Tách dòng và biểu hiện Lignin Peroxidase Isozyme H8 của Phanerochaete Chrysosporium trong nấm men Pichia Pastoris

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
******************



VŨ VĂN LỢI



TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE
ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS




LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC









Hà Nội - 2012
1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
****************



VŨ VĂN LỢI



TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE
ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 62 42 40


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC


Người hướng dẫn khoa học:

TS. PHÍ QUYẾT TIẾN

Hà Nội – 2012
2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
i


LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến và TS. Phạm Thị
Bích Hợp, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo và các cán bộ Phòng Công nghệ
lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.
Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa Học và Công nghệ
Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo
điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-1
ĐT.07.08/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực
công nghiệp chế biến đến năm 2020.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động
viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm 2012




Vũ Văn Lợi

3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Một số số liệu đã được đăng trên
các tạp chí khoa học chuyên ngành như trong: “Danh mục công trình khoa
học đã công bố có liên quan đến luận án”, đã được sự đồng ý cho phép sử
dụng các số liệu của các đồng tác giả và phần còn lại là các kết quả như trong
luận án.

Hà nội, ngày tháng năm 2012
Học viên


Vũ Văn Lợi
4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
1
bp

Cặp bazơ (base pair)
2
cDNA
DNA bổ trợ (Complementary DNA)
3
DEPC
Diethyl pyrocarbonate
4
his
Histidine dehydrogenase
5
DNA
Deoxyribonucleic acid
6
dNTP
Deoxynucleotide
7
EDTA
Ethylene diamine tetra-acetic acid
8
EtBr
Ethidium bromide
9
kb
Kilo bazơ
10
kDa
Kilo Dalton
11
LiP

Lignin peroxidase
12
LiP H8
Lignin peroxidase isozyme H8
13
rLiP H8
Lignin peroxidase isozyme H8 tái tổ hợp
14
mRNA
ARN thông tin (messenger RNA)
15
OD
Mật độ quang (Optical Density)
16
ORF
Khung đọc mở (Open Reading Frame)
17
PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain
reaction)
18
pI
Điểm đẳng điện (isoelectric point)
19
RNA
Ribonucleic acid
20
rRNA
ARN ribosom
21

RT-PCR
Phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase
(Reverse transcription polymerase chain reaction)
22
SDS
Sodium dodecyl sulfate
23
SDS-PAGE
Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium doecyl
sulfate
24
TAE
Tris-acetat EDTA
25
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine
26
tRNA
ARN vận chuyển

5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
2.1
Thành phần gel chạy SDS-PAGE

29
3.1
So sánh độ tương đồng của trình tự amino acid giữa các LiP
H8 từ P. chrysosporium
38
3.2
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới hoạt tính rLiP H8
của chủng P. pastoris C132
44
3.3
Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng đến khả năng
phát triển và sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris
C132
47
3.4
Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men trong môi trường đến
khả năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132
48
3.5
Ảnh hưởng của nồng độ peptone trong môi trường đến khả
năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132
49
3.6
Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate đến
hoạt tính rLiP H8.
50
6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v

DANH MỤC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin
3
1.2
Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin
4
1.3
Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của
polymer lignin, tạo thành các oligomer
5
1.4
Cơ chế phân cắt mối liên kết C

-C

tạo thành gốc aryl
6
1.5
Cơ chế xúc tác của laccase
7
1.6
Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus
his4
14
3.1
Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số và sản phẩm cDNA của
nấm đảm P. chrysosporium 36210

33
3.2
Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen lipH8 và plasmid
pCR2.1::lipH8 trên gel agarose 1,0%
35
3.3
So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen lipH8 từ
chủng P. chrysosporium 36210 với trình tự amino acid của
các protein tương ứng từ các chủng P. chrysosporium khác
được đăng ký trên GenBank
36
3.4
Cây phân loại thể hiện sự tương đồng về trình tự amino acid
suy diễn của LiP H8 từ chủng P. chrysosporium 36210 và
các trình tự LiP H8 tương ứng của các chủng P.
chrysosporium khác
38
3.5
Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pPIC9::lipH8 bằng hai
enzyme giới hạn
39
3.6
Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen lipH8 với khuôn
40
7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vi

DNA là bộ gen của P. pastoris tái tổ hợp
3.7
Điện di đồ protein dịch nuôi cấy của năm dòng P. pastoris

tái tổ hợp trên SDS-PAGE gel
42
3.8.
Hoạt tính rLiP H8 của các dòng P. pastoris tái tổ hợp sau
84 giờ nuôi cấy
43
3.9.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện rLiP H8
của chủng P. pastoris C132
45
3.10
Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rLiP H8 bởi
chủng P. pastoris C132 trong bình lên men tự động Bioflo
110 dung tích 7,5 lít
51
3.11.
Hoạt tính rLiP H8 từ chủng P. pastoris C132 trước và sau
quá trình tối ưu
52
3.12.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8
sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132
53
3.13.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh
tổng hợp bởi P. pastoris C132
54
3.14
Độ bền của rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 khi ủ ở các
nhiệt độ khác nhau theo thời gian

55
3.15
Độ bền của rLiP H8 ở các pH khác nhau theo thời gian
55

8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vii

MỤC LỤC

Trang

i

ii

iii

vi

v

vii
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Lignin-
3


4
1.2.1. Lignin peroxidase
5
1.2.2. Mangan peroxidase
6
1.2.3. Laccase
7

8
1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi)
8
1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn
9

10
  lignin peroxidase 

11

12
1.6.1. Vector biểu hiện pPIC9
12
1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men
13
1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115
14

P. pastoris
16
1.7.1. Ảnh hưởng methanol

16
9Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
viii

1.7.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
17
1.7.3. Ảnh hưởng của điều kiện lên men
18
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20

20
2.1.1. Các chủng sinh vật và plasmid
20
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu
20
2.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy
21
2.2. 
22
2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase
22
2.2.2. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
22
2.2.3. Tách chiết RNA tổng số từ P. chrysosporium 36210
23
2.2.4. Tổng hợp cDNA
24
2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa LiP H8 từ cDNA
24

2.2.6. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8
25
2.2.7. Đăng ký trình tự lipH8 trên GenBank
25
2.2.8. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn
25
2.2.9. Phản ứng ghép nối gen
26
2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli và P. pastoris
26
2.2.11. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ tế bào nấm men P.
pastoris
28
2.2.12. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp
28
2.2.13. Sàng lọc dòng P. pastoris biểu hiện LiP H8 tái tổ hợp hoạt
tính cao
29
2.2.14. Xác định hàm lượng protein
29
2.2.15. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide - SDS
30
2.2.16. Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men biểu hiện rLiP
H8 của chủng P. pastoris C132
30
2.2.17. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính và độ bền của
31
10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ix

rLiP H8 sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
33
3.1. Nhân dòng gen lipH8
33
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
33
3.1.2. Khuếch đại gen lipH8 từ cDNA
34
3.1.3. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8 của P.
chrysosporium 36210
35
3.2. rLiP H8 trong P. pastoris
38
P. pastoris rLiP H8
39
3.4. P.
pastoris 
41
3.5. P. pastoris C132
43
3.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
43
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
45
3.5.3. Nồng độ chất cảm ứng methanol
46
3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men và peptone
48
3.5.5. Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate

49

50
3.7. 
H8
53
3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của rLiP H8
53
3.7.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ xúc tác của rLiP H8
54
3.7.3. Độ bền của rLiP H8 với nhiệt độ
53
3.7.4. Độ bền của rLiP H8 với pH
55
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
58
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
62
PHỤ LỤC
63

11Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1

MỞ ĐẦU
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật, có mặt trong
nguyên liệu, phụ phẩm và chất thải của sản xuất nông, lâm, công nghiệp.
Lignocellulose chứa lignin, hemicellulose và cellulose; trong đó lignin (chiếm

khoảng 20÷30% sinh khối khô) là hợp chất khó bị phân giải nhất. Thành phần
hóa học chính của lignin là polymer của các phenylpropanoid phức tạp được
cấu trúc từ ba loại rượu thơm coniferyl, sinapsyl và p-coumaryl (Elis, 2002).
Trong quy trình sản xuất bột giấy, cần phải loại bỏ lignin khỏi sinh khối
gỗ và giữ lại bột giấy (cellulose và một phần hemicellulose) sao cho độ dài,
độ bền của xơ sợi chứa cellulose được bảo tồn cao nhất. Một trong các hướng
có triển vọng được quan tâm nhiều là sử dụng các enzyme phân hủy lignin
trong sản xuất bột giấy và giấy (xử lý dăm mảnh nguyên liệu, tẩy trắng bột
giấy, khử màu nước thải) nhằm giảm sử dụng hóa chất và giảm thải các chất
độc hại ra môi trường (Elis, 2002). Các enzyme phân hủy lignin quan trọng
nhất là lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và laccase (Kirk
et al., 1996; Gettemy et al., 1998; Wang et al., 2004; Hong et al., 2006).
Lignin peroxidase là enzyme phân hủy lignin mạnh nhất, oxy hóa các tiểu
phần lignin không chứa hợp chất phenol (chiếm 90% polymer của các
phenylpropanoide) (Gold et al., 2000; Martinez, 2002). Các nghiên cứu trước
đây cho thấy khi sử dụng enzyme phân hủy lignin từ Phanerochaete
chrysosporium để tẩy trắng bột giấy cho phép giảm 2/3 hàm lượng lignin, độ
trắng của bột tăng 54,6% (Elis, 2002). Ngoài ra, các enzyme phân hủy lignin
được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác như xử lý nguyên liệu
phế phụ phẩm nông nghiệp trong sản xuất cồn nhiên liệu, xử lý các nguồn ô
nhiễm lignin hay các hợp chất hydrocarbon đa vòng thơm (Polycyclic
Aromatic Hydrocarbon, PAH)
Lignin peroxidase được sinh tổng hợp bởi nhiều loại vi khuẩn (thuộc
các chi Pesudomonas, Bacillus, Serritia ), xạ khuẩn (thuộc các chi
Streptomyces, Thermomonospora ), nấm mốc (Aspergillus) hay nấm đảm
12Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2

(Phanerochaete, Trametes ) sống ký sinh trên thân thực vật bị mục hoặc
trong các nguồn cơ chất có chứa lignin. Có 6 loại isozyme LiP bao gồm H1,

H2, H6, H7, H8 và H10 đã được tách từ dịch nuôi cấy của P. Chrysosporium
(Leisola et al., 1987; Ollikka et al., 1993). Các isozyme này được cho rằng có
thể tạo ra từ quá trình sửa đổi các protein sau quá trình dịch mã (post-
translational modification). Các gen mã hóa enzyme H2, H6, H8 và H10 đã
được xác định và giải trình tự trong khi một số gen mã hóa các isozyme LiP
khác chưa được xác định. Trong các isozyme trên thì LiP H2 và LiP H8 có
hoạt tính phân hủy lignin cao hơn cả. Khi biểu hiện enzyme LiP H8 tái tổ hợp
trong Escherichia coli, enzyme chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ dạng
thể vùi LiP đã biến tính (denatured inclusion bodies) (Doyle, Smith, 1996).
Biểu hiện LiP H8 trong các vật chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P.
chrysosporium (Gelpke et al., 1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004),
đã được thực hiện thành công trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái
tổ hợp sử dụng vector pGV1503, hoạt tính enzyme đạt 1,125 nkat/mg. Trong
khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP H8 trong P. methanolica có hoạt tính
lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector pMETA và 1933 U/L đối với
pMETαA (Wang et al., 2004). Vì vậy, biểu hiện LiP H8 trong các vi sinh vật
khác nhau nhằm thu LiP hoạt tính cao đang được nhiều nhóm nghiên cứu trên
thế giới quan tâm (Doyle, Smith, 1996; Martinez, 2002; Wang et al., 2004).
Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào biểu hiện các
isozyme LiP từ P. chrysosporium và ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột
giấy (Nguyễn Thị Thanh Kiều, Phạm Thành Hổ, 2002). Do vậy, mục tiêu của
của luận văn này là:”Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8
của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris“ nhằm
thu enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

13Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lignin-cấu trúc và chức năng
Lignin là một polymer không tham gia vào quá trình trao đổi chất trong
thực vật. Nó thường tập trung ở các mô hoá gỗ, đóng vai trò như chất liên kết
các tế bào, làm tăng sức bền cơ học, khả năng chống thấm, ngăn chặn sự xâm
nhập của các chất độc, các enzyme vi sinh vật và các tác động khác từ bên
ngoài. Lignin có cấu trúc 3 chiều không đồng nhất và là đại phân tử với khối
lượng 600÷1000 kDa. Tuy phức tạp, nhưng về cơ bản, lignin được hình thành
từ 3 loại monomer: p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol
(Hình 1.1). Các monomer này được tích hợp vào lignin dưới dạng các
phenylpropanoid tương ứng là: p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringal
(S).


Hình 1.1. Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin
Tùy theo từng loài thực vật mà tỷ lệ ba thành phần này trong lignin
khác nhau. Lignin của cây hạt trần chứa chủ yếu dạng G và một lượng nhỏ H;
của cây hạt kín hai lá mầm thường chứa hỗn hợp G và S và ít dạng H, còn ở
cây một lá mầm thì là hỗn hợp của cả ba dạng trên. Nhiều loại cỏ có lignin
dạng G, trong khi ở cây cọ chủ yếu là dạng S
(
Như vậy, lignin thực chất không phải là một hợp chất có công thức xác
định mà là nhiều loại hợp chất khác nhau tùy thuộc vào thành phần và số
14Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4

lượng các tiểu phần cấu tạo nên nó cũng như cơ chế kết hợp giữa các thành
phần đó.

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin

Do sự phức tạp trong cấu trúc lignin với các tiểu phần khác nhau bắt
cặp với nhau một cách ngẫu nhiên, nên cho đến nay người ta vẫn chưa mô tả
được chính xác và đầy đủ cấu trúc hoá học của lignin.
1.2. Hệ enzyme phân hủy lignin
Trong thực tế, lignin được phân giải bằng quá trình oxy hóa phức tạp,
nhưng nhờ tác động của một số enzyme cơ bản (lignin peroxidase (LiP),
mangan peroxidase (MnP)

và laccase) do nấm mục trắng và vi sinh vật sinh
tổng hợp. Ngoài ra, một thành phần quan trọng của hệ thống enzyme phân
huỷ lignin là các enzyme oxidase, bao gồm: glyoxal oxidase, glucose oxidase,
aryl alcohol oxidase… Các enzyme này không trực tiếp tham gia vào cơ chế
phân cắt mạch lignin nhưng chúng tiến hành phản ứng oxy hoá chuyển
C
2
H
2
O
2
(có sự tham gia của O
2
) thành H
2
O
2
cần thiết cho hoạt động của các
peroxidase ngoại bào.

15Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5

1.2.1. Lignin peroxidase
Lignin peroxidase (EC 1.11.1.14) được tìm thấy trong môi trường nuôi
cấy P. chrysosporium sau nhiều năm nghiên cứu độc lập của hai nhà khoa học
người Mỹ và người Nhật (Tien, Kirk, 1983). Sau này enzyme này còn tìm
thấy trong các nấm làm mục gỗ khác như Phlebia radiate, P. tremellose,
Trametes versicolor và xạ khuẩn Streptomyces viridosporus,
Thermomonospora fusca…
Lignin peroxidase là một glycoprotein có nhân heme, khối lượng phân tử
38÷43 kDa. pH tối thích cho hoạt động của lignin peroxidase tương đối thấp,
khoảng 2,5÷3,0 và điểm đẳng điện pI là 3,2÷4,0. Lignin peroxidase hoạt động
với sự tham gia của hydro peroxide (H
2
O
2
) sinh ra từ các enzyme khác, tiến hành
phản ứng oxy hoá nhường electron cho các cơ chất. Cơ chất của LiP là veratryl
alcohol và các phenolic acid nhưng chủ yếu là veratryl alcohol. Nó thực hiện xúc
tác các quá trình oxy hóa khác nhau trong mối liên kết aryl của phức hợp lignin,
cắt mối liên kết C

-C

của nhánh bên lignin (Hình 1.3), thực hiện oxy hóa
veratryl alcohol và các cấu trúc tương tự tạo thành aldehyde và ketone, phân cắt
mối liên kết intradiol của cấu trúc phenylglycol và hydro hóa nhóm benzylic
methylene (Hình 1.4).

Hình 1.3. Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của
polymer lignin, tạo thành các oligomer

16Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6


Hình 1.4. Cơ chế phân cắt mối liên kết C

-C

tạo thành gốc aryl
Lignin peroxidase phản ứng với cơ chất qua hai giai đoạn oxy hóa kế
tiếp chuyển dịch một điện tử, hình thành cation-gốc tự do trung gian. Do thế
oxy hóa khử cao (1.5V), lignin peroxidase cũng có thể oxy hóa đơn vị mắt
xích của lignin là phenyl propan ở dạng không phenolic (Schoemaker,
Piontek, 1996).
Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của lignin peroxidase
trong quá trình phân giải lignin và các thực vật chứa lignin. Enzyme này có
thể phân giải lignin trong dung dịch loãng, oxy hóa và phân giải hàng loạt
dimer và oligomer tương ứng với các cấu trúc của lignin trong điều kiện
phòng thí nghiệm, xúc tác cho quá trình tạo ra các phân tử oxy hoạt tính.
1.2.2. Mangan peroxidase
Mangan peroxidase được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P.
chrysosporium, được Kuwahara và cộng sự công bố năm 1984. Mangan
peroxidase là một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 40÷48 kDa và
có điểm đẳng điện pI 2,9÷7,0. Ngoài P. chrysosporium, MnP còn được tìm
thấy trong nấm mục trắng khác T. versicolor, P. radiata, Ceriporiopsis
cubvermis, Agarious bisporus, Nematoloma frowadic. Enzyme này hoạt động
như một phenoloxydase trên cơ chất phenolic bằng cách sử dụng Mn
3+
/Mn

2+

17Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7

làm cặp oxy hoá khử trung gian. Nhiệm vụ chính của enzyme này là tham gia
vào phản ứng oxy hoá hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenolic của lignin
(có - OH phenol tự do). Mangan peroxidase tấn công trực tiếp vào cấu trúc
vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc có khối lượng phân tử thấp
theo con đường oxy hóa khử mangan gián tiếp (Johansson, Nyman, 1993;
Gold et al., 2000).
1.2.3. Laccase
Laccase (benzeldiol: O
2
oxydoreductase) cũng đóng vai trò quan trọng
trong quá trình phân giải lignin. Phần lớn nấm mục trắng có khả năng sản sinh
ra enzyme này (Donal, Muralidhara, 1993; Bononi et al., 2005).
Tất cả các laccase đều là glycoprotein. Enzyme này có chứa 4 ion đồng,
phân bố ở ba vị trí liên kết khác nhau (một ion dạng I, một ion dạng II và hai
ion dạng III) và mọi ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc
tác. Ion đồng dạng I có vai trò là một ion vận chuyển điện tử từ cơ chất tới
tâm hoạt động của enzyme được tạo thành bởi ion dạng II và dạng III, là nơi
chúng liên kết với oxy và bị khử trở thành hai phân tử nước. Các ion đồng này
giúp cho quá trình khử 4 electron của phân tử oxy không tạo thành chất trung
gian là oxy nguyên tử hoạt động mạnh.

Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa, thực hiện thủy phân các hợp chất hydroxyl
thơm hoặc các amino thơm tới các gốc phenol và gốc amino tự do. Laccase
cũng oxy hóa cấu trúc lignin phenol thành các gốc phenol tự do dẫn đến thay

đổi các chất quinon. Sự thay đổi này dẫn tới việc phân tách bộ khung cacbon-
cacbon hoặc cacbon-oxy bên trong các tiểu đơn vị phenylpropan của lignin.
18Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8

Kết quả là hai chuỗi bên và các vòng thơm bị phân hủy. Đây là những bước
phản ứng quan trọng cho quá trình chuyển hóa, phân hủy các hợp chất lignin.
Trong quá trình xúc tác, laccase kết hợp với một số enzyme như glucose
oxydase, lignin peroxidase….thực hiện phân cắt các mối liên kết cacbon-
cacbon, cacbon-oxy trong cấu trúc lignin và hợp chất lignin thành các vòng
thơm có cấu trúc đơn giản hơn.
1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin
Trong tự nhiên, gỗ là cơ chất khó bị phân huỷ do thành phần hoá học và
kết cấu đặc trưng của nó. Các polyme cấu trúc chính của gỗ bao gồm
cellulose (chiếm 40÷50 % trọng lượng khô của gỗ), hemicellulose (25÷40%),
lignin (20÷30%) và một lượng nhỏ protein (<5%). Như vậy trong gỗ có chứa
rất ít nitơ, mà nitơ lại cần để tạo ra các enzyme phân huỷ các hợp phần này.
Ngoài ra, lignin nằm trong vách tế bào cũng cản trở sự phân hủy gỗ do nó hạn
chế khả năng thấm nước của cellulose và hemicellulose, do vậy cũng cản trở
sự phân hủy của các polysacaride này; đồng thời nó hình thành một rào chắn
các enzyme vi sinh vật tấn công 2 thành phần còn lại. Bên cạnh đó, trong gỗ
luôn có các chất độc như ta-nanh, terpen, stilbenen, flavonoit và troponol
khiến cho côn trùng và vi sinh vật khó tiêu hóa được gỗ. Mặc dầu vậy, vẫn có
một số loài nấm và vi sinh vật tấn công được vào thành tế bào gỗ và phân hủy
mô gỗ.
1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi)
Tác nhân làm mục gỗ nhiều nhất trong tự nhiên là các loại nấm thuộc
nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) - tác nhân cần thiết trong quá trình tuần
hoàn sinh khối và làm giàu đất cho hệ sinh thái rừng. Theo cách thức tấn công
vách tế bào mà chúng được chia thành ba loại: nấm mục trắng, mục nâu và

mục xốp. Tuy nhiên, chỉ có nấm mục trắng là có khả năng phân hủy lignin,
còn hai loại nấm kia chủ yếu tấn công vào cellulose và hemicellulose.
Nấm mục trắng là tác nhân phân huỷ gỗ hiệu quả nhất, chúng có khả
năng khoáng hoá hoàn toàn các thành phần của gỗ, tạo ra CO
2
và nước. Đúng
19Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9

với tên gọi của mình, nấm mục trắng có thể phân hủy cả cellulose,
hemicellulose và lignin, khiến cho vị trí thân gỗ bị nấm tấn công trở thành
màu trắng. Tuy có khả năng phân huỷ triệt để lignin, chúng lại không thể sử
dụng lignin như nguồn cacbon duy nhất. Người ta cho rằng chúng phân giải
lignin để tiếp cận nguồn nitơ và cacbon có trong các thành phần protein và
cacbonhydrat còn lại (Highley, Dashek, 1998).
Có hai dạng nấm mục trắng chủ yếu được phân loại dựa trên tính đặc
hiệu khi tấn công. Dạng thứ nhất là phân hủy có chọn lọc, ở giai đoạn đầu
lignin được phân hủy nhanh hơn so với cellulose và hemicellulose, khiến cho
gỗ mất màu nhưng vẫn giữ được một phần cấu trúc. Dạng thứ hai là phân hủy
đồng thời, hệ enzyme do những loài nấm này sinh ra có thể phân hủy cả ba
thành phần chính của gỗ với tốc độ gần như nhau, thân gỗ bị phá hủy hoàn
toàn, trở thành dạng mùn trắng (Highley, Dashek, 1998). Tuy nhiên, tốc độ
phân huỷ các thành phần cacbonhydrat của nấm mục trắng vẫn chậm hơn nấm
mục nâu và nấm mục xốp. Nấm mục trắng tấn công vào các cây gỗ cứng. Các
loài nấm mục trắng có hệ enzyme phân giải lignin mạnh được quan tâm
nghiên cứu nhiều nhất là Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor,
T. hirsuta, chi Cerrena (C. unicolor), Pleurotus và một số chi khác.
1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn
Các vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas, Acinetobacter và Xanthomonas
được cho là có tham gia vào quá trình phân giải lignin nhưng vai trò của chúng

vẫn chưa thực sự rõ ràng. Một số tác giả đã phân lập được vi khuẩn thuộc chi
Agrobacterium, Burkholderia, Arthrobacter và Sphingomonas thường xuyên có
mặt trong môi trường nuôi cấy P. chrysosporium. Quan hệ giữa vi khuẩn và loài
nấm này được giả thiết là cộng sinh, vì chúng có khả năng phân giải các hợp
chất thơm là sản phẩm từ quá trình phân hủy lignin của nấm.
Một số nghiên cứu mới đây đã cho thấy khả năng phân giải lignin của các
vi khuẩn thuộc chi Clostridium đã chứng minh được rằng lignin cũng có thể bị
phân huỷ trong điều kiện yếm khí (Crawford, 1978).
20Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10

1.4. Ứng dụng của lignin peroxidase
Nước ta là một nước nông nghiệp nhiệt đới nên nguồn phụ phẩm và phế
thải có nguồn gốc thực vật rất dồi dào. Lignocellulose lại chiếm một tỉ lệ rất
lớn. Hiện nay, nhìn chung việc xử lý lignocellulose ở nước ta, đặc biệt là lignin,
còn rất thô sơ. Các biện pháp chủ yếu là thải trực tiếp vào môi trường để phân
hủy tự nhiên, chôn lấp (rác thải sinh hoạt) hoặc đốt (rơm rạ).
Nước thải từ các cơ sở chế biến bột giấy có lượng khá lớn dẫn xuất của
lignin là các hợp chất vòng thơm độc hại, muối vô cơ và hydro sulfur (H
2
S)
có mùi hôi do sử dụng sulfit natri để tách lignin. Lignin trong nước thải có thể
phản ứng với clo tạo thành các hợp chất phenol clo hóa độc hại nhưng khó bị
phân hủy. Theo số liệu thống kê, khoảng 90% chất màu từ cơ sở dệt nhuộm
không bị phân hủy sau quá trình xử lý nước thải bằng biện pháp lý-hóa học.
Đôi khi, sản phẩm phân giải các chất màu này lại còn độc hại hơn. Ví dụ,
trong quá trình xử lý yếm khí nước thải, enzyme azo-reductase thường cắt
chất màu azo thành amin. Nhiều chất thuộc nhóm amin là tác nhân gây đột
biến hoặc ung thư. Để giải quyết vấn đề này, sử dụng enzyme vi sinh vật là
giải pháp an toàn nhất, bởi enzyme làm giảm độc tính của các hợp chất phenol

clo hóa thông qua phản ứng trùng ngưng hoặc gắn kết hợp chất phenol đã bị
biến đổi với phenol tự nhiên (Abadulla et al., 2000).
Trong công nghiệp bột giấy và giấy, lignin là chất cần bị loại bỏ do sự có
mặt của lignin làm giấy thô kém bền, khiến cho giấy nhanh bị ngả vàng và dòn.
Quy trình Kraft, hiện đang thông dụng, tạo ra bột giấy toàn sợi cellulose gần
như tinh khiết nhờ xử lý dăm gỗ bằng xút hoặc sulfit natri để tách lignin ra
khỏi cellulose. Một trong những ưu thế của bột giấy Kraft là làm ra giấy dai
nhất so với tất cả các quy trình khác. Tuy nhiên, bột giấy Kraft lại có màu sẫm
nhất do trong đó còn nhiều hợp chất lignin đã bị biến đổi. Do vậy, để tạo được
giấy trắng chất lượng cao thì phải loại được các hợp chất lignin đó ra khỏi bột
giấy, thường là dùng hóa chất như clo, dioxit clo và xút (NaOH). Vấn đề đáng
quan tâm là quy trình Kraft sử dụng một lượng nước rất lớn và sản sinh ra
21Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11

nhiều hợp chất hữu cơ dạng clo hóa độc hại cho sức khỏe. Việc thu hồi các
hóa chất dùng tẩy trắng nói trên hoặc xử lý khử độc nước thải đòi hỏi phải có
đầu tư về quy trình công nghệ và trang thiết bị đắt tiền mà không phải doanh
nghiệp vừa và nhỏ nào cũng thực hiện được. Mặt khác, nhằm đáp ứng mối
quan tâm về bảo vệ môi trường và tiêu chuẩn ngày càng cao về khí thải, công
nghiệp bột giấy và giấy đang nỗ lực tìm kiếm các biện pháp giảm lượng lignin
clo hóa trong nước thải bằng cải tiến công nghệ chế biến và cải thiện công
nghệ xử lý nước thải. Một số quy trình khác cũng được thử nghiệm, ví dụ
dùng ozon, hydro peroxit hoặc polyoxometalat. Tuy nhiên, các phương pháp
này còn cần phải cải tiến hơn nữa để nâng cao độ trắng của giấy và hạ giá
thành. Việc sử dụng vi sinh vật và enzyme vi sinh để giảm thiểu tiêu thụ clo
và các hóa chất tẩy đã được nhiều nhóm tác giả nghiên cứu và chứng minh là
giải pháp công nghệ khả thi và có hiệu quả kinh tế (Glenn, Goald, 1983;
Williams et al., 1983).
1.5. Tình hình nghiên cứu và biểu hiện lignin peroxidase trên thế giới và

tại Việt Nam
Isozyme lignin peroxidase được mã hóa bởi một tổ hợp các gen và đã
được biểu hiện như là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của quá trình nuôi cấy.
Ngoài ra, một vài hệ biểu hiện đồng hình (homologous expression) và hệ biểu
hiện dị hình (heterologous expression) cho LiP đã được nghiên cứu.
Một vài loại isozyme LiP mã hóa bởi các gen lip khác nhau đã được
nghiên cứu trong xạ khuẩn và nấm mục trắng P. chrysosporium. Leisola và
cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích dựa vào điểm đẳng điện và tìm
thấy có 15 loại isozyme LiP khác nhau trong dịch nuôi cấy chủng P.
chrysosporium BKM-1767 thu nhận ở các thời gian và điều kiện nuôi cấy
khác nhau (Leisola et al., 1987). Các isozyme LiP có đặc tính vật lý, độ bền
và tính oxy hóa đặc hiệu khác nhau đối với các chất màu tổng hợp hoặc các
cơ chất có cấu trúc tương tự lignin. Trong dịch nuôi cấy P. Chrysosporium,
sáu loại isozyme LiP bao gồm các loại H1, H2, H6, H7, H8 và H10 đã được
22Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12

phân tách và nhận biết. Các gen mã hóa isozyme H2, H6, H8 và H10 đã được
xác định và giải trình tự, trong khi một số gen mã hoá các isozyme LiP khác
chưa được tìm thấy. Cho đến nay, một số gen mã hóa cho một vài loại
isozyme LiP khác nhau đã được phân lập, giải trình tự gen và biểu hiện ở các
sinh vật chủ khác nhau. Trong đó, biểu hiện enzyme tái tổ hợp LiP H8 trong
E. coli, enzyme tái tổ hợp chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ các thể vùi
LiP biến tính (denatured inclusion bodies). Biểu hiện LiP H8 trong các vật
chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P. chrysosporium (Gelpke et al.,
1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004), đã được thực hiện thành công
trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái tổ hợp sử dụng vector
pGV1503, đạt 1,125 nkat/mg. Trong khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP
H8 trong P. methanolica có hoạt tính lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector
pMETA và 1933 U/L đối với vector pMETαA (Wang et al., 2004).

Ở Việt nam, việc nghiên cứu về LiP đã bắt đầu từ nhiều năm qua tại
một số viện nghiên cứu và trường đại học trên cả nước như Viện Công nghệ
sinh học, Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh… Nhìn chung, những công trình đã công bố hiện nay chủ yếu tập trung
vào hướng tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy của các chủng sinh LiP và
đặc tính enzyme.
1.6. Vector biểu hiện pPIC9 và hệ biểu hiện trong nấm men P. pastoris
1.6.1. Vector biểu hiện pPIC9
Vector biểu hiện pPIC9 được thiết kế có chứa gen kháng ampicillin
dùng cho chọn lọc trong tế bào E. coli và gen his4 (histidinol dehydrogenase)
dùng làm dấu chuẩn chọn lọc trong tế bào nấm men P. pastoris. Plasmid
pPIC9 là một vector biểu hiện protein ngoại lai mạnh. Trên vector có một số
điểm của enzyme giới hạn như XhoI, EcoRI, NotI, SnaBI, AvrII nằm trong
vùng đa nối để tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa gen ngoại lai vào vector.
Ngoài ra, vector này còn chứa một trình tự tiết α-MF prepro được gắn với
promoter AOX1 để protein ngoại lai được tiết ra môi trường nuôi cấy (Phụ
23Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13

lục 6).
Để gen ngoại lai có thể hoạt động và tồn tại bền vững trong chủng biểu
hiện, vector biểu hiện được tích hợp vào hệ gen của vật chủ nhờ trao đổi giữa
các vùng tương đồng của vector biểu hiện và hệ gen của nấm men. Thông
thường, vector được mở vòng bằng một số enzyme giới hạn như SalI, StuI
nằm trong trình tự gen HIS4 để định hướng vector tích hợp hiệu quả vào gen
his4 bị đột biến trong hệ gen. Đồng thời gen his4 được sử dụng như là dấu
chuẩn chọn lọc các thể tái tổ hợp. Chủng nấm men được sử dụng trong nghiên
cứu này là chủng P. pastoris GS115 đã bị đột biến khuyết dưỡng histidine, do
vậy chỉ những dòng nấm men tái tổ hợp đã tích hợp vector biểu hiện mới có
khả năng phát triển trên môi trường không có histidine (Invitrogen, 2005,

Joseph et al., 1999).
1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men
Đối với hệ biểu hiện P. pastoris, vector thường được tích hợp vào hệ
gen của tế bào nấm men để tăng tính ổn định của chủng biểu hiện tới mức lớn
nhất. Tất cả các vector biểu hiện của P. pastoris đều chứa ít nhất một đoạn
DNA của promoter có chứa điểm cắt giới hạn đặc biệt có tác dụng hướng
vector đã mở vòng tích hợp vào hệ gen thông qua kiểu trao đổi đơn (single
crossover) (Cereghino, Cregg 2000; Cregg et al., 2000). Vector chứa gen
HIS4 của P. pastoris có thể được tích hợp vào locus his4 trong hệ gen (Hình
1.6). Trên thực tế, một phần đáng kể chủng sau biến nạp không chứa vector
biểu hiện. Hiện tượng này có nhiều khả năng do sự chuyển đổi gen giữa gen
HIS4 của vector và locus his4 trong hệ gen, khiến chỉ có gen HIS4 của vector
được gắn vào hệ gen (Cereghino, Cregg 2000; Cregg et al., 2000). Do đó, cần
phải dùng các kỹ thuật phân tích DNA như PCR, Southern blot để khẳng định
sự có mặt của gen ngoại lai trong hệ gen của chủng đột biến.
24Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14


Hình 1.6. Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus his4
1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115
Trong số các hệ biểu hiện gen thường được sử dụng là E. coli, Bacillus
sp., nấm men và tế bào động vật thì nấm men được xem là hệ biểu hiện hiệu
quả nhất đặc biệt là trong biểu hiện các protein có nguồn gốc từ eukaryote.
Nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh và lợi thế về thao tác di truyền thuận
tiện như E. coli đồng thời lại có môi trường nhân chuẩn, thực hiện được rất
nhiều cải biến protein sau dịch mã như cắt bỏ các trình tự tín hiệu, bao gói,
cuộn xoắn, tạo cầu disulfide, glycosyl hóa khiến protein ngoại lai có tính tan
tốt, giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo hoạt tính sinh học-vấn đề thường
bị hạn chế khi biểu hiện trong E. coli. Lợi thế của nấm men so với hệ biểu

hiện tế bào động vật là sinh trưởng rất nhanh (trung bình 1÷3 giờ/thế hệ so
với nuôi cấy mô tế bào 1 ngày/thế hệ), các trang thiết bị, môi trường nuôi cấy,
kỹ thuật xử lý, đặc biệt là quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp đơn giản và
kinh tế hơn.
Những loài nấm men có khả năng sử dụng methanol làm nguồn cacbon
và năng lượng duy nhất cho sinh trưởng đã được Ogata mô tả lần đầu tiên
năm 1969. Kể từ đó, cùng với những hiểu biết về nấm men Saccharomyces
cerevisiae, hàng loạt những nghiên cứu đã được thực hiện. Đến nay, nấm men
25Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên