Đánh giá mức độ Methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng Promoter gen APC trên các bệnh ung thư


Báo cáo KLTN-          Trang 1

T VN 
Theo thng kê ca T Chc Y T Th Gii (WHO), trên th gii có khong
14,1 tring hi và 8,2 tring hp t vong xy ra trong
i 12,7 tring hp mi mc bnh và 7,6 triu ng hp t
c tính cho th
tuc chc
  t cung là hai long gp và gây t
vong cao  ph n
[64]
.
Gen APC là gen c ch khm ti v trí 5q21-q22 trên nhim
sc th s 5 ca b i. Gen APC bao gm 15 exon nm trong mt locus
98-kilobase
[83]
. S methyl hóa xy ra ti co CpG xung quanh vùng promoter
gen APC, dn c ch s biu hin ca gen, là nguyên nhân dn t
[30]
.
S methyl hóa DNA là s bii phân t gn nhóm -CH
3
vào v trí Cytosin trong
o CpG ca trình t DNA. Nhiu báo cáo khoa hc trên th gii cho thy s
methyl hóa vùng promoter ca gen APC (Adenomatous polyposis coli gene) là du
chng sinh hc ting và ch
[37] [55]
[30]
.
Trên th gii, vic nghiên c tn s methyl hóa ca gen APC c

thc hin  nhiu lo  : i trc tràng
[29][51]
  i
[53][89]

[9][55][86][89]

[31]
 t cung
[21]
Tuy
nhiên, d liu v s methyl hóa vùng promoter gen APC i vi bnh 
Vic công b nhiu. Do vy, chúng tôi thc hi khóa
lun tt nghip: " ÁNH GIÁ MC  METHYL HÓA TI CÁC O CpG
THUC VÙNG PROMOTER GEN APC TRÊN CÁC BNH UNG TH" vi
mn tìm du chng sinh hc ting, ch
b t cung nói riêng. Ni dung
nghiên cu bao gm:
 Kho sát in silico

Báo cáo KLTN-          Trang 2

- Thu thp thông tin v m, cu trúc ca gen APC và m
s methyl hóa trên gen APC vi các bc bi và ung
 t cung.
- Thit k b mi c hiu cho phn ng MSP khui vùng gen cn kho
sát.
- Kho sát,  thông s vt lýc hiu ca b mi (Cp mi methyl
APC-MF, APC-MR và cp mi unmethyl APC-UF, APC-UR) trên trình t o
CpG thuc vùng promoter gen APC.

 Kho sát thc nghim
- Kh c hiu, nhi lai tp mi methyl và unmethyl.
- Thc hin quy trình phn    m methyl hóa vùng
promoter gen APC vi các mu sinh thit mô vú t nhng bnh nhân m
vú (kèm theo thông tin mu và các ch tiêu lâm sàng) và các mu mô vú lành tính,
c cung cp t bnh vii hc TP. H Chí Minh; mu máu hoc
dch pht t nh nhim HPV kiu uy
p, mu máu hoc dch pht t o lành tính (kèm theo các ch tiêu
lâm sàng) c công ty c phn công ngh Vit Á cung cp.

Báo cáo KLTN-          Trang 3








Phn I:
TNG QUAN

Báo cáo KLTN-          Trang 4

I.1. Ung th
I.1.1. nh ngha ung th
là  


 Quá trình dlà nguyên nhân

 (WHO)
[92]
.
 và  U
lành tính và   
. U ác tính 

 
[106]
.
I.1.2. Phân loi ung th
 c phân loi da theo tính cht gii phu bnh ho
quan b t Các t t khi u (bao gm c t 
u xut phát t mt t bào duy nht phân chia mà thành. t bnh
 c phân loi theo loi t bào khi phát và theo v trí ca t bào
     ng h      c khi u
nguyên phát
[97]
. t phát t t bào gng hin din  tinh
hoàn hoc bung trng
[100][102]
.
 u mô (carcinoma)
 ch mt khi u ác tính có ngun gc t t bào biu
mô và niêm mc bên trong hoc bên ngoài c ng tiêu hóa hay các
tuyu mô, chim 80-90% ca tt c ng h
u mô c các tuyn có kh t,
 tuyn vú sn xut sa, phi tit cht nhi tràng, tuyn tin lit hoc bàng
quang.
 Bnh lý huyt hc ác tính (hematological malignancy) nh bch cu


Báo cáo KLTN-          Trang 5

(leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xut phát t máu và t
Bnh bch cng liên n vic sn xut quá mc các t bào bch cu
ng thành, các t  các chn d
bng d b nhim trùng. Bnh bch cn các t
bào hng cu, có th t mi do thiu máu.
    ng phát trin trong h bch huyt (lá lách, amidan, và
tuyn c).
 t phát t mô liên kt,
n, và cht béo.
 U hc t do ri lon ca t bào sc t.
 U quái bt ngun t các t bào mm.
I.1.3. Bnh ung th vú
 vong ph bin nht trong các b
ph n. Bnh ung  n s phát trin bng ca các t bào có
ngun gc t các mô vú
[49]
 xy ra  ph n mà còn  c
nam gii, t l mc bnh  nam gii chim khong 1% ca tt c ng hp

[91]
.
 Các yu t nguy c dn đn ung th vú:
Các yu t i vi bi tính n i ln
tui. Yu t m: Tin s i tit t, li sng và ch 
ng thiu khoa hng sng b ô nhim
 Tui và gii tính
i tác. Hu hng hp ung

n tric tìm thy  ph n trên 50 tui. Ph n  ung
n so v
[68]
.
 Tin s gia đình
Nu mt vài thành viên c 
 cung, ung ng trng, hot kt ) bnh nhân có th có

[44]
. Mt s i có nht bin di truyn dn

Báo cáo KLTN-          Trang 6

n nhiu kh n ung  bin nhc tìm thy trong các
gen BRCA1, BRCA2 và mt s gen khác ít ph bip53, CHEK2, ATM, BRIP,
PALB2, PTEN, và STK11
[17]
.
 Ni tit t
i m  có th kích
thích phát trii tit t b n bu và kt
thúc ca chu k kinh nguyt, mang thai sm, liu pháp thay th hormon, s dng
thuc ung
[68]
.
 Li sng và ch đ n ung
 c vng, ch  ng nhiu cht béo  bnh nhân béo phì
và c bit là  ph n mãn kinh có th  d ung
có cn, hút thuu t 
[25][58]

.
 Yu t môi trng
Yu t ng có th  p xúc vi
hóa cht, tia bc x
[25][58]
.
I.1.4. Ung th c t cung:
 t cung là ng th hai trong s các long
gp  ph n trên toàn th gii và là nguyên nhân chính gây t 
ph n thuc n.
 Các yu t nguy c dn đn ung th c t cung:
Ht c ng hp  t n HPV
(Human Papiloma Virus), mt loc thù theo mô, d lây lan và
lây lan rng rãi. HPV là vi rút d lây nhing tình dc nht. Không có
thuu tr c hiu cho nhim HPV
[81]
.
HPV là mt t hp các chng vi rút khác nhau
[62]
. Trên th git t
100 chng HPV. Vi rút HPV c chia làm 2 nhóm: nhóm nhóm
p (v Các nhóm u ht các bnh
u môn - sinh dc, trong khi các nhóm p có th gây sùi
mào gà sinh dc, t bào c t cung bng, bng hô hp tái phát,

Báo cáo KLTN-          Trang 7

hoc ph bin nht là các viêm nhim không có triu chng và không phát hin

[80]

. Hu ht ng h t u phát
hin có nhip thì him khi
gp
[1]
.
Có ít nht 13 kiu gekiu gen 
liên quan ti khong 70% tt c các ng hp  t cung là HPV-16 và
HPV-18. Bên cHPV-45 và HPV- t
cung, chim khong 4% s ca mi kiu gen
[23][78]
.
Hu ht các viêm nhim  c t cung u t bin mt mà không  li triu
chm kéo dài vi các kiu gen HPV 
gây nên các tu mô c t cung. Trong s các ph n nhim các
long t 5-10% s chuyn thành viêm nhim HPV kéo
dài, dn t hin các t c t cung. Nu
u tr, các t tin tri
t cung xâm ln
[78][79]
.
I.1.5.Các phng pháp chn đoán ung th.
I.1.5.1. Các phng pháp chn đoán ung th vú.
Theo t chc y th th gii (WHO), chm là chic  u tr
c bit là  c có thu nhp th
bnh ng ch c ch n cui
[104]
.
 Kim tra hình nh
 Chnh
Chc s dng khi bnh nhân i qua nhng du hiu thay

i  tuyn vú xut hin dch tit núm vú hoc mt khi u mi.
 Siêu âm
Siêu âm s dng sóng âm thanh tn s  quan sát hình nh ca các mô vú.
Siêu âm có th phân bit gia mt khi rn, có th t u nang cha
y d

Báo cáo KLTN-          Trang 8

 Chp cng t MRI
MRI s dng t ng  quan hình nh chi tit và cho phép phân bit m
t. MRI  c s d sàng lc
 nhng ph n mc bnh cao.
 Sinh thit t bào
Mu bnh phc qua sinh thit bng mt kim nh thích hp cho vic
ch bào hc. ó, mu mô c kim tra i kính hin vi  phân
tích trng thái ca bnh. Tuy nhiên, sinh thit t bào bng kim nh có th xy ra
hing âm tính gi 
I.1.5.2.Các phng pháp chn đoán ung th c t cung.
Theo t chc y t th gi  t cung có th  u tr
c phát hin sm. Các xét nghim Pap smear (pht t bào)
là th nghim duy nhc s dng rng rãi trong chc chng
minh là làm gim t l mc u t cung và t vong. Các xét nghim khác
(VIA, HPV, khoét chóp sinh thit CTC )  ha hn mang li hiu qu trong
chu tr.
 Sàng lc t bào hc ậ Pap’s smear
,  bào hc phát
hin nhng bng ca t bào bi phát hin s
c gi là Pap smear. Nguyên lý da trên tính cht bong ra mt cách t nhiên,
liên tc ca t c bit là các t bào bng có tính cht
bong sm và rt d bong.

Phân tích hình thái hc chi tit, du hiu ca t bào b nhim HPV là s b bin
i thành các dng t  ng l, hoc nhân teo li, hay
có th tìm thy t bào bóng, t 
 smear c nhy 44- c hiu cao 91-96%. Tuy
 l âm tính gi, theo các tác gi ng t 1,1
-29,7%
[4]
.
 Soi c t cung

Báo cáo KLTN-          Trang 9

Soi c t c s dng khi kt qu sàng lc c t cung bng, hoc
có triu chng c t cung. Soi c t cung s dng mt kính hin vi
nh  tìm bt k bng trong c t cung. Trong khi kim tra c t cung, bác
 khoa có th loi b mt mu mô nh (sinh thi có th kim ti
kính hin vi cho các t 
[54]
.
 Khoét chóp sinh thit c t cung
Khoét chóp sinh thit c t      
u tr nhng b t cung  n s
này, mu mô hình nón nh ca c t cung s c loi b  kii kính
hin vi cho các t 
[54]
.
 Quan sát bng mt thng vi acid acetic (VIA)
s dng dung dch acid acetic 3-5% (dm) xt hoc bôi lên
b mt c t cung và quan sát c t cung bng mng sau 1 phút. Nu quan
sát thy các vùng b trng gn vi khu vc chuyn tip thì xét nghic

i vi t bào tin n
si phi có phòng xét nghim hay nhân viên
o chuyên sâu. Kt qu cho thy ngay lp tu tr ngay
trong ln u kim tra.  nhy ca VIA tt bng hoc t nhy ca Pap
 smear, kim tra bng mng là rt ch
quan, và cn ph kim soát chng cm tra
bng mng. VIA có th không phù hp lm  ph n sau mãn kinh bi vì
vùng chuyn tip dch chuyn vào ng c t cung khi mãn kinh
[26][27][76][74]
.
 Phng pháp Sinh hc phân t HPV-PCR
Mu máu hoc mu t bào t c t cung, o c ly c xét nghim
dt sinh hc phân t c bit là PCR. Mm ca xét nghim
c thc hiu ki
không mang tính ch c bng mng và sàng
lc t bào hc. Bên cnh vic nh

Báo cáo KLTN-          Trang 10

nhim b nh các ph n  bnh  c t cung
[88]
.
I.1.6. Tình hình ung th trên th gii và  Vit Nam:
I.1.6.1. Tình hình ung th trên th gii
c tính, trên th gii có khong 14,1 tring
hi và 8,2 tring hp t vong x012, so vi
12,7 tring hp mi mc bnh và 7,6 triu ng hp t vong 
c tính cho thcó 32,6 trii ( tu
sng, c chm
[69]

.
Các lo bin nht trên toàn th gic ch
phi (1,8 triu ng hp, chim khong 13,0% tng s ng hp), vú
(1,7 triu ng hp, chim khong 11,9%), và  (1,4 triu
ng hp, chim khong 9,7%)
[105 ]
.
Nguyên nhân ph bin nht gây t vong do i (1,6 triu
ng hp, chim khong 19,4% tng s),   gan (0,8 triu ng hp,
9,1%), và ung d dày (0,7 triu ng hp, chim khong 8,8%)
[69]
.
Theo th     nh trên toàn th gi c tính
ng h ng
thi u ph n c ch 
triu ph n còn sc ch 
K t c tính, t l mc b
t l t ên 14%. T l vú cao nhc phát
tri l t u  c kém phát trin do
thiu kin phát hin sm và tip cn v u tr (IARC)
[69]
.
u cp thit trong kip cn hiu qu
 phát hin sm, chu tr  nhng ph n sng  các quc
gia kém phát trin.


Báo cáo KLTN-          Trang 11

Hình 1.1.1: Thng kê 10 bnh ung th gây t vong ph bin nht trên th
gii, s liu nm 2012
[105 ]
.
I.1.6.2. Tình hình ung th  Vit Nam
 
 do ung

 
. 
TP.HCM     

[96]
.
Ngoài ra, theo BS Trng Khoa Ni 4, bnh viu
thành ph H  1995-2010, ti Vit Nam, s ph
n mc b t cung; hin tr thành loi bnh
ng gp nht  n gii và s tip tng thi
ph n Ving có tâm lý e ng 
t cung n bnh s u tr hiu qu
[96]
. Bnh vin Ung
u thành ph H Chí Minh cho bit, mp nhn khong 300

Báo cáo KLTN-          Trang 12

bnh nhân b  c mu tri
Bnh vin K Hà Ni, mp nhi 200 b
vú mc mu tr. Ti Vit Nam b hóa so
vi các quc gia khác trên th gii tc là có nhiu ph n i 40 tui

c bu tra, ph n  tui 30-34 có tng hp
trên tng s i mc bnh, trong khi   tui 40-44 t l này là 26,6.
c bit, ngay c nhng ph n  tui t 20-  mc bnh
[103]
.
Ti Vit Nam, m     i mc mi   CTC, 2.400
i t vong và trung bình có bi cht/ngày. TP.HCM có t l mc 
CTC cao nhc vi tn sut 14-i. La tui phát hin mc và
t vong nhiu nht t 40-75 tui. Riêng ti bnh vin T   
c phát hin CTC
[99]
.
I.2. Epigenetic và s methyl hóa DNA
I.2.1 nh ngha Epigenetics
Epigenetics là nhng s i bn cht di truyn ca DNA và nhim sc th
i trình t DNA. S bii epigenetics n s
biu hin gen thông qua nhng  riêng bit nn s nh, gp
cunh v, và t chc ca DNA
[43]
.
Epigenetics bao gm nhiu hii histone
và microRNAs
[18]
. Trong nghiên cu này chúng tôi ch tp trung vào hing
methyl hóa DNA.
I.2.2. S methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA là mt trong nhng bii phân t ph bin nht trong s
hình thành khi u  i và s vùng promoter ca gen là mt
trong nh ng xn s mt cha gen
[30]

.
Methyl hóa DNA là bii phân t xy ra do mt nhóm CH
3
liên kt cng hóa tr
vi cacbon s 5 ca Cytosin nm  v trí hai nucleotide Cytosin - Guanin (vit tt
là CpG - vi p là liên k gn gc -CH
3
vào DNA trong

Báo cáo KLTN-          Trang 13

quá trình phân bào nh các enzyme methyltransferases (DNMTs). DNMTs tìm
thy trong các t ng vt có vú bao gm DNMT1, DNMT3a, và DNMT3b
[13]
.





Hình 1.2.1: S b xung nhóm CH
3
vào v trí cacbon s 5 ca Cytosin.
c bit ph bin trong gen c ch khi u và gen sa cha
DNA
[24]
. Methyl hóa ti các v trí CpG trong vùng promoter ca các gen c ch
khi u, sa cha DNA trong t u hòa, kim soát chu
k t bào, kt dính t bào, hoc sa cha DNA. S methyl hóa DNA bng 
nhng gen p16, INK4A, p14 ARF, p15, CCDN2, DAPK, MGMT, hMLH1, GSTP1,

RAR2, APC, ER, CDH1, CDH13 và nhng gen tioncogen) có liên
n s hình thành và din tin ca khi u
[24]
.
S bi     ng d      quá trình
  i mc (hypomethylation) hoc   t mc
(hypermethylation)
[11]
. i mc dn bt nh nhim sc th
và kích hot gen ti   oncogene)    met  t mc
ng gn lin vi bt hot gen c ch khi u
[Error! Reference source not found.]
. Tuy
nhiên, s bic công b rng rãi trong các ba
i là t mc to CpG ca vùng promoter  gen c
ch khCDKN2A, CDKN2B, TP73, MLH1, APC, BRCA1, MGMT, VHL,
CDH1 và DAPK1. Bên ct s gen c ch khTIMP3, SFRP1,
SFRP2 , SFRP4 , SFRP5 him khi b t bin, hot bin ca chúng cng
c báo cáo trong  i
[87][85]
. Vì vy, vic kim tra m methyl
hóa trên các gen c ch khi u có th là du chng sinh hc tih tr
chu tr 

Báo cáo KLTN-          Trang 14

Trong nhiu nghiên cu, các tác gi u có chung nhnh r
lai các du chng da trên thông tin methyl hóa DNA, s c s dng ngày càng
nhiu trong cht công c sàng lc, mt du hiu có th phát
hin bnh bi s methyl hóa t mc  o CpG

[24][93]
.






Hình 1.2.2: S methyl hóa trong t bƠo bình thng và t bào ung th.
I.2.3. o CpG
Vùng trình t c khong 200bp vi tp hp CG chi
c g  o CpG
[50]
. Trong t  i có khong 70- o CpG b
methyl hóa, khong xut hin  vùng promoter và kéo
n exon 1 trong trình t gen cng vt có vú
[33]
. Khi DNA b methyl hóa
trong vùng promoter cc bu, các gen b bt hot
và im lng dn ri lou hòa trong các t bào khi u
[16][46]

vy, s methyl hóa to CpG thuc vùng promoter ca gen n
s biu hin ca gen c ch khi u, làm cho gen không th phiên mã và dn

I.3. Gen APC
I.3.1. Cu trúc gen APC và protein APC
Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) là gen c ch kh c Goss
K.H. và cs. 2000 thông qua liên kt ca nó vi mt hi chng di
truyn ci trc gi là n có tính cht 

(vit tt là FAP)
[37]
. Gen APC nm  v trí 5q21-q22, gm 15 exon
[49][66]
.

Báo cáo KLTN-          Trang 15

Gen APC mã hóa cho mt protein có tên là protein APC gm 2.843 acid amin,
trng phân t là 311646 Da
[77]
, có kh n vi nhiu loi protein khác
-catenin, Axin, CtBP, Asef, IQGAP1, EB1 và cu trúc vi ng.
Hình 1.3.1: Cu trúc protein APC. Protein APC gm 6 vùng chc nng
chính: vùng Armadillo, vùng lp li 15 acid amin, vùng lp li 20 acid amin,
vùng c bn, vùng gn Axin và vùng gn EB1
[98]
.
I.3.2. Chc nng gen APC và protein APC
Gen APC là mt gen c ch khng tín hiu
n - ng cn thit cho s hình thành khi u. Cha gen
APC c th hin qua cha sn phm sinh tng hp ca nó là protein
APC. Protein APC là mt protein c ch khi u , có vai trò trong mt
s n ca t bám dính a t bào, cu to
mi actin và các vi ng, phân chia nhim sc th c bit là kìm hãm con
ng truyn tín hiu Wnt n
[63][37]
.

Báo cáo KLTN-          Trang 16

 Kìm hãm con đng tín hiu Wnt kinh đin (Canonical)
Mt trong nhng v quan trng nht trong nghiên cu v gen APC là xác
nh ng chu trách nhim v sinh bnh hc u (tumorigenesis) ca nó.
Protein APC là yu t ng truyn tín hiu Wnt-catenin -
kim soát tng sinh và bit hóa t bào
[8]
.
Protein APC là mt phn ca phc hp Axin gây phosphoryl hóa -catenin, c
ch s dephosphory hóa ca -catenin, thúc y loi b -catenin t nhân, làm
gim phc hp -catenin/TCF trong nhân
[40][65][72]
. Bên cnh  protein APC
 liên kt vi -catenin, nhm  chn s  tác vi TCF
[65]
.

Hình 1.3.2 : Con đng truyn tín hiu Wnt kinh đin
[107]

 Kích thích s bám dính t bào
S bt hoy quá trình phát sinh khi u
qua vic làm m bám dính ca t bào
[14][15]
. Nhiu kt qu nghiên cu trên th
gii cho rng protein APC kích thích s bám dính t bào bng cách g-catenin
ti các vùng lp li Armadillo, các vùng lp li 15 ho kim soát

Báo cáo KLTN-          Trang 17

s phân b c-catenin gia nhân t  
ca t bàong thc  E-cadherin  a t bào
[48][60][14][15]
.
 Kích thích s phân cc vƠ di c ca t bào
u hòa s phân cc và s a t bào thông qua s kim
soát ca b khung actin (actin cytoskeleton)
[47]
.
Protein APC kích thích s a t bào bng cách gn vào Acef1 và Acef2
các vùng lp l   hot hóa chúng và hot hóa Cdc42; gn vào
IQGAP1 ti các vùng lp l thu thp IQGAP1 và CLIP170, to nên
mt phc hp v       c hot hóa, hình
thành mi actin; gn vi EB1 ti vùng gn EB1 tu kin d dàng cho
hong ca Rho và mDia, làm nh và polymer hóa các vi ng, giúp cho vic
phân chia nhim sc th chính xác
[34][47][6][56][67][90]
.
 n đnh mng li các vi ng
c tìm thy  cui ca các vi ng (microtubules), nó có th
bám vào và nh các vi ng. Các kt qu này ch ra ru hòa mng
i vi ng và có th a các vi ng
  bào và s hình thành trc chính ca con thoi (spindle)
[64]
.
 Phân chia nhim sc th chính xác
S mt nh nhim sc th c xem là mt
trong nhng  kích thích s hình thành khi u thông qua s phân chia sai
lch (mis-segregation) ca nhim sc th (Aoki và cs., 2007)
[7]

.
T nhng kt qu nghiên cc
[7][39][84]
, protein APC giúp s phân chia
chính xác nhim sc th bng cách gn vào các vi ng t   n (basic
domain)  u hòa các cha kinetochore - mt cu trúc protein  nhim
sc thi tr bào -  y
các nhim sc th xa ra.
 c ch s cht theo chng trình ca t bào (apoptosis)
Protein APC c ch s cht t    a t bào

Báo cáo KLTN-          Trang 18

bng cách g-catenin ti các vùng lp li Armadillo, các vùng lp li 15
ho c ch s cht t  n G2/M
trong chu trình t ng tín hi
cho s phân chia nhim sc th 
[28]
.
I.3.3. S methyl hóa gen APC trong ung th
S methyl hóa bng vùng promoter gen APC xy ra  rt nhiu loi ung
i trc tràng
[29][51]
i
[53[89]
vú
[45][89][30]
, ung
 t cung
[21]

Theo các nghiên cu trên th gii, tn s methyl hóa ca gen
APC trong các khc ca khi u (Virmani và
cs., 2001; Roa và cs., 2004; Chen và cs., 2007; Liu và cs., 2007).
Theo các nghiên cu c công b, ti Hoa K methyl hóa ti
vùng promoter gen APC  bi là 53%
(Virmani AK., 2001) i Nht Bn, Jin Z. và cs. công b
m methyl hóa  các mc phát hin
 (Jin Z., 2001).
Ti Trung Qu methyl hóa là 36,8%  các mu mô ung
 (Liu Z., 2007)t ln n
cu vi m methyl hóa là 39,5%  các mn I và 7,7%
 các mô phi lành tính (Lin Q., 2009). u mô c t c
u và phát hin m methyl hóa là 56,8%  các mu mô ung
 các mu mô lành (Chen Yong, 2013).
Mt nghiên cu kt hp gia B  
hin m methyl hóa trên DNA là MSP và c s dng cho các mu
mô vú. Vháp MSP, phát hin m methyl hóa  mu mô bnh, mô
lành l t là 71% và 43%.     n 74% và 46% s
methyl hóa  mô khi u và mô lành tính (Auwera IV. , 2008).
Ti Hi L methyl hóa  c phát hin
là 53,3% (Tserga A., 2012). Tu huyt thanh ca bnh
c s d  n m  methyl hóa là

Báo cáo KLTN-          Trang 19

20% (Matuschek C., 2010).
Nghiên cu v  u mô t bào vy thc qu    
Canada phát hin m methyl hóa là 44,4%  các m (ZareM.,
2009) Iran thc hin nghiên cu c  
lành và có phát hin thú v là: m methyl hóa  các m,4%

th các mu mô lành tính là 87,7% (Rigi-Ladiz M., 2011).

Ti Vi c phát hin là 87,5%  các
m,8% trên các mô cách v trí khi u 5cm  các bnh nhân
 (Duong Thi Quynh Mai và cs., 2011
30
) Vit Nam kt hp
vi Thn nghiên cu v methyl hóa  các bnh nhân mc bi
trc tràng, và phát hin m methyl hóa  các bnh nhân Vit Nam và Thy
n lt là 44,9% và 53,8% (Dimberg JJ., 2013).
Các nghiên cu v m methyl hóa  vùng promoter gen APC c thc
hin  nhiu quc gia trên th gii và  nhiu louy nhiên, các nghiên
cu  Vit Nam còn hn ch, bên cu v  t
c công b, vì vy, nhóm chúng tôi thc hi tài n kho sát mc
 methyl hóa to CpG thuc vùng promoter gen APC  các bnh nhân
  t cung.
I.4. Phng pháp phát hin s methyl hóa DNA
Hin nay, m methyl hóa DNA có th ng rt
nhii trình t trc tip Direct sequencing
[35]
, Bisulphite
pyrosequencing
[59]
, Q-MSP
[18]
, Ms-SNuPE
[41]
 c bi    
c s dng nhiu nh n s methyl hóa  o CpG.
 Phng pháp Methylation Specific PCR (MSP)

    ng s công b   c s
d phân tích nhanh tình trng methyl hóa co CpG. Vic lp b
chính xác c thành cn thit
cho vic tìm hiu quá trình sinh hu DNA, bt hot nhim
sc th X, và im lng gen c ch kh i
[42]
.

Báo cáo KLTN-          Trang 20

MSP t hp s bii DNA bng natri bisulfit
i hai cp mi methyl và unmethyl, sau quá trình bii,
tt c cytosines không methyl hóa s c chuyn thành uracil, các v trí cytosines
unmethyl thì không b bii
[52]
. MSP ch cn mng nh DNA, nhy cm
vi 0,1% alen methyl hóa ca mt locus o CpG nhnh, và có th c thc
hin trên DNA chit xut t mu paraffin. Sn phm sau khi PCR s c kim tra
bc nhui
tia UV
[42]
.
Hình 1.4.1: S bin đi bisulfit và methyl hóa DNA.

Có th thy rng, hin nay, trên th gii s dng nhii
mu bnh ph  methyl hóa trên các gen, tuy nhiên
c s dng nhiu vì s  nhy cao và phát
hin nhanh chóng hing methyl hóa ti vùng gen kho sát.
 Kho sát các đc tính, thông s vt lý ca b mi:
Thành phn nucleotide A, T, G, C trong trình t mi là thông s quan trng cho

mt phn ng PCR, nó n nhi  nóng chy c  
nhi bt cp ca mi v   phân bit gia trình t DNA methyl và
unmethyl, mi có cha v trí CpG càng nhiu càng tt (ít nht mt CpG) và tt
nht  u 3'. Ít nht mt trong ba nucleotide cui cùng tu 3' ca mi phi là
mt CpG "C".
Chiu dài mi là mt yu t quan trng trong phn ng dao

Báo cáo KLTN-          Trang 21

ng t 18 bp-ng hp c th thì chiu dài có th
c nghiu dài chung 15 bp-30 bp. Các cp mi chúng
tôi s dng có chiu dài hoàn toàn phù hp yêu cu, xem kt qu  bng 3.2.2.
Nhi nóng chy ca các m rt quan trng. Da vào
nhi nóng chy mà ta có th quynh nhi  (bt cp) trong phn ng
ng nhi nóng chy ca mi xuôi và mc nên xp x
nhau, nhi  chênh lch gia hai mi này không nên quá 5
o
C. Nhi nóng
chy ca các mi chúng tôi s dng có nhi chênh lch khong 2
o
C.
 Cu trúc th cp:
Kh t to cu trúc th cp ca mt tiêu chí quan trng
 i. Cu trúc này bao gm: hairpin loop, homo dimer và hetero dimer.
Nu cu trúc này càng bn vng thì hiu qu ca phn ng PCR s càng thp vì nó
s góp phn cn tr kh t cp ca các mi vào trình t 
  bn vng ca các liên ki ta dùng mt khái nim là
giá tr bing t  n
 không n phn ng PCR s dng các cp
mi khu  

Cu trúc th cp và cu trúc kp tóc có th c loi b bu dài
mi
[10]
.
S dng phn mm trc tuyn IDT kho sát thông s c
kt qu th hin  bng 3.2.3.


Báo cáo KLTN-          Trang 22






Phn 2:
VT LIU VÀ
PHNG PHÁP

Báo cáo KLTN-          Trang 23

II.1. Vt liu
Nghiên cu s dng 12 mu sinh thi6
mu sinh thit t nhng bnh nhân m và 6 mu lành t nhng bnh
nhân mc bnh lý khác, c cung cp bi bnh vii hc TP. H Chí
Minh; 11 mu bnh phm dch pht t o hoc m
mu bnh phm nhim HPV ki t
cung  hoc p và 5 mu lành (kèm theo các ch
tiêu lâm sàng) c cung cp bi công ty c phn công ngh Vit Á.
II.2. Phng pháp

II.2.1. Khai thác d liu và kho sát in silico
II.2.1.1. Thu thp trình t gen quan tâm, xác đnh v trí vùng cn tìm
Thu thp trình t nucleotide ca gen APC t ngân hàng gen có Accession
number NC_000005.10. Vùng kho sát kéo dài t  n exon 1A ca
gen. S dng phn mm trc tuyn Methprimer (
 xác
nh v trí các o CpG trong c vùng gen n quan tâm nht.
II.2.1.2. Phng pháp đánh giá, thit k mi
S dng   c tuyn TFSEARCH trên trang web
/>  nh v trí nhn bit ca
các nhân t phiên mã trên vùng promoter ca gen APC.
Thit k mi cho phn ng MSP b   
(www.urogen.org).
Kim tra kh t cp b sung, v trí bt cc sn phm to
thành ca các cp mi trên gen bng phn mm Annhyb.
 

Cui cùng, chúng tôi phân tích các thông s ca mi: Tm (nhi nóng chy),
chiu dài, t l % GC, kh o các cu trúc th cp ca mi, bao gm: self
dimer, hairpin loop và hetero dimer bng phn mm trc tuyn IDT

Báo cáo KLTN-          Trang 24

www.idtdna.com
  m t
thuyt ca các cp mi.
II.2.2.Kho sát in vitro
 Ni dung nghiên cu
Vi mh giá m o CpG thuc vùng promoter gen
APC bchúng tôi tin hành nghiên cu theo quy trình thc

nghim sau:
- Tách chit mu DNA t mu bnh phm: mu sinh thit mô (m
và mu mô lành) ca bú, mu DNA tách chit t mu máu hoc
dch pht t o (kèm theo các ch nh nhim
virut HPV kiu gen ,  p và mu lành do công ty Vit Á
cung cp.
- Bii sodium bisulfite bng EZ DNA METHYLATION-GOLD
TM
Kit.
- Thc hin quy trình MSP nhm phát hin s o CpG thuc
vùng promoter ca gen APC.
- Gi sn phi din ca phn  .
II.2.2.1. Tách chit DNA t mu mô đúc parafin:
 Nguyên tc:
Chúng tôi s d tách chit DNA. Trong
 c bin tính bng cht ty m
s c bin tính, loi b bng phenol/chloroform DNA b gen s c ta vi
ethanol lc thù ca ngun mc fin) chúng
tôi s d x lý parafc khi tin hành tách chit DNA.
 Thit b vƠ hóa cht
- 

:
+ Máy ly tâm lnh (Hettich)
+ 






(Thermo Final Test)
- 
+ Phenol (TBR)

Báo cáo KLTN-          Trang 25

+ Chloroform (Merck)
+ NaCl 5M
+ Tris HCl 1M (pH=8)
+ EDTA 0,5M (pH=8)
+ SDS 10%
+ Ammonium acetate 5M
+ Ethanol 100% (Merck)
+ Ethanol 70% (Merck)
+ Proteinase K (Fermentas)
 Phng pháp tin hành:
- Mu mô trong parafc ct nh và cho vào eppendorf 1,5 ml. Thêm 1 ml
xylene, vortex 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, 2 phút.
- Thêm 1 ml Ethanol 100%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, thu cn.
- Thêm 1 ml Ethanol 70%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
thu cn.
- Thêm 1 ml Ethanol 50%, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút,
 trong vòng 30 phút.
- .  trong 56
o
C/3 ngày.
Thành ph
NaCl 5 M 14 µl
Tris-HCl 1 M, pH 8 14 µl
EDTA 0.5M, pH 8 14 µl

SDS 10 % 33µl
Proteinase K 8 µl
H
2
O 617 µl
-  (pH8): chloroform vi t l 1:1. Tru, ly tâm 13000
vòng/phút, 3 phút. Thu dch ni cha DNA (500-
- Thêm cùng th tích chloroform. Ly tâm 13000 vòng/1.5 ch
ni.