phát hiện đoạn gen elip 18 của chủng edwardsiella ictaluri atcc 33202 bằng phương pháp lamp (loop mediated isothermal amplifications)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………




Lê Nguyễn Nguyên Hạ




PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG
Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LAMP (Loop – mediated isothermal amplification)


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60.42.40







LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRƯƠNG NAM HẢI



Hà Nội, 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………




Lê Nguyễn Nguyên Hạ




PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG
Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LAMP (Loop – mediated isothermal amplification)


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60.42.40

LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRƯƠNG NAM HẢI




Hà Nội, 2010
1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất
nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long nhƣ An Giang,
Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang với mục đích xuất khẩu sang các nƣớc
nhƣ Mỹ và Châu Âu. Việc thâm canh hóa trong nuôi cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus), đặc biệt là nuôi với mật độ cao và chƣa có những biện pháp quản
lý dịch bệnh hợp lý đã làm cho dịch bệnh xảy ra thƣờng xuyên hơn và gây thiệt hại
nhiều hơn. Một trong những bệnh truyền nhiễm đã và đang gây thiệt hại nghiêm
trọng đến năng suất và sản lƣợng cá nuôi là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây nên. Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng 61%,
nhƣng tỷ lệ chết đến 60 - 80%, làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ thống nuôi.
Hiện nay chƣa có vaccine phòng bệnh này một cách hiệu quả, do đó việc
phát hiện sớm tác nhân gây bệnh đóng vai trò quan trọng trong phòng chống, kiểm
soát và điều trị bệnh cho cá, ao nuôi nhằm hạn chế tối thiểu thiệt hại về kinh tế cho
bà con. Thông thƣờng, để phát hiện một tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp vi

sinh trong phòng thí nghiệm thƣờng mất từ 3 đến 7 ngày, đối với phƣơng pháp PCR
truyền thống có thể từ 3 đến 4 giờ, đối với phƣơng pháp ELISA có thể từ 1 đến 2
ngày. Các phƣơng pháp này không nhanh nhạy, lại khó thao tác, phức tạp và có chi
phí cao. Trong khi đó, LAMP là một phƣơng pháp chẩn đoán mới, nhanh nhạy, phát
hiện chính xác tác nhân gây bệnh với khả năng ứng dụng nhanh bên ngoài phòng thí
nghiệm. Đứng trƣớc tình hình đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện đoạn gen
eip18 của chủng Edwardsiella ictaluri ATCC 33202 bằng phƣơng pháp LAMP
(Loop mediated isothermal amplifications)” với mục đích xây dựng phƣơng pháp
để phát triển hƣớng tạo kit phát hiện một số tác nhân gây bệnh.


2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 VI KHUẨN Edwardsiella
Edwardsiella là một trong những chi mới thuộc họ Enterobacteriaceae, lần
đầu tiên đƣợc phân lập và phân loại bởi nhà khoa học ngƣời Mỹ P.R Edwards
(1901-1966) [16, 28]. Chi Edwardsiella gồ m 3 loài: E. tarda, E. ictaluri, E.
hoshinae, trong đó E. ictaluri đƣợc tìm thấy muộn nhất. Chi Edwardsiella mang các
đặc điểm điển hình của họ Enterobacteriaceae: vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng,
nhỏ, kích thƣớc 1 × 2 - 3 µm, không hình thành bào tử, không di động hoặc di động
bằng tiên mao, hô hấp kị khí tùy tiện. Kích thƣớc khuẩn lạc trên môi trƣờng cơ sở
sau 24 giờ nuôi cấ y rấ t nhỏ chỉ từ 0,5 đến 1 mm) [12, 32].

Hình 1.1. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dƣới kính hiển vi điện tử (A) và
nhuộm Gram (B) ()
Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của chi Edwardsiella là 37
0

C, trừ E. ictaluri, phát
triển ở nhiệt độ thấp hơn 28-30
o
C. Trong quá trình tăng trƣởng cần bổ sung
nicotinamide và acid amin, khử nitrat thành nitrit. Lên men D-glucose cho sản phẩm
là các acid và các khí thông thƣờng khác. Ngoài ra còn có thể lên men một số
carbohydrate khác nhƣng không lên men đƣợc nhiều nhƣ các chi khác thuộc họ
Enterobacteriaceae. Vi khuẩn thƣờng phân lập đƣợc từ các loài cá sông, các loài
động vật máu lạnh và môi trƣờng sống của chúng, đặc biệt là nƣớc ngọt. Chúng gây
bệnh cho cả động vật máu nóng nhƣ: chó, lợn, bò, khỉ, chuột, chồn hôi, sƣ tử biển…
nhƣng vai trò gây bệnh ở các đối tƣợng này chƣa đƣợc biết đến nhiều. Hầu hết
ngƣởi ta chỉ quan tâm đến tác hại gây bệnh của vi khuẩn thuộc chi này trên cá, đặc
A
B
3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

biệt là cá da trơn do mức độ nguy hiểm về khả năng bùng phát thành dịch với mức
độ thiệt hại về kinh tế khá lớn [12].
Vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella có khả năng đ ề kháng v ới colistin và
polimycin B nhƣng lạ i khá nhạ y cả m vớ i mộ t số tá c nhân khá ng vi sinh vậ t thông
thƣờ ng nhƣ penicillin G , ampicillin, carbenicillin, streptomycin, kanamycin,
gentamicin, tetracycline, chloramphenicol, cephalosporins, sulfadiazine, exceptions
và nalidixic acid [7, 12]. Tuy nhiên, Waltman và đtg (1986) đã bá o cá o về khả năng
kháng mạnh các hợp chất lƣu hunh, streptomycin và methicillin bằ ng phƣơng phá p
khuế ch tá n trên đĩ a thạ ch, nhƣ̃ ng khá c biệ t nà y cũ ng có thể là do sƣ̣ khá c biệ t về
nguồ n phân lập vi khuẩ n.
E. tarda có thể gây ra sự bùng phát bệnh xuất huyết trong ao nuôi cá chình
hay bệnh thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội ở ngƣời [22]. Các

báo cáo này cho thấy E. tarda gây ra bùng phát ổ dịch trong hàng loạt các ao nuôi.
E. tarda thƣờng đƣợc phân lập từ cá hồi và các loài cá khác ở Tây bắc Thái Bình
Dƣơng của Hoa K và cũng đƣợc khẳng định là nguyên nhân gây bệnh trên cá hồi,
cá bẹ và cá hồi cầu vồng cũng nhƣ là cá da trơn [12].
Theo báo cáo của Grimont và cộng sự năm 1980, môi trƣờng sống của E.
hoshinae đƣợc biết đến hiện nay bao gồm các loài bò sát, chim và nƣớc. Mặt dù có
hai trong số các nghiên cứu của họ đƣợc phân lập từ phân con ngƣời nhƣng những
ngƣời này không bị bệnh nên không có bằng chứng để khẳng định E. hoshinae gây
ra bệnh tiêu chảy cho ngƣời. Một loài khác của Edwardsiella là E. ictaluri đƣợc cho
là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết cấp tính trên cá da trơn. Từ khi công bố đầu
tiên của Hawke và đtg (1981), bệnh này đã trở thành một vấn đề rất trầm trọng của
ngành nuôi cá da trơn trong vùng đông nam Hoa K. Shott và đtg (1986) cho rằng
bệnh sinh của E. ictaluri có thể đƣợc truyền thông qua nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa.
Viêm ruột gây nhiễm trùng máu do E. ictaluri gây ra khi nhiệt độ môi trƣờng từ 22-
28
o
C, và tiến triển nhanh chóng, kết quả là tỷ lệ tử vong tăng lên đáng kể [18].
Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của E. ictaluri trong phòng thí nghiệm là từ
25 - 30
o
C và nhiệt độ cho bệnh bắt đầu xuất hiện ở ngoài môi trƣờng là khoảng 22 -
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

28
o
C. Điều này phản ánh sự thích ứng của chúng trong vật chủ biến nhiệt. E.
ictaluri sinh trƣở ng rấ t chậ m trên môi trƣờ ng thạ ch đĩa , thông thƣờ ng sau 2-3 ngày
nuôi cấ y ở 30

0
C mớ i tạo thành khuẩn lạc kích thƣớc 1 mm. Trong khi đó E. tarda
và E. hoshinae sinh trƣởng và phát triển ở nhiệt độ cao hơn khoảng 37
o
C và về mặ t
sinh hó a cũng nhi ều hoạt tính hơn E. ictaluri [12, 14]. E. ictaluri có khả năng di
động yếu khi nuôi cấy tại 25 - 30
o
C và hoàn toàn không di động khi nuôi cấy ở
37
o
C. Khả năng di động này có thể thay đổi phụ thuộc vào các điều kiện sống khác
nhau [32].
E. ictaluri có những đặc điểm điển hình của chi này nhƣ kị khí không bắt
buộc, hoạt tính catalase (+), hoạt tính oxidase (-), hoạt tính urease(+), dƣơng tính
với glucose. Khác với E. tarda chúng không sinh H
2
S và không sinh Indole. Do hai
loài này có hình dạng rất giống nhau và cùng là tác nhân gây bệnh trên cá da trơn
nên sự khác nhau về các hoạt tính sinh hóa là đặc điểm quan trọng để phân biệt và
xác định đƣợc chính xác tác nhân gây trên trên cùng một vật chủ [28]. Một đặc
điểm sinh hóa điển hình của E. ictaluri là khả năng sinh enzyme phân hủy
chondroitin – thành phần chính của sụn. Khả năng này liên quan trực tiếp tới bệnh
viêm não cấp tính ở cá đặc biệt đối với cá giống có tỷ lệ sụn cao. Hoạt tính tan
huyết cũng là một trong những hoạt tính quan trọng liên quan tới độc tính của vi
khuẩn này. Do là loài vi khuẩn ƣa huyết nên trên cá thể bị bệnh thƣờng chỉ đƣợc
phân lập đƣợc ở những cơ quan nhiều máu nhƣ gan, thận, tì tạng. Chỉ có một lƣợng
rất nhỏ vi khuẩn đƣợc phân lập từ mô não của cá bệnh. E. ictaluri thiếu các enzyme
nhƣ lipase, protease, pectinase, alginease, collagenase, chitinase và hầu hết các
enzyme ngoại bào [12].

Các plasmid khác nhau, từ 2-120 MDa cũng đƣợc tìm thấy ở Edwardsiella
[20]. Sự hiện diện của R plasmid là trung gian kháng kháng sinh đã đƣợc tìm thấy
trong E. tarda bởi Aoki và đtg (1977). Các chủng E. ictaluri phân lậ p tƣ̀ cá da trơn
luôn luôn chƣ́ a 2 plasmid 5.7 và 4.9 kb (kí hiệu là pCL 1 và pCL2) [17]. Các nhà
khoa họ c giả thiế t rằ ng chƣ́ c năng củ a cá c plasmid nà y mã hó a cho cá c protein tạ o
ra tính độ c hoặ c có vai trò quan trọ ng trong vậ t chủ hoặ c cả hai . Lobb và đtg (1993)
đã phân lậ p đƣợ c vi khuẩ n tƣ̀ cá kiế m xanh (khác biệt về mặt huyết thanh học với cá
5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

da trơn) có chứa 4 plasmid có liên quan đế n khả năng di độ ng củ a vi khuẩ n nà y vớ i
kích thƣớc lần lƣợt là 6.0, 5.7, 4.1 và 3.1 kb trong đó plasmid 5.7 và 4.1 kb nà y
tƣơng tƣ̣ vớ i pCL1 và pCL2 [17, 20].
Genome của E. ictaluri là một nhiễm sắc thể đơn dạng vòng, có kích thƣớc
khoảng 2,15 Mb. Nghiên cứu DNA chỉ ra rằng E. ictaluri liên quan chặt chẽ nhất
đến E. tarda. Trong hệ gen của E. ictaluri thì họ gen eip là đặc trƣng chỉ có ở loài
E. ictaluri. Họ gen này bao gồm 11 gen trong đó chỉ có 8 gen xác định mã hóa cho
protein. Trong số đó có 3 gen lần lƣợt là eip18, eip19, eip20 mã hóa cho các sản
phẩm protein với trọng lƣợng khoảng 18, 19 và 20 kDa. Theo Moore và đtg (2002)
thì gen eip18 đƣợc biểu hiện trong quá trình nhiễm bệnh và đóng vai trò là kháng
nguyên gây đáp ứng miễn dịch [22]. Do họ gen này mang tính đặc trƣng cho loài
nên có thể sử dụng một trong số 3 gen này để phân lập đến loài bằng phƣơng pháp
sinh học phân tử. Hiện nay, gen eip18 là gen đƣợc dùng nhiều trong các nghiên cứu
để phát hiện, định danh vi khuẩn E. ictaluri, tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết
trên cá da trơn Mỹ [34].
Phân tích phát sinh loài dựa trên sự tƣơng đồng của 16S- 23S rDNA cho thấy
sự tƣơng đồng giữa E. ictaluri và E. tarda đạt tới 96% [19]. Tỷ lệ G + C của E.
ictaluri là khoảng 53%. Việc sử dụng các trình tự gen mã hóa 16S rRNA để nghiên
cứu phát sinh loài vi khuẩn và phân loại đã đƣợc sử dụng rất phổ biến. Chúng tồn

tại nhƣ một họ đa gen hoặc operon; chức năng của gen mã hóa 16S rRNA không
thay đổi theo thời gian cho thấy sự thay đổi thứ tự ngẫu nhiên là một thƣớc đo chính
xác trong quá trình tiến hóa và gen 16S rRNA có kích thƣớc khoảng 1500 bp là đủ
lớn cho các mục đích thông thƣờng dùng trong phân loại ở cấp độ phân tử [25].
1.2 BỆNH GAN THẬN MỦ
1.2.1 Tác nhân gây bệnh gan thận mủ
E. ictaluri đƣợc phát hiện là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết ở cá da
trơn (Ictalurus punctatus) nuôi ở các bang Đông nam Mỹ bởi Hawke năm 1981
[18]. Từ đó đến nay vi khuẩn này luôn đƣợc xem là nguyên nhân gây bệnh nhiễm
trùng huyết với tỷ lệ chết rất cao trên cá da trơn nuôi công nghiệp. Cá thƣờng bị
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nƣớc hạ thấp (khoảng từ tháng 9
đến tháng 1 năm sau). Do mở rộng nuôi trồng và kiểm soát dịch không tốt nên dẫn
đến việc dịch bệnh diễn ra quanh năm. Thời điểm phát triển bệnh và khả năng lây
lan của bệnh khác nhau theo từng năm liên quan đến những biến động về thời thiết
và điều kiện nuôi trồng. Vi khuẩn tồn tại trong môi trƣờng ao nuôi và trong cơ thể
cá khỏe mạnh, khi bị shock do vận chuyển, thay đổi nhiệt độ, thức ăn cũng có thể
dẫn đến bùng phát bệnh. Bệnh có thể tiến triển rất nhanh trong ao nuôi gây thiệt hại
nặng về kinh tế [38].
Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ xuất hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 [3].
Mặc dù đƣợc phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhƣng bệnh gan thận
mủ đƣợc đánh giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng. Tỷ lệ cá chết do nhiễm bệnh
cao, từ 50 - 60% và nguy hiểm nhất là giai đoạn cá giống. Ở giai đoạn này tỷ lệ cá
chết có thể lên tới 90% [4]. Nhƣ vậy bệnh gan thận mủ đƣợc đánh giá là một trong
những bệnh gây tổn thất lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là cá tra và cá
basa của nƣớc ta.
Cá tra Việt Nam mắc bệnh gan thận mủ có những biểu hiện tƣơng tự nhƣ cá

da trơn của Mỹ nhƣ: ở mức độ nhẹ, cá ăn ít, gầy yếu, bụng chƣớng to, mắt hơi lồi,
bên ngoài thân cá bình thƣờng không biểu hiện xuất huyết nhƣng khi mổ ra thì gan,
thận, t tạng xuất hiện nhiều đốm trắng (nhƣ đốm mủ). Ở mức độ nặng hơn cá có
thể bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nƣớc, cá thƣờng nhào lộn và xoay tròn mất phƣơng
hƣớng. Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động. Một số cá có thể xuất
huyết tất cả các vi và toàn thân. Đó là những biểu hiện đặc trƣng nhất của bệnh gan
thận mủ [1, 8].
1.2.2 Tình hình bệnh dịch
Nuôi trồng thủy sản thƣơng mại lần đầu tiên đƣợc coi là nhƣ là ngành kinh tế
bắt đầu từ thập niên 1950 ở Mỹ. Trong thập niên 1960, 1970 nuôi cá da trơn phát
triển nhanh chóng, các cải tiến trong quản lý ao nuôi, nhận diện và kiểm soát dịch
bệnh, và chuẩn bị thức ăn cũng đƣợc phát triển. Ngành công nghiệp này phát triển
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhanh ở miền Nam nƣớc Mỹ, ít nhất 90% cá nuôi đƣợc sản xuất trong khu vực
thung lũng sông Mississippi. Đến nay, cá da trơn (Ictalurus punctatus) đƣợc nuôi
với quy mô lớn ở các bang Đông Nam nƣớc Mỹ nhằm cung cấp cá da trơn thƣơng
phẩm cho thị trƣờng này. Tuy nhiên, những thiệt hại gần đây do dịch bệnh mang lại
làm cho ngành công nghiệp cá da trơn tổn thất hàng triệu USD và tăng đều đặn
hàng năm cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp này. Sản lƣợng cá da trơn
thƣơng mại sản xuất chiếm 85- 90% của tổng số sản xuất nuôi trồng thuỷ sản cá ở
Hoa K, với gần 300.000 tấn sản xuất hàng năm và thiệt hại đáng kể do bệnh nhiễm
trùng huyết đƣợc báo cáo hơn 60% của tất cả các trang trại hoạt động (USDA,
2007). Hình thức nuôi thâm canh với mật độ cao là nguyên nhân dẫn đến những vấn
đề suy thoái môi trƣờng và bệnh dịch [10].
Bệnh nhiễm trùng huyết là một trong những bệnh phổ biến và tốn kém nhất
trong số các bệnh do vi khuẩn gây ra ảnh hƣởng lớn tới việc nuôi trồng và xuất khẩu
cá tra ra thị trƣờng tiêu thụ và là một trong những bệnh gây trở ngại chính cho lợi

nhuận của nông dân nuôi cá da trơn thƣơng mại. Bệnh thƣờng phát triển từ tháng 9
năm này đến tháng 1 năm sau. Theo báo cáo của các nƣớc trên thế giới bệnh nhiễm
trùng huyết gây thiệt hại về lợi nhuận cho ngƣời nuôi từ 4 tới 50 triệu USD, ngƣời
dân hằng năm phải bỏ ra 10 triệu USD cho chi phí do bệnh này [7].
Ở Việt Nam, ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay đã phát triển khá mạnh và
góp một phần không nhỏ trong GDP cả nƣớc. Năm 2008 diện tích nuôi trồng thủy
sản mở rộng lên hơn 1 triệu ha và sản lƣợng đạt gần 2,4 triệu tấn góp phần đƣa kim
ngạch xuất khẩu thủy sản lên 4.5 tỷ USD. Những năm gần đây cá Tra (Pangasius
hypophthalmus) là loài cá nƣớc ngọt đƣợc nuôi và xuất khẩu nhiều nhất so với các
đối tƣợng thủy sản khác. Theo Cục chế biến, Thƣơng mại nông lâm thủy sản và
Nghề nuôi, tổng kim ngạch xuất khẩu cá Tra cả nƣớc tính từ đầu năm đến
15/11/2009 đạt gần 1,171 tỷ USD [6]. Ở Việt Nam đối tƣợng này đƣợc nuôi với quy
mô công nghiệp ở một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long nhƣ: An Giang, Đồng
Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… Mặc dù đƣợc phát hiện muộn hơn so với
một số các bệnh khác nhƣng bệnh gan thận mủ đƣợc đánh giá là bệnh gây thiệt hại
nghiêm trọng. Theo báo cáo năm 2009, tổng diện tích thả nuôi trong 6 tháng đầu
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

năm 2009 của các địa phƣơng thuộc đồng bằng Sông Cửu Long vào khoảng 7.940
ha, bệnh gây thiệt hại khoảng 113 ha [4].
Ngƣời dân thƣờng dùng kháng sinh liều thấp để phòng bệnh cho cá do chi
phí cao, việc sử dụng dẫn đến hiệu quả điều trị của kháng sinh ngày càng giảm theo
thời gian sử dụng. Việc sử dụng kháng sinh không đúng liều lƣợng đã dẫn đến việc
hình thành các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng kháng sinh trở thành trở ngại chính
trong việc điều trị và hạn chế tác hại của bệnh. Khi cá bị bệnh ngƣời nuôi thƣờng
dùng chất hoá học và thuốc kháng sinh để chữa trị, tuy nhiên vi khuẩn E. ictaluri
trên cá tra kháng với một số loại thuốc kháng sinh nhƣ: Oxytetracylin, Oxolinic
acid, Sulphonamid [2]; Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Amoxicilin (40,4%),

Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%) và thể hiện tính nhạy với các kháng sinh
nhƣ sau: Doxycyclin (63,8%), Amoxicilin (59,6%), Tetracyclin (48,9%), Colistin
(2,1%) [5]. Việc sử dụng kháng sinh làm cho các sản phẩm thủy sản sau đó thƣờng
không đƣợc ƣa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt.
Một trong những kháng sinh còn có tác dụng với E. ictaluri là Florfenicol, là
kháng sinh thế hệ mới nhất thuộc nhóm kháng sinh Phenicol có phổ kháng khuẩn
rộng, hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên gia súc, gia cầm, đối với
thủy sản do vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Đầu năm 2006, Khoa Thủy sản Trƣờng
Đại học Cần Thơ công bố kết quả nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc kháng sinh
thay thế các loại thuốc cấm, đã công nhận Florfenicol là kháng sinh đặc trị bệnh
này. Sử dụng thuốc từ 7 - 10 ngày sẽ cho hiệu quả tốt, cá sẽ hồi phục nhanh khi
ngƣời nuôi thực hiện tốt khâu vệ sinh diệt mầm bệnh trong khu vực nuôi và trong
môi trƣờng nƣớc. Florfenicol có độ tồn dƣ thấp trong mô cơ. Dùng thuốc liều 10
mg/kg thể trọng liên tục 12 ngày, khi ngƣng sử dụng 7 ngày mức tồn dƣ trong cơ
cá tra còn 0,222 - 0,109 ppm (mức cho phép của Việt Nam và Mỹ là 1 ppm) [4].
Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với
tiểu đơn vị 50S của ribosome, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin vì vậy
ức chế sự tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát triển và
tồn tại. Sản phẩm Vime - fenfish với hoạt chất chính Florfenicol và các chất dẫn
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

xuất đặc biệt là sản phẩm đang đƣợc dùng để điều trị bệnh gan thận mủ mang lại
hiệu quả rất cao ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Trên thế giới đang sử dụng chế phẩm Edwardsiella ictaluri bacterin
(Escogen J) để điều trị bệnh hoại tử gan tụy cho đối tƣợng cá nheo Mỹ. Tuy nhiên,
hiệu lực của vaccine còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nhƣ yếu tố di truyền, kích
thƣớc cá, mùa vụ, nhiệt độ, chất lƣợng nƣớc, phƣơng pháp sử dụng và yếu tố dinh
dƣỡng, tình trạng sức khoẻ và tình trạng sử dụng kết hợp với một số loại thuốc

khác. Nghiên cứu của Craig A. Shoemaker và đtg cho thấy việc sử dụng vaccine
sống cải tiến cho cá ở giai đoạn 7 đến 31 ngày tuổi đã nâng tỉ lệ sống sót của cá lên
từ 45,3 đến 79,5% [13]. Điều này chỉ ra rằng việc dùng vaccine để phòng bệnh cho
cá cũng chỉ thu đƣợc hiệu quả thấp. Tại Việt Nam, giữa năm 2009, tiến sĩ Nguyễn
Hữu Thịnh (Trƣờng Đại học Nông Lâm) cùng các đtg của các trƣờng Đại học Đài
Loan và Na Uy đã tổ chức nghiên cứu và thực nghiệm một phƣơng pháp mới “kết
hợp phƣơng pháp chủng ngừa vaccine bằng cách ngâm và cấp qua đƣờng tiêu hóa
để hạn chế tỷ lệ chết do vi khuẩn trên cá Tra”. Việc sử dụng các loại vaccine bất
hoạt để phòng ngừa bệnh nhiễm khuẩn do E. ictaluri đã đƣợc thử nghiệm trên nhiều
loài cá da trơn khác nhau, đặc biệt là ở Mỹ. Các loại vaccine bất hoạt có thời gian
miễn dịch không dài và loại vaccine sống sử dụng vi khuẩn E. ictaluri đƣợc làm
giảm độc lực cũng chỉ có tác dụng bảo vệ trong một khoảng thời gian ngắn sau khi
tiêm vaccine. Ngòai ra, những phƣơng pháp khác sử dụng các loại vaccine bất hoạt
để phòng ngừa bệnh nhiễm khuẩn do E. ictaluri cho cá Tra ở Việt Nam cũng đã
đƣợc thử nghiệm nhiều nhƣng chƣa có kết quả về lâu dài. Chủng ngừa bằng cách
kết hợp phƣơng pháp ngâm/cho ăn để gây miễn dịch ban đầu và cho ăn tăng cƣờng
vẫn chƣa thật sự đem lại hiệu quả khi cá bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri [36].
1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E. ictaluri
Có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định một vi khuẩn, bao gồm cả
phƣơng pháp truyền thống lẫn hiện đại. Sau đây là một số phƣơng pháp đã đƣợc
dùng để xác định vi khuẩn E. ictaluri từ trƣớc đến nay.
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.3.1 Phƣơng pháp truyền thống
 Phân lập: Phƣơng pháp phân lập là một trong các phƣơng pháp cơ bản
dùng để phát hiện vi khuẩn. Mẫu bệnh phẩm sau khi thu nhận đƣợc nuôi
cấy trên môi trƣờng chọn lọc riêng dành cho vi khuẩn E. ictaluri là EIM
(Edwardsiella ictaluri medium). Vi khuẩn phát triển trên EIM đƣợc

phân biệt với E. ictaluri dựa trên hình thái của khuẩn lạc. EIM ức chế vi
khuẩn Gr (+) ngoại trừ cầu tràng khuẩn (Enterococci). Ngoài ra,
fungizone cũng đƣợc thêm vào EIM nhằm ngăn chặn sự phát triển của
hầu hết các loại nấm. EIM cho phép đánh giá nguồn môi trƣờng, mức độ
nhiễm và nguồn mang E. ictaluri. Sau khi cấy trải vi khuẩn trên môi
trƣờng EIM, nuôi cấy ở nhiệt độ 28
o
C sau 24 – 48 giờ thu đƣợc khuẩn
lạc đơn có hình tròn nhỏ màu xanh và kích thƣớc từ 0,5 – 1 mm [30].
 Xác định hoạt tính sinh hóa điển hình: Bên cạnh phƣơng pháp vi sinh,
để phát hiện chính xác vi khuẩn E. ictaluri, ta tiến hành các phản ứng
sinh hóa đặc trƣng của E. ictaluri nhƣ: hoạt tính catalase (+), hoạt tính
oxydase (-), khả năng sinh Indole (-), sinh H
2
S (-), sinh axit trên các môi
trƣờng sucrose, monitol, arabinose. E. ictaluri có hoạt tính protease rất
hạn chế, không phân hủy casein, gelatin, collagen nhƣng lại phân hủy
chrondroitin sulfate và có hoạt tính tan huyết. Để thực hiện nhanh các
phản ứng sinh hóa này, có thể sử dụng bộ kit (API-20E) đƣợc lƣu hành
trên thị trƣờng để kiểm tra nhanh 20 chỉ tiêu sinh lý sinh hóa. Từ đó có
thể dựa vào sản phẩm màu của cơ chất bị biến đổi tra vào khóa phân loại
vi khuẩn của Bergey để định tên vi khuẩn đến loài [9]. Bộ kit API-20E
nhƣ sau :

11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Hình 1.2. Bộ kit API-20E với các giếng phản ứng sinh hóa

(-) Các giếng cho phản ứng âm tính
(+) Các giếng cho phản ứng dƣơng tính
1.3.2 Phƣơng pháp hiện đại
Năm 2003, Bilodeau và đtg đã dùng phƣơng pháp real-time PCR để phát
hiện vi khuẩn E. ictaluri [11]. Phƣơng pháp này có cùng nguyên lý với phƣơng
pháp PCR, cũng là phản ứng nhân bản các trình tự gen đặc hiệu nhƣng có sử dụng
chất phát hunh quang. Việc phát tín hiệu hunh quang đƣợc thực hiện ngay trong
bƣớc bắt cặp mồi và kéo dài. Năm 2005, Panangala và cộng sự đã dùng phƣơng
pháp khuếch đại đoạn gen 16S rDNA đặc trƣng để phát hiện đƣợc đến chi
Ewardsiella [25]. Nhƣng đến năm 2007, ông và cộng sự đã phát triển một phƣơng
pháp multiplex-PCR để nhận diện bộ 3 vi khuẩn, trong đó có E. ictaluri. Bên cạnh
đó, phƣơng pháp lai phân tử, Nested PCR cũng đƣợc ứng dụng để phát hiện E.
ictaluri [26]. Hầu hết các phƣơng pháp trên đều cho kết quả khả quan nhƣng thao
tác phức tạp, chi phí cao, thời gian thực hiện kéo dài, không đáp ứng đƣợc tính cấp
bách của việc phát hiện E. ictaluri trên cá tra để kịp thời có biện pháp giải quyết,
khắc phục dịch bệnh.
Đối với phƣơng pháp miễn dịch học, hiện nay Tổ chức Thú Y thế giới (OIE)
khuyến cáo nên dùng các phƣơng pháp nhƣ tạo kháng thể hunh quang gián tiếp
(IFAT), phƣơng pháp miễn dịch enzyme (EIA) hoặc phƣơng pháp miễn dịch liên
kết enzyme (ELISA) để xác định E. ictaluri. Các phƣơng pháp trên là một trong
những kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét
nghiệm.
(-)
(+)
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Năm 2000, Notomi và đtg đã phát triển kỹ thuật LAMP (Loop-mediated
isothermal amplifications), một phƣơng pháp phát hiện dựa trên việc khuếch đại

một trình tự DNA có sẵn trong điều kiện đẳng nhiệt [24]. Từ đó đến nay kỹ thuật
này đƣợc thế giới ứng dụng để phát hiện rất nhiều loại vi khuẩn, trong đó có E.
ictaluri [29]. Đây là một phƣơng pháp mới, đơn giản, sử dụng hai cặp mồi đƣợc
thiết kế đặc hiệu và thực hiện ở điều kiện đẳng nhiệt trong thời gian ngắn nhƣng cho
kết quả có độ chính xác cao. Kết quả của phản ứng có thể đọc nhanh bằng mắt
thƣờng nhờ phản ứng tạo màu hunh quang, không cần điện di trên gel agarose.
1.4 PHƢƠNG PHÁP LAMP
LAMP là một phƣơng pháp mới đƣợc dùng chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực
y sinh học. LAMP có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn DNA, RNA mà không cần
máy biến nhiệt. Phƣơng pháp LAMP dựa vào quá trình tổng hợp DNA đƣợc thực
hiện bởi một DNA polymerase đặc biệt và hai cặp mồi đặc hiệu. Bƣớc đầu tiên của
quá trình bốn mồi đƣợc sử dụng, sau đó hai mồi đƣợc sử dụng cho mỗi chu k.
Toàn bộ quá trình khuếch đại đoạn DNA đích cần thời gian khoảng 60 phút. Sản
phẩm cuối cùng nhận đƣợc là các đoạn DNA dạng gấp khúc có kích thƣớc gấp
nhiều lần kích thƣớc của đoạn gen cơ bản và có thể nhìn thấy bằng mắt thƣờng mà
không cần điện di trên gel agarose. DNA polymerase thƣờng đƣợc sử dụng trong
các phản ứng LAMP là Bst DNA polymerase, có hoạt tính tự tách chuỗi cao.
Phƣơng pháp LAMP rất nhạy, có thể thu đƣợc kết quả tốt ngay ở nồng độ DNA
thấp (khoảng 6 fg). Tuy nhiên, mồi dùng cho phản ứng LAMP lại phức tạp hơn mồi
cho phản ứng PCR thông thƣờng. Phản ứng LAMP cần phải sử dụng hai cặp mồi,
một cặp có chiều dài 40 nucleotide và đƣợc thiết kế đặc biệt, cặp còn lại có chiều
dài khoảng 20 nucleotide. Kỹ thuật LAMP có những ƣu điểm mà kỹ thuật PCR
không có đƣợc nhƣ [23]:
 Không đòi hỏi máy biến nhiệt đắt tiền nhƣ PCR bởi vì tất cả phản ứng diễn
ra tại 1 nhiệt độ cố định.
13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Kết quả có thể đƣợc đọc ngay sau khi phản ứng kết thúc mà không cần

điện di trên gel agarose. Dựa vào sự tạo thành Mg
2
P
2
O
7
kết tủa để đo độ
đục hoặc phát hunh quang bởi Calcein dƣới tia cực tím: trong quá trình sao
chép DNA ở phản ứng LAMP, một lƣợng lớn sản phẩm phụ đƣợc tạo thành
là ion P
2
O
4
-

từ dNTPs. Calcein trong hỗn hợp phản ứng sẽ kết hợp với ion
Mn
2+
để không phát quang. Khi phản ứng khuếch đại đƣợc tiến hành,
calcein bị tƣớc mất Mn
2+
. Calcein tự do nhanh chóng kết hợp với ion Mg
2+

để tạo nên trạng thái phát quang [24]. Ngoài ra, có thể dựa vào chỉ thị màu:
FD (Fluorescent detection), HNB (Hydroxyl naphthol blue) hay SYBR
Green I tạo phức với sợi DNA kép cho màu hunh quang.
 Thời gian thực hiện đƣợc 1 phản ứng rất ngắn, trong vòng 60 phút với giới
hạn phát hiện cao hơn kỹ thuật PCR từ 100 – 1000 lần.
 Độ đặc hiệu cao vì sử dụng 2 cặp mồi nhận biết 6 vùng riêng biệt trên DNA

khuôn.
 Hàm lƣợng DNA tổng hợp đƣợc lớn hơn gấp nhiều lần so với PCR.

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Hình 1.3. Nguyên lí phƣơng pháp LAMP
(a) Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: 6 vùng khác biệt trên sợi DNA khuôn đƣợc
kí hiệu là F3, F2, F1, B1c, B2c và B3 từ đầu 5’. Kí tự c có nghĩa là vùng trình tự
này nằm trên sợi bổ sung, trình tự F1c là trình tự bổ sung với trình tự F1, B1c là
trình tự bổ sung với trình tự B1, B2c là trình tự bổ sung với trình tự B2. Hai mồi
trong là BIP và FIP và hai mồi ngoài là F3 và B3 đƣợc sử dụng trong phản ứng
LAMP. FIP (BIP) là mồi lai có chứa trình tự F1c (B1c) và F2 (B2).
15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(b) Bƣớc tạo cấu trúc khởi đầu: Quá trình đƣợc khởi đầu là mồi FIP, vùng F2 bắt
cặp với vùng F2c trên sợi DNA khuôn và khởi đầu cho sự kéo dài chuỗi về phía đầu
5’ của sợi khuôn. Tiếp tục đến mồi BIP, vùng B2 cũng gắn với vùng B2c của sợi
DNA và kéo dài chuỗi. Mồi F3 tiếp tục đến và gắn vào vị trí F3c trên DNA khuôn,
một sợi mới đƣợc tổng hợp từ mồi F3 và thay thế cho sợi tổng hợp bởi mồi FIP. Sợi
đơn tổng hợp bằng mồi FIP sẽ bị đẩy ra và hình thành nên một cấu trúc loop ở đầu
3’ của nó (cấu trúc 3). Quá trình sẽ đƣợc tiếp diễn với mồi BIP và mồi B3. Cuối
cùng một sợi đơn có cấu trúc loop ở cả hai đầu 3’ và 5’ đƣợc hình thành (cấu trúc
5).
(c) Bƣớc khuếch đại theo chu trình: sử dụng cấu trúc 5’ làm sợi khuôn, DNA tự
mồi đƣợc khởi đầu từ đầu 3’ của vùng F1 và bắt đầu kéo dài từ mồi FIP gắn với

vùng F2c trong cấu trúc loop. Qua một vài bƣớc, cấu trúc 7 sẽ đƣợc hình thành la
cấu trúc bổ sung với cấu túc 5. Cấu trúc 5 đƣợc hình thành từ cấu trúc 8 trong phản
ứng theo kiểu hình thành cấu trúc 5-7. Cấu trúc 9 và cấu trúc 10 đƣợc hình thành từ
cấu trúc 6 và cấu trúc 8, và các cấu trúc kéo dài hơn tiếp tục đƣợc tạo thành.
Phản ứng kết thúc, kết quả đọc đƣợc nhờ chỉ thị phát hunh quang nhƣ sau:

Hình 1.4. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị kim loại phát hunh quang
(-): Phản ứng âm tính cho màu vàng cam
(+): Phản ứng dƣơng tính cho màu xanh hunh quang


(-) (+)
16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 VẬT LIỆU
2.1.1 Chủng vi sinh vật
 Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ATCC 33202 (German Collection of
Microorganisms and Cell Cultures, Đức)
 Một số chủng vi sinh vật kiểm định: E. coli ATCC 25922, Salmonella
typhimurium và Proteus chủng thí nghiệm của phòng Kỹ thuật di truyền,
Viện Công nghệ sinh học.
 E. coli DH10B đƣợc sử dụng để làm thể nạp trong các thí nghiệm biến nạp,
nhân dòng và chọn dòng các plasmid.
 Plasmid pJET 1.2 (Invitrogen) sử dụng làm vector tách dòng.
2.1.2 Hoá chất, enzyme, máy móc
 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu: Tris-HCl, EDTA, TAE, SDS, isoamyl
alcohol, phenol, agarose, ethidium bromide (Sigma), bộ tinh sạch DNA từ

dung dịch và từ gel agarose (QIAGEN, Đức).
 Enzyme: enzyme hạn chế (Biolab, Fermentas), enzyme chịu nhiệt Taq-DNA
polymerase (Fermentas), T4-DNA ligase (Fermentas), proteinase K,
lysozyme, RNase (Fermentas).
 Máy móc: Máy lắc ổn nhiệt (Nhật), máy đo pH (Mỹ), máy li tâm nhỏ
(Sorwall), máy PCR (Eppendorf), máy ly tâm lạnh (Đức), máy soi gel (Mỹ),
máy đo quang phổ UV3000, máy chạy điện di.
2.1.3 Các loại môi trƣờng
 Môi trường EIM: Bacto - tripton: 10 g; Yeast extract: 10 g; Phenylalanin:
1,25 g; Ferric amonium citrate: 1,2 g; NaCl: 5 g; Brome thymol Blue: 0,03g;
Agar: 17 g; H
2
O: 990 ml; pH : 7; Manitol: 3,5 g; Colistin: 10 g; Bible salt: 3
g; Crystal: 10 µg/ml; Bacitracin: 10 IU/ml ( Merck, Đức)
17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Môi trường BHIA: Calf Brain-Beef Heart Infusion Solids: 17,5 g; Peptic
Digest of Animal Tissue: 5,0 g; Pancreatic Digest of Casein: 5,0 g; Dextrose:
2,0 g; NaCl: 5,0 g; Dibasic Sodium Phosphate: 2,5 g; Agar:15,0 g; pH: 7,4 ±
0,2 ở 25
o
C (Merck, Đức)
 Môi trường BHIB: Enzymatic Digest of Animal Tissue: 10,0 g; Beef Heart
Infusion: 5,0 g; NaCl: 5,0 g; Calf’s Brain Infusion: 12,5 g; Glucose: 2,0 g;
Disodium Phosphate: 2,5 g ( Merck, Đức)
 Môi trường LB lỏng: 0,5% Yeast Extract, 1% Bacto-pepton, 1% NaCl.
 Môi trường LB thạch: môi trƣờng LB lỏng bổ sung thêm 1,6% Bacto-aga.
 Môi trường chọn lọc: môi trƣờng LB + 100 µg/ml Ampicillin.

(Các môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1 atm trong 30 phút)
2.1.4 Các dung dịch sử dụng
 Dung dịch tách plasmid:
o Dung dịch I: Tris-HCl 50 mM, pH = 8; EDTA 10 mM pH = 8;
Glucose 50 mM.
o Dung dịch II: NaOH 0,2 M; SDS 1 %.
o Dung dịch III: Kali acetat 3 M; acid acetic 11,5%; natri acetat 3 M.
(Dung dịch I và III giữ ở 4
o
C)
 TE: 10 mM Tris-HCl pH = 8, EDTA 1 mM pH = 8.
 Gel agarose 0,8%, 1,2%.
 Dung dịch TAE 50x: 24,2 g Tris base; 5,71 ml acid acetic; 10 ml EDTA 0,5
M; chỉnh pH = 8.
 Dung dịch nhuộm gel Ethydium bromide 0,5 µg/ml.
 Dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl alcolhol theo tỷ lệ thể tích 25:24:1.
18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Dung dịch Chloroform: Isoamyl alcolhol theo tỷ lệ thể tích 24:1.
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Tách chiết DNA genome của vi khuẩn
Cơ sở lý thuyết: Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng qua đêm ở
37
o
C đến khi OD
600
= 0,5. Tế bào vi khuẩn đƣợc phá vỡ bằng lysozyme và SDS.
Protein bám DNA và một số protein khác đƣợc phân giải bằng proteinase K.

Proteinase có khối lƣợng lớn còn lại sau khi xử lý với enzyme đƣợc loại bỏ bằng
cách ly tâm, protein nhỏ hòa tan vào dung dịch phenol: chloroform: isoamyl
alcolhol nằm ở pha dƣới. DNA genome ở pha trên đƣợc tủa lại bằng cồn. Quy trình
nhƣ sau:
 Nuôi cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn qua đêm, ly tâm 5000 vòng/phút, trong 10
phút thu tế bào.
 Hòa tan tế bào bằng 0,5 ml TE trong ống Eppendorf, voltex, ly tâm 5000
vòng/phút trong 5 phút thu tế bào.
 Bổ sung 570 µl TE, 3 µl RNase, 2 µl lysozyme, trộn đều, để 30 phút ở nhiệt
độ phòng.
 Bổ sung 100 l SDS 10%, lắc nhẹ, để 15 phút ở nhiệt độ phòng.
 Bổ sung 3 µl proteinase K, trộn đều, ủ ở 37
o
C trong 60 phút.
 Bổ sung 180 µl NaCl 5 M, trộn đều, để 10 phút ở 65
o
C.
 Bổ sung 450 l phenol: chloroform: isoamyl alcolhol (25:24:1) vào, trộn
đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 13.000 vòng/phút thu dịch sang
eppendorf mới. (Bắt đầu từ bước này, làm trên đá. Bước này được lặp lại 2
lần.)
 Bổ sung 450 µl chloroform: isoamyl alcolhol (24:1), lắc nhẹ, ly tâm 13.000
vòng/phút trong 10 phút thu dịch.
 Dùng ethanol 100% với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa DNA, ủ mẫu ở
4
o
C trong 30 phút.
19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa bằng máy Speech Vac.
 Hòa tan tủa bằng 40 µl TE.
 Điện di kiểm tra 1,5 µl dung dịch DNA genom trên gel agarose 0,8%.
2.2.2 Tách plasmid từ vi khuẩn
Cơ sở lý thuyết: Tế bào E. coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân
bằng thì đƣợc ly tâm thu tế bào. Thành và tế bào đƣợc phá với bằng kiềm và chất
tạo sức căng bề mặt. Sau đó DNA genome và protein đƣợc tủa bằng lại bằng muối
kali acetat và SDS, phần tủa bị loại bỏ khỏi DNA plasmid bằng cách ly tâm. DNA
plasmid đƣợc tủa lại bằng ethanol. Quy trình nhƣ sau:
 Cấy chuyển một khuẩn lạc đơn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi trƣờng LB có
bổ sung kháng sinh ampicillin, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37
o
C, 200 vòng/phút.
 Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf, ly tâm 5000 vòng/phút, trong 5
phút thu tế bào.
 Hòa đều tế bào thu đƣợc bằng 100 µl dung dịch I bằng máy voltex. Từ bƣớc
này các thao tác với mẫu đƣợc thực hiện trên đá.
 Bổ sung 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ nhàng.
 Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, lắc nhẹ, tủa protein xuất hiện và có màu
trắng đục.
 Hút 450 µl phenol: chloroform: isoamyl alcolhol cho vào mẫu và lắc nhẹ để
các protein nhỏ hòa tan vào dịch có phenol, sau đó ly tâm ở 1300 vòng/phút
trong 15 phút. Lúc này mẫu hình thành 3 pha: pha trên cùng có chứa DNA
plasmid, pha giữa là protein lớn không có khả năng tan và cuối cùng là
protein tạp.
 Dùng pipet hút nhẹ nhàng dung dịch pha trên và chuyển chúng sang ống
eppendorf mới sau đó dùng 2 lần thể tích cồn 100% để tủa DNA plasmid.
20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

 Li tâm thu tủa ở 13000 vòng/phút trong 15 phút. Tủa đƣợc làm khô và hòa
vào 30 µl TE, dùng 3 µl để chạy điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.2.3 Kỹ thuật PCR
Cơ sở lý thuyết: trên cở sở đoạn DNA khuôn, trong môi trƣờng chứa một
lƣợng dƣ dNTP và cặp mồi đặc hiệu, quá trình khuếch đại các đoạn DNA mới diễn
ra dƣới sự xúc tác của enzyme chịu nhiệt DNA polymerase. Thông thƣờng mỗi
phản ứng chứa 25 µl bao gồm các thành phần nhƣ sau:
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích (µl)
10 X buffer
2,5
dNTP 2,5 mM
2,0
Mồi xuôi 10 pmol/l
2,0
Mồi ngƣợc 10 pmol/l
2.0
Taq polymerase LC
0,5
DNA khuôn
1
Nƣớc
15

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Nhiệt độ (

0
C)
Thời gian
1
94
4 phút
2
94
30 giây
3
45
40 giây
4
72
1 phút 50 giây

Lặp lại 25 lần từ bƣớc 2

5
72
5 phút 30 giây
6
4
-

21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Kết quả đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1,2%.

2.2.4 Phản ứng nối ghép gen
Cơ sở lý thuyết: Nhờ sự xúc tác của enzyme DNA ligase, cầu nối
phosphodieste đƣợc hình thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau của hai đoạn DNA
này. Kết quả là một liên kết este hình thành giữa gốc phosphat đầu 5’ của đoạn
DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của đoạn kia đồng thời giải phóng ra một phân tử
nƣớc. Tùy thuộc vào nồng độ và chiều dài đoạn DNA cần nối mà có tỷ lệ trộn mẫu
plasmid và đoạn gen nối khác nhau. Phản ứng nối ghép thƣờng tiến hành với tổng
thể tích là 10 µl. Ở đây, ta chọn cách ghép đầu bằng, dùng bộ kit của Fermentas.
Kết quả sẽ đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,2%.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng làm bằng đầu sản phẩm PCR (10 µl/ mẫu):
Thành phần
Thể tích (µl)
Buffer 2x
5
Sản phẩm PCR
1,5
Nƣớc
3
Blunting enzyme
0,5

Ủ hỗn hợp ở 70
o
C trong 7 phút

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector pJET 1.2:
Thành phần
Thể tích (µl)
Hỗn hợp đầu bằng
5

Vector pJET 1.2
0,5
Enzyme T4 ligase
0,5
Buffer 2x
5

Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 05 phút
22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.5 Biến nạp bằng sốc nhiệt vào E. coli
Cơ sở lý thuyết: sử dụng sự thay đổi nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt) để lỗ màng
tế bào mở ra, nhờ đó mà DNA có thể dễ dàng xâm nhập qua màng tế bào vào bên
trong. Khi ngừng sốc nhiệt và giữ ở điều kiện lạnh, màng tế bào hồi phục lại và giữ
DNA lạ trong tế bào. Tế bào chứa DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen kháng
kháng sinh nên đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng chứa chất kháng sinh.
 Tạo tế bào khả biến
o Nuôi cấy một khuẩn lạc E. coli DH10B trong môi trƣờng LB lỏng qua
đêm. Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào trong 150 ml môi trƣờng LB
lỏng, lắc ở 200 vòng/phút trong 2 giờ ở 37
o
C. Khi OD
600
đạt 0,5-0,6,
lấy mẫu ra để lạnh 1giờ.
o Ly tâm 5000 vòng/phút trong 7 phút thu tế bào.
o Rửa tế bào lại bằng 10 ml CaCl
2

100 mM. Ly tâm 5000 vòng/phút
trong 10 phút thu tế bào.
o Dịch hóa tế bào bằng 20 ml CaCl
2
100 mM, lắc đều, ủ 1 giờ ở 4
o
C.
o Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút thu tế bào, ở 4
o
C.
o Hòa tế bào trong 2 ml CaCl
2
100 mM, ở 4
o
C.
o Bổ sung thêm 15% Glycerol và giữ tế bào ở -80
o
C.
 Biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
o Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ tủ -80
o
C và đƣợc làm tan trên đá trong
khoảng 30 phút.
o Lấy 7 l sản phẩm plasmid tái tổ hợp, đảo nhẹ nhàng để DNA phân
bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó, để mẫu trên đá trong
khoảng 30 phút.
23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

o Sốc nhiệt bằng cách đƣa mẫu và o b ể ổn nhiệt (water bath) với nhiệt
độ là 42
o
C và ủ mẫ u trong 1 phút 30 giây.
o Lấy mẫu ra rồi đặt trên đá trong 2 phút.
o Cho và o khoảng 500 - 600 l LB lỏng, lắc ở 37
o
C trong 60 phút.
o Lấy 100 l dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ
sung Ampicillin 100 g/ml, ủ mẫ u ở tủ 37
o
C qua đêm.
2.2.6 Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp
Cơ sở lý thuyết: Tế bào E. coli nguyên thủ y không ti ếp nhận đƣợc plasmid
tái tổ hợp khi nuôi cấy trên thạch cho dù có X-gal hay không, nếu không có kháng
sinh ức chế, chúng vẫn phát triển thành khuẩn lạc màu trắng và dễ nhầm với khuẩn
lạc của vi khuẩn tái tổ hợp. Do vậy, ngƣời ta dùng chất kháng sinh Ampicillin để
làm dấu chuẩn chọn lọc. Dựa trên đặc điểm của vector pJET 1.2/blunt, các tế bào
chứa plasmid không mang đoạn gen đƣợc cài sẽ bị kháng sinh tiêu diệt, còn vi
khuẩn tiếp nhận plasmid pJET 1.2 có chứa đoạn gen đƣợc cài sẽ kích hoạt gen bla
(Ap
R
) có sẵn trong plasmid pJET 1.2 sản xuất enzyme phá hủ y kháng sinh nên t ồn
tại và phát triển thành khuẩn lạc.
2.2.7 Cắt DNA plasmid bằng enzyme hạn chế
Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế thƣờng đƣợc tiến hành với tổng
thể tích là 10 µl. Mục đích nhằm kiểm tra đoạn DNA đƣợc cài vào plasmid có đúng
kích thƣớc của đoạn gen mong muốn hay không.