nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex pcr phát hiện nhanh và đồng thời staphylococcus aureus và salomonella typhi gây bệnh trong thực phẩm

Số hóa bởi trung tâm học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC








PHẠM VĂN PHÚC








NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus
VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC











Thái Nguyên - 2013







Số hóa bởi trung tâm học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM VĂN PHÚC





NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI Staphylococcus aureus
VÀ Salmonella typhi GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM





Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã Số: 60420201




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN VĂN DUY

Thái Nguyên - 2013








Số hóa bởi trung tâm học liệu


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá
nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Văn
Duy. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn
này là trung thực.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Học viên


Phạm Văn Phúc

Số hóa bởi trung tâm học liệu


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Lê Quang Hòa,
trưởng phòng Công nghệ gen, Viện CNSH&CNTP, Trường Đại học Bách Khoa
Hà Nội; TS. Nguyễn Đắc Trung, phó trưởng khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học

Y Dược Thái Nguyên; ThS. Nguyễn Thị Lan Hương, cán bộ Trung tâm Y tế dự
phòng tỉnh Thái Nguyên; ThS. Đỗ Bích Duệ, cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa
học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã cung cấp các chủng vi
sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ phòng Vi sinh, Viện Khoa học Sự
sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; các cán bộ Bộ môn Vi sinh,
Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên; các cán bộ phòng thí
nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên.
Tôi x
.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2013
Học viên


Phạm Văn Phúc


Số hóa bởi trung tâm học liệu


iii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 2

4.1. Ý nghĩa khoa học 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella 3
1.1.1. Trên thế giới 3
1.1.2. Ở Việt Nam 6
1.2. Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 7
1.2.1. Salmonella typhi 7
1.2.1.1. Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi 7
1.2.1.2. Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi 10
1.2.1.3. Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi 11
1.2.1.4. Đặc tính sinh học của Salmonella typhi 12
1.2.1.5. Đặc tính gây bệnh của Salmonella typhi 14
1.2.2. Staphylococcus aureus 15
1.2.2.1 Hình thái , cấu tạo của Staphylococcus aureus 15
1.2.2.2. Cấu trúc di truyền của Staphylococcus aureus 18
1.2.2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus 18
1.2.2.4. Đặc tính sinh học Staphylococcus aureus 19

Số hóa bởi trung tâm học liệu


iv
1.2.2.5. Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus 22
1.3. Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 24
1.3.1. Các phương pháp vi sinh 24
1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử 25
1.4. Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR 27
1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật multiplex PCR 27
1.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây

bệnh……………………………………………………………………………….28
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. Đối tượng nghiên cứu 31
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 31
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 31
2.3. Vật liệu nghiên cứu 31
2.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài 31
2.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài 32
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị 33
2.4. Phương pháp nghiên cứu 33
2.4.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi 33
2.4.1.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Staphylococcus aureus 33
2.4.1.2. Thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng bằng phản
ứng PCR 34
2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA 35
2.4.2.1. Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sốc nhiệt 35
2.4.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn bằng hóa chất 36

Số hóa bởi trung tâm học liệu


v
2.4.2.3. Định lượng, kiểm tra chất lượng tách chiết DNA 37
2.4.3. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus
và Salmonella typhi 38
2.4.4. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR 39
2.4.5. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của multiplex PCR 39
Chƣơng 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40
3.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời

Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 40
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus
và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR 43
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn 43
3.2.2. Nghiên cứu nồng độ DNA tối thiểu của các phản ứng PCR đơn phát hiện riêng
rẽ Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 45
3.2.3. Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
aureus và Salmonella typhi 47
3.2.4. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các chủng vi khuẩn
thuần …………………………………………………………………………… 53
3.2.5. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplex PCR với các phương pháp tách chiết
DNA khác nhau 54
3.3. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh
và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 56
3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng
thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi. 57
Chƣơng 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 60
4.1. Kết luận 60
4.2. Kiến nghị 61

Số hóa bởi trung tâm học liệu


vi
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62



DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên đầy đủ

ATTP An toàn thực phẩm
ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm
CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol
CFU Colony Forming Unit - Đơn vị đo khuẩn lạc
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
NĐTP Ngộ độc thực phẩm
OD Optical Density - Giá trị mật độ quang
PCR Polymerase Chain Reaction
















Số hóa bởi trung tâm học liệu


vii

Số hóa bởi trung tâm học liệu


viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp
KauffmannWhite. 8
Bảng 1.2. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci 22
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 32
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 32
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33
Bảng 3.1. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số của các chủng vi khuẩn
nghiên cứu. 44

Số hóa bởi trung tâm học liệu


ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc tế bào vi khuẩn S. typhi 9
Hình 1.2. Hình thái Staphylococcus aureus 16
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR thử nghiệm khả năng khuếch
đại của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 42
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của các
chủng vi khuẩn nghiên cứu 43
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR
(đường chạy 1-6) và sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi BS1-BS2 (đường chạy 7-
12) sử dụng DNA khuôn ở các nồng độ khác nhau 45
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại của các phản ứng PCR
phát hiện riêng rẽ S. typhi (đường chạy 1-12) và S. aureus (đường chạy 13-24) ở
các điều kiện hàm lượng MgCl
2
và nhiệt độ gắn mồi khác nhau. 48
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR với cặp mồi BS1-
BS2 và NucF-NucR ở nồng độ 0,6 µM sử dụng khuôn là hỗn hợp 1,8 ng/µl
DNA tổng số của S. typhi và 2,0 ng/µl DNA tổng số của S. aureus. 49
Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các
nồng độ mồi khác nhau. 51
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR trên các chủng
Salmonella typhi và Staphylococcus aureus 54

Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR khi
sử dụng 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau 55
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex
PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi và S. aureus 57

Số hóa bởi trung tâm học liệu


x
Hình 3.10. Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR
trên các chủng vi khuẩn kiểm định. 58

Số hóa bởi trung tâm học liệu


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm trở lại đây vấn đề bảo đảm chất lượng và an toàn thực
phẩm (ATTP) đang là mối quan tâm đặc biệt ở nước ta và nhiều nơi trên thế
giới. Thực tế hiện nay thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, gia cầm bán ở các
chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lượng. Chính vì vậy con người có thể bị
nhiễm vi sinh vật thông qua thức ăn sống hoặc nấu chưa chín như thịt, gia cầm,
trứng và các sản phẩm sữa [54]. Điều đó cũng lý giải vì sao mà hàng năm có rất
nhiều vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy ra. Trên thế giới các vụ ngộ độc thực
phẩm có xu hướng ngày càng tăng [37]. Trung bình cứ 1.000 dân có 175 người
bị NĐTP mỗi năm và chi phí cho 1 ca NĐTP mất 1.531 đôla Mỹ (FDA 2006).
Ở Việt Nam theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh thực
phẩm (ATVSTP) từ đầu tháng 4/2012 đến hết tháng 12/2012 cả nước đã xảy ra
10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập

viện và đã có 04 trường hợp tử vong. Phần lớn các vụ NĐTP xảy ra với quy mô
nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi
sinh vật. Đặc biệt vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhi) và tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus) là thủ phạm chính gây ra các vụ NĐTP.
Để phát hiện Salmonella typhi và Staphylococcus aureus, phương pháp
chủ yếu hiện nay vẫn được sử dụng là phương pháp nuôi cấy truyền thống trên
môi trường đặc hiệu. Phương pháp này bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết
hợp với các bước kiểm tra sinh hóa tốn nhiều thời gian (từ 4 đến 5 ngày theo
ISO 6579:2003) [37], [44], [54]. Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh
trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân góp phần giúp cho
những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến
sức khỏe của con người và gây ảnh hưởng đến công tác phòng chống bệnh
truyền nhiễm trong cộng đồng.
Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gen đặc hiệu cho các loài vi
sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Staphylococcus và
Salmonella đã được hiểu biết khá đầy đủ. Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân
tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây
bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu loài.

Số hóa bởi trung tâm học liệu


2
Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, multiplex PCR, ELISA, DNA arrays…
Trong đó multiplex PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, cho phép phát hiện nhanh
và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh chỉ trong một phép phân tích [7], [44].
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu
và được sự chấp thuận của Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex

PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella
typhi gây bệnh trong thực phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
Xây dựng được kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời
Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm với độ nhạy
và độ đặc hiệu cao.
3. Nội dung nghiên cứu
* Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR.
* Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR.
* Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi.
* Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi.
4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng
thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm. Tạo tiền
đề khoa học cho việc phát triển bộ kít phát hiện nhanh hai loài vi khuẩn gây
bệnh này trong mẫu thực phẩm.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Số hóa bởi trung tâm học liệu


3
Kết quả nghiên cứu sẽ tạo tiền đề phát triển bộ kít phát hiện nhanh và
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm góp
phần giám sát chất lượng ATTP.
Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus và Salmonella
1.1.1. Trên thế giới
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị
nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối
với người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại
cùng một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng một loại thức ăn [63]. Ngộ độc thực
phẩm có những triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu
chảy…hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ
độc [63].
Thực phẩm nhiễm các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một trong
những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở cả các nước có
nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát triển
[44]. Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh
truyền nhiễm thông qua thực phẩm. Các triệu chứng lâm sàng khá đa dạng, từ
mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy cơ tử
vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống của
bệnh nhân. Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm
rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng. Thể hiện, mỗi năm ở Mỹ có khoảng 76
triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện và 5
nghìn ca tử vong. Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la,
thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm [51].
Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm các
mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc. Trong số

Số hóa bởi trung tâm học liệu


4
hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật

đã được xác định vai trò gây bệnh. Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn,
nấm, ký sinh trùng và virút, trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% số ca
bệnh tử vong ở người. Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản
xuất và phân phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian
địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm.
Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt
đã làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao. Số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [51].
Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh trực
tiếp từ thực phẩm vẫn chưa được phát hiện đầy đủ. Tại Mỹ, chỉ có 14/76 triệu ca
mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong do nhiễm độc thực
phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân [51]. Trong số các nguyên
nhân đã được xác định, có một số mầm bệnh có khả năng gây nhiễm trùng,
nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera,
Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica. Tụ cầu vàng gây ra
khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm và hàng năm Mỹ mất khoảng 1,5
tỉ đô la cho những vụ ngộ độc do tụ cầu [57]. Ngoài vấn đề viện phí còn phải
mất nhiều thời gian làm việc cũng như sản phẩm lao động của người bệnh, và cả
việc phải loại bỏ những sản phẩm bị nhiễm.
Vụ ngộ độc lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở
Michigan do phomai. Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt bò bị nhiễm vi
sinh vật. Thịt bò bị nhiễm tụ cầu vàng cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo,
Michigan vào năm 1907. Năm 1914 ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa
lấy từ bò bị viêm vú đã gây ra ngộ độc ở người. Năm 1930, Dark lại xác định
được vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh giáng sinh [50].
Cách đây vài thập niên, các vụ ngộ độc do tụ cầu chiếm 25% các vụ ngộ
độc thực phẩm ở Mỹ [57]. Từ năm 1988 đến 1992, S. aureus gây ra 5,1% trong

Số hóa bởi trung tâm học liệu

5
số các vụ ngộ độc ở Châu Âu [57]. Từ năm 1988 đến 1996, ở Đức xảy ra nhiều
vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng gây ra và vào năm 2000 lại xảy ra một vụ
dịch làm 297 người bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu vàng [14].
Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến
năm 1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng tại một
trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện
ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng [74] . Ở Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm
1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa
tươi có nhiễm tụ cầu vàng [28]. Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus
là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm [28].
Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây
ra ngộ độc [2]. Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S.
aureus cao là Indonesia và Philippines. Ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc S.
aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5
trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 1478 người bị ngộ độc ở
vùng Kansai. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có
nhiễm S. aureus của tập đoàn Snow. Còn ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy
ra 1 vụ NĐTP ở trẻ em vì uống sữa bị nhiễm S. aureus [2].
Ngày 1/1/2006 tại Allanta đã xảy ra một đợt truyền nhiễm vi khuẩn
Salmonella có liên quan tới thực phẩm đã làm ngã bệnh 172 người ở 18 tiểu
bang, 11 người phải vào bệnh viện. Thực phẩm bị nghi nhiễm Salmonella gồm:
rau diếp và cà chua ở các tiệm ăn và siêu thị. Ngày 26/12/2007 Ban kiểm dịch
và an toàn thực phẩm của Bộ Nông nghiệp Mỹ (FSIS) phát hiện vi khuẩn
Salmonella trong thịt bò tươi ở các cửa hàng và các kho chứa tại các siêu thị ở
Arinoza, California, Hawaii, Nevada và New Mexico. Đã làm 38 trường hợp bị
mắc bệnh [9]. Ngày 9/7/2008 tại Mỹ đã có trên 1000 người bị ngã bệnh vì vi
khuẩn Salmonella, được xem là con số lớn nhất từ 10 năm qua tại Mỹ vì NĐTP.

Thủ phạm chính bị nghi ngờ là cà chua, ớt đỏ và ngò tươi. Tốc độ nhiễm trung

Số hóa bởi trung tâm học liệu


6
bình là 25-40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang. Tại Canada cũng có 4
trường hợp [9].
1.1.2. Ở Việt Nam
Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ
cầu vàng để lại hậu quả không nhỏ. Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới,
hàng năm Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại
trên 200 triệu đô la. Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở
nước ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233
người mắc 59 người tử vong [3].
Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong
những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do
tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40 - 45% trong các loại gây ngộ độc,
trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là vi khuẩn Staphylococcus
aureus và vi khuẩn Salmonella typhi [8].
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa
dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích
(96,6%), bánh gato (85%), patê (83,3%). Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus
thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [10]. Qua các cuộc
khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại
các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với
các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong
những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu
(53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) [6], [8]. Điển hình là vụ ngộ độc
thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất và Sinh học trường Đại học Khoa

học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh vào ngày 27/7/2006 trong chuyến đi thực tế
đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa). Vụ ngộ độc làm tất cả 105 người phải vào
bệnh viện để cấp cứu. Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến không
hợp vệ sinh, lại để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tố enterotoxin [4].

Số hóa bởi trung tâm học liệu


7
Theo thống kê của Cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm
năm 2002, trong tổng số 269 vụ ngộ độc theo dõi từ năm 1983-1989 có 5756
người mắc, tử vong 156 (2,7%) mà nguyên nhân chủ yếu là do Salmonella.
Ngày 16/5/2005 vụ ngộ độc kem Tràng Tiền làm 13 người gia đình chị Ngô
Mai Lan phải vào viện Bạch Mai. Nguyên nhân chính là do trong kem nhiễm vi
khuẩn Salmonella [9].
Tình trạng ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn mà
còn diễn ra phổ biến ở nhiều địa phương khác trên cả nước [73]. Từ dữ liệu của
Cục vệ sinh an toàn thực phẩm thì năm 2005 số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước
ta là 141 vụ, làm 4291 người bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi
sinh vật gây ra [8].
1.2. Tổng quan về Salmonella typhi và Staphylococcus aureus
1.2.1. Salmonella typhi
1.2.1.1. Hình thái, cấu tạo của Salmonella typhi
Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi khuẩn
này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di động được.
Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella, trong đó Kauffmann
White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm
2003. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên
bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng nguyên H [29].
Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng

của màng tế bào. Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu
đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường. Những thay đổi trong thành
phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng
nguyên O khác nhau. Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết
thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4 [29].

Số hóa bởi trung tâm học liệu


8
Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại
kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau [29]. Tuy nhiên
hoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được biểu
hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn [29]. Hai kháng nguyên H này
được xếp vào pha 1 và pha 2. Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện
một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng
nguyên pha 1 hoặc pha 2. Ngoài ra, một số tuýp huyết thanh “đơn pha” do tự
nhiên như S. enteriditis, S. typhi.
Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài:
Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella
enterica phân loài V). Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định
bằng tên hoặc số La Mã. Trong đó S. typhi thuộc phân loài I [27].
Bảng 1.1. Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp
KauffmannWhite [27].
Loài và phân loài
Salmonella
Số lƣợng tuýp
huyết
thanh trong mỗi
phân loài

Vật chủ
S.enterica subsp.enterica (I)
1454
Động vật máu nóng
S.enterica subsp.salamae (II)
489
Động vật máu lạnh và môi trường
S.enterica subsp.arizonae (IIIa)
94
Động vật máu lạnh và môi trường
S.entericasubsp.diarizonae (IIIb)
324
Động vật máu lạnh và môi trường
S.enterica subsp.houtenae (IV)
70
Động vật máu lạnh và môi trường
S.bongori (V)
20
Động vật máu lạnh và môi trường
S.enterica subsp.indica (VI)
12
Động vật máu lạnh và môi trường
Tổng cộng: 2463 tuýp huyết thanh

Số hóa bởi trung tâm học liệu


9
Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi (S. typhi) là chủng vi
khuẩn có tên tuýp huyết thanh (serotype) là typhi thuộc giống Salmonella, loài

Salmonella enterica và phân loài enterica [27].
Salmonella typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I
9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9, 12
và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không có
kháng nguyên H pha 2. Phần lớn (59%) tuýp huyết thanh của Salmonella thuộc
S. enterica phân loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là
O2, O4, O9 gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động
vật máu nóng [27].

* Đặc điểm cấu trúc của Salmonella typhi (Hình 1.1)

Hình 1.1. Cấu trúc tế bào vi khuẩn S. typhi [59]
Salmonella typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0,5 µm, cấu trúc gồm
2 màng, màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng
nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều là các
lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào.

Số hóa bởi trung tâm học liệu


10
Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi tế
bào chất [59].
Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O. Ở S. typhi và S.
paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của axit
Nacetylglucosamine uronic, nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng
nguyên O. Salmonella typhi còn mang các roi dài 2-5 µm là sự kéo dài của các
thể nền bên trong tế bào. Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp
cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ. Những sợi lông này có đường
kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các

tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin [59].
Cấu trúc bề mặt của S. typhi đóng vai trò quan trọng quyết định các đặc
tính sinh lý và sự bám vào các mô của tế bào chủ. Nếu Salmonella mất hoặc
không biểu hiện kháng nguyên O sẽ không có khả năng sống sót trong tế bào
chủ do kháng nguyên O là lớp lipopolisaccharide bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn
công của các bổ thể của hệ miễn dịch [7], [43].
1.2.1.2. Cấu trúc di truyền của Salmonella typhi
Trình tự bộ gen của chủng S. typhi đa kháng thuốc CT18 phân lập ở bệnh
viện Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh đã được công bố lần đầu tiên trên thế giới
vào năm 2001 [59]. Bộ gen có kích thước 4.809.037 bp với khoảng 4599 gen,
mang nhiều đoạn gắn chèn lớn (Salmonella pathogenicity islands-SPIs). Các đảo
độc tính này chứa các gen quan trọng cho sự xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn
trong tế bào chủ. Đặc biệt bộ gen S. typhi mang 204 pseudogen chiếm hơn 4%
trình tự mang mã, tương tự với bộ gen của S. paratyphi [31], [41]. Pseudogen là
những trình tự DNA mang mã nhưng không được dịch mã. Những gen này có thể
bị bất hoạt do đột biến tạo stop codon, đột biến gây lệch khung, mất đoạn hay tái
sắp xếp đoạn. Trong khi hầu hết các tuýp huyết thanh của S. enterica đều gây bệnh
ở nhiều kí chủ khác nhau và giới hạn ở viêm dạ dày, ruột thì S. typhi và S.
paratyphi chỉ gây bệnh ở người và còn gây nhiễm trùng hệ thống. Trình tự DNA
bộ gen S. typhi và S. paratyphi có mức độ tương đồng cao nhất. Sự bất hoạt những

Số hóa bởi trung tâm học liệu


11
gen đóng vai trò quan trọng trong tương tác với các tế bào chủ, các gen làm thay
đổi chu trình kí sinh nội bào…được xem là cơ chế tiến hóa để S. typhi cũng như S.
paratyphi trở thành vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người [31], [41].
Một đặc điểm quan trọng khác ở S. typhi là vi khuẩn này mang rất ít đặc
tính đa dạng di truyền. Khi giải trình tự gen để phân biệt S. typhi thu được rất ít vị

trí đa hình [42]. Việc tìm hiểu những vi khuẩn có tính đa dạng di truyền thấp như
S. typhi gặp rất nhiều khó khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức tạp [12].
Trình tự gắn chèn IS200 là một nhân tố di truyền có thể di chuyển. Ở E.
coli không có trình tự này. Trình tự IS200 được tìm thấy trên các locus bảo tồn
ở nhiễm sắc thể của nhiều tuýp huyết thanh của Salmonella. Trong nghiên cứu
của mình, Gibert đã xác định số lượng nhân tố IS200 trên 15 chủng S. typhi dao
động từ 10-25. Do số lượng bản sao nhiều và khác biệt đáng kể nên IS200 được
xem là chỉ thị thích hợp để phân biệt các kiểu di truyền ở S. Typhi [34]. Tuy
nhiên trong một nghiên cứu dịch tễ sử dụng trình tự IS200 để phân biệt các kiểu
di truyền ở S. typhi chỉ tìm được 11-15 nhân tố IS200 trên nhiễm sắc thể S.
typhi. Dựa vào các trình tự này có thể xác định được một số kiểu di truyền ở S.
typhi nhưng hiệu quả phân biệt không cao [59].
1.2.1.3. Các chỉ thị phân tử của Salmonella typhi
Cho đến nay, nhiều trình tự gen của Salmonella typhi đã được sử dụng
làm chỉ thị trong việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh loài vi khuẩn
này. Chaudhry R. và cộng sự (1997) đã sử dụng gen fliC-d mã hóa cho kháng
nguyên lông có mặt ở hơn 100 phân loài của Salmonella để phát hiện S. typhi
[30]; Hashimoto Y. và cộng sự (1995) đã sử dụng gen kháng nguyên vỏ ViaB
làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi [36]; Zhu Q. và cộng sự (1996) đã sử dụng
gen 16S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi [78]; Pui C. F. và cộng sự
(2011) đã sử dụng gen 23S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi [63].
Kumar S. và cộng sự (2005) đã sử dụng multiplex PCR để khuếch đại bốn trình
tự gen invA, viaB, flic-d, prt nhằm phát hiện vi khuẩn S. typhi [44]. Gen prt là
một phần của cụm gen rfb và mã hóa cho CDP paratose synthase trong đó

Số hóa bởi trung tâm học liệu


12
chuyển đổi CDP-4-keto-3, 6 - dideoxyglucose thành CDP paratose. Gen này

hiện diện trong phân loài typhi, paratyphi A và vài phân loài khác [37], [44].
Một tập hợp 7 gen chỉ thị được chọn nằm rải rác trên nhiễm sắc thể của S.
typhi CT18 bao gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III
beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD (histidinol
dehydrogenase), purE (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase), sucA
(alpha ketoglutaratedehydrogenase) và thrA (aspartokinase+homoserine
dehydrogenase). Các gen này được giải trình tự (tổng cộng 3336 bp) và được
dùng để phân biệt 26 chủng S. typhi phân lập khắp nơi trên thế giới từ năm 1918
đến 2000. Tuy nhiên kết quả chỉ tìm thấy có 3 vị trí đa hình ở 26 chủng này và 4
loại trình tự [42].
Gen rfbE là một gen trong S. typhi mã hóa protein vận chuyển màng
CDP-tyvelose epimerase [18], [47], trình tự hoàn chỉnh của gen rfbE được trích
dẫn từ GenBank (mã số AF332602) là 1313 bp [54]. Gen rfbE đã được nhiều
nghiên cứu sử dụng làm chỉ thị phát hiện đặc hiệu S. typhi. Mousavi S. L. và
cộng sự (2006) đã sử dụng gen rfbE làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi bằng
phương pháp PCR-ELISA, kết quả của nghiên cứu cho thấy quy trình có độ đặc
hiệu đạt 100%, giới hạn phát hiện trong PCR-ELISA là 2,5ρg DNA, toàn bộ
quy trình mất khoảng 100 phút [54]. Liu D. và cộng sự (1991) đã nghiên cứu
mối quan hệ giữa các vùng rfb của vi khuẩn Samonella phân loài A, B và D và
cho thấy gen rfbE là vùng gen đặc hiệu cho phân loài S. typhi [47]. Hirose K. và
cộng sự (2002) đã sử dụng multiplex PCR khuếch đại có chọn lọc các gen tyv
(rfbE), prt (rfbS), viaB, và gen flic để xác định Salmonella enterica serovar
typhi và paratyphi A đạt kết quả đặc hiệu 100% [37].
1.2.1.4. Đặc tính sinh học của Salmonella typhi
Salmonella typhi là trực khuẩn Gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy ý,
di động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37
o
C, có
khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, có thể tạo một ít H
2

S

Số hóa bởi trung tâm học liệu


13
từ cơ chất sulphat tan. Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trong quá
trình sống [39].
Điều khác biệt giữa S. typhi so với hầu hết Salmonella là không bao giờ
sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc decarboxylate orthinine và
không lên men rhamnose. Salmonella typhi không sinh indole, thử nghiệm
Voges-Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase và urease âm tính. Các đặc
tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử nghiệm ngưng kết kháng
huyết thanh trong định danh S. typhi [39].
Salmonella typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây
bệnh ở bất kỳ sinh vật nào khác. Salmonella typhi có khả năng thay đổi để
chống lại các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy rất
khó để loại bỏ tận gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn. Salmonella typhi có thể
tồn tại ở thịt chưa được nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản axit dạ dày để
gây bệnh ở người [39].