Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phả hệ vùng gen nrLSU

B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP. H CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGH SINH HC


BÁO CÁO KHOÁ LUN TT NGHIP

H TR 
A TRÊN
PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN nrLSU.

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYN ÁI THÚY
ThS. LAO C THUN
SVTH: NGUYN TH HI NGC
MSSV: 1053010498
NIÊN KHÓA: 2010-2014

Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014

LI CM N
 hoàn thành khoá lun tt nghip này, li đu tiên, em xin t lòng bit n sơu
sc đn thy ThS. Lao c Thun, đƣ tn tình hng dn, ch bo vƠ giúp đ em trong
sut quá trình nghiên cu và thc hin đ tài.
Em xin chân thành gi li cm n đn cô PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy,
ThS. Lao c Thun, ThS. Trng Kim Phng và tt c các Thy, Cô trong khoa
Công Ngh Sinh Hc, Trng i Hc M Tp. H Chí Minh đƣ tn tình hng dn,
giúp đ và truyn đt cho em vn kin thc quý giá trong sut 4 nm hc tp ti

trng. Nhng kin thc, kinh nghim và nim đam mê nghiên cu khoa hc mà em
nhn đc t quý Thy, Cô s lƠ hƠnh trang đ em vng bc trong tng lai.
Cm n tt c các bn bè trong phòng thí nghim Sinh hc phân t đƣ nhit tình
giúp đ, đng viên mình nhng lúc khó khn trong thi gian thc hin đ tài.
Cui cùng em xin gi li cm n chơn thƠnh đn tt c bn bè vƠ gia đình, đc
bit là cha m và nhng ngi thân yêu, nhng ngi đƣ luôn to điu kin, ng h và
đng viên em vt qua nhng khó khn trong cuc sng.
Em xin chân thành cm n!
Bình Dng, ngƠy 22 tháng 05 nm 2014
SINH VIÊN THC HIN


Nguyn Th Hi Ngc


Danh mc bng biu
B
nrLSU 23
Bng 3.1. Bng đánh giá mi khuch đi vùng gen nrLSU nm ký sinh côn trùng. 26
Bng 3.2. Kt qu kim tra DNA bng quang ph k kho sát trên 3 mu nm ký sinh
côn trùng đc tách chit theo phng pháp phenol:chloroform. 30
Bng 3.3. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph các mu nm tách chit có
b sung -mercaptoethanol 31
Bng 3.4. Kt qu kim tra DNA bng mt đ quang ph k các mu nm tách chit có
b sung -mercaptoethanol 32
B
ng hp thit lp chu k nhit PCR khuch đi các vùng gen
nrLSU ca các mu nm ký sinh côn trùng 33
Bng 3.6. Bng hiu chnh các nucleotide ti các v trí (i) đn (vi) 35
Bng 3.7. Tng hp kt qu hiu chnh trình t các mu nm ký sinh côn trùng. 38

Bng 3.8. Kt qu chiu dài các trình t trc và sau hiu chnh. 39
Bng 3.9.
nrLSU
40
B
[38] 41
B
59



Danh mc hình nh
Hình 1.1. Cordyceps sinensis 3
4
Hình 1.3. Cu trúc ca rDNA. 9
Hình 1.4. S đ v trí các vùng domain thuc trình t nrLSU 10
Hình 3.1. Kt qu kim tra mi bng BLAST trên GenBank 27
Hình 3.2. V trí mi xuôi LR0R đc sp gióng ct vi các trình t d liu. 28
Hình 3.3. V trí mi ngc LR5 đc sp gióng ct vi các trình t d liu. 28
Hình 3.4. Kt qu Annhyb cp mi LR05/LR5 vi trình t gen nrLSU. 29
Hình 3.5. Kt qu đin di sn phm cp mi LR0R/LR5 tách chit theo phng pháp
phenol: chloroform. 30
Hình 3.6. Kt qu đin di sn phm vi cp mi LR0R/LR5 tách chit theo phng
pháp phenol:chloroform b sung -mercaptoethanol. 31
Hình 3.7. Kt qu đin di 7 mu vi cp mi LR0R/LR5 trong quy trình b sung
-mercaptoethanol và ti u hóa nhit đ. 32
Hình 3.8. Hiu chnh tín hiu nhiu  đu mch xuôi ca nrLSU mu DL0015. 34
Hình 3.9. V trí sai lch ca hai kt qu gii trình t  đu mch xuôi ca LSU. 35
Hình 3.10. Hiu chnh  vùng gia trên 2 mch nrLSU. 36
Hình 3.11. Hiu chnh vùng 3, vùng 4 trên mch xuôi ca gen nrLSU. 36

Hình 3.12. Hiu chnh vùng cui mch xuôi (5‟-3‟) ca gen LSU 37
Hình 3.13. Hiu chnh vùng cui trên mch xuôi ca gen nrLSU. 37
Hình 3.14. Hình kt qu BLAST trình t nrLSU mch xuôi sau hiu chnh. 37
Hình 3.15. Kim tra mc đ tng đng bng công c Dot plot. 38
Hình 3.16. Cơy NJ đc dng vi b d liu 155 trình t ca gen nrLSU. 47
Hình 3.17. Cơy ML đc dng vi b d liu 155 trình t ca gen nrLSU. 48
Hình 3.18. Cơy MP đc dng vi b d liu 155 trình t ca gen nrLSU. 49


Hình 3.19. Cây ph h phân t NJ ca gen nrLSU nhm đnh danh 6 mu nm. 54
Hình 3.20. Cây ph h phân t ML ca gen nrLSU nhm đnh danh 6 mu nm. 55
Hình 3.21. Cây ph h phân t MP ca gen nrLSU nhm đnh danh 6 mu nm. 56

MC LC
T VN  1
CHNG 1. TNG QUAN
1.1. NM KÝ SINH CÔN TRÙNG 2
1.1.1. c đim chung và thành phn loài 2
1.1.2. Tim nng ng dng 4
1.2. NGHIÊN CU NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 6
1.2.1. c đim nhn dng vƠ đnh danh 6
1.2.2. nh danh phân t 7
1.2.3. DNA ribosome và trình t nrLSU trong đnh danh phân t nm 8
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRONG NC 10
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CU TRÊN TH GII 11
1.5. PH H PHÂN T 12
1.5.1. Ph h phân t trong nghiên cu phát sinh loài 12
1.5.2. Nhng bc c bn trong nghiên cu phát sinh chng loài 12
1.6. K THUT PCR VÀ GII TRÌNH T T NG 17
1.6.1. K thut PCR 17

1.6.2. Gii trình t t đng 18
CHNG 2. VT LIU ậ PHNG PHỄP
2.1. THI GIAN VÀ A IM NGHIÊN CU 19
2.2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIểN CU 19
2.2.1. B mu nm ký sinh côn trùng 19
2.2.2. Dng c - thit b - hoá cht 19
2.2.3. Danh mc các phn mm s dng 20
2.3. TIN TRÌNH NGHIÊN CU 21


2.3.1. Tách chit DNA tng s t h si nm ký sinh côn trùng 22
2.3.2. Kim tra sn phm DNA đƣ tách chit 22
2.3.3. PCR 23
2.3.4. in di 23
2.3.5. Gii trình t 23
2.3.6. Hiu chnh trình t 24
2.3.7. So sánh vi c s d liu Genbank 25
2.3.8. Xây dng b c s d liu DNA 25
2.3.9. Dò tìm mô hình tin hoá 25
2.3.10. Xây dng cây phát sinh loài 25
CHNG 3. KT QU VÀ THO LUN
3.1. KT QU ÁNH GIÁ MI 26
3.1.1. Kim tra cp mi vi các thông s vt lý trên IDT 26
3.1.2. Kim tra mi bng BLAST trên NCBI 27
3.1.3. Kim tra mi bng sp gióng ct vi Clustal2w 28
3.1.4. Kt qu Annhyb cp mi LR0R/LR5 vi trình t gen nrLSU 29
3.2. XÂY DNG QUY TRÌNH THC NGHIM NHM KHUCH I VÙNG
GEN LSU CHO CÁC MU NM KÝ SINH CÔN TRÙNG 29
3.3. KT QU HIU CHNH TRÌNH T 33
3.4. .KT QU SO SÁNH VI C S D LIU TRÊN GENBANK 40

3.5. XÂY DNG B D LIU TRÌNH T GEN LSU 41
3.6. KT QU XÂY DNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 46
CHNG 4. KT LUN VÀ  NGH
4.1. KT LUN 60
4.1.1. V lý thuyt 60
4.1.2. V thc nghim 60


4.2.  NGH 61
5. TÀI LIU THAM KHO 62



Danh mc nhng ch vit tt

ATP
: Adenosine triphosphate
BLAST
: Basic Local Alignment Search Tool
Bp
: base-pair
DNA
: deoxyribonucleotide triphosphate
ETS
: external transcribed spacer
IGS
: intergenic spacer
ITS
: internal transcribed spacer
LSU

: large subunit
ML
: maximum likelihood
MP
: maximum parsimony
NJ
: neighbor-joining
Nu
: nucleotide
rDNA
: ribosomal DNA
rRNA
: ribosomal RNA
OTUs
: operational taxanomic unit
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 1
T VN 
Cordyceps sinensis
Cordyceps sinensis có hot tính chng phát trin t bào khi u,
chng oxi hóa và kích thích s đáp ng min dch ca c th, nh đó cha tr đc
nhiu bnh liên quan đn thn, huyt áp, tim mch, min dch, ni tit t, ung th…
Gn đơy, nhiu nghiên cu cho thy không ch có Cordyceps sinensis mà nhiu loài
khác trong chi Cordyceps và các chi h hƠng (Isaria, Metarcordyceps) cng mang li
nhng tim nng ng dng cao trong y dc.
Trc đơy, vic đnh danh và xây dng h th
c các loài nm này
ch yu da trên phân tích hình thái gii ph


phát trin mnh ca sinh hc phân t đƣ cho phép công tác đnh danh chính xác hn
da vào vic xây dng cây ph h trên các trình t có tính đc trng cho các chi vƠ các
loài nm. Mt trong các trình t đc s dng rt ph bin trong đnh danh nm là
vùng trình t nrLSU (trình t DNA mã hoá tiu phn ln ribosome), đơy lƠ vùng trình
t thuc rDNA, có nhiu bn sao trong b gen, d dàng khuch đi bng các mi ph
quát nên thng đc s dng đ thit lp mi quan h v ngun gc ca nm.
Trong gii hn ca đ tài chúng tôi s xây dng quy trình h tr đnh danh các
loài nm ký sinh côn trùng da trên phân tích vùng gen nrLSU bng phng pháp sinh
hc phân t kt hp vi sinh tin hc.








1. CHNG 1. TNG QUAN
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 2

NM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1.
1.1.1. c đim chung và thành phn loài
Cordyceps là mt chi nm ký sinh trên côn trùng thuc h Clavicipitaceae, b
Hypocreales, lp Pyrenomycetes, ngành nm túi Ascomycota [21]. Chi Cordyceps
xut phát t ting Latin, ắcordẰ = ắchùyẰ, ắcepsẰ = ắđuẰ đƣ mô t đúng đc đim hình
dng trong t nhiên ca nm có hình ging nh gy đánh khúc quơn cu, đu có dng
hình chùy. im ni bt ca nm ký sinh côn trùng là nhng giá tr y dc quý him.
Loài nm ký sinh côn trùng có giá tr y dc đc bit đn đu tiên là Cordyceps

sinensis, sng ký sinh trên u trùng ca các loài sâu thuc chi Thitarodes (đc bit là
Thitarodes armoricanus; Thitarodes baimaensis) có tên gi thông thng lƠ ắông
Trùng H ThoẰ [21]. Giá tr y dc ca loi nm nƠy đƣ đc ghi nhn hn 2000 nm
qua  Trung Quc vƠ phng ông, nhng mƣi đn nm 1726 khi đc gii thiu
trong mt hi ngh khoa hc ti Paris, gii khoa hc phng Tơy mi bit đ
 ng d c, có hot tính
chng phát trin t bào khi u, chng oxi hóa và kích thích s đáp ng min dch ca
c th, nh đó cha tr đc nhiu bnh liên quan đn thn, huyt áp, tim mch, min
dch, ni tit t, ung th [21]… Gn đơy, nhiu nghiên cu cho thy không ch có
Cordyceps sinensis mà nhiu loài khác trong chi Cordyceps và các chi h hƠng cng
mang li nhng tim nng ng dng cao trong y dc[20].
Trong t nhiên, Cordyceps sinh sôi ny n tt trong các khu rng ôn đi và
nhit đi m 
u trùng và c trên cá th trng
thành ca nhiu loài côn trùng khác nhau. Sau khi xâm nhp vƠo c th côn trùng, bào
t nm s ny mm và phát trin thành h si nm. H si nm s xâm chim và thay
th các mô vt ch và s hình thành qu th khi gp điu kin thích hp [30]. Do vy,
qu th ca Cordyceps thng đc tìm thy trên xác nhng hoc u trùng ca côn
trùng sau mt thi gian nhim nm. Qu th nm có dng hình tr, có th phân nhánh
hay có hình dng phc tp. Chi nm này và mt vài các chi h hàng phân b nhiu 
Chơu Á, đc bit lƠ vùng ông Á, ngoƠi ra còn có  Châu Úc và mt s n
c tìm thy  đ cao t 4000-
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 3

5000m so vi mt nc bin trên các cao nguyên Himalaya, Tây Tng, T Xuyên,
Thanh Hi,
c miêu t [39].

Hình 1.1. Cordyceps sinensis [49]
Gn đơy đa s các nm ký sinh  đng vt chơn đt ca b Hypocreales đu
đc xp vào chi Cordyceps thuc h Clavicipitaceae [35]. Phân loi này da trên các
đc đim: th túi dng tr, đnh túi dày và các bào t túi dng si thng có th ngt
ri thành nhiu bào t th cp [39]. Nm 2007, Sung vƠ cng s đƣ sp xp li h
thng nhóm nm Cordyceps và Clavicipitaceae, kt qu phân loi thành ba h đn
ngành: Clavicipitaceae s.s. (Clavicipitaceae lp A), Cordycipitaceae (Clavicipitaceae
lp B) và Ophiocordycipitaceae (Clavicipitaceae lp C) [35] [38] [39].
Vic phân loi phát sinh loài hin ti ca nm Hypocreleales [46] nh sau:
Clavicipitaceae s.s: Conoideocrella, Hypocrella, Metacordyceps, Moelleriella,
Orbiocrella, Regiocrella, Samuelsia, Shimizuomyces, Villosiclava, …
Ophiocordycipitaceae: Cordyceps s.l., Elaphocordyceps, Ophiocordyceps,…
Cordycipitaceae: Ascopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella, …

Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 4

1.1.2. Tim nng ng dng
1.1.2.1. Các thành phn dinh dng chung ca Cordyceps ậ các thành phn hoá
hc
Các phân tích hoá hc cho thy trong sinh khi ca Cordyceps sinensis có cha
nhiu thành phn dinh dng nh: các amino acid, vitamin E, K, B1, B2, B12, C…
Ngoài ra, chúng còn cha nhiu đng, bao gm c mono-, di-, oligosaccharide và
nhiu phc hp polysaccharide, protein, sterol, nucleoside, và các nguyên t
(K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V, và Zr) [21].
1.1.2.2. Các hot cht chính ca Cordyceps và ng dng trong y dc
1.1.2.2.1. Cordycepin
Cordycepin có c
-deoxyadenosin, là m

Cordyceps militaris
nm 1950 [21]. Cordycepin có tác dng kháng ung th [42], ngn cn quá trình tng
hp RNA ca t bào HeLa [36], c ch tng hp protein và s bám dính t bào [45]

Hình 1.2.
]
1.1.2.2.2. Polysaccharide
- Các polysaccharide hay nhng hp cht có ngun gc t
đng ca Cordyceps bao gm d-mannitol (cordycepic acid), beta-glucan, beta-
mannan và mt s các polysaccharide phc tp kt hp nhiu loi phân t đng khác
nhau. Các polysaccharide có kh nng chng ung th, điu hoƠ đng huyt [21], ci
thin chc nng h thng min dch, bo v gan, có hot tính chng oxy hóa [29]…
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 5

1.1.2.2.3. Sterol
Các sterol trong Cordyceps đc tìm thy gm: ergosterol, delta-3 ergosterol,
ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol, campesterol
a nó có hot tính kháng virus, điu hoà tim mch, điu tr bnh thn [46].
Dng glycosyl hoá ca ergosterol peroxide có tác dng c ch s tng sinh các dòng t
bƠo ung th K562, Jurkat, WM-1341, HL-60 và RPMI-8226 [12].
1.1.2.2.4. Protein, acid amin và các hp cht khác
HƠm lng protein trong Cordyceps vào khong 29,1% ậ 33% bao gm 18 acid
amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, Các acid amin có
hƠm lng acid amin cao nht lƠ glutamat, arginin, acid aspartic vƠ có dc tính cao
nh

Các protein, peptide, polyamine,
các amino acid và mt s các dipeptide vòng ca Cordyceps cng có hot tính chng

ung th vƠ tim nng min dch [21]. Nm Hypcrealean AP và vài loài trong chi
Cordyceps có kh nng sn xut ra các cht chuyn hóa th cp có hot tính sinh hc
làm ngun tim nng đ sn xut dc phm và thuc điu tr. Ví d: Cyclosporin A là
thuc ngn chn min dch vi thành phn dc cht là cyclosporin có tác dng kìm
hãm h min dch giúp ích trong cy ghép các b phn ca c th ngi. Cyclosporin
là mt sn phm chuyn hóa ca Cordycepin đc phân lp t nm Tolypocladium
inflatum [45]. Nm nƠy đc bit là dng sinh sn vô tính ca nm Elaphocordyceps
subsessilis (Cordyceps subsessilis) [19] [38].
1.1.2.3. ng dng kim soát côn trùng
Ngoài tim nng ng dng trong y dc, các loƠi Cordyceps còn đc ng
dng trong kim soát sinh hc. Do đc đim ký sinh trên côn trùng, Cordyceps tr
thƠnh thiên đch ca các loài côn trùng gây hi. Vì vy nhiu loƠi đƣ đc s dng
rng rƣi trong đu tranh sinh hc kim soát dch bnh, trong đó ph bin là các loài
Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Theo McCoy (1990)
[31], các tiêu chí quan trng đ các loài nm côn trùng có th đc s dng làm thuc
tr sâu sinh hc bao gm kh nng gơy đc cho ký ch cao, có tác dng nhanh, có ph
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 6

ký ch rng, có tính n đnh trong nuôi cy và bo qun, d dàng lên men chìm, d
kim soát và phân tích s lng vƠ an toƠn cho con ngi [2]. Theo Taborsky (1992)
[40], ng dng đu tiên s dng Metarhizium anisopliae cho đu tranh sinh hc đc
thc hin vƠo nm 1888 bi Krassilstchik. Trên th trng hin có sn phm thuc tr
sâu sinh hc Green Muscle đc làm t nm Metarhizium anisopliae var. acridum
giúp thay th thuc tr sâu hóa hc đ kim soát châu chu  Châu Phi. Ti Vit Nam,
nhiu nghiên cu đƣ thƠnh công trong vic s dng nm ký sinh côn trùng phòng tr
các loi côn trùng và sâu hi cây trng, đin hình nh nm Metarhizium anisopliae và
Beauveria bassiana đƣ đc ng dng trong phòng tr mi nhà [3], sâu khoang hi ci
xanh [11], sâu hi đu tng vƠ đu xanh [8], ry mm và các loài sâu hi lúa [9] [4].

NGHIểN CU NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 1.2.
1.2.1. c đim nhn dng và đnh danh
Trc đơy, vic đ
ng h thng hc các loài nm này ch yu
da trên phân tích hình thái gii phu. Các đc đim đ nhn bit h Clavicipitaceae
bao gm: th túi dng tr, đnh túi dày và các bào t túi dng si thng có th ngt
ri thành nhiu bào t th cp [38]. Nm 1982, Kobayashi trên c s x lý các thông
tin t vic phân tích 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài thuc v các
chi lân cn khác đƣ xơy dng nên khóa đnh lo

8]:
Cordyceps
militaris


Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 7

Metarcordyceps youngmunensis
(Metarcordyceps taii

Ophiocordyceps sinensis)
(Ophiocordyceps variabilis

c chi nm ký
sinh côn trùng có kh nng bin đi r
u kin môi trn
c đim l u tính (dng
qu th

ng mycelium) c
i s phát tri a sinh hc phân t
nh chính xác hn
các loài c

1.2.2. nh danh phân t
nh danh phân t
i sinh vt  mc đ phân t da trên
c s so sánh trình t nucleotide và axit amin ca các phân t DNA, RNA, protein.
Trong nghiên cu đnh danh phân t, vic la chn vùng trình t DNA, RNA, protein
đ kho sát gia các loài là mt bc quan trng, trình t này cn đm bo tính bo
tn cao trong cùng mt loƠi nhng bin đng ln gia các loƠi khác nhau. i vi đnh
danh mt s loài thì vùng gen gi nhà (house-keeping gen) đƣ đc s dng ph bin
trong nhiu nm g
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 8

n nay, đnh danh phân t đang tr thành ngành khoa
hc mi nhn trong phân loi hc, b sung trong phân loi hc truyn thng nhng
phng pháp nghiên cu m

1.2.3. DNA ribosome và trình t nrLSU trong đnh danh phân t nm
nh danh phân t là mt trong các phng pháp phơn loi sinh vt, s dng d
liu là các trình t DNA đ phân tích. Trong nghiên cu đnh danh phân t, vic la
chn vùng trình t DNA đ kho sát gia các loài là mt bc quan trng, trình t này
cn đm bo tính bo tn cao trong cùng mt loƠi nhng bin đng ln gia các loài
khác nhau. i vi nhóm Cordyceps vùng gene mã hoá cho RNA ribosome (DNA
ribosome, rDNA) đƣ đc s dng ph bin đ nghiên cu trong nhiu nm gn đơy.
rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa rRNA ca ribosome, có nhiu bn sao

và không mã hóa cho bt k protein nƠo. ơy lƠ vùng gen bo tn nên đc xem lƠ c
s chính xác đ tìm ra s tng đng và các khác bit ca các sinh vt cùng loài hay
khác loƠi, đóng vai trò quan trng trong các nghiên cu quá trình tin hóa, phát sinh
loài, phân loi nm vƠ xác đnh tính đa dng di truyn ca sinh vt cng nh các dòng
nm do vic phân loi nm da vƠo đc đim hình thái, đc đim sinh hóa có kt qu
phân loi thng không chính xác và cn khong thi gian dài [23].
Ribosome là bào quan nh có trong tt c các t bào ca sinh vt nhơn s vƠ
sinh vt nhân chun. Chúng đm nhn chc nng thc hin quá trình sinh tng hp
protein ca t bƠo. Các ribosome đc cu to t rRNA và ribosome protein. Mt
ribosome gm tiu phn nh và tiu phn ln. Hai tiu đn v này ch kt hp vi nhau
to ra mt ribosome hot đng khi làm nhim v tng hp protein. Ribosome có th
nm t do trong t bào cht, hay bám trên màng ca mng li ni cht. RNA
ribosome là mt trong hai thành phn chính ca ribosome.  sinh vt nhân chun, tiu
phn nh ca ribosome (40S) cha 18S RNA, tiu phn ln (60S) cha 28S, 5.8S và
5S.RNA ribosome đc phiên mã t DNA ribosome. DNA ribosome bao gm nhiu
đn v lp li, mi đn v lp li bao gm vùng LSU (ribosomal large subunit-25-28S),
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 9

vùng 18S, ITS (internal transcribed spacer), 5.8S, 5S RNA và vùng IGS (intergenic
spacer). (Hình 1.2) Vùng IGS bao gm phn ETS (external transcribed spacer) và phn
không phiên mã NTS (non-transcribed spacer).


Hình 1.3. Cu trúc ca rDNA[47].
Mt đn v lp li bao gm vùng IGS2-18S (SSU)-ITS1-5.8S-ITS2-28S (LSU)-
IGS1-5S-IGS2. Trong đó vùng 18S-28S là vùng phiên mã chính (Vilgalys, 2004).
Vùng này cha thông tin di truyn phiên mã cho rRNA - thành phn cu trúc chính
ca ribosome (LSU, SSU). Bi rDNA gm nhiu đn v lp li nên sau khi khuch đi

bng mi, kt qu s thu đc mt s lng rt ln các đon DNA cn kho sát. ơy
cng lƠ mt trong nhng thun li ca trình t nrLSU. Các trình t mã hoá cho rRNA
có tính bo tn cao, phù hp cho các nghiên cu  cp h.
Trình t nrLSU-rRNA là vùng gen mã hóa RNA 25S-28S ca ribosome (tiu
phn ln ca ribosom). Cu trúc ca nrLSU-rRNA ngoài nhng vùng bo tn còn có
nhng vùng bin đng gi là domain D1/D2/D3 (D-divergence region, các s đc
đánh th t 1,2,3 bt đu t đu 5‟-3‟) [34]. Các domain khác nhau ca 25-28S
rDNA (tiu phn ln LSU) cha nhiu thông tin cho phép so sánh các cp phân loi t
cao xung đn cp đ loƠi [17]. c bit, vùng DNA D1/D2 mã hóa cho tiu phn ln
ca ribosome gn đơy đc xem là rt hu ích cho vic phân loi phn ln các loài
nm có giá tr y dc [15] [26].
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 10


Hình 1.4. S đ v trí các vùng domain thuc trình t nrLSU [50]
Các nghiên cu ph h phân t đi vi nm t lơu đƣ s dng vùng gen mã hóa
RNA ca ribosom (nrSSU, nrLSU) làm vùng gen mc tiêu trong nghiên cu. Bi vì,
nhng vùng gen này cha nhiu thông tin di truyn có tính bo tn cao, đc bit rng
rãi trên th gii và có kh nng thit k đc các cp mi ph quát giúp khuch đi và
gii trình t các trình t ca nhiu loài nm. Cp mi LR0R/LR5 là cp mi ph quát
đc bit đn nhiu nht vƠ cng đc s dng trong nhiu nghiên cu ph h phân t
nm trong nhng nm gn đơy [41]. Cp mi nƠy đc thit k đ khuch đi vùng
D1-D2 và cho kt qu khuch đi khong 800-1300 bp [34]. Vùng D1, D2 là nhng
domain khác nhau nm trên vùng gen LSU có kh nng gii quyt vic đnh danh
nhng loài có mi liên quan rt gn gi vi nhau bi các domain này cha nhiu thông
tin di truyn, có tính bin đng.
TỊNH HỊNH NGHIểN CU TRONG NC 1.3.
 Vit Nam, các nghiên cu v thành phn loài nm ký sinh côn trùng vn cha

đc quan tâm. Do vy, cho đn nay cha có mt công b đy đ nào v thành phn
các loài nm ký sinh côn trùng. S thiu thông tin v thành phn loài làm cho kh
nng khai thác các loƠi nm trong nc ng dng trong nghiên cu, xây dng quy
trình nuôi trng nm và sn xut dc liu gp nhiu tr ngi.
Ti Vit Nam, nhng nghiên cu v thành phn loài nm ông trùng h tho
đc công b vào nhng nm 1996 vƠ 2001 có 3 loƠi nm thuc chi Cordyceps, đó lƠ
Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps sabrolifera [10] và 2 loài mi
đc phát hin mi cho khu h nm Vit Nam đó lƠ Cordyceps nutans và Cordyceps
gunnii [5][6][7].
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 11

Vin Khoa hc Lâm nghip Vit Nam đƣ tin hành thu mu ông trùng h tho
ti mt s Vn quc gia và Khu bo t
ng s 24 loài nm
ông trùng h tho đc giám đnh. Các loài nm ông trùng h tho nƠy đu thuc
h Clavicipitaceae, b Hypocriales, lp Sordariomycetes, ngành ph n
n gen các loài nm nƠy đang đc lu tr ti Trung tâm
Nghiên cu bo v rng, Vin Khoa hc Lâm nghip Vit Nam. Trên c s ngun gen
thu thp đc vƠ su tp t Trung Quc và Nht Bn, Trung tâm Nghiên cu bo v
rng, Vin Khoa hc Lâm nghip Vit Nam đƣ nghiên cu nuôi trng qu th nm
đông trùng h tho trên giá th nhân to. Mt s loƠi đƣ có quy trình công ngh sn
sàng chuyn giao cho các c s sn xut nm nh: quy trình nuôi trng nm Nhng
trùng tho (Cordyceps militaris), ông trùng h tho bông tuyt (Isaria tenuipes) và
ông trùng h tho b xít (Cordyceps nutans) [7].
Nm 2009, ln đu tiên  Vit Nam, ái Duy Ban cùng các nhƠ khoa hc uy tín
đƣ tìm ra vƠ nhơn nuôi thƠnh công ông Trùng H Tho vi công trình ắNghiên cu
phát hin mi loƠi đông trùng h tho Isaria cerambycidae  Vit Nam vƠ xác đnh
mt s hot cht sinh hc trong đông trùng h thoẰ [1].

TỊNH HỊNH NGHIểN CU TRểN TH GII 1.4.
Hin nay, nghiên cu ph h phân t nhm xây dng h thng phân loi vƠ đnh
danh các loài nm ký sinh côn trùng đc nhiu nhà khoa hc  khp ni quan tơm
nghiên cu, ni bt lƠ các nc  khu vc ông Á, ông Nam Á vƠ phng Tơy nh
Hàn Quc, Trung Quc, Nht Bn, M, Thái Lan Do vy, trong nhng nm gn
đơy, s công trình nghiên cu v h thng phân t ca nm ký sinh côn trùng ngày
cƠng tng. c tính, s lng nghiên cu đt đc lƠ tng lên gp đôi c sau 2 nm,
và s lng các loài trong mi nghiên cu cng ngƠy cƠng tng [32].
Hin nay, nhiu công trình nghiên cu ph h phân t đƣ s dng vùng gen
nrLSU làm gen mc tiêu trong nghiên cu nh nm 2003,  Trung Quc, Jeewon
nghiên cu mi quan h ph h phân t ca các loài nm thuc h Amphisphaeriaceae
da vào d liu vùng gen 28S [22]. Nm 2006,  M, Dentinger đƣ tin hành nghiên
cu xây dng h thng phân loi các loài nm thuc h Clavariaceae da vào vùng
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 12

gen nrLSU [13]. Nm 2006,  Hàn Quc, Ji Seon Lee nghiên cu nhm phát trin
phng pháp đnh danh phân t mt s loài nm y dc da vào vùng gen nrLSU [27].
Gn đơy, nghiên cu ph h da trên nhiu vùng gen lƠ xu hng mi, nm
2007, Sung và cng s đƣ sp xp li h thng phân loi nhóm nm cordyceps và
clavicipitacea, chia các loài trong nhóm nm này thành 3 h là Clavicipitaceae s.s.,
Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae da trên phân tích ph h phân t 7 vùng
gen nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, tef1, tub, atp6 vi b d liu 162 loài nm kt hp vi
đnh danh bng hình thái.
PH H PHÂN T 1.5.
1.5.1. Ph h phân t trong nghiên cu phát sinh loài
Ph h phân t là nghiên cu v mi quan h tin hóa ca tp hp các trình t
gen, d

Dng cây ph h phân t là mt quá trình phc tp bi thc t không th xây
dng mt cơy đúng nht. Tp hp d liu phát sinh loài có th bao gm hƠng trm loƠi
khác nhau, mt trong s đó có th đƣ thay đi t l đt bin dn đn nh hng tin
hóa. Do đó, có rt nhiu mô hình tin hóa khác nhau vƠ các phng pháp phơn tích
phát sinh chng loài, dò tìm cây tin hóa ti thích cho mt phân tích phát sinh loài
[14].
1.5.2. Nhng bc c bn trong nghiên cu phát sinh chng loài
1.5.2.1. Chn la marker phân t và sp xp b d liu
Bc đu tiên là cn xác đnh protein hay trình t DNA s là d liu đc ch
trình t quan tâm có th ly t trang NCBI hay các công c tìm kim tng đng khác,
đ to ra mt c s d liu cuc b [14].
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 13

1.5.2.2. c và hiu chnh trình t
Do các phân tích phát sinh chng loài da trên nhng s khác bit khi quan sát
các trình t đc so sánh thng hƠng. Do đó li trình t s có th đa đn mt cây tin
hóa không tht chính xác. c bit vi trng hp vùng DNA có đ bo tn cao và
nhà phân tích chn mô hình tin hóa phc tp thì li trình t s cho ra kt qu có đ sai
khác rt ln.  tránh trng hp li trình t do ch quan, ngi ta buc phi đc
trình t c hai si đ vic hiu chnh sau đó đc đm bo tính khách quan hn.
1.5.2.3. Sp ct thng hàng các trình t
Vic sp c
c hin bng máy tính mt cách t
đ
i nhng gen hay
vùng DNA kém bo tn thì quá trình sp xp thng hàng t đng rt d gây ra li. Do
đó vi gene hay vùng DNA có đ bin thiên cao cn đc trc tip thc hin quá trình
sp xp thng hàng bng mt. Vi nhng vùng không có kh nng sp xp thng hàng

thì cn ph
 trc khi đa vƠo phơn tích.
1.5.2.4. Chn la mô hình tin hoá
i d liu phi tri qua quá trình kim tra dò tìm mô
hình tin hóa thích hp.
Trong mô hình tin hóa đn gin nht, tc đ bin đi cng đc gi đnh là
bng nhau cho mi dng đt bin đim. Khi đó s lng các dng bin đi trong mô
hình tin hóa nƠy đc thit lp là 1.
Mô hình tin hóa phc tp nht hin nay lƠ mô hình có kh nng hi bin tng
quát theo thi gian (General time reverible model). Mô hình nƠy cho rng có 6 kiu

Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 14

Mt vài mô hình tin hóa ngu nhiên ph bin gm Jukes-Cantor, Kimura 2-
parameter (K2P), Tamura 3-parameter, Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), Tamura Nei,
General Time Reversible (GTR)…
Mt s chng trình phn mm, nh PAUP *, s t đng s dng mt mô hình
mc đ

1.5.2.5. Phân tích s phát sinh chng loài [28]
VƠi phng pháp nhm suy lun cây phát sinh ch
c bit khá rõ
hin nay đu là nhng phng pháp kt hp thu
i thích và mt
nhóm tiêu chun ti u chn trc. Tin trình thc hin ca nó là dò tìm nhng cây
tin hóa ti thích, sau đó nhng cây tin hóa nƠy đc đánh giá di nhng tiêu chun
ti u chn trc đ cho ra mt cây tin hóa tt nht.
1.5.2.5.1. Dò tìm cây tin hoá ti thích

Trong thc nghim ng
n hai phng pháp dò tìm cơy tin hóa
đó lƠ phng pháp branch-and-bound vƠ phng pháp heuristics.
Trong phng pháp branch-and-bound, mt cơy đc coi là tt nht s đc la
chn, sau đó cơy nƠy đc đánh giá cho đim theo các tiêu chun đƣ chn trc. Cây
này s đc gi trong b nh vƠ đim ca cơy nƠy đc xem lƠ ắđim chunẰ. im
các cơy khác đc so sánh, nu di đim chun s b b qua, nu cao hn đim chun
thì s tr thành cây tt nht mi vi đim chun mi. Tin trình c th tip tc cho đn
ht. Thut toán này cho phép dò tìm cây tin hóa tt nht nhng li tiêu tn nhiu thi
gian.
Phng pháp heuristics mc dù không cho kt qu chính xác cao nh phng
pháp trên nhng vn thng đ

t phng pháp na lƠ phng pháp phơn rƣ hình ngôi sao.
Phng pháp nƠy có nguyên lý lƠ đu tiên mt hình cây d
chnh đc to thành, k đn mt taxa liên h gn nht đc đa vƠo sao cho nó phi
tìm đc v trí tt nht. Tin trình thc hin nhiu ln cho đn khi cây tin hóa hình
thành.
Khoá lun tt nghip nm hc 2013-2014

SVTH: Nguyn Th Hi Ngc 15

1.5.2.5.2. Tiêu chun ti u
t l t nht v lch s tin hóa da
vào nhng thông tin cha hoàn chnh ca d liu. Phng pháp s dng tiêu chun ti
u có 2 bc theo th t: u tiên lƠ xác đnh m c nng tính đim
cơy. Bc hai là tìm mt cây thay th ng vi mt tiêu chu
cây. Quá trình tt s cho ra nhiu gii pháp thay th ti u.
[18]. Nguyên lý ca
phng pháp maximum parsimony lƠ tìm kim mt cây sao cho s lng thay đi tin

hóa là thp nht đ gii thích nhng s khác nhau đc nhìn th
 chn cây có tng chiu dài nh
nht.
gorithm).
Distance method)
ng cách chính là khong cách tin hóa gia các cp đi
tng đang đc so sánh. V nguyên tc, phng pháp khong cách c tìm ra mt cây
thích hp da vào ma trn khong cách gen ca các cp trình t. Khi tt c các khong
cách gia các cp trình t
c tính toán và thit l  đó đa hình hc
mt ca cơy đc xây dng nh vƠo các phng pháp khác nhau. Phng pháp
khong các a vƠo đ
 dng mô hình đt bi ng cách không
chng minh đc khong cách đúng gia các gen bi vì mt s v trí nucleotide có th
đƣ xy ra quá trình đt bi