất, kết hợp giữa cơ chất và cofactor… Các
protease thiol thường hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng;
chỉ hoạt động khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động khơng bị bao vây. Do đó,
các chất như Cys, acid ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền
và hoạt hóa enzyme này. Một số ion kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy
ngân và các chất khác như iodoacetamid có tác dụng ức chế enzyme protease
thiol và các chất như: iodine, H2O2, EDTA… cũng có tác dụng ức chế enzyme
này vì chúng có khả năng gắn với ion kim loại nên thường làm tăng độ bền của
ion kim loại. Protease thiol thường là protease của thực vật như papain,
bromeline…
• Protease acid: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung
tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Asp hoặc Glu hay
cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptide. Các protease acid
thường hoạt động ở vùng pH acid, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl
ester (DNME) và và có tính đặc hiệu đối với các amino acid có vịng thơm hoặc
kỵ nước ở hai phía của liên kết peptide bị thủy phân. Protease acid là các enzyme
và của vi nấm như renin (renet)…
• Protease kim loại (metalloprotease): là những protease trong trung
tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại. Các protease kim loại thường hoạt
động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc amino acid
chứa nhóm (-NH2-) của liên kết peptide; chúng có thể tác dụng lên các peptide
chứa nhóm (-NH-) của các amino acid kỵ nước có kích thước hoặc các liên kết
peptide được tạo thành từ các amino acid có phân tử thấp. Các protease kim loại

- 22 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

thường bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA… Protease kim loại
carboxylpeptidase A, collagenase và thermolysin…
Ngồi ra, protease cịn được chia thành 3 nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng bao gồm:
• Protease acid: hoạt động được ở pH < 3.
• Protease trung tính: là một metalloenzyme (enzyme cơ kim), chúng
có pH hoạt động 6 - 7.
• Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động từ 9 - 10, trong
trung tâm hoạt động có serine.
• Trong 4 nhóm kể trên, các protease serine và protease thiol có khả
năng phân giải các liên kết ester và amide của cả các dẫn xuất acid của amino
acid. Ngược lại các protease kim loại và protease acid thì thường khơng có hoạt
tính esterase và amidase đối với dẫn xuất của amino acid.
• Các protease serine có trọng lượng phân tử khoảng 20.000 - 27.000
Da, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease serine
khoảng 33.800 - 48.400 Da. Protease thiol và nhiều protease acid cũng có phân
tử lượng khoảng 30.000 - 40.000 Da.
Protease của vi sinh vật gồm protease ngoại bào và protease nội bào. Mỗi
loại có các chức năng khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật như sau:
• Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử
khác có trong mơi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật
có thể dễ dàng hấp thụ. Một số dẫn liệu cho thấy các đột biến vi sinh vật mất khả
năng tiết ra protease ngoại bào không thể sử dụng nguồn protein làm nguồn đạm

dinh dưỡng. Trong quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá trình tổng hợp
chúng ở nhiều vi khuẩn bị giảm khi trong môi trường chứa một lượng lớn amino
acid.
• Protease nội bào: có thể ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết
với ribosome, mặt trong của màng tế bào và chỉ tìm thấy ở môi trường xung
quanh sau khi tế bào bị phá vỡ. Cho đến nay, các protease nội bào đang tiếp tục
được nghiên cứu và chưa biết rõ hết vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroshi

- 23 -


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

(1976), protease nội bào có thể có vai trị quan trọng hơn protease ngoại bào.
Chúng có thể hồn thành một số chức năng sau:
− Phân giải các peptide được đưa từ mơi trường ngồi vào thành
các amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc dùng làm nguồn C, S, N,…
giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi của môi trường.
− Sự phân giải các peptide phân tử lượng thấp cịn có vai trị loại
trừ tác dụng độc hại của nó đối với tế bào vì một số peptide phân tử lượng thấp
có thể là kháng ngun gây kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật.
− Các protease nội bào có thể tham gia q trình cải tiến một số
phân tử protein và enzyme. Điều này có ý nghĩa đối với việc hình thành và nảy
mầm của bào tử vi sinh vật.
− Protease nội bào cịn có tác dụng phân hủy protein vô dụng,
tổng hợp sai do đột biến hoặc cũng có thể tham gia vào q trình sinh trưởng của
vách tế bào…

1.2.2.2. Cơ chế xúc tác của protease vi sinh vật
a) Cơ chất tác dụng
• Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein, chúng
phân giải các liên kết peptide và sản phẩm tạo thành cuối cùng là các acid amin.
Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng và đậu tương…
Bảng 1.1. Một số nguồn thực phẩm giàu protein
Nguồn protein

Hàm lượng (%)

Nguồn protein

Thịt bò

20

Thịt gà

Thịt lợn

29

Cá

Đậu tương

34

Trứng gà

(tổng hợp từ nguồn internet)

- 24 -

Hàm lượng (%)
23,3
16 - 17
12


Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Tống Ngọc Triêm

b) Cơ chế tác dụng
• Trong trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật, ngồi gốc
amino acid đặc trưng cho từng nhóm cịn có một gốc amino acid khác tham gia.
Ví dụ: histidine thường tham gia và cấu tạo trung tâm hoạt động của các protease
có serine và protease có nhóm -SH; tyrosine là trung tâm hoạt động của các
protease có kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có
khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E+S

E–S

E – S* + P1

E + P2

Trong đó:
E: enzyme.
S: cơ chất (substance).
E – S: phức chất enzyme - cơ chất.
E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme).
P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới
được tạo thành).
P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do
được tạo thành).

1.2.3. Enzyme pectinase
Enzyme pectinase là nhóm enzyme xúc tác q trình thủy phân các
polymer pectin thành các hợp phần khác nhau như: galacturonic, arabinose,
methanol... Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.
Những enzyme này có vai trò rất quan trọng trong việc bảo quản trái cây và rau
quả. Enzyme pectinase còn được ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm,
đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme
pectinase cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm.

1.2.3.1. Đặc điểm và tính chất của pectinase vi sinh vật
Trong hệ enzyme pectinase phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzyme
khác nhau, chúng có khối lượng phân tử khoảng 40.400 Da. Pectinase cũng như
các enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc
tác đặc hiệu cơ chất cao.

- 25 -