Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây lúa có hoạt tính kích thích tăng trưởng cây trồng và kháng nấm Rhizoctonia sp. gây bệnh trên cây lúa

Li Cm n

 hoàn thành khóa lun tt nghip này, bên cnh s c gng ca bn thân, em
đã nhn đc s hng dn vƠ giúp đ nhit tình ca thy cô, gia đình, bn bè.
Li đu tiên, con xin cm n ba m và các anh ch đã luôn  bên cnh ng h
tinh thn, tip sc cho con trong nhng lúc khó khn, luôn to mi điu kin tt
nht đ con an tâm thc tp.
Em xin chân thành cm n thy cô trong Khoa Công ngh Sinh hc, trng i
hc M Thành ph H Chí Minh đã truyn đt nhng kin thc nn tng vô cùng
quý giá, to tin đ đ em tip tc hc tp, nghiên cu. Em xin gi li cm n chơn
thành nht đn thy Nguyn Thanh Thun, thy Nguyn Vn Minh, cô Dng Nht
Linh, cm n thy cô luôn bên cnh đnh hng truyn đt kinh nghim, đng viên
em hoƠn thƠnh đ tài.
Em xin cm n thy an Duy Pháp, ch Võ Ngc Yn Nhi, ch Nguyn Th M
Linh, anh Hà Ch Linh và các anh, ch, các bn, các em  phòng vi sinh đã ng h,
giúp đ em trong sut thi gian em thc hin đ tài.
Cui cùng em xin chân thành cm n nhng ngi thơn đã luôn bên cnh ng h
em v mi mt và là ngun đng viên tinh thn rt ln đ em có th yên tâm thc
hin đ tài.
Em xin chân thành cm n.

Sinh viên thc hin
Lê Th Ho
Tháng 5/2014

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

DANH MC CH VIT TT

CFU Colony Forming Unit
đ m đc
H Gi
IAA Indole Acetic Acid
MS Minimal Salt
NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
OD Optical Density
ppm Parts per milion
TSA Tryticase Soy Agar
TSB Tryticase Soy Brot

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

DANH MC BNG
Bng 2.1 Xây dng đng chun phospho 21
Bng 2.2 Xây dng đng chun IAA 23
Bng 3.1 Kt qu quan sát đi th ca các chng đc phân lp 35
Bng 3.2 Kt qu quan sát vi th 37
Bng 3.3 Kt qu đnh lng phân gii lân ca các chng 41
Bng 3.4 Kt qu đnh lng sinh IAA ca các chng 44
Bng 3.5 Kt qu kho sát phn trm c ch 46
Bng 3.6 Kt qu quan sát đi th, vi th ca 2 chng vi khun phân lp t phân
Dasvila. 48
Bng 3.7 Kt qu đnh danh 2 chng vi khun phân lp t phân Dasvila 48
Bng 3.8 Kt qu đnh lng kh nng sinh IAA ca chng DV2 50
Bng 3.9 Tng hp các chng có kh nng kích thích tng trng cây trng 51
Bng 3.10 Kt qu đnh danh sinh hóa ca vi khun thuc nhóm Azotobacter 53

Bng 3.11 Kt qu đnh danh sinh hóa ca vi khun thuc Bacillus 54
Bng 3.12 Kt qu chiu dài r, thân lúa, trng lng ti, trng lng khô 58
Bng 1 Giá tr OD ca đ th đng chun phospho 78
Bng 2 Kt qu OD
600nm
xác đnh phospho trong dch nuôi cy 78
Bng 3 Giá tr OD ca đ th đng chun IAA 79
Bng 4 Kt qu OD
530nm
xác đnh IAA trong dch nuôi cy 80
Bng 5 Kt qu OD
530nm
xác đnh IAA trong dch nuôi cy 87
Bng 6 Kt qu đo chiu dài r ca các nghim thc 88
Bng 7 Kt qu đo chiu dài thân ca các nghim thc 90
Bng 8 Kt qu cân trng lng ti ca các nghim thc 92
Bng 9 Kt qu cân trng lng khô ca các nghim thc 94

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

DANH MCăSă
S đ 2.1 B trí thí nghim 19
S đ 2.2 Quy trình đnh lng phospho 22
S đ 2.3 Quy trình đnh lng IAA 24

DANH MC BIUă
Biu đ 3.1  th biu din nng đ phospho tan dch nuôi cy các chng 42
Biu đ 3.2  th biu din nng đ IAA trong dch nuôi cy các chng 45

47
Biu đ 3.3  th biu din phn trm c ch nm bnh ca 2 chng V5 và D5 47
Biu đ 3.4 So sánh hƠm lng IAA sinh ra ca chng DV2 so vi các chng vi
khun ni sinh 50
Biu đ 3.5  th chiu dài r ca các nghim thc 58
Biu đ 3.6  th biu din chiu dài thân ca các nghim thc 59
Biu đ 3.7  th biu din trng lng ti ca các nghim thc 59
Biu đ 3.8  th biu din trng lng khô ca các nghim thc 60
Biu đ 3.9 đ th biu din hiu qu kích thích tng trng GPE (%) 60
Biu đ 1  th tng quan gia mt đ quang và nng đ phospho chun. 78
Biu đ 2  th tng quan gia mt đ quang và nng đ IAA chun. 79

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

DANH MC HÌNH NH
Hình 1.1 Cu trúc phân t ca IAA và tryptophan 10
Hình 1.2 Hình thái Bacillus 12
Hình 1.3 Hình thái Azotobacter trên môi trng vô đm và t bào vi khun
Azotobacter 15
Hình 3.1 Hình đi th ca mt s chng vi khun trên môi trng NA 36
Hình 3.2 Phân lp vi khun ni sinh trên môi trng TSA (A) vƠ đa đi chng
cha nc ra mu cui cùng (B) 37
Hình 3.3 Mt s hình nh quan sát vi th mt s chng phân lp đc (X100) 39
Hình 3.4 Kh nng phát trin ca vi khun V18, B3, V7, B5, V3, D1 trên môi
trng vô đm 39
Hình 3.5 Kh nng phơn gii lân ca vi khun trên môi trng Pikovskaya 40
Hình 3.6 Phn ng màu phospho hòa tan ca các chng 42
Hình 3.7 Phn ng màu gia thuc th FeCl

3
-H
2
SO
4
và IAA sinh ra bi vi khun 45
Hình 3.8 Th nghim kép và kho sát phn trm c ch nm Rhizoctonia sp. ca
chng D5 47
Hình 3.9 Sn phm phân Dasvila và phân lp chng vi khun t phân. 49
Hình 3.10 Hình nh vi khun DV2 và DV1 phát trin trên môi trng vô đm
Ashby 49
Hình 3.11 Hình nh kh nng sinh IAA ca chng DV2 lp li 3 ln 51
Hình 3.12 Kt qu th kh nng tng thích gia các chng vi khun đc la chn
55
Hình 3.13 Ht lúa ny mm trên đa agar 56
Hình 3.14 Ht lúa ny mm đc ngâm trong dch khun tng ng vi tng
nghim thc 56
Hình 3.15 Giai đon lúa phát trin đc 3 ngày, 7 ngày, 19 ngày sau khi gieo 57
Hình 3.16 Chiu dài r gia các nghim thc 61
Hình 3.17 Chiu cao thân gia các nghim thc 61
Hình 1 Kh nng lên men đng glucose ca vi khun 85
Hình 2 Phn ng VP Hình 3 Phn ng citrat 85
Hình 4 Kh nng phơn gii tinh bt Hình 5 Kh nng di đng 85
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

Hình 6 Th nghim catalase Hình 7 Th nghim oxidase 86
Hình 8 Phn ng nitrat Hình 9 Phn ng Indol 86

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

MC LC
PHN 1: TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1 VI KHUN NI SINH 4
1.1.1 S lc v vi khun ni sinh 4
1.1.2 Tình hình nghiên cu trong nc 5
1.1.3 Tình hình nghiên cu trên th gii 6
1.2 S C NHăNITăPHÂN T CA VI KHUN 6
1.2.1 Quá trình c đnh nit phơn t 6
1.2.2 C ch quá trình c đnh nit phơn t 7
1.3 VI KHUN HÒA TAN LÂN 8
1.3.1 Vai trò ca lơn đi vi cây trng 8
1.3.2 Vi sinh vt hòa tan lân hu c 8
1.3.3 Vi sinh vt hòa tan lơn vô c 8
1.4 VI KHUN SINH IAA 9
1.5 BNH KHÔ VN TRÊN LÚA DO NM BNH Rhizoctonia sp.
GÂY RA 10
1.5.1 Triu chng 10
1.5.2 c đim phát sinh phát trin 11
1.6 VI KHUN Bacillus 12
1.7 VI KHUN Azotobacter 14
PHN 2: VT LIUăVẨăPHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 16
2.1 THIăGIANăVẨăAăIM NGHIÊN CU 17
2.2 VT LIU 17
2.3 THIT B, DNG C,ăMỌIăTRNG 17
2.3.1 Thit b 17
2.3.2 Dng c 17

2.3.3 Môi trng 17
2.3.4 Thuc th 18
2.4 PHNGăPHÁPăTHC HIN 19
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

2.4.1 B trí thí nghim 19
2.4.2 Phng pháp phơn lp 20
2.4.3 nh tính kh nng sinh NH
3
ca vi khun 20
2.4.4 Xác đnh kh nng hòa tan lơn 21
2.4.5 Xác đnh kh nng sinh IAA 23
2.4.6 Th kh nng đi kháng nm bnh và kho sát phn trm c ch 25
2.4.7 nh danh chng đc la chn 26
2.4.8 Thí nghim th kh nng tng thích gia các chng đc la chn . 31
2.4.9 Thí nghim trng lúa 32
PHN 3: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 34
3.1 KT QU QUANăSÁTăI TH 35
3.2 KT QU QUAN SÁT VI TH 37
3.3 KH NNGăC NHăNITăPHỂNăT 39
3.4 KH NNGăHọAăTANăLỂN 40
3.4.1 nh tính kh nng hòa tan lơn 40
3.4.2 nh lng kh nng phơn gii lân ca các chng 40
3.5 KH NNGăSINHăIAA 43
3.6 KT QU KIM TRA KH NNGăI KHÁNG NM 46
3.7 KT QU PHÂN LP,ăXÁCăNH HOT TÍNH KÍCH THÍCH
TNGăTR
NG THC VT CA VI KHUN TRONG PHÂN VI SINH

DASVILA 48
3.7.1 Kt qu quan sát đi th, vi th, đnh danh 48
3.7.2 Kt qu kho sát kh nng c đnh đm 49
3.7.3 Kt qu kho sát kh nng sinh IAA t 2 chng vi khun phân lp t
phân Dasvila 49
3.8 KT QU NH DANH MT S CHNG VI KHUNăC
LA CHN 51
3.8.1 Kt qu đnh danh s b 53
3.8.2 Kt qu đnh danh chng dng trc, Gram (-), không bào t 53
3.8.3 Chng dng trc, Gram (+), có bào t 54
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

3.9 KT QU TH KH NNGăTNGăTHệCHăGIA CÁC CHNG
VI KHUNăC LA CHN 55
3.10 KT QU TRNG LÚA 55
3.10.1 Chn ging, m ht ging ny mm, tin hành trng lúa 55
3.10.2 Kt qu mt s đc tính nông hc 57
PHN 4: KT LUNăVẨă NGH 65
4.1 KT LUN 66
4.2  NGH 66

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 1

T VNă
Lúa (Oryza sativa L.), thuc h Hòa Bn lƠ cơy ng cc quan trng nht trong
s phát trin th gii vƠ lƠ lng thc chính ca hn na dân s th gii
(FAOSTAT: ). Ngày nay, Thái Lan và Vit Nam lƠ hai nc
xut go hƠng đu trong th trng lúa go th gii. Theo FAOSTAT, tng sn
lng lúa go nm 2012 ca Vit Nam là 43.661.569,64 tn (FAOSTAT:
).
Có nhiu phng pháp đ tng nng sut cng nh kim soát nm gây bnh,
trong đó có bin pháp s dng hóa cht nông nghip. Phân bón và thuc hóa hc
ngƠy cƠng đc nông dơn a chung và s dng đn mc d tha. iu này chng
nhng làm tiêu tn tin bc mà còn gây tác hi đn đt trng, ngun nc, làm
cho môi trng b ô nhim vƠ đc bit, nh hng trc tip đn cuc sng con
ngi cng nh nhng sinh vt sng trong môi trng. S dng phơn bón vi sinh đ
thay th cho phân bón hóa hc là vn đ đang quan tâm và chú ý vì phân bón vi sinh
không nhng giúp nơng cao nng sut cây trng mà còn thân thin vi môi trng
(Nguyn Th Hunh Nh và cs., 2013).
Mt s nghiên cu cho thy rng, vi khun ni sinh phân lp t đt trng hoc r
cây lúa có kh nng thúc đy tng trng bng kh nng c đnh nit t do, hòa tan
lân, sinh hormon tng trng nh acit indol acetic (IAA)… vƠ c ch các bnh trên
cây trng (Cao Ngc ip và cs., 2009; Verma và cs., 2011; Wang và cs., 2009).
Kích thích tng trng thc vt do vi sinh vt có th thông qua c ch trc tip và
gián tip. Kích thích trc tip là cung cp cht dinh dng thông qua các c ch nh
c đnh nit phơn t, hòa tan lân và các cht dinh dng khác, đng thi sn sinh
các hormon IAA, axit gibberellic, cytokinin. Kích thích gián tip mà các vi sinh vt
có li c ch các vi sinh vt gây bnh có hi cho s tng trng và phát trin ca
thc vt (Raddadi và cs., 2008), đng thi tng kh nng đi kháng nm bnh cho

cây trng.

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 2

Da trên c s li ích ca vi sinh vt ni sinh, chúng tôi mong mun thc hin đ
tài: ”SƠng lc vi sinh vt ni sinh cây lúa có hot tính kích thích tng trng cây
trng và kháng nm Rhizoctonia sp. gây bnh trên cây lúa.” ti tnh Bình Dng,
ng Nai, Vng TƠu nhm sàng lc chng có hot tính cao đa vƠo sn xut phân
sinh hc chuyên dùng cho cơy lúa giúp tng kh nng c đnh đm cho cây, kích
thích tng trng, tng nhng tính nng tt nh hòa tan lơn khó tan, tng hp nhiu
kích thích t thc vt, kháng nm và góp phn phát trin nn nông nghip bn vng.
 Mc tiêu tng quát:
Phân lp vi khun ni sinh cây lúa nhm sàng lc chng có kh nng c đnh nit
phân t, hòa tan lân, sinh IAA và kháng nm có kh nng kích thích tng trng
cây trng.
 Ni dung thc hin
 Phơn lp vƠ sƠng lc vi khun ni sinh cơy lúa có kh nng c đnh nit phơn
t, hòa tan lơn, sinh IAA, kháng nm Rhizoctonia sp. gơy bnh trên cây lúa.
 Phơn lp vƠ đnh danh s b các chng vi khun t sn phm phơn vi sinh
thng mi. So sánh các chng nƠy vi các chng tuyn chn đc t cơy
lúa da trên kh nng c đnh đm vƠ sinh IAA.
 nh danh chng có hot tính cao.
 Thí nghim thc t.

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 3















PHNă1:
TNG QUAN TÀI LIU
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 4

1.1 VI KHUN NI SINH

1.1.1 S lc v vi khun ni sinh
Thut ng vi sinh vt ni sinh bao gm tt c các sinh vt có toàn b hoc mt
phn thi gian chu k sng ca chúng bên trong mô thc vt mà không to ra bt k
triu chng nào (Khan, 2007).
Cơy thng xuyên tham gia vƠo tng tác vi mt lot các vi khun. Vùng r là
ni tip giáp gia r thc vt vƠ đt, lƠ ni lng đng các cht hu c, vƠ lƠ ni xut
phát ca các môi trng sng và các ngun sng khác nhau cho các vi sinh vt đt.
Thc vt có th thay đi vùng r ca chúng nh s hp thu các cht dinh dng, đ
m và oxy t vùng r; và các cht do r tit ra (El-Shatnawi và cs., 2001). Vùng r
lƠ ni xut phát nhiu vi khun ni sinh chui vào r, thơn, lá đ sng ni sinh; sau
khi xâm nhp vào cây ch có th tp trung ti v trí xâm nhp hoc di chuyn đi
khp ni trong cơy đn các h mch ca r, thân, lá, hoa (Zinniel và cs., 2006), thúc
đy các quá trình chuyn hóa trong cây, s phát trin lông r mt cách mnh m và
gim s kéo dài r (Harari và cs., 1988).
Vi khun ni sinh thúc đy thc vt tng trng, tng nng sut vƠ đóng vai trò lƠ
mt tác nhơn điu hòa sinh hc (Ryan và cs., 2007). Vi khun ni sinh không gây
hi cho cây ch cng nh cu trúc bên ngoài ca thc vt, đc phân lp t hoa, trái
cây, lá, thân, r và ht ging loài thc vt khác nhau (Ahmad và cs., 2006), hu ht
chúng đu có kh nng c đnh đm nh: Azospirillum, Gluconacetobacter
diazotrophicus, Herbaspirillum, Klebsiella, Azoarcus, Enterobacter, Burkholderia,
Pseudomonas, Azotobacter (Phm Th Khánh Vân và cs.). Chúng thng có kh
nng tng hp kích thích t auxin (Barbieri và cs., 1986), giúp loi b các cht gây
ô nhim môi trng (Kobayashi và cs., 2000), tng hƠm lng các cht khoáng,
tng kh nng kháng bnh (Fahey và cs., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây trng
hp th tt cht dinh dng (Lng Ngc Du và cs., 2007). Vi khun ni sinh sn
xut hƠng lot các sn phm t nhiên có li cho thc vt kỦ ch mƠ ta có th khai
thác nhng tác nhơn đó đ ng dng trong y hc, nông nghip hay công nghip.
NgoƠi ra nó còn có tim nng loi b các cht gơy ô nhim trong đt bng cách tng
cng kh nng kh đc trên thc vt vƠ lƠm cho đt tr nên mƠu m thông qua
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 5

vic phơn gii lơn vƠ c đnh đm. NgƠy cƠng có nhiu quan tơm trong vic phát
trin các ng dng tim nng công ngh sinh hc ca vi khun ni sinh đ phát trin
các ging cơy trng có kh nng kh đc đng thi có kh nng sn xut sinh khi
vƠ nhiên liu sinh hc (Ryan và cs., 2007).
1.1.2 Tình hình nghiên cu trong nc
 nc ta, vic nghiên cu các vi khun ni sinh có kh nng c đnh đm, hòa
tan lân, tng hp kích thích t IAA  các cây nông nghip đã đc tin hành khá
nhiu trong nhng nm gn đơy. Ti vin nghiên cu và phát trin sinh hc ậi
hc Cn Th, Nguyn Th Hunh Nh và cs. (2013) phân lp các dòng vi khun ni
sinh có kh nng tng hp IAA và c đnh đm trên cy chui; Nghiên cu ca
Lng Th Hng Hip và cs. (2011) phân lp và nhn din vi khun ni sinh trong
cây Cúc Xuyên Chi. Nguyn Hu Hip và cs. (2008) đã phân lp các dòng vi khun
ni sinh đ sn xut phân bón  quy mô phòng thí nghim cho cây mía ti tnh Sóc
Trng.
Phm Th Khánh Vân và cs. phát hin vi khun Azospirillum lipoferum ni sinh
trong cơy lúa mùa đc sn (Oryza sativa L.) trng  vùng đng bng sông Cu
Long. Nghiên cu ca Nguyn Th Ngc Bích, Cao Ngc ip (2009) nhn din vi
khun nt r ni sinh trong cây lúa bng k thut PCR- ARDRA IGS, kt qu cho
thy rng các dòng vi khun nt r, không phân bit là lên nhanh hay lên chm, đu
có th ni sinh  cây không phi thuc h đu nh cơy lúa. Khi vi khun nt r ni
sinh  cây lúa cao sn cho thy tính tích cc nh gia tng nng sut lúa, rm lúa vƠ
đc bit lƠ gia tng hƠm lng nit trong lá lúa t s ng dng k thut 15N đng
v thông qua s tích ly nit t s c đnh nit sinh hc. Vi khun nt r còn giúp
cây lúa hp thu nhiu lân, kali và st so vi cây không b sung vi khun nt r.
ng thi vi nhng thí nghim chng minh các dòng vi khun nt r này tng hp
và phóng thích các cht sinh trng giúp cho cây m cng cáp đn khi cây lúa
trng thành vi nhng hp cht IAA và c đnh đm sinh hc.

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 6

1.1.3 Tình hình nghiên cu trên th gii
Nm 2002, Lodewyck và cs. nêu lên phng pháp phơn lp và mô t đc đim vi
khun ni sinh t các loài thc vt khác nhau. Rosenblueth và cs. (2006) đã công b
mt danh sách toàn din ca vi khun ni sinh đc phân lp t mt lot các b
phn ca cây. Nm 2002, Zinniel và cs. đã phơn lp vi khun ni sinh t cây c.
Theo nghiên cu ca Fahey và cs. (1991) cho thy rng vi khun ni sinh có kh
nng kim soát sinh hc. Nhiu nghiên cu ca Sturz và Matheson (1996), Duijff và
cs., (1997), Krishnamurthy và Gnanamanickam (1997) đã ch ra rng vi khun ni
sinh có kh nng kim soát đc mm bnh trên thc vt; nghiên cu ca Azevedo
và cs., (2000), vi khun ni sinh có kh nng kim soát đc mm bnh  côn trùng
và nghiên cu ca Hallmann và cs. (1997, 1998) cng
đã ch ra rng vi khun ni
sinh có kh nng kim soát đc mm bnh c  tuyn trùng. Nghiên cu ca
Chanway, (1997) ch ra trong mt s trng hp chúng có th đy mnh tc đ ny
mm ca ht, thúc đy s hình thƠnh cơy con trong điu kin bt li và nâng cao
kh nng tng trng ca thc vt. Vi khun ni sinh còn có th ngn chn mm
bnh phát trin bng cách tng hp các cht ni sinh trung gian, qua đó đ tip tc
tng hp các cht chuyn hóa và các hp cht hu c mi.
Nghiên cu ca Sun và cs. (2008), v s đa dng ca vi khun ni sinh vùng r
lúa bng k thut phân tích trình t 16S rDNA. Nhiu tác gi cng phát hin mi
quan h gia vi khun nt r và cây lúa, chúng xâm nhim vào r lúa theo nghiên
cu ca Terouchi và Syono, 1990 nghiên cu ca Plazinski và cs. 1985 đã cho thy
s hình thành nt gi (cu trúc nh nt r)  cây lúa. Thí nghim nghiên cu ca
Biswas và cs. (2000a), chng vi khun nt r cho cơy lúa lƠm gia tng lng quang
hp, lng sinh khi, lng nit trong lá vƠ cui cùng lƠ nng sut ht tng so vi

đi chng.
1.2 S C NHăNITăPHỂNăT CA VI KHUN
1.2.1 Quá trình c đnh nit phân t
Mt trong nhng quá trình vi sinh vt hc có Ủ ngha ln đi vi nông nghip là
quá trình c đnh nit phơn t. Trong khong không khí trên mi hecta đt có ti
80.000 tn nit nhng ngi, gia súc và cây trng đu không có kh nng s dng
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 7

đc nit  dng phân t này. Cây trng trên toƠn trái đt mi nm s dng khong
100-110 triu tn nit, trong khi đó phơn đm hóa hc ca tt c các nc trên th
gii ch b sung khong 30 % s lng nit b ly đi. Mun phá v ba liên kt trong
phân t nit (N=N) đ d to ra các loi phân hóa hc, cn phi s dng các điu
kin k thut rt phc tp (nhit đ cao, áp sut cao, cht xúc tác đt tin) (Bch
Lan Phng, 2011).
1.2.2 C ch quá trình c đnh nit phân t
C đnh đm sinh hc là quá trình kh N
2
thành NH
3
di s xúc tác ca h
enzym nitrogenase. Sau đó, NH
3
có th kt hp vi các acid hu c đ to thành
protein. Trong không khí, N
2
 dng rt bn và s lng rt phong phú, chim 78,16
% theo th tích và 75,5 % theo khi lng. Cây trng cng nh các loƠi đng vt và
ngi không có kh nng đng hóa trc tip ngun N

2
t do t không khí. Quá trình
c đnh đm xy ra trong t bào vi khun và vi khun lam đu ging nhau là nh
chúng có h thng gen nif (ni là ch vit tt ca nitrogen-nit vƠ f lƠ fixing-c đnh)
điu khin quá trình tng hp enzym nitrogenase. Nitrogenase là h enzym xúc tác
cho phn ng kh N
2
thành NH
3
. Nh vy, h thng gen nif đc xem là h thng
gen điu khin cho quá trình c đnh đm sinh hc (Bch Lan Phng, 2011).
Ngày nay nhiu nhà nghiên cu khoa hc đã chng minh NH
3
va là sn phm
ca quá trình c đnh nit phơn t va là nhân t điu hoà hot tính ca enzym
nitrogenase. Khi NH
3
tích ly đn mt nng đ nht đnh thì nó lƠm đình ch tc
khc hot đng ca nitrogenase. Kiu điu hoƠ nh vy gi lƠ “iu hoà liên h
ngc”. Tuy nhiên NH
3
không tham gia điu hoà trc tip mà thông qua mt
protein khác là enzym glutamin synthetase. Khi môi trng có nhiu NH
3
thì enzym
này b adenin hoá nên  trng thái bt hot. Ngc li môi trng vi nng đ NH
3

thp hoc không có thì không b adenin hoá và enzym s  dng hot đng. Khi 
trng thái hot đng nó s hot hóa h gen chu trách nhim tng hp nitrogenase

(Bch Lan Phng, 2011).

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 8

1.3 VI KHUN HÒA TAN LÂN
1.3.1 Vai trò ca lân đi vi cây trng
Lân gi vai trò quan trng trong đi sng cây trng vì nó có thành phn ca
protit to nên nhân t bào, cn cho vic to ra các b phn mi cho cây, tham gia
tng hp acid amin. Nh vy lân gi vai trò rt quan trng trong đi sng ca t
bƠo. Khi cơy tng trng, hình thành nên nhiu t bào mi thì cn phi có thêm
nucleo-protit và cây phi hút thêm c đm ln lân. Nu trong đt có lân mà không
có đm cơy cng không phát trin đc.
Nhiu hp cht phc tp khác nhau tham gia vào quá trình hô hp và quang hp
ca cơy đu cha lân. Trong rt nhiu quá trình sinh hóa xy ra trong cây luôn có s
tham gia ca lân.
Vi sinh vt s bin đi lân thành dng mui ca acid phosphoric. Di dng này
mt phn đc cây s dng, mt phn đc c đnh di dng khó tan nh
Ca
3
(PO
4
)
2
. Nhng dng khó tan nƠy trong môi trng có pH thích hp s chuyn
hóa và bin thành dng d tan. Trong quá trình này vi sinh vt gi vai trò quan trng
(Bch Lan Phng, 2011).
1.3.2 Vi sinh vt hòa tan lân hu c
Vi sinh vt hòa tan lân hu c ch yu gm Bacillus và Pseudomonas. áng chú

ý là B. megaterium var phosphatsum có kh nng hòa tan lơn hu c cao, đng thi
B. megaterium còn có kh nng hình thƠnh bƠo t nên sc sng rt mnh.
Phân gii xác đng vt, thc vt acid nucleic, nucleotid, phospholipid, sn phm
phân gii cui cùng là H
3
PO
4
. Quá trình phân gii cn s tham gia ca nhiu nhóm
vi sinh vt thuc các ging Bacillus và Pseudomonas (Bch Lan Phng, 2011).
Quá trình có th biu din tng quát theo s đ sau:
Nucleoprotein  nuclein  acid nucleic  nucleotide  H
3
PO
4
.
Leucithin  Glycero phosphat  H
3
PO
4
.
1.3.3 Vi sinh vt hòa tan lân vô c
Nhiu vi khun nh Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,
Pseudomonas fluorescens, có kh nng phơn gii Ca
3
(PO
4
)
2
và bt apatit. C ch
quá trình phân gii Ca

3
(PO
4
)
2
có liên quan mt thit đn s sn sinh acid trong quá
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 9

trình sng ca vi sinh vt. Tác dng vi mt trong bn loi acid: H
3
PO
4
, H
2
CO
3
,
HNO
3
, H
2
SO
4
, trong đó H
2
CO
3
rt quan trng. Chính H

2
CO
3
đã lƠm cho Ca
3
(PO
4
)
2

phân gii (Bch Lan Phng, 2011). Quá trình phân gii nh sau :
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4H
2
CO
3
+ H
2
O  Ca(HPO
4
)
2
.H
2
O + Ca(HCO

3
)
2
1.4 VI KHUN SINH IAA
IAA là mt hormon quan trng đc sn xut bi mt s PGPR, có rt nhiu
nghiên cu đã chng minh rng khi cây trng đc x lý vi IAA do PGPR sn
xut s gia tng s phát trin. Vic  vi khun Bacillus RC23, Paenibacillus
polymyxa RC05, B. subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans
RC41, B. megaterium RC01, B. simplex RC19 vi trƠ đã lƠm gia tng t l r so vi
đi chng do vi khun có kh nng sinh IAA (Maheshwari K, 2011). Mt nghiên
cu khác cho thy Azospirillum không ch có kh nng c đnh đm mà còn có kh
nng sn xut IAA. Các chng Azospirillum đc nghiên cu cho thy rng sn
phm IAA ph thuc vƠo môi trng nuôi cy và tin cht tryptophan.
Cytokinins là mt nhóm hormon hin din vi lng rt nh trong sinh vt và
thng gơy khó khn cho vic phát hin vƠ đnh lng. Cytokinins đc sn xut
bi mt s vi khun nh Azospirillum và Pseudomonas spp. Ngoài ra, mt vài vi
khun PGPR đc báo cáo là có kh nng sn sinh cytokinins nh Rhizobium
leguminosarum, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens (Maheshwari
K, 2011).
Trong mt vài nghiên cu, các PGPR nh R. phaseoli, A. lipoferum,
Azotospirillum brasilense, Acetobacter diazotropicus, Herbospirillum seropedicae,
Bacillus licheniformis, B. pumilus, Bacillus cereus MJ-1, Bacillus macroides CJ-29
đã đc báo cáo là có kh nng sn xut GAs, nhng điu nƠy cha đc chng
minh mt cách rõ ràng. Tuy nhiên, trong nhng nghiên cu gn đơy, Gutierrez-
Manero và cng s (2001) đã cung cp chng c v bn loi GAs đc sn xut bi
Bacillus pumilus và Bacillus licheniformis

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 10

Acid indoleacetic (IAA) Tryptophan (Trp)
Hình 1.1 Cu trúc phân t ca IAA và tryptophan ()
1.5 BNH KHÔ VN TRÊN LÚA DO NM BNH Rhizoctonia
sp. GÂY RA
1.5.1 Triu chng
Bnh khô vn gơy hi ch yu  mt s b phn ca cơy nh b lá, phin lá vƠ c
bông. Các b lá sát mt nc hoc b lá giƠ  di gc thng lƠ ni phát sinh bnh
đu tiên.
Vt bnh  b lá lúc đu lƠ vt đm hình bu dc mƠu lc ti hoc xám nht, sau
lan rng ra thƠnh dng vt vn da h, dng đám mơy. Khi bnh nng, c b vƠ phn
lá phía trên b cht li.
Vt bnh  lá tng t nh  b lá, thng vt bnh lan rng ra rt nhanh chim
ht c b rng phin lá to ra tng mng vơn mơy hoc dng vt vn da h. Các lá
giƠ  di hoc lá sát mt nc lƠ ni bnh phát sinh trc sau đó lan lên các lá 
trên.
Vt bnh  c bông thng lƠ vt kéo dƠi bao quanh c bông, hai đu vt bnh có
mƠu xám loang ra, phn gia vt bnh mƠu lc sm co tóp li.
Trên vt bnh  các v trí gơy hi đu xut hin hch nm mƠu nơu, hình tròn dt
hoc hình bu dc nm ri rác hoc thƠnh tng đám nh trên vt bnh. Hch nm
rt d dƠng ri ra khi vt bnh vƠ ni trên mt nc rung (V Triu Mân, 2007).
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 11

1.5.2 c đim phát sinh phát trin
Bnh khô vn phát sinh mnh trong điu kin nhit đ cao vƠ đ m cao. Nhit
đ khong 24-32
o
C vƠ m đ bão hoƠ hoc lng ma cao thì bnh phát sinh phát

trin mnh, tc đ lơy lan nhanh. Bnh thng phát sinh trc tiên  các b vƠ lá
giƠ sát mt nc hoc  di gc. Tc đ lơy lan lên các lá phía trên ph thuc rt
nhiu vƠ thi tit ma nhiu, lng nc trên đng rung quá cao, đc bit  các
rung nhiu nc, cy quá dƠy.
S phát trin ca bnh khô vn  thi k đu t cơy m đn đ nhánh có mc đ
bnh ít. Giai đon đòng tr đn chín sáp lƠ thi k nhim bnh nng.  min Bc
nc ta bnh khô vn gơy hi trong v mùa ln hn  v đông xuơn.
S phát sinh phát trin ca bnh có liên quan nhiu ti ch đ nc trên đng
rung vƠ ch đ phơn bón. Bón phơn đm nhiu, bón đm mun thúc đòng bnh s
phát sinh phát trin mnh hn. Bón nhiu ln cng lƠm cho mc đ b bnh cao.
Bón Kali có tác dng lƠ gim mc đ nhim bnh ca cơy.
Ngun bnh ch yu lƠ hch nm tn ti  trên đt rung vƠ si nm  gc r vƠ
lá b bnh còn sót li sau thu hoch. Hch nm có th sng mt thi gian dƠi sau thu
hoch lúa thm chí trong điu kin ngp nc ngn hn vn có ti 30 % s hch gi
đc sc sng, ny mm thƠnh si vƠ xơm nhim gơy bnh cho v sau. Quá trình
xơm nhim lp li thng xy ra qua tip xúc gia hch vƠ b lá úa (V Triu Mân,
2007).
Ch s ca đt gơy bnh ln đu có liên quan mt thit vi s lng hch tip
xúc vi cơy, nhng s phát trin ca bnh sau khi tip xúc vi kỦ ch li chu nh
hng ln ca nhit đ, m đ vƠ tính mn cm ca cơy kỦ ch.
Phn ng ca các ging đu nm trong phm vi t nhim nm đn tng đi
chng chu. Cha có ging lúa nƠo th hin đc tính chng bnh cao. Ging lúa
Indica chng chu bnh tt hn ging lúa Japonica.  nc ta, hu ht các ging lúa
đa phng vƠ ging nhp ni đu có mc đ nhim bnh khô vn t trung bình đn
nhim nm. Mt s ít các ging nh KV10, IR9965, IR50, IR17494, OM80, có
mc đ nhim bnh nh hn so vi các ging khác, lúa thun, lúa lai, (V Triu
Mân, 2007).
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 12

1.6 VI KHUN Bacillus
Theo Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Gibson T. và cs., 1975),
Bacillus phân loi nh sau:
Gii: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lp: Bacilli
B: Bacillales
H: Bacillaceae
Chi: Bacillus

Hình 1.2 Hình thái Bacillus ()
Bacillus hu ht lƠ các vi khun hình que, Gram dng, hiu khí, to ni bƠo t,
các t bƠo tn ti riêng l hay dính nhau thƠnh chui ngn. Ni bƠo t đc mô t
đu tiên bi Cohn khi nghiên cu v B. subtilis vƠ sau đó lƠ Koch trong các nghiên
cu v các loƠi gơy bnh nh B. anthracis vƠo nm 1976. S to thƠnh ni bƠo t
sau đó đc chp nhn nh lƠ mt đc tính cn bn đ phơn loi vƠ xác đnh các
thƠnh viên ca chi (Gibson và cs., 1975).
Tuy nhiên, cng có mt s loƠi Bacillus không to bƠo t nh B.
thermoamylovorans, B. halodenitrificans, mt s khác có Gram ơm hay Gram
dng yu nh B. thermosphaericus, B. horti, B. oleronius, B. azotoformans. Thêm
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 13

vƠo đó, khi phơn loi da vƠo gii trình t ADN - ARN, dng vi khun không to
bƠo t, k khí bt buc cng thuc nhóm Bacillus nh B. infernus.
T bƠo sinh dng Bacillus thng, có đu tròn hay vuông, kích thc t 0,5-
1,2x2,5-10 m,  dng đn l hay chui ngn hoc dƠi. i vi Bacillus có ni bƠo
t thì bƠo t hình tr, oval, tròn, thnh thong có hình bu dc. Tùy theo loƠi, bƠo t

có th nm  gia, gn cui hoc  cui, vƠ túi bƠo t phng hoc không phng.
Tr B. anthracis và B. mycoides, hu ht các loƠi Bacillus đu di đng, mc dù có
s khác bit rt ln v kh nng di đng trong mi loƠi. a s các loài có catalase
dng tính (Nguyn c Qunh Nh vƠ cs, 2009; Nguyn Vn Thanh và cs.,
2009).
Phn ln các chi Bacillus phát trin tt trên các môi trng dinh dng thng
mi gm các thƠnh phn c bn nh: pepton, cao tht, glucose, lactose, cht
khoáng,…, mc dù trong mt s trng hp đc bit, các môi trng nƠy cn đc
điu chnh pH hoc nng đ mui (pH t 2 ậ 11, vƠ nng đ mui t di 2 ậ 25
%). Trong phòng thí nghim, di điu kin phát trin ti u, thi gian th h ca
Bacillus khong 25 phút. Trong môi trng nuôi cy lng chúng to váng trên b
mt. Trên môi trng thch to khun lc to, tròn hay hình dng bt thng, có mƠu
xám ng vƠng nht, b mt khóm sn sùi, hi nhn hoc to mƠng mn lan trên b
mt thch (Gibson và cs., 1975).
Hình dng khun lc thay đi tùy theo đ tui, vƠ các đa nuôi cy riêng l có th
to ra các dng khun lc khác nhau. B. larvae và B. popilliae trong môi trng
nuôi cy cn có thêm thiamine. Chúng thng phát trin trên môi trng J cha
trypton, glucose, dch chit nm men. B. pasteuri cn b sung 0,5 ậ 1 % urea vƠo tt
c môi trng nuôi cy. B. stearothermophilus phát trin trên môi trng dinh
dng có b sung calci vƠ st (Gibson và cs., 1975).
Phn ln các chng Bacillus a nhit trung tính. Các loƠi a nhit nh B.
stearothermophilus phát trin t 55 đn 70
o
C, thng lƠ khong 60
o
C. Các loài này
a nhit bt buc vƠ không th phát trin  37
o
C. LoƠi a nhit trung bình nh B.
coagulans phát trin tt ti 45 ậ 50

o
C. LoƠi gơy bnh cho côn trùng nh B. larvae
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 14

và B. popilliae phát trin  nhit đ t 25-30
o
C. Tng t nh vy đi vi B.
thuringiensis và B. cereus (Gibson và cs., 1975).
1.7 VI KHUN Azotobacter
Vi khun Azotobacter đc phân lp ln đu tiên nm 1901 (M.W.Beijerrinck,
1901). ó lƠ loƠi Azotobacter chroococum. V sau ngi ta tìm thy nhiu loài khác
trong chi Azotobacter.
Vi khun thuc chi Azotobacter có t bào t hình cu đn hình que. Khi còn non
t bƠo thng có hình que vi kích thc khong 2,0-7,0 x 1,0-2,5 µm. ôi khi
chiu dƠi đt đn 10-12 µm. Di đng nh tiên mao mc quanh khp c th.
Trên môi trng không cha nit khun lc ca Azotobacter có dng nhy, li,
đôi khi nhn nheo. Khi nuôi cy lơu trên môi trng đc, khun lc có màu vàng
lc, màu hng hoc mƠu nơu đen (tùy loƠi Azotobacter) (Nguyn Lân Dng và cs.).
Quan sát kính hin vi khi t bào già, nhn thy Azotobacter đc bao bc bi
mt lp v nhy khá dày. V nhy cha khong 75 % là cht hidrit ca axit uronic
và ch cha khong 0,023 % nit.Theo khoá phân loi Bergey’s, Azotobacter ch
yu có 6 loài (Breed Robert và cs.):
- Azotobacter chroocuccum: khi còn non có kh nng di đng, không sinh sc
t.
- Azotobactera beijerincki: không di đng, không sinh sc t.
- Azotobacter paspali: khi còn non có kh nng di đng, khi giƠ có sc t mƠu
vƠng ti mƠu xanh lc, sinh sc t phát hunh quang.
- Azotobacter nigricans: không di đng, khi giƠ có sc t mƠu nơu đen, cho ti

mƠu tím đ.
- Azotobacter vinelandi: có kh nng di đng, sc t mƠu vƠng lc đn hunh
quang, khuych tán vƠo môi trng.
- Azotobacter armeniacus: có kh nng di đng, sc t mƠu nơu đen cho ti
mƠu tím đ.
Azotobacter thuc loi vi khun hiu khí nhng có th phát trin đc trong các
điu kin vi hiu khí. Nhit đ thích hp khong 26-30
o
C, pH thích hp nht đi
vi Azotobacter là 7,2 - 8,2.
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 15

Azotobacter thuc loi vi khun có kh nng chu đc nhng nng đ mui khá
cao, có th phát trin đc ngay c trong nhng môi trng cha 2,5-3 % NaCl.
Vi khun Azotobacter có kh nng t túc v các cht sinh trng khác nhau:
tiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), xianocobalamin (vitamin B12), acid
pantotenic, acid folic, biotin, gibberellins.
Mt s nghiên cu còn xác đnh rng Azotobacter có kh nng tng hp ra mt
s cht kháng nm, kh nng nƠy không ging nhau  các chng Azotobacter. Mt
s chng Azotobacter chroococcum có kh nng sinh ra mt s cht kháng nm có
ph tác dng khá rng c ch Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria,…
S phát trin và c đnh nit ca Azotobacter trong đt chu nh hng mt thit
ca khu h vi sinh vt đt. Bên cnh nhng nhóm vi sinh vt có nh hng tt đi
vi s phát trin ca Azotobacter (tng hp các cht hot đng sinh hc, phân gii
các cht hu c bn vng) còn có nhiu nhóm vi sinh vt có kh nng c ch s
phát trin ca Azotobacter (cnh tranh thc n, sn xut cht kháng sinh,…)
(Nguyn Lơn Dng và cs.).

Hình 1.3 Hình thái Azotobacter trênămôiătrngăvôăđm và t bào vi khun
Azotobacter ()



BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 16







PHNă2:
VT LIUăVẨăPHNGă
PHÁP NGHIÊN CU