Xác định môi trường cảm ứng tạo phôi thích hợp và cải thiện khả năng tạo dòng đơn bội kép bằng Colchicine trong nuôi cấy bao phấn bắp

TRNG I HC M THÀNH PH H CHÍ MINH


BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP


Tên đ tài:
XÁC NH
MÔI TRNG CM NG TO PHÔI THÍCH HP
VÀ CI THIN KH NNG
TO DÒNG N BI KÉP BNG COLCHICINE
TRONG NUÔI CY BAO PHN BP


Khoa: Công ngh sinh hc
Chuyên ngành: Nông nghip
CBHD 1: TS. Lê Th Kính
CBHD 2: CN. Phm Ngc Hi
SVTH: Nguyn Th Thu
MSSV: 1053010750
Khóa: 2010


Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014

i

LI CM N
 mt sinh viên có đc chng đng hc tp trên ging đng đi hc nói
chung và khong thi gian thc tp và làm khóa lun tt nghip nói riêng thành công,

không th không k đn s quan tơm giúp đ và ch dy tn tình ca quý thy cô, cha
m và bn bè.
Em xin gi li cm n sơu sc đn quý thy cô khoa Công ngh sinh hc trng
i hc M Thành ph H Chí Minh luôn ht lòng truyn đt nhng kin thc và kinh
nghim quý báu trong sut thi gian chúng em hc tp ti trng. Nhng điu hc tp
t quý thy cô s là hành trang vng chc cho chúng em khi bc qua cánh ca đi
hc.
Em xin chân thành cm n cô Lê Th Kính đƣ hng dn chúng em trong sut
quá trình thc hin đ tƠi cng nh dy bo chúng em qua các bui hc trên lp. Cm
n ban Giám đc Trung tâm nghiên cu Ging cây trng Min Nam đƣ to điu kin
thun li cho chúng em có c hi thc tp trong môi trng làm vic chuyên nghip
và thân thin.
Em cm n anh Phm Ngc Hi, anh Nguyn Duy Khánh cùng các anh ch t
nuôi cy mô cng nh trong phòng công ngh sinh hc luôn quan tơm giúp đ và ch
dy cho chúng em tn tình.
Cui cùng, con xin t lòng bit n chơn thƠnh đn công lao dng dc và sinh
thành ca cha m.
Sinh viên
Nguyn Th Thu



ii

DANH MC BNG
Trang
Bng 2.1: Các hóa cht đc s dng trong đ tài 17
Bng 2.2: Các nghim thc thí nghim 1 19
Bng 2.3: Các nghim thc thí nghim 2 20
Bng 2.4: Các nghim thc thí nghim 3 21

Bng 3.1: T l phôi to thành t bao phn bp trên ba môi trng MS, N6, YP 29
Bng 3.2: nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi
ca bao phn bp NK67 34
Bng 3.3: nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose lên s to phôi
ca bao phn bp HN88 35
Bng 3.4: nh hng ca colchicine lên kh nng cm ng to phôi ca bao phn bp
NK67  ngƠy th 30 sau nuôi cy 39
Bng 3.5: nh hng ca colchine lên kh nng tái sinh cơy trong nuôi cy bao
phn bp 41


iii

DANH MC HÌNH
Trang
Hình 1.1: S phát trin in vitro ca ht phn bp 7
Hình 1.2: Cu to ca c bp và bông bp 11
Hình 3.1: Bp ngun HN88 vƠ NK67 đc trng vƠ chm sóc trong nhƠ li
sau 30 ngày gieo ht 24
Hình 3.2: Mt s giai đon phát trin in vivo ca ht phn bp
 đ phóng đi 40X 25
Hình 3.3: S tng quan gia các giai đon phát trin ca ht phn
vi hình thái c bp, bông bp và bao phn 26

Hình 3.4: Nuôi cy bao phn bp NK67 trên môi trng
cm ng to phôi N6 27
Hình 3.5: Cu trúc phôi hình thành t nuôi cy bao phn bp HN88 trên môi
trng YP sau 34 ngày nuôi cy 28
Hình 3.6: Phôi phát sinh t bao phn bp NK67 trên môi trng YP
sau 34 ngày nuôi cy 32

Hình 3.7: Bao phn bp NK67 hóa nâu trên môi trng N6
sau 34 ngày nuôi cy 33
Hình 3.8: Phôi phát sinh t bao phn bp HN88  nghim thc S12M0
sau 34 ngày nuôi cy 38
Hình 3.9: Cây bp NK67 trên môi trng tái sinh sau 10 ngày nuôi cy 42
Hình 3.10: Cơy bp in vitro t nuôi cy bao phn bp NK67 sau 55 ngƠy
chuyn ra nhƠ li 45


iv

DANH MC BIU 
Biu đ 3.1: nh hng ca cochicine đn kh nng to dòng đn bi kép trong
nuôi cy bao phn bp 43



v

DANH MC NHNG T VIT TT
2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
CTCP: Công ty c phn
MS: Murashige and Skoog, 1962
PTN: Phòng thí nghim
N6: Chu, 1975
TIBA: 2,3,5-Triiodobenzoic acid
YP: Ku và cs, 1981
w/v: Phn trm khi lng/ th tích

vi

MC LC

T VN  1
Phn 1: TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1.Tng quan v cây bp 3
1.1.1. Phân loi 3
1.1.2. Ngun gc và phân b 3
1.1.3. Tình hình sn xut bp trên th gii và Vit Nam 3
1.1.4. Vai trò ca bp trong nn kinh t 4
1.1.5. Ging bp lai đn F1 NK67 vƠ HN88 5
1.2. Tng quan v nuôi cy bao phn bp 6
1.2.1. Các giai đon phát trin in vivo ca ht phn bp 6
1.2.2. S phát trin ca ht phn bp trong điu kin in vitro 7
1.2.3. Các nghiên cu v nuôi cy bao phn trong vƠ ngoƠi nc 8
1.2.4. Các nhân t nh hng đn nuôi cy bao phn bp 9
1.2.5. Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp
bng colchicine 14
Phn 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 17
2.1. Vt liu 17
2.1.1. a đim và thi gian thí nghim 17
2.1.2. Vt liu 17
2.2. Phng pháp nghiên cu 18
2.2.1. Xác đnh giai đon phát trin ca ht phn bp in vivo 18

vii

2.2.2. Thí nghim 1: Xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp cho
nuôi cy bao phn bp 18

2.2.3. Thí nghim 2: Nghiên cu nh hng ca myo-inositol và nng đ
sucrose lên s to phôi ca bao phn bp 20
2.2.4. Thí nghim 3: Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy
bao phn bp bng colchicine 21
Phn 3: KT QU VÀ THO LUN 24
3.1. Xác đnh giai đon phát trin ca ht phn bp in vivo 24
3.2. Thí nghim 1: Xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp cho
nuôi cy bao phn bp 28
3.3. Thí nghim 2: Nghiên cu nh hng ca myo-inositol và nng đ sucrose
lên s to phôi ca bao phn bp 33
3.4. Thí nghim 3: Ci thin kh nng to dòng đn bi kép trong nuôi cy
bao phn bp bng colchicine 38
3.4.1. nh hng ca colchicine lên kh nng cm ng to phôi ca
bao phn bp 39
3.4.2. nh hng ca colchicine lên kh nng tái sinh cơy trong nuôi cy
bao phn bp 41
3.4.3. nh hng ca cochicine đn kh nng to dòng đn bi kép trong
nuôi cy bao phn bp 43
Phn 4: KT LUN VÀ KIN NGH 48
TÀI LIU THAM KHO 49



1

T VN 
Các ging bp lai F1 hin đang chim gi th trng bp ging trên toƠn th gii
bi u th vt tri v nng sut vƠ cht lng ca chúng so vi các ging th phn t
do (OP: open pollinated).  to ra mt ging bp lai F1 có kh nng cnh tranh tt
trên th trng, vic chn to các dòng cha m thun chng u vit là yu t tiên

quyt. Phng pháp truyn thng thng đc s dng lƠ rút dòng t qun th phơn ly
(F2, F3). T mt qun th lai F2 phi tri qua 6 ậ 8 v t th (khong 4 nm) mi to
ra dòng có đ thun đ tiêu chun dùng cho lai to. Tuy nhiên vi s phát trin ca
công ngh sinh hc hin đi, bng phng pháp nuôi cy các t bƠo đn bi (giao t),
đc bit lƠ giao t đc, ngi ta có th to ra dòng thun ch trong vòng vƠi tháng. T
đó tit kim ngun lc vƠ rút ngn thi gian cn thit đ to ging mi.
Nuôi cy bao phn lƠ k thut nuôi cy in vitro các bao phn cha ht phn cha
thƠnh thc trên môi trng dinh dng thích hp đ to ra cơy đn bi (haploid) và
đn bi kép. Môi trng cm ng to phôi nh hng ln đn t l cơy tái sinh t bao
phn bp. Tuy nhiên, kh nng cm ng vƠ tái sinh ca bao phn in vitro còn thp vƠ
ph thuc nhiu vƠo kiu gen. Vì vy đ xác đnh môi trng ti u cho mi kiu gen
cn phi qua thc nghim. Mt s môi trng cm ng thng đc s dng trong các
nghiên cu trc đơy nh MS (Murashige and Skoog, 1962), N6 (Chu, 1975), YP
(Genovesi and Collins, 1982), Nitsch (Nitsch, 1969). Trong đó N6 vƠ YP đƣ đc
chng minh lƠ tt trong nuôi cy bao phn bp khi so sánh vi mt s môi trng cm
ng to phôi khác (Armstrong và cs, 1985; Mohammadi và cs, 2007).
Trong nuôi cy bao phn bp, cây tái sinh phn ln có b nhim sc th đn bi.
Trong quá trình nuôi cy, phôi phát sinh t bao phn có th t đa bi hóa mt cách
ngu nhiên đ to thƠnh cơy đn bi kép (DH: double haploid). Cơy đn bi kép tái
sinh t nuôi cy bao phn có s đng nht v kiu gen vƠ có kh nng sinh sn bình
thng, vì vy nuôi cy bao phn đc coi nh phng pháp rút dòng thun hu hiu.
Theo nhiu nghiên cu trc đơy, t l cây t đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp
dao đng t 4,5% đn 22%, trung bình lƠ 10% (Buter, 1997). Trong khi đó, t l này là
50%  lúa mch (Lyne và cs, 1986) vƠ lúa nc (Rania, 1989). Nn nông nghip hin

2

đi đang phát trin vi nhu cu v ging ngƠy cƠng cao c v s lng vƠ cht lng,
do đó rút ngn thi gian chn to nhng ging mi u tú lƠ rt cn thit. S t đn bi
kép trong nuôi cy bao phn bp xy ra theo kiu ngu nhiên vi tn s thp, vì vy

tìm ra phng pháp kích thích t đa bi trong nuôi cy bao phn bp nhm tng s
lng vƠ rút ngn thi gian to dòng thun lƠ mt đóng góp tích cc cho công tác lai
vƠ chn to ging bp mi.
Có nhiu phng pháp gơy đt bin đa bi trên thc vt nh chn thng c gii,
sc nhit, dùng tia rnghen nhng phng pháp hóa hc lƠ đn gin vƠ nhanh nht.
Cochicine là tác nhơn gơy đa bi đc s dng ph bin nht trong phng pháp to
cơy đa bi cùng ngun.
Do đó, đ tƠi “ng cm ng to phôi thích hp và ci thin kh
i kép bng colchicine trong nuôi cy bao phn bp” đc thc
hin nhm mc đích xác đnh môi trng cm ng to phôi thích hp trong nuôi cy
bao phn bp, đng thi to ra cơy đn bi kép vi t l cao. T đó có th sn xut
nhiu dòng bp thun trong thi gian ngn vi chi phí hóa cht vƠ công lao đng thp,
đng thi tit kim nguyên liu nuôi cy.



3

Phn 1: TNG QUAN TÀI LIU
1.1. Tng quan v cây bp
1.1.1. Phân loi
Gii: Plantae
B: Poales
H: Poaceae
Chi: Zea
Loài: Zea mays L.
1.1.2. Ngun gc và phân b
Cây bp đc thun dng trc tip t c ngô (Zea mays ssp. parviglumis) có
ngun gc  min Trung Mexico, sau đó đc trng rng khp châu M. Mƣi đn th
k XV, khi Columbus phát hin ra châu M, bp mi đc nhp vào châu Âu. Sau khi

xâm nhp vào châu Á, bp đƣ phát trin và ta rng vi tc đ nhanh. Cây bp đc
du nhp vào Vit Nam khong 300 nm trc vƠ lƠ cơy lng thc quan trng đng
th hai sau lúa (ng Hng Dt, 2004).
1.1.3. Tình hình sn xut bp trên trên th gii và Vit Nam
1.1.3.1. Tình hình sn xut bp trên th gii
Cùng vi lúa nc và lúa m, bp lƠ cơy lng thc quan trng đi vi các nc
trên th gii. Bp đng th 3 v din tích, đng th hai v sn lng vƠ đng th nht
v nng sut. Nm 1985, din tích trng bp trên toàn th gii là 126,706 triu ha và
nm 2005 lƠ 145,499 triu ha, nng sut bp trung bình là 4,9 tn/ha và cho tng sn
lng 712,87 triu tn, trong khi lúa m din tích là 215,9 triu ha, nng sut 2,9
tn/ha và sn lng 625,10 triu tn vƠ lúa nc tng ng 151,7 triu ha, 4,1 tn/ha
và sn lng 629,90 triu tn (Ngô Hu Tình, 2009).
M luôn lƠ cng quc s mt v bp. Nm 2006 có din tích 28,6 triu ha, nng
sut bình quân 9,36 tn/ha và tng sn lng là 267,6 triu tn, chim 39% sn lng
bp th gii.

4


Trung Quc lƠ nc có nn sn xut bp phát trin và có s tng trng rt
nhanh, hin lƠ nc có din tích và sn lng bp đng th hai th gii. Nm 2006
Trung Quc sn xut 27,1 triu ha bp vi nng sut bình quân là 5,4 tn/ha và tng
sn lng là 145,6 triu tn (FAOSTAT, 2007).
1.1.3.2. Tình hình sn xut bp  Vit Nam
Cây bp đc đa vƠo Vit Nam vào khong th k XVII, cách đơy khong 300
nm.  nc ta bp là cơy lng thc quan trng đng th 2 sau lúa, vi din tích
trng đang tng dn qua các nm, nm 2000 lƠ 700 ngƠn ha vƠ nm 2006 lƠ 1,032
triu ha.
Trc nm 1981 hu ht din tích trng bp đu đc gieo trng ging bp đa
phng nên nng sut rt thp, ch đt khong 1,47 ậ 1,56 tn/ha/v. Nng sut này

vào loi thp nht th gii, thp hn nng sut trung bình ca các nc đang phát trin
(2,4 tn/ha/v). Trong nhng nm va qua  nc ta đƣ có nhng chuyn bin quan
trng trong ngh trng bp. Nông dân đƣ chuyn dn t các ging đa phng sang các
ging bp th phn chn lc. T nm 1990 các ging bp lai đc đa vƠo trng và
tng nhanh qua các nm. Nm 1990 có 5 ha trng bp lai, đn nm 1991 tng lên 500
ha, nm 1993 lƠ 50 ngƠn ha vƠ nm 2000 lƠ 450 ngƠn ha (ng Hng Dt, 2004).
Cây bp đc trng  tt c các vùng và các tnh  Vit Nam, song do yu t đt
đai vƠ khí hu nên nng sut có s khác bit rõ rt. Mt s tnh có din tích trng bp
ln  nc ta nh: Sn La 82,4 ngƠn ha, Ngh An 67,1 ngƠn ha, ng Nai 56,8 ngàn
ha, HƠ Giang 43,3 ngƠn ha,… Mt s tnh có nng sut bp cao: An Giang 75,8 t/ha,
ng Tháp 65,5 t/ha, k Nông 58,9 t/ha,… (Ngô Hu Tình, 2009).
1.1.4. Vai trò ca bp trong nn kinh t
Ht bp có giá tr dinh dng cao, trong ht bp cha tng đi đy đ các cht
dinh dng cn thit cho ngi và gia súc. Vi t l tinh bt cao (65 ậ 83%), bp đc
dùng là nguyên liu quan trng trong công nghip ch bin bt.  nhiu nc, ngi
ta đƣ ch bin bp thành nhiu loi bánh ko, đ hp. Hin nay đƣ có hƠng trm mt
hàng khác nhau t ht bp trong ngƠnh lng thc, công ngh thc phm, công

5

nghip dc và công ngh ch bin. Hng nm trên th gii lng bp xut nhp
khu lên đn khong 70 triu tn. Các nc xut khu ch yu là M, Pháp,
Achentina, Mexico…
Tt c các nc trng bp nói chung đu n bp vi mc đ khác nhau. Toàn th
gii (giai đon 1995 ậ 1997) s dng 17% sn lng bp lƠm lng thc cho ngi,
trong đó các nc đang phát trin lƠ 30%, các nc phát trin khong 4%, các nc 
Trung M, Nam Á và châu Phi s dng bp lƠm lng thc chính.
Có th nói bp là cây thc n chn nuôi quan trng nht hin nay. Ngoài vic cung
cp cht tinh t ht, thơn cơy vƠ lá cng đc s dng làm thc n xanh vƠ  chua cho
gia súc, đc bit là bò sa. Theo thng kê ca CIMMYT, giai đon 1997 ậ 1999, th

gii dùng bp làm thc n chn nuôi lƠ 60% - khong 400 triu tn/nm. Các nc
phát trin có t l dùng bp làm thc n chn nuôi thng trên 70%. Mt s nc có t
l này rt cao nh M 76%, B Ơo Nha 91%, Malaysia 91%, (CIMMYT, 2001).
Hin nay, Vit Nam dùng bp làm thc n chn nuôi lƠ chính. Khong 70% cht
tinh trong thc n gia súc có ngun gc t bp. Ngoài ra, thân bp ti cng đc  đ
làm thc n cho gia súc (Cao c im, 1998). Nhu cu thc n chn nuôi  nc ta
là rt ln, cn khong 4 triu tn bp mi nm. Nhu cu bp s ngƠy cƠng gia tng vì
ngƠnh chn nuôi đang phát trin rt mnh, kt hp vi ngành thy sn cng tiêu th
mt lng bp rt ln làm thc n cho tôm, cá.
Ngoài ra, bt bp còn đc dùng đ nu cn, sn xut đng glucose làm môi
trng nuôi cy nm Pennicilin, Streptomicin, sn xut acid acetic. Lõi bp đc dùng
làm nguyên liu sn xut nhiu hp cht hóa hc nh aceton, nha hóa hc. Phôi bp
cha 17,2 ậ 56,8% lipid nên có th dùng đ ép du. Du bp đc s dng rng rãi
trong công nghip thc phm và công nghip dc (ng Hng Dt, 2004).
1.1.5. Ging b
Ging bp t NK67 và bp np NH88 là hai ging bp lai đn F1 đc trng ph
bin ti Vit Nam. Trong đó bp lai F1 NK67 có ngun gc t Syngenta, là ging bp
đá, trái to, dƠi, cùi nh, đc bit có kh nng chu hn khá và kháng bnh r st, đm lá.
Nng sut v hè thu khong 7 ậ 8 tn/ha (www.agpps.com.vn). Ging bp HN88 do

6

công ty c phn Ging cây trng Trung ng tuyn chn, là ging bp np ngn ngày,
nng sut cao, cht lng ngon, có v đm, thm đc trng. Sinh trng khe, chu
hn và chu rét tt, chng chu tt vi sâu bnh, bp to dài, kín lá bi. Nng sut bp
ti đt 18-20 tn/ha (www.vinaseed.com.vn). C hai ging bp đu có th trng
quanh nm, tuy nhiên gieo trng cn tránh bp tr c phun râu vào các tháng quá khô,
quá nóng, quá lnh đ đm bo nng sut.
1.2. Tng quan v nuôi cy bao phn bp
n phát trin in vivo ca ht phn bp

 mc đ in vivo, tip theo sau quá trình phân chia gim nhim ca t bào, các
ht phn đn bi đn nhơn đc gii phóng ra khi t t ri tri qua hai ln nguyên
phân đ thu đc mt ht phn ba nhân. Giai đon đn nhơn sm có đc đim kích
thc nhơn tng đi ln chim 1/3 đn 1/2 th tích t bƠo. n gia giai đon đn
nhân các ht phn có kích thc ln hn, nhơn nh hn vi s hình thành ca không
bào trung tâm ln, nhân b đy v phía đi din vi l ht phn (pollen pore). n cui
giai đon đn nhơn t bào ht phn có th tích tng lên vƠ tri qua ln phân bào nguyên
phân ln th nht. n đu giai đon hai nhân, các nhân ging nhau v kích thc
nhng ngay sau đó bt đu bit hoá, nhơn sinh dng có kích thc ln hn. Ti cui
giai đon hai nhơn, nhơn nƠy di trú đn phía đi din và nm gn l ht phn, nhân
sinh sn di trú v phía l ht phn ri tri qua s phân bào nguyên phân ln th hai đ
thu đc mt ht phn ba nhân (Pescitelli và Petolino, 1988).

7


(Ngun: Pescitelli và Petolino, 1988)
Hình 1.1: S phát trin in vivo ca ht phn bp
A. T t B. n nhơn sm C. n nhơn gia D. n nhơn mun: nhơn đi
din vi l ht phn (mi tên) E. Nguyên phân ln 1 F. Hai nhân sm G. Hai
nhân gia vi nhơn sinh dng ln (v) H-I. Hai nhân mun J. Nhân sinh dc (g)
di trú v l ht phn K. Ht phn ba nhân L. Ht phn bt thng (mi tên).
1.2.2. S phát trin ca ht phn bp u kin in vitro
Trong quá trình nuôi cy bao phn in vitro, ch mt t l nh các ht phn tri
qua quá trình phát trin th giao t in vivo bình thng. Trong nhng gi đu tiên ca
nuôi cy bao phn, các ht phn bt đu trng lên, sau đó mt phn ln ht phn bt
đu cht. Trong tun đu tiên, t l ht phn sng sót gim đi t 80 - 90% xung 10%
hoc thp hn. Trong s các ht phn sng sót, mt s ht bt đu tri qua quá trình
nguyên phân. Sau nhiu ln nguyên phân liên tip, các ht phn phát trin thành các
cu trúc đa bƠo mƠ vn nm trong v ht phn, nhng cu trúc nƠy đc gi là "nhng

ht phn phát sinh phôi thun tuý". Sau giai đon này các cu trúc t bƠo đa nhơn tng
trng v kích thc và tách khi v ht phn. Các cu trúc phát sinh phôi đc tách

8

ra hoƠn toƠn vƠ đc bao bc bi lp t bào ngoi vi. Cui cùng là các cu trúc tng
t phôi (embryo like structure) đa bƠo hình thƠnh (Pescitelli vƠ cs, 1988).
1.2.3. Các nghiên cu v nuôi cy bao phc
Nm 1921, Bergner phát hin ra cơy đn bi đu tiên trong t nhiên  cƠ đc
dc Datura stramonium L. vƠ đc báo cáo bi Blakeslee vƠ cs (1922). Ti thi đim
đó, vai trò quan trng ca th đn bi đi vi công tác lai to vƠ nghiên cu di truyn
thc vt đƣ nhanh chóng đc công nhn. S lng loƠi có kh nng t đn bi đc
phát hin ngƠy mt nhiu. n nm 2010, danh sách nhng loƠi thng xy ra s t
đn bi mi đc công b bi Dunwell. Tuy vy, cơy đn bi trong t nhiên xut hin
mt cách ngu nhiên vi tn sut rt thp không th đáp ng yêu cu nghiên cu vƠ
chn to ging.
Khong 40 nm sau khi cơy đn bi t nhiên đu tiên đc phát hin, hai nhà
khoa hc Guha vƠ Maheshwari (1964) đƣ chng minh có th nuôi cy bao phn cha
trng thƠnh trong điu kin in vitro nhm ngn cn s phát trin bình thng ca ht
phn, làm cho phôi to ra có b nhim sc th đn bi, t phôi này có th to ra cây
tái sinh đn bi. Phát hin nƠy đƣ to tin đ cho hàng lot nghiên cu sơu hn trong
tng lai. Lúa mch (Hordeum vulgare L.), ci du (Brassica napus L.), khoai tây
(Nicotiana spp.) vƠ lúa nc (Triticum aestivum L.) thng đc dùng đ nghiên cu
sâu v s to phôi t ht phn bi chúng có kh nng tái sinh cao (Forster vƠ cs,
2007).
Tuy nhiên, không phi giao t đc ca tt c các loi cây trng đu có kh nng
cm ng tt trên môi trng to phôi. Mt s loài quan trng v mt khoa hc và kinh
t nh nhng cây thuc h thp t, cây thân g hay mt s loài thuc h đu vn còn
gp nhiu khó khn trong vic phát sinh hình thái in vitro (Bajaj, 1990; Germanà,
2009).

Cùng vi các cơy lng thc khác, nuôi cy bao phn bp cng đƣ đc nhiu
nhà khoa hc quan tâm nghiên cu. Nm 1975, bao phn bp đc nuôi cy thành
công trên môi trng MS (Anonymuos, 1975). Sau đó bao phn bp đc nuôi cy
thành công trên nhiu môi trng khác nhau. Nhìn chung nuôi cy bao phn bp còn

9

gp nhiu khó khn vƠ hn ch trong vic ng dng vào thc tin. Mc dù vy, k
thut nuôi cy bao phn đ thu nhn các dòng bp đn bi kép đƣ đc ng dng
thành công  mt s nc.  Trung Quc, hn 100 dòng thun đƣ thu đc t 30 t
hp lai khác nhau, mt s ging đc áp dng trong chn to ging lai vƠ đƣ đc s
dng trong sn xut nh AC 4115, Elite DK 524… (Wu và cs, 1983).
Vic nghiên cu và ng dng k thut nuôi cy bao phn  bp cng đƣ thu hút
đc mi quan tâm ca các nhà khoa hc trong nc. Trên c s đó, vic nghiên cu
ti u hoá các điu kin nuôi cy là cn thit đi vi chng trình nghiên cu chn và
ci to ging, nghiên cu di truyn và k thut gen đi vi cây bp  Vit Nam trong
thi gian ti, phc v đc lc cho vic to ging bp mi, đc bit là bp lai.
VƠo nm 1998, trên c s các ging bp CM2, CM8, Vin Di truyn Nông
nghip đƣ hoƠn thin quy trình nuôi cy bao phn vi tn s tái sinh cao (30-80%). Vi
quy trình này, thi gian to dòng thun rút ngn t 5 - 8 th h ngoƠi đng rung
xung còn 8 tháng trong phòng thí nghim. Vin đƣ tip tc nghiên cu áp dng quy
trình nƠy đ sn xut các dòng thun cho sn xut. Các nghiên cu tp đoƠn ngô Vit
Nam đƣ ch ra rng: các ging bp Vit Nam nhìn chung có phn ng thp trong nuôi
cy bao phn, do đó cn phi ci tin quy trình và nâng cao phn ng ca các ging
ngô Vit Nam (Lê Huy Hàm, và cs, 1990, 1998).
1.2.4. Các nhân t n nuôi cy bao phn bp

Tn s phôi to thành trong nuôi cy bao phn bp ph thuc vào kiu gen ca
cây cho bao phn (Genovesi và cs, 1990). i vi nuôi cy bao phn bp, ch mt t l
nh kiu gen ca bao phn nuôi cy có kh nng cm ng to phôi (Miao và cs,

1978). Kh nng cm ng to phôi là khái nim ch t l phôi to thành t nuôi cy
bao phn ca mt kiu gen, mt kiu gen có kh nng cm ng to phôi cao khi t l
phôi to thành t nuôi cy bao phn ca kiu gen đó cao. Miao và cs (1978) báo cáo
rng ch có 9 trong tng s 159 (khong 5,6%) kiu gen bp trong nghiên cu có kh
nng cm ng. Trong khi đó, Petalino vƠ Jones (1986) ch quan sát đc hin tng

10

cm ng to phôi  12 trong s 39 kiu gen (30,8%) ly t United States Corn Belt,
trong đó bao phn ca nhng cây lai cho t l phn ng cao hn. NgoƠi ra, nhng kiu
gen d hp t thng cm ng tt hn nhng kiu gen đng hp t (Genovesi và
Collins, 1982).
1.2.4.2. Trng thái sinh lý ca cây cho bao phn
Trng thái sinh lý ca cây m nh hng đn kh nng cm ng to phôi trong
nuôi cy bao phn bp (Nitsch và cs, 1982). Bao phn trên nhng cây khe mnh có t
l cm ng to phôi cao hn hn bao phn trên nhng cây yu, ngay c  nhng kiu
gen đƣ đc cho là cm ng tt. Genovesi (1990) quan sát thy ch mt vài phôi hoc
mô so in vitro đc to thành t nhng cây m sinh trng yu, đơy lƠ mt nhân t
rt quan trng nh hng trc tip đn s cm ng to phôi trong nuôi cy bao phn.
Ông còn nhn mnh s quan trng ca yu t môi trng, bao gm nh hng ca
chu k chiu sáng, cng đ và cht lng ánh sáng, nhit đ và ch đ dinh dng
cho cây bp khe mnh. Das vƠ cs (2002) thu đc lng phôi cao gp đôi khi nuôi
cy bao phn ca cơy sinh trng trong điu kin nhiu ánh sáng khi so sánh vi cây
sinh trng trong môi trng râm mát. Mt khác, phôi t bao phn ca cây sinh
trng trong môi trng rơm mát cng phát trin chm và yu hn. Cơy m sinh
trng và phát trin trong điu kin nhit đ ban ngày t 25 ậ 30
o
C và nhit đ ban
đêm t 18 ậ 20
o

C, thi gian chiu sáng 16 ậ 18 gi là nhng điu kin thun li cho
s cm ng to phi ca bao phn bp (Buter, 1997).
Mùa v cng nh hng đn kh nng to phôi ca bao phn nuôi cy. Cây bp
sinh trng trong nhƠ li vƠo mùa đông thng không to phôi (Dieu và Beckert,
1986; Petalino và Thompson, 1987).
n ca ht phn và s phát trin ca bao phn nuôi cy
Có nhiu báo cáo cho rng la chn bao phn khi ht phn  giai đon đn nhơn
trc khi tin x lý lnh lƠm tng kh nng cm ng ca bao phn nuôi cy
(Nitsch
vƠ cs, 1982). Ku vƠ cs (1981) vƠ Brettel vƠ cs (1981) đu báo cáo rng bao phn s
cm ng tt nht khi ht phn  giai đon không bƠo vƠ giai đon đn nhân mun.

11

Trái ngc vi các nghiên cu k trên, Satorova (1994) li quan sát thy ht phn 
đu giai đon hai nhân cm ng to phôi tt nht. Das vƠ cs (2002) đƣ so sánh kh
nng cm ng ca ht phn  các giai đon đn nhơn sm, gia, mun và hai nhân
sm. Kt qu cho thy phôi thu đc nhiu nht  gia giai đon đn nhơn (8,54%),
tip theo lƠ giai đon đn nhơn mun (7,27%) và thp nht  giai đon đn nhơn sm
và hai nhân sm.
Theo Greyson và Dunlop (1986), nên thu c  giai đon cây bp 13 lá, và nuôi cy
khi ht phn  giai đon đn nhơn s cho t l to phôi ln nht. Ht phn  giai đon
đn nhơn khi c bp vn cha nhú ra khi thơn mƠ đc bao bi mt/mt vài phin lá
(Genovesi, 1990). Bao phn  trc chính bông cm ng tt hn bao phn  các nhánh
bông (Genovesi và Yingling, 1990).

(Ngun: Trn Vn D vƠ cs, 2011)
Hình 1.2: Cu to ca c bp và bông bp
1.2.4.4. Tin x lý và  c
X lý lnh c bp ngay sau khi thu đƣ đc chng minh là rt quan trng, bao

phn đc tin x lý lnh cm ng cao hn khi không đc x lý vì nhit đ thp
giúp ngn cn s phát trin ca giao t (Pace và cs, 1987). Tuy nhiên, Pescitelli và
Petolino (1988) chng minh rng ht phn vn tip tc quá trình phát trin ca chúng

12

trong thi gian x lý lnh. Ht phn  giai đon gia đn cui đn nhơn sau khi x lý
lnh 10 ậ 14 ngày  8
o
C s phát trin ti giai đon đn nhơn mun đn hai nhân gia.
ƣ có nhiu nghiên cu v nhit đ cng nh thi gian x lý lnh khác nhau.
Dieu vƠ Beckert (1986) thu đc kt qu nuôi cy tt nht khi tin x lý c bp 7
ngày  7°C và tip tc  7 ngày  14°C. Genovesi (1990) và Choi và cs (1995) x lý
 10°C và 9°C trong 14 ngày. Yuan và cs (2001) báo cáo rng x lý c  5°C t 15
đn 21 ngày cho hiu qu to thành phôi ln nht. Tip theo, gi bao phn  nhit đ
33°C giúp to ra phôi sm, nhiu và cht lng hn. Das vƠ cs (2002) thu đc t l
bao phn cm ng cao nht (8,54%)  8 - 10°C trong 14 ngày và   27 ± 2°C trong
14 ngày. T l cm ng thp nht khi    25 ± 2°C và 30°C.
1.2.4.5ng nuôi cy
Môi trng đu tiên nuôi cy thành công bao phn bp là MS (Murashige và
Skoog, 1962) cha 12 - 24% sucrose, kt qu thu đc 1% phôi đc to thành
(Anonymous, 1975). Môi trng N6 (Chu vƠ cs, 1975) đƣ đc s dng đ nuôi cy
thành công bao phn bp (Brettell, 1980). Bên cnh MS vƠ N6, môi trng YP (Ku
vƠ cs, 1978) cng đc s dng thành công trong nuôi cy bao phn bp (Genovesi
và Collins, 1982; Petalino và Jones, 1986).
Beaumont (1997) đƣ nghiên cu nh hng ca các ngun đng khác nhau lên
s cm ng ca bao phn bp. Kt qu cho thy phôi không đc to thành trên môi
trng có b sung manitol, starch, trihalose và maltotriose. Trên môi trng cha
sucrose, bao phn bp cm ng tt nht. Trc đó, Brettell (1980) đƣ s dng môi
trng N6 + 12% sucrose + 500 mg/l casein hydrolysate + 0,35 mg/l TIBA và to

đc nm cơy con in vitro hoàn chnh, vào thi đim đó kt qu nƠy đc coi là mt
thành công ln trong nuôi cy bao phn bp vƠ lƠ bc đm cho nhiu nghiên cu v
sau. Tng t, Sheridan và cs (1980) báo cáo rng t l cm ng đc ci thin trên 7
kiu gen khác nhau khi nuôi cy trên môi trng N6 cha 12% sucrose và 0,5% than
hot tính. Mt nghiên cu khác ca Kuo và cs (1988) cho rng môi trng N6 b
sung casein hydrolysate, 0,5% than hot tính và 15% sucrose là ti u nht cho nuôi

13

cy bao phn bp. Tuy nhiên, Tsay and Widholm (1986) đƣ chng minh s dng 9%
sucrose cho môi trng nuôi cy tt hn 3, 6, 12 vƠ 15%.
Ku và cs (1981) đƣ so sánh kh nng cm ng trên môi trng YP b sung 2 mg/l
2,4-D + 1mg/l kinetin + 2 mg/l BAP và YP b sung các nng đ TIBA khác nhau và
kt lun bao phn cm ng tt nht khi môi trng đc b sung 0,1 mg/l TIBA.
Theo nhóm tác gi, vic b sung 2,4-D là không cn thit trong nuôi cy bao phn
bp. Cn b sung cytokinin nng đ cao vƠo môi trng nuôi cy, tt nht nên s
dng TIBA và không b sung thêm bt k hormone sinh trng nƠo trong môi trng
nuôi cy. Tng t, Genovesi và Collins (1982) cng thu đc t l cm ng cao 
nhiu kiu gen nht khi s dng môi trng YP + 0,1 mg/l TIBA. Loi pyridoxine và
pantothenate khi môi trng nuôi cy không nhng không gây hi mà còn có th ci
thin t l bao phn cm ng.
Theo Zheng và cs (1983), bao phn bp không cm ng khi b sung auxin (2,4-
D) vƠo môi trng và cm ng không n đnh vi antiauxin (TIBA). T l to phôi
tng khi b sung TIBA vƠo môi trng YP nhng li không có hiu qu trên môi
trng N6. T l phôi tng khi gim nng đ auxin vƠ tng nng đ cytokinin trong
môi trng. Hongchang và cs (1991) báo cáo rng mô so to đc nhiu nht trên
môi trng YP b sung 2mg/l 2,4-D và 1,5 mg/l kinetin
Myo-inositol là mt trong nhng cht đc s dng nhiu nht trong nuôi cy mô
cùng vi thiamine (B1), acid nicotinic (PP) và pyridoxine (B6). Mc dù đơy lƠ mt
carbohydrate ch không phi là vitamin, nó cng đc chng minh kích thích cho s

tng trng ca t bƠo đa s loài thc vt. Ngi ta cho rng myo-inositol đc phân
tách ra thành acid ascorbic và peptine vƠ đc đng hóa thành phosphoinositide và
phosphatidylinositol có vai trò quan trng trong s phân chia t bào. Myo-inositol có
vai trò trong sinh tng hp thành t bào, c th là sinh tng hp acid polygalacturonic
và pectine.
Trong nuôi cy bao phn, myo-inositol thng đc b sung vƠo môi trng
nuôi cy  mt s loƠi nh lúa nc vi nng đ 100 mg/l (Niroula và cs, 2005), 100
mg/l  lúa mch (Asakaviciute và cs, 2008) và 50 mg/l  lúa m (Last vƠ cs, 1990)…

14

Trong nuôi cy bao phn bp, myo-inositol đc b sung vƠo môi trng tái sinh.
Tuy nhiên, nh hng ca myo-inositol đn s to phôi ca bao phn bp trên môi
trng cm ng to phôi vn cha đc nghiên cu và công b nhiu. Genovesi và
Collins (1982) đƣ báo cáo rng s dng myo-inositol 100 mg/l không có tác dng
kích thích s to phôi trong nuôi cy bao phn bp. Tuy nhiên nhng nng đ khác
vn cha đc th nghim.
ng tái sinh
Phôi đc to thành t bao phn bp s tái sinh thành cây hoàn chnh trên môi
trng tái sinh. Cht lng ca phôi là yu t đc quan tâm nhiu bi nó nh hng
đn s tái sinh cây trong nuôi cy bao phn bp (Dieu và Beckert, 1986). Nhng phôi
có r có t l tái sinh thp nht trong khi phôi dng cu tái sinh tt nht.
Phôi đc chuyn vào khong 20 ngày sau khi nuôi cy. Tuy nhiên có nhiu
trng hp phôi không tái sinh thƠnh cơy con bình thng. Có nhiu phôi to ra r
nhng không to chi, s khác li ra chi nhng không có r và mt s trng hp
bt thng khác. Môi trng tái sinh N6 b sung 2,4-D (2mg/l) và kinetin (1,5mg/l)
có th kim soát đc tình trng này (Hassan và cs, 2001).
Nitsch vƠ cs (1982) thu đc t l tái sinh ln nht trên môi trng YP b sung
0,1 mg/l TIBA. Barnabás (1999) đƣ s dng môi trng MS b sung 100 mg/l myo-
inositol +150 mg/l L-asparagine + 0,5 mg/l thiamine HCl + 1 mg/l kinetine + 0,05

mg/l NAA + 2 g/l sucrose + 7 g/l agar  pH 5,8. Kt qu thu đc 22,2% cây tái sinh
 kiu gen A21.
1.2.5. Ci thin kh i kép trong nuôi cy bao phn bp bng
colchicine
Nm 1972, Thompson to thành công cây ci du đn bi kép. K t đó, nhiu
nghiên cu trên các cơy khác đc thc hin, nh có s góp sc ca công ngh mà s
lng loài có th to ra cơy đn bi vƠ đn bi kép ngày càng nhiu. Cơy đn bi và
đn bi kép là công c đc lc phc v nhng nghiên cu v t bào hc, nghiên cu
v đt bin và di truyn vƠ đc bit là chn to ging cây trng. n nay, khong 300

15

ging cây trng mi thuc mt s h quan trng (đc bit là cây nông nghip ngn
ngƠy) đƣ đc to thành. Mt trong nhng phng pháp sn xut ging là s dng cây
đn bi kép nh lƠ mt phng pháp tách dòng phc v cho công tác lai to (Kasha
Kao, 1970).
S t đn bi kép trong nuôi cy bao phn đƣ đc báo cáo  mt s loài quan
trng nh lúa mch (Subrahmanyam and Kasha, 1975), thuc lá (Burk và cs, 1972),
lúa mì (Hu vƠ cs, 1978), lúa nc (Chen và Li, 1978), bp (Ku và cs, 1981), bp ci
(Charne và cs, 1988). T l cây t đn bi kép trong nuôi cy bao phn bp dao đng
t 4,5% đn 22%, trung bình là 10% (Buter, 1997). Trong khi đó, t l này là 50% 
lúa mch (Lyne vƠ cs, 1986) vƠ lúa nc (Raina, 1989).
Gn đơy, mt s nhà khoa hc đƣ nghiên cu v nhng nh hng ca colchicine
lên s to thƠnh cơy đn bi kép trong nuôi cy bao phn trên mt s loƠi ng cc: lúa
mì (Redha và cs, 1998; Zamani và cs, 2000), bp (Saisingtong và cs, 1996; Barnabás
vƠ cs, 1999), lúa nc (Chen vƠ cs, 2001). Colchicne đc dùng làm tác nhân gây
lng bi  t bào thc vt trong điu kin in situ và in vitro. Colchicine có kh nng
liên kt vi tubulin, mt protein cu to nên các si vi ng. Liên kt này cn tr s
hình thành các si vi ng khin nhim sc th không th di chuyn v hai cc t bào
dn đn b nhim sc th ca t bƠo đc gp đôi sau mi chu k nguyên phân.

Phng pháp x lý colchicine đc s dng ph bin nht là ngâm r cây vào dung
dch colchicine (Levan, 1938).  mt s loƠi, đnh sinh trng, chi nách, chi r
cng đc dùng đ x lý colchicine (Mathias và Robbelen, 1991). Nhng phng
pháp này cho kt qu khong 50% cây phn ng li tác đng ca colchicine, tuy
nhiên t l cây cht hoc bt thng v mc bi th cao (Wenzel và cs, 1977; Banabás
và cs, 1990).  bp, vic x lý colchicine trên cây con có th làm gp đôi b nhim
sc th  c hoc trái, nhng him khi  c hai. iu này gây tr ngi ln cho vic t
th đ to ra dòng thun (Wan vƠ cs, 1989). Nh vy, phn ln cây cht hoc phát
trin bt thng đc quan sát sau khi x lý colchicine  giai đon cây con, chng t
vic to th đn bi kép  giai đon cây tái sinh trong nuôi cy bao phn bp không
có hiu qu cao.

16

Kt qu nghiên cu ca Wan và cs (1989, 1995) cho thy: khi x lý colchicine vi
hai nng đ 0,025% và 0,05%  giai đon phôi và mô so, cây bp tái sinh t nuôi
cy bao phn  hai nng đ x lý không có s khác bit, t l đn bi kép khong
50% và n đnh v mt di truyn. Banabás và cs (1999), Payam và cs (2007) li báo
cáo rng s dng colchicine  giai đon đu nuôi cy cho t l cơy đn bi kép cao.
Nghiên cu ca Banabás và cs (1999) khi s dng hai nng đ colchicine là 0,02% và
0,03% x lý bao phn bp  giai đon đu nuôi cy cho thy nng đ 0,03% cho t l
cơy đn bi kép cao hn, tuy nhiên hƠm lng colchicine cao (0,03%, 0,04%) làm
tng t l cây bt thng (Mohammadi và cs, 2007). Trong mt s nghiên cu, x lý
colchicine kt hp sc nhit lnh trong 7 ngƠy lƠm tng t l cơy đn bi kép trong
nuôi cy bao phn bp (Saisingtong và cs, 1996; Antoine Michard và Beckert, 1997).


17

Phn 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIểN CU

2.1. Vt liu
2.1.m và thi gian thí nghim
a đim: PTN Nuôi cy mô, Trung tâm nghiên cu Ging cây trng Min Nam,
p Tân Hip, huyn Phú Giáo, tnh Bình Dng.
Thi gian: T tháng 11/2013 đn tháng 4/2014
2.1.2. Vt liu
- Ging
+ Ht ging bp t lai đn F1 NK67: Là sn phm do Công ty Syngenta nhp khu và
phân phi. ơy lƠ ging bp lai đc trng ph bin ti Vit Nam.
+ Ht ging bp np lai đn F1 HN88: Có xut x t Trung Quc đc Công ty
CTCP Ging cây trng Trung ng
nhp khu và phân phi.
- Hóa cht
Bng 2.1: Các hóa cht đc s dng trong đ tài
STT
Tên hóa cht
Xut x
1
Myo-inositol
Sigma
2
2,4-D, TIBA
Sigma
3
Hóa cht pha môi trng MS, N6, YP
Sigma
4

Phytagel, than hot tính,
Casein hydrolysate

Sigma
ng sucrose
CTCP ng Biên
Hòa
5
Colchicine
Hi Media
Laboratories,
n 
- Thit b, dng c: Kính hin vi, t lnh, máy ct nc, ni hp kh trùng, bình nuôi
cy, t cy, gng tay, khu trang…