đánh giá sự ảnh hưởng của vi khuẩn cố định nitơ lên một số loại cây trồng

i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




ĐÀO MINH THUẬN




ĐÁNH GIÁ SỰ ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH NITƠ LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


THÁI NGUYÊN - 2014




ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



ĐÀO MINH THUẬN



ĐÁNH GIÁ SỰ ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH NITƠ LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS Tăng Thị Chính



THÁI NGUYÊN – 2014


iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Vi sinh vật Môi trƣờng - Viện Công nghệ Môi trƣờng -
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm

2013 tới tháng 5 năm 2014.



Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Học viên


Đào Minh Thuận


















iv
MỤC LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
LỜI CẢM ƠN x
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên 3
1.2. Quá trình cố định nitơ phân tử 5
1.2.1. Quá trình cố định nitơ tự do 6
1.2.1.1. Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter) 6
1.2.1.2. Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium 8
1.2.1.3. Vi khuẩn Beijerinskii 9
1.2.2. Quá trình cố định nitơ cộng sinh 10
1.2.2.1. Khái niệm và quan điểm về phân loại 10
1.2.2.2. Đặc tính sinh học và tính chuyên hóa của vi khuẩn nốt sần 12
1.2.2.3. Sự hình thành hệ cộng sinh ở rễ cây họ đậu 13
1.2.2.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nitơ 15
1.2.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình cố định nitơ 17
1.3. Vai trò và ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên cây trồng 18
1.4. Tình hình sử dụng và sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định nitơ trên Thế
giới và Việt Nam 19
1.4.1. Tình hình sử dụng và sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định nitơ trên Thế
giới 19
1.4.2. Tình hình sử dụng và sản xuất chế phẩm vi khẩn cố định nitơ ở Việt
Nam 21


v
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Vật liệu nghiên cứu 26

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu 26
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26
2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 26
2.3.2 Thời gian nghiên cứu 26
2.4. Bố trí thí nghiệm 26
2.4.1. Thực hiện bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 26
2.4.2. Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng 27
2.5. Phƣơng pháp phân tích 28
2.5.1. Phƣơng pháp xác định mật độ vi sinh vật 28
2.5.2 . Phƣơng pháp xác định chỉ số nốt sần 28
2.5.3. Phƣơng pháp xác định độ ẩm và hệ số khô kiệt của đất 29
2.5.4. Phƣơng pháp phân tích nitơ trong đất 30
2.5.4.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitơ tổng số 30
2.5.4.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitơ dễ tiêu 31
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu 31
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. Ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên cây đậu xanh trên quy mô
phòng thí nghiệm 32
3.1.1. Kết quả vi sinh vật trong các mẫu đất 32
3.1.2. Đánh giá tác động của vi khuẩn cố định nitơ tới hàm lƣợng nitơ tổng số
và nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng đậu xanh 34
3.1.3. Đáng giá tác động của vi sinh vật cố định nitơ lên sinh trƣởng và năng
suất của cây đậu xanh 37


vi
3.2. Đánh giá hiệu quả của vi khuẩn cố định nitơ lên cây ngô và cây bắp cải
ngoài đồng ruộng 40
3.2.1. Đánh giá hiệu quả của vi khuẩn cố định nitơ lên cây ngô 40
3.2.1.1. Đánh giá mật độ vi sinh vật trong các mẫu đất trồng ngô 40

3.2.1.2. Đánh giá hàm lƣợng nitơ tổng số và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong mẫu
đất trồng ngô 41
3.2.1.3. Đánh giá tác động của vi khuẩn cố định nitơ lên sự sinh trƣởng của
cây ngô 44
3.2.2. Đánh giá tác động lên cây bắp cải 45
3.2.2.1. Đánh giá mật độ vi sinh vật trong các mẫu đất trồng bắp cải 45
3.2.2.2. Đánh giá hàm lƣợng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu trong đất trồng cây
bắp cải 46
3.2.2.3. Kết quả đánh giá sinh khối bắp cải 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
Kết luận 49
Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
Tài liệu Tiếng Việt 50
Tài liệu Tiếng Anh 51
Tài liệu internet 53
PHỤ LỤC 54







vii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Chữ viết tắt
Nội dung
1

ATP
Adenosin triphosphat
2
Az
Azotobacter
3
CFU
Colony Forming Unit
4
Cl
Clostridium
6
ĐC
Đối chứng
7
ĐC(-)
Đối chứng âm
8
ĐC(+)
Đối chứng dƣơng
5
DNA
Deoxyribonucleic acid
9
MPA
Meat pepton agar
10
N
Nitơ
11

P
Phốtpho
12
ppm
Parts per million
13
TN
Thí nghiệm
14
TN1
Thí nghiệm 1
15
TN2
Thí nghiệm 2
16
VSV
Vi sinh vật
17
YME
Yeast Manniol Extract








viii
DANH MỤC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Tình hình sử dụng chế phẩm nốt sần cho cây đậu đỗ tại Việt
Nam
22
1.2
Khả năng cố định nitơ của một số cây họ đậu trên đồng
ruộng
24
2.1
Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm
26
2.2
Bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng với vi khuẩn cố
định nitơ
27
2.3
Các thông số xác định chỉ số nốt sần
28
3.1
Sự biến động mật độ vi khuẩn cố định nitơ tự do, nitơ cộng
sinh và vsv tổng số trong các mẫu đất trồng cây đậu xanh
32
3.2
Chỉ số nốt sần ở rễ cây đậu xanh
33
3.3
Kết quả so sánh hàm lƣợng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu

trong đất trồng đậu xanh
36
3.4
Kết quả đo chiều dài trung bình thân cây đậu xanh
37
3.5
Kết quả mật độ vi khuẩn cố định nitơ tự do, nitơ cộng sinh
và vsv tổng số trên mẫu đất trồng cây ngô
40
3.6
Kết quả so sánh hàm lƣợng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu
trong các mẫu đất trồng ngô
43
3.7
Kết quả đánh giá mật độ cố định nitơ tự do, ni tơ cộng sinh
và vsv tổng số ở mẫu đất trồng cây bắp cải
45
3.8
Kết quả so sánh hàm lƣợng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu
trong các mẫu đất trồng bắp cải
47






ix
DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình
Trang
1.1
Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên
4
1.2
Azotobacter
7
1.3
Clostridium
9
1.4
Nốt sần rễ họ đậu
12
1.5
Sự xâm nhiễm của vi khuẩn nốt sần
14
2.1
Đồ thị đƣờng chuẩn P tổng số (mg/ml) ở OD
882

34
2.2
Đồ thị chuẩn đƣờng P dễ tiêu (mg/ml) với OD
882

37
3.1
Sự biến động của nitơ tổng số trong mẫu đất trồng đậu xanh
34

3.2
Sự biến động của nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng đậu xanh
35
3.3
Sinh khối trung bình cây và chiều dài rễ cây đậu xanh
38
3.4
Quả đậu xanh thu hoạch ở quy mô phòng thí nghiệm
39
3.5
Tỷ lệ quả chắc và năng suất quả trung bình cây đậu xanh
39
3.6
Kết quả phân tích hàm lƣợng N tổng số trong mẫu đất trồng
ngô
42
3.7
Kết quả phân tích hàm lƣợng N dễ tiêu trong đất trồng ngô
42
3.8
Hình ảnh cây ngô trồng ở quy mô đồng ruộng
44
3.9
Tỷ lệ bắp đều hạt và năng suất trung bình bắp ngô
44
3.10
Kết quả phân tích nitơ tổng số trong mẫu đất trồng cây bắp
cải
46
3.11

Kết quả phân tích nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng cây bắp
cải
46
3.12
Sinh khối tƣơi trung bình của cây bắp cải khi thu hoạch
48



x
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày chân thành bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS Tăng Thị Chính – Trƣởng phòng Vi sinh vật Môi trƣờng
– Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa
chất, thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới Th.S Đặng Thị Mai Anh và các
anh chị, cán bộ phòng Vi sinh vật môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hƣớng dẫn,
giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy
cô giáo trong trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên; các thầy cô
trong Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè,
những ngƣời đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.

Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Học viên

Đào Minh Thuận




1
MỞ ĐẦU
* Đặt vấn đề
Nitơ là nguồn dinh dƣỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật,
thực vật và ngay cả với các loài vi sinh vật. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn,
riêng trong không khí nitơ chiếm 78% thể tích. Ƣớc tính, trong bầu khí quyển
bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ. Lƣợng nitơ này có thể
cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm. Tuy nhiên, cây trồng không
tự đồng hóa đƣợc nguồn nitơ này. Cây trồng chỉ có thể sử dụng nguồn nitơ
trong không khí thông qua quá trình cố định nitơ của các vi sinh vật.
Ngày nay, nguồn nitơ cung cấp cho cây trồng trong nông nghiệp chủ
yếu là từ phân bón hóa học. Nhƣng việc sử dụng không đúng cách và lạm
dụng quá mức dẫn đến hiệu quả không cao và gây ô nhiễm môi trƣờng đất và
môi trƣờng nƣớc. Nhằm khắc phục những bất lợi của việc sử dụng quá mức
phân bón hóa học, hiện nay đã và đang có nhiều nghiên cứu ứng dụng về việc
sử dụng phân bón sinh học trong nông nghiệp. Đây là một trong những biện
pháp làm tăng độ phì nhiêu cho đất, tăng khả năng giữ ẩm đất, cải tạo cấu trúc
đất và hạn chế sự ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, giá thành của loại phân này
vẫn còn cao và chƣa đƣợc ngƣời nông dân ƣa chuộng sử dụng bởi hiệu quả
không tức thì nhƣ phân bón hóa học.
Vì vậy, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lƣợng phân bón vi
sinh vật là việc làm hết sức cần thiết. Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi đã
lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Đánh giá sự ảnh hưởng của vi khuẩn cố định

nitơ lên một số loại cây trồng”.
* Mục tiêu của đề tài:
Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn cố định nitơ đã đƣợc tuyển
chọn của Phòng Vi sinh vật Môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam lên một số loại cây trồng, qua đó


2
phục vụ sản xuất phân hữu cơ nhằm hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học,
tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi trƣờng.
* Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng cố định nitơ và và sự ảnh hƣởng của vi khuẩn cố
định nitơ lên năng suất cây trồng khi bổ sung vào đất ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Đánh giá khả năng cố định nitơ và và sự ảnh hƣởng của vi khuẩn cố
định nitơ lên năng suất cây trồng khi bổ sung vào đất ở quy mô ngoài đồng
ruộng.

3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên
Nitơ là nguồn dinh dƣỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật,
thực vật và các loài vi sinh vật trên trái đất [35]. Lƣợng dự trữ nitơ trong tự
nhiên rất lớn, trong không khí nitơ chiếm khoảng 78% thể tích [30]. Ngƣời ta
ƣớc tính, trong bầu không khí bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu
tấn nitơ. Lƣợng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu
năm. Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0,4 x 10
9
tấn
nitơ. Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4 x 10
15
tỷ tấn nitơ.
Muối vô cơ của nitơ (muối ammon, nitrate, nitrite) có độ hòa tan trong
nƣớc cao và dễ tham gia vào vòng tuần hoàn. Chất mùn (humus) trong đất ôn
đới thông qua việc khoáng hóa từ từ mà chuyển biến thành nitơ vô cơ. Vùng
nhiệt đới do nóng và ẩm, tốc độ khoáng hóa nhanh nên ít tích lũy chất mùn.
Khí nitơ là loại khí trơ, muốn mở nối liên kết phân tử của nó cần dùng rất
nhiều năng lƣợng. Tuy nhiên, chỉ có một số ít sinh vật trong tự nhiên có thể
cố định đƣợc nitơ. Thông qua tia chớp phóng điện, phun trào của núi lửa có
thể cố định đƣợc một lƣợng ít nitơ. Ngoài ra cố định nitơ tại các nhà máy
phân đạm hóa học (tốn rất nhiều năng lƣợng) cũng có thể biến nitơ thành
muối ammon hoặc nitrate cung cấp cho cây trồng.
Khoảng 85% tác dụng cố định nitơ trên Trái đất là do vi khuẩn cố định
nitơ thực hiện, trong đó 60% xảy ra trên đất liền và 40% xảy ra ở ngoài đại

dƣơng [38].
Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại
vi sinh vật phân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng
dễ tiêu (NH
3
hoặc NH
4
+
), cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ cho cây trồng, quá
trình này đƣợc gọi là quá trình amôn hóa [9]. Các vi sinh vật có khả năng
amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả


4
năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Các vi sinh vật này có khả
năng tiết ra men phân giải protein vào môi trƣờng, thủy phân thành các amino
acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và
đổng hóa.
Tiếp nối quá trình amôn hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ
NH
3
thành NO
3
-
đƣợc gọi là quá trình nitrat hóa.
Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ
NO
3
-
thành N để bù trả nitơ cho không khí và đƣợc gọi là quá trình phản nitrat

hóa.
Dƣới tác dụng của các loại vi sinh vật, nitơ không khí đƣợc chuyển vào
các hợp chất hữu cơ chứa nitơ đƣợc gọi là quá trình cố định nitơ phân tử.
Tất cả các quá trình: cố định – phân hủy – chuyển hóa và phản nitrat
hóa luôn xảy ra dƣới tác dụng của các loài vi sinh vật và tạo đƣợc thế cân
bằng nitơ. Nhờ đó mà đã khép kín đƣợc vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên
theo hình 1.1.

Hình 1.1. Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên (theo J.G.Black) [38]


5
1.2. Quá trình cố định nitơ phân tử
Bản thân thực vật không thể sử dụng đƣợc nitơ trong không khí bởi vì
nguồn nitơ này không thể sử dụng để làm nguồn dinh dƣỡng cho thực vật
đƣợc, nhƣng chúng có thể nhờ vào vi khuẩn để tạo nên các cổng xử lý nitơ
trong nốt sần trên rễ cây [36]. Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên
này làm chất dinh dƣỡng, nitơ không khí phải đƣợc chuyển hóa thông qua quá
trình cố định nitơ, trong đó nitơ phân tử đƣợc chuyển hóa thành amôn.
Nitơ là nguyên tố trơ và khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác,
nếu không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị
chuyển hóa trong một chu trình khép kín do tác động sinh học hay hóa học
khác nhau. Dƣới tác động của hoạt động hóa học hoặc sinh học, nitơ phân tử
chuyển thành đạm vô cơ, sau chuyển thành đạm thực vật hoặc động vật thông
qua quá trình chuyển hóa. Một phần đạm thực vật dƣới dạng tàn dƣ và một
phần đƣợc cây trồng sử dụng, một phần còn lại mất do rửa trôi và bay hơi do
hoạt động của vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm.
Quá trình mất đạm chịu ảnh hƣởng lớn bởi các chế độ canh tác. Nitơ
đồng thời cũng là yếu tố dinh dƣỡng vô cùng quan trọng không chỉ với sinh
vật bậc cao mà cả với các sinh vật có kích thƣớc nhỏ mà mắt thƣờng chúng ta

không nhìn thấy đƣợc [7].
Quá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học
hoặc sinh học, trong đó ngƣời ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm
sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi truờng.
Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử nitơ thành NH
3
có xúc
tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP [31].




6

N
2
+ AH
2
+ ATP NH
3
+ A + ADP + P
Năm 1992, các nhà khoa học đã hoàn thiện đƣợc cơ chế của quá trình
cố định nitơ phân tử nhƣ sau [31]:
N = N NH=NH H
2
N-NH
2
NH
3

N
2
+ 8H
+
+ 8e
-
+ 16 Mg.ATP + 160 2NH
3
+ H
2
+ 16Mg.ADP + 16P
1.2.1. Quá trình cố định nitơ tự do
1.2.1.1. Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter)
Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitơ hoạt động nhất.
Trong số các loài Azotobacter đã đƣợc miêu tả thì các loài đƣợc nghiên cứu
nhiều hơn cả là Az. chroococcum, Az. agilis và Az. vinelandii. Trong đó Az.
chroococcum tạo ra những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu không màu,
sau đó biến thành mầu nâu tối, thậm trí màu đen nhƣng không làm nhuộm
màu môi trƣờng khuẩn lạc. Đặc điểm của Az. vinelandii và Az. agilis là có
khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục hoặc lam – lục,
sắc tố khuếch tán vào môi trƣờng [25], [26], [27].
Khi còn non, tế bào Azotobacter có khả năng di động, hình que đầu
tròn, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu
đồng đều. Chiều dài của tế bào từ 2 – 3μm đến 4 – 6μm. Tế bào của Az. agilis
có kích thƣớc lớn nhất (khoảng 5 – 6μm). Dần dần các tế bào hình que chuyển
thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đƣờng kính lên tới 4μm, hình dạng
không cố định. Khi có tiêm mao rụng đi và tế bào trở lên bất động, bọc bao
nhầy, tế bào chất xuất hiện cấu tạo dạng hạt, các trế bào tròn có thể phủ lớp
vỏ dày và chuyển thành kén. Hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi
của chúng phụ thuộc vào tuổi của giống và điều kiện phát triển [7].

nitrogenaza
nitrogenaza



7
Tất cả các loài Azotobacter (theo hình 1.2) đều sống dị dƣỡng. Để dùng
nguồn cacbon, chúng sử dụng nhiều nguồn hữu cơ khác nhau: monosaccarit,
disaccarit, một số polysaccarit đa đƣờng, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả
các hợp chất thơm. Nguồn nitơ đối với Azotobacter không chỉ là nitơ phân tử
mà còn là muối ammon, nitrat, nitrit, amino axit.

Hình 1.2. Azotobacter [34]
Tùy thuộc vào các hợp chất chứa nitơ có trong môi trƣờng mà quá trình
cố định nitơ trong môi trƣờng bị ức chế nhiều hay ít. Azotobacter có nhu cầu
lớn đối với photpho, canxi và nhận năng lƣợng từ quá trình oxy hóa các hợp
chất hữu cơ thành CO
2
và H
2
O. Phần lớn các chủng Azotobacter phát triển ở
pH lớn hơn 6 và cần độ ẩm cao hơn so với nhiều loại vi khuẩn, vì vậy ít gặp
chúng ở nơi khô hạn. Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ tự
nhiên có khả năng cố định đƣợc trên 10mgN/1g hợp chất cacbon. Một số
chủng Azotobacter trong điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá đƣợc đến
300mgN/1g hợp chất cacbon.
Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi khuẩn
khác Azotobacter sẽ có hoạt động cố định nitơ cao hơn so với việc nuôi cấy
riêng rẽ. Azotobacter sẽ đem một phần nitơ đồng hoá đƣợc đƣa vào môi
trƣờng dƣới dạng NH

2
, axit amin hoặc protein.


8
Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter ở trong đất còn chịu ảnh
hƣởng mật thiết của khu hệ các vi sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật
có ảnh hƣởng tốt đối với sự phát triển của Azotobacter (tổng hợp các chất
hoạt động sinh học, phân giải các thức ăn hữu cơ bền vững) còn có nhiều
nhóm vi sinh vật có khả năng làm ức chế sự phát triển của Azotobacter (cạnh
tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh,…).
Azotobacter thƣờng xuyên có mặt trong vùng rễ cây trồng với số lƣợng
cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ. Số lƣợng của chúng còn biến đổi phụ
thuộc vào từng loại cây, từng giai đoạn phát triển của cây và nhiều yếu tố sinh
thái, địa lý khác. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng Azotobacter không phát
triển trên bề mặt rễ mà phát triển trong đất xung quanh rễ.
Azotobacter có tác dụng làm tăng cƣờng thức ăn nitơ cung cấp cho cây
trồng. Trung bình khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lƣợng, Azotobacter có
khả năng đồng hoá đƣợc khoảng 10 – 15mgN phân tử [4]. Azotobacter không
chỉ có khả năng cố định nitơ mà còn có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kích
thích sinh trƣởng thực vật, một số vitamin và hoạt chất ức chế sự sinh trƣởng,
phát triển của một số vi nấm gây bệnh vùng rễ một số cây trồng.
Ở Việt Nam, sản phẩm phân bón vi sinh vật chứa vi khuẩn cố định nitơ
tự do đã đƣợc khảo nghiệm hiệu lực đối với cây trồng trên đồng ruộng và
đƣợc đƣa vào danh mục các loại phân bón đƣợc phép sử dụng [33].
1.2.1.2. Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium
Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả năng cố định nitơ trong
không khí nhƣ: Cl. Pastuerianum, Cl. Butyrium, Cl. Acetobutylicum, Cl.
Felsineum. Chúng thuộc một nhóm phân loại, nhƣng khác nhau về đặc điểm
hình thái học và sinh lý sinh hóa học. Cl. Pasteurianum có khả năng đồng hóa

nitơ phân tử mạnh mẽ nhất. Tế bào của Cl. Pasteurianum là loại trực khuẩn
khá lớn, dài 1,5 – 8μm và rộng 0,8 – 1,3μm [21], [24]. Đây là nhóm dị dƣỡng


9
hóa năng hữu cơ, các nguồn hữu cơ chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit,
một số polysaccarit nhiều rƣợu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp
chất thơm (theo hình 1.3).

Hình 1.3. Clostridium (theo CDC Public Health, 2007) [32]
1.2.1.3. Vi khuẩn Beijerinskii
Năm 1893 nhà bác học Ấn Độ Stacke đã phân lập đƣợc một loài vi
khuẩn ở ruộng lúa nƣớc pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử, ông đặt
tên là vi khuẩn Beijerinskii.
Vi khuẩn Beijerinskii có khả năng đồng hóa tốt các loại đƣờng đơn,
đƣờng kép, cứ tiêu tốn 1g đƣờng gluco nó cố định đƣợc khoảng 5 – 10mgN.
Vi khuẩn Beijerinskii có hình cầu, hình bầu dục hoặc hình que, gram âm
không sinh nha bào, hiếu khí, một số loài có tiêm mao có khả năng di động.
Kích thƣớc tế bào dao động 0,5 – 2,0μm x 1,0 – 4,5μm, khuẩn lạc thuộc nhóm
S, rất nhầy, lồi không màu hoặc màu nâu tối khi già, không tạo nang xác.
Khác với vi khuẩn Azotobacter, vi khuẩn Beijerinskii có tính chống
chịu cao với acid, nó có thể phát triển ở môi trƣờng pH = 3 nhƣng vẫn phát
triển ở pH trung tính hoặc kiềm yếu, vi khuẩn Beijerinskii sống thích hợp ở độ
ẩm 70 – 80% và ở nhiệt độ 25 – 28
o
C. Vi khuẩn Beijerinskii phân bố rộng
trong tự nhiên, nhất là ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới.


10

1.2.2. Quá trình cố định nitơ cộng sinh
1.2.2.1. Khái niệm và quan điểm về phân loại
Quá trình đồng hóa nitơ của không khí dƣới tác dụng của hệ cộng sinh
tạo thành các hợp chất chứa nitơ đƣợc gọi là quá trình cố định nitơ cộng sinh
nhờ mối quan hệ đặc biệt giữa cây họ đậu và vi khuẩn nốt sần. Cây họ đậu hút
nƣớc, muối khoáng và các chất dinh dƣỡng ở trong đất để nuôi cộng sinh, còn
vi khuẩn nốt sần đồng hóa nitơ không khí nuôi cho hệ cộng sinh. Cứ nhƣ vậy
chúng gắn bó với nhau nhƣ một cơ thể, mỗi nốt sần rễ cây họ đậu đƣợc ví một
nhà máy sản xuất phân đạm tí hon [4], [16].
Năm 375 – 287 Trƣớc Công nguyên, các nhà triết học cổ Hy Lạp đã coi
cây họ đậu nhƣ vật bồi bổ lại sức lực cho đất. Nhận xét này đã đƣợc nhiều
ngƣời La Mã cổ quan tâm vào những năm 30 Trƣớc Công nguyên [31].
Năm 1833, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình
cố định nitơ phân tử. Các ông đã chứng minh đƣợc khả năng của cây họ đậu
lấy đƣợc nitơ trong khí quyển là nhờ vi khuẩn nốt sần sống trong nốt sần vùng
rễ cây đó. Họ đã đặt tên cho vi khuẩn này là Bacillus radicicola. Sau đó,
Pramovski đã đổi tên là Bacterium radicicola. Cuối năm 1889, Frank đề nghị
đổi tên là Rhizobium.
Về phân loại vi khuẩn nốt sần cho đến nay vẫn còn chƣa hoàn thiện,
nhƣng có thể liệt kê nhƣ sau:
- Năm 1974, theo Bergey thì vi khuẩn nốt sần bao gồm 6 loài:
Rhizobium leguminosarum; Rhizobium phaseoli; Rhizobium trifolii;
Rhizobium lupini; Rhizobium japonicum; Rhizobium melilot [4].
- Năm 1978, theo Mixustin thì vi khuẩn nốt sần bao gồm 11 loài:
Rhizobium leguminosarum; Rhizobium phaseoli; Rhizobium japonicum;
Rhizobium vigna; Rhizobium cicer; Rhizobium lupini; Rhizobium trifolii;
Rhizobium meliloti; Rhizobium simplese; Rhizobium lotus; Rhizobium robinii.


11

- Năm 1984, theo Bergey thì vi khuẩn nốt sần thuộc họ Rhizobiaceae
có 2 nhóm, gồm 7 loài sau:
+ Nhóm 1: có 2 – 6 tiên mao, mọc theo kiểu chùm mao hoặc chu mao,
phát triển nhanh trên môi trƣờng cao nấm men (môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
nốt sần).
Thuộc về nhóm 1 bao gồm có 4 loài: Rhizobium leguminosarum (cộng
sinh ở cây đậu Hà Lan); Rhizobium phaseolii (cộng sinh ở cây đậu Côve);
Rhizobium trifolii (cộng sinh ở cây cỏ Ba lá); Rhizobium meliloti (cộng sinh ở
cây phân xanh – medicago).
+ Thuộc về nhóm 2 bao gồm có 3 loài: Rhizobium japonicum (cộng
sinh ở cây đậu tƣơng); Rhizobium vigna (cộng sinh ở cây đậu xanh, cây l5c);
Rhizobium lupini (cộng sinh ở cây lupin).
- Năm 1996, tạm phân loại vi khuẩn nốt sần thành 2 nhóm với 4 giống:
Sinorhizobium feradii; Bradyrhizobium; Agrobacterium; Phyllobacterium.
Trong 4 giống trên chỉ có 2 giống là Bradyrhizobium và Sinorhizobium
feradii có khả năng cố định nitơ phân tử trong nốt sần rễ cây họ đậu.
Đặc điểm của giống Sinorhizobium feradii là những loài mọc nhanh,
sản sinh axit, hình thành độ đục trên môi trƣờng dịch thể. Khuẩn lạc hình
thành trong 2 – 3 ngày, có thời gian thế hệ là 2 – 4 giờ, có kích thƣớc khoảng
0,5 – 1,3μm x 2,5 – 3,0μm. Có từ 2 – 3 roi, có khả năng di động đƣợc và phát
triển tốt ở môi trƣờng gluco, mannitol và sacazozơ. Loài vi khuẩn này thích
hợp ở vùng nhiệt độ ôn hòa [4].
Đặc điểm của giống Bradyrhizobium là những loài mọc chậm, sản sinh
chất kiềm. Khuẩn lạc hình thành 3 – 5 ngày, có thời gian thế hệ là 6 – 8 giờ,
có kích thƣớc 0,3 – 1,2μm x 2,2 – 3,2μm, có từ 1 – 2 tiên mao, có khả năng di
động đƣợc. Chúng phát triển tốt ở môi trƣờng pentozơ.


12
1.2.2.2. Đặc tính sinh học và tính chuyên hóa của vi khuẩn nốt sần

Vi khuẩn nốt sần Rhizobium (theo hình 1.4) là trực khuẩn hình que,
hiếu khí, gram âm, không sinh nha bào, có tiên mao mọc theo kiểu đơn mao
hoặc chu mao, có khả năng di động đƣợc. Khuẩn lạc có màu đục, nhày, lồi, có
kích thƣớc từ 2 – 6mm. Tế bào Rhizobium có kích thƣớc 0,5 – 0,9 x 1,2 –
3,2μm. Chúng thích ứng ở điều kiện pH = 6,5 – 7,5; độ ẩm 60 – 70%; nhiệt
độ 28 – 30
o
C.

Hình 1.4. Nốt sần rễ họ đậu [37]
Về quan hệ giữa vi khuẩn nốt sần với cây họ đậu đã đƣợc nghiên cứu
rất nhiều, chúng tạo thành một thể sinh lý hoàn chỉnh, khi tách rời, khả năng
đồng hóa nitơ phân tử không còn. Tất nhiên không phải cây họ đậu nào cũng
có vi khuẩn nốt sần cộng sinh.
Theo Anlen thì ngƣời ta mới tìm hiểu đƣợc khả năng tạo nốt sần của
1200 loài trong số hơn 11000 loài cây thuộc bộ đậu. Trong số 1200 loài này
có 133 loài (khoảng 9%) đƣợc chứng minh là không có khả năng tạo nốt sần.
Tỉ lệ các loài không tạo thành nốt sần ở các họ khác nhau không giống
nhau. Ví dụ nhƣ so với đậu tƣơng và lạc thì nốt sần của cây đậu xanh ít và
nhỏ hơn [18]. Khi đã hình thành nốt sần rồi thì độ ẩm cao hay thấp ít ảnh
hƣởng đến hoạt động của chúng.


13
Độ thoáng khí của đất có liên quan đến số luợng và chất lƣợng nốt sần.
Nốt sần tạo thành nhiều ở các rễ phân bố nông (xung quanh cổ rễ cây họ đậu),
càng xuống sâu, ít oxy, số lƣợng nốt sần ít hơn. Điều kiện kém thoáng khí làm
giảm hàm lƣợng sắc tố leghemoglobin, làm giảm tính kháng nguyên và chất
hoạt tính hô hấp của vi khuẩn nốt sần.
1.2.2.3. Sự hình thành hệ cộng sinh ở rễ cây họ đậu

Vi khuẩn nốt sần thƣờng xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua các
lông hút và đôi khi thông qua vết thƣơng ở vỏ rễ. Mỗi loại cây họ đậu thƣờng
tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích thích những chủng vi khuẩn
nốt sần chuyên tính và ức chế những chủng không chuyên tính để thực hiện
quá trình xâm nhiễm nhƣ các hợp chất gluxit, các axit amin, các axit hữu cơ
Muốn xâm nhiễm tốt, mật độ của vi khuẩn trong vùng rễ phải đạt khoảng 10
4

tế bào trong 1g đất. Nếu xử lí với hạt đậu thì mỗi hạt đậu loại nhỏ cần 500 –
1000 tế bào vi khuẩn, hạt to cần khoảng 70000 tế bào [14].
Nhiều nghiên cứu của một số tác giả cho rằng, vi khuẩn nốt sần có tính
chuyên tính rất cao đối với cây họ đậu cùng chi. Một số lại cho rằng chúng có
tính chuyên tính thấp đối với cây họ đậu cùng chi.
Sự hình thành, phát triển của nốt sần diễn ra qua một số công đoạn sau:
+ Giai đoạn trƣớc khi xâm nhiễm vào rễ: Các vi khuẩn Rhizobium hoặc
Bradyrhizobium đƣợc nhân lên trong vùng rễ nhờ các dịch tiết của rễ. Trong
rễ cây họ đậu có chứa lectin là một glycoprotein có tác dụng dẫn dụ các vi
khuẩn về phía lông hút của rễ.
+ Giai đoạn xâm nhiễm: Rhizobium xuyên sâu vào bên trong lông hút
làm dây xâm nhiễm phát triển, dây xâm nhiễm này đƣợc tạo thành từ màng tế
bào chất có chứa dịch nhầy đông đặc, tại đây các vi khuẩn tăng cƣờng hoạt
động của mình. Dây xâm nhiễm xuyên qua thành pectoxelluloza của tế bào
thực vật, nó lớn lên và phân chia ở bên trong vỏ rễ.


14
+ Sự xuất hiện của nốt sần: Khi Rhizobium đi vào trong rễ thì quá trình
hình thành nốt sần bắt đầu. Nốt sần lớn lên nhờ hoạt động của mô phân sinh
này. Tại đây ngƣời ta giả thiết rằng có sự chuyển DNA của tế bào vi khuẩn tế
bào cây chủ mà nó đƣợc xác định bởi một hoocmon.

+ Giai đoạn thành thục nốt sần: Các Rhizobium đƣợc giải phóng trong
tế bào chất nhờ sự tụt vào của màng sinh chất và dây xâm nhiễm và chính dây
xâm nhiễm này lại tạo thành màng bao bọc vi khuẩn.
Sự xâm nhiễm của vi khuẩn nốt sần đƣợc thể hiện theo hình 1.5.

Hình 1.5. Sự xâm nhiễm của vi khuẩn nốt sần
(1): Rhzizobia tấn công vào lông hút của rễ; (2): Sự xâm nhập của vi khuẩn
nốt sần qua dây xâm nhập vào rễ cây họ đậu; (3): Từ bacteria chuyển thành
bacteroids; (4): Tế bào rễ lớn lên và hình thành nốt sần.
Cƣờng độ cố định nitơ của từng loại cây trồng khác nhau thì khác nhau,
vì vậy cho số lƣợng nốt sần khác nhau, thậm chí còn phụ thuộc vào từng giai
đoạn sinh trƣởng của cây: cây đậu xanh có nốt sần sớm hơn ở các cây họ đậu
đỗ khác (10 – 15 ngày có nốt sần); cây đậu tƣơng sau 20 – 25 ngày có nốt sần,


15
còn ở cây lạc có nốt sần 25 – 30 ngày sau khi cây mọc [2], [3], [10]. Ngƣời ta
nhận thấy rằng những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa hoạt động mạnh
hơn loại nốt sần đƣợc sinh ra ở nửa đầu thời kì sinh trƣởng [18]. Số lƣợng nốt
sần tổng số và nốt sần hữu hiệu ở cây đậu đỗ đạt cực đại vào thời kỳ cây ra
hoa, hình thành quả non và giảm dần đến cuối vụ thu hoạch.
1.2.2.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nitơ
Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bí ẩn của quá trình cố
định nitơ phân tử. Họ đã chứng minh đƣợc khả năng của cây bộ đậu lấy đƣợc
nitơ khí quyển là nhờ vi khuẩn nốt sần sống ở vùng rễ cây bộ đậu và đặt tên
cho loại vi khuẩn này là Bacillus radicicola. Năm 1889, Pramovskii đã đổi
tên vi khuẩn này là Bacterium radicicola. Đến cuối năm 1889, Frank đề nghị
đổi tên là Rhizobium [11].
Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu, thuộc loại hiếu khí, Gram
âm, không sinh bào tử. Vi khuẩn nốt sần phát triển tốt ở pH: 6,5 – 7,5; nhiệt

độ: 24 – 26
o
C; độ ẩm: 50 – 70%. Có hình dạng thay đổi tuỳ theo từng giai
đoạn phát triển và điều kiện sống: khi còn non có hình que ngắn, bắt màu
đồng đều và có khả năng chuyển động nhờ tiêm mao; khi về già bất động, tế
bào có kích thƣớc lớn, chứa nhiều glycogen, volutin và lypoprotein gọi là thể
giả khuẩn. Thể giả khuẩn là trạng thái duy nhất có khả năng cố định nitơ của
vi khuẩn nốt sần, giai đoạn này trùng với giai đoạn ra hoa của thực vật, khi đó
cƣờng độ cố định nitơ của chúng là cực đại. Vi khuẩn nốt sần có tính chuyên
hoá cao, mỗi loài chỉ xâm nhiễm một nhóm cây họ đậu nhất định.
Ngay từ 1888, ngƣời ta đã phát hiện rằng vi khuẩn nốt sần cộng sinh
với cây trồng thuộc bộ đậu có thể cố định đƣợc nitơ trong khí quyển nhƣng
khi nó sống đơn độc trong đất lại không làm đƣợc điều đó. Quá trình khử N
thành NH
3
là do sự tham gia của nitrogenaza trong vi khuẩn, nitrogenaza tạo
thành từ 2 bản thể: Một bản thể có phân tử thấp và chứa Fe; một bản thể có