tạo dòng gen mã hóa glucanase từ trichoderma asperellum

1
MỞ ĐẦU
Cellulose được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và tảo để phục vụ cho quá
trình sinh trưởng và phát triển của chúng. Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn
cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ
tích tụ lại và gây hại cho hệ sinh thái. Cellulose là polysaccharide cấu tạo bởi
các đơn phân β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &
Shoham, 2003). Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều
khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp
.
Trong tự nhiên, các loài nấm thường kết hợp với các vi khuẩn phân hủy
cellulose thành các đơn phân (monomer) là glucose rất dễ hấp thụ đối với các
sinh vật khác. Tuy nhiên trong các hệ sinh thái nhân tạo như các vườn, trang
trại, đồn điền, ruộng lúa, các sinh vật phân hủy cellulose trên không tồn tại
hoặc rất ít, do đó sẽ không diễn ra quá trình phân hủy cellulose (cũng như các
chất cao phân tử khác) một cách dễ dàng và nhanh chóng như trong các hệ
sinh thái rừng tự nhiên.
Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ
enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu
nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số
loại polysaccharide tương tự khác tạo thành các oligosaccharide.
Nhiều chủng nấm tiết enzyme cellulase với lượng lớn hơn các chủng vi
khuẩn và Trichoderma được biết như chi nấm có khả năng tiết cellulase nhiều
nhất (Amouri và cs, 2006). Cellulose "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme
phân hủy chúng nhưng các loài nấm Trichoderma lại có khả năng phân hủy
hoàn toàn cellulose. Hầu hết các cellulase thương mại là được sản xuất bởi
nấm T. reesei và Aspergillus niger. Điều này phản ảnh một thực tế rằng nấm
2
mốc là một nguồn tự nhiên tiết enzyme mạnh (Bergquist và cs, 2002) và có
thể nghiên cứu để sản xuất enzyme với quy mô công nghiệp .
Một ứng dụng tiềm năng của cellulase là sản xuất ethanol nhiên liệu từ

sinh khối lignocellulose (Duff và cs, 1996), dùng để thay thế cho xăng trong
động cơ đốt trong. Công nghệ triển vọng nhất cho sự chuyển đổi sinh khối
lignocellulose thành ethanol nhiên liệu là dựa trên sự phân giải cellulose nhờ
enzyme cellulase (Holker và cs, 2004; Ahamed & Vermette, 2008) .
Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi
sinh vật phân hủy cellulose (Đặng Minh Hằng, 1999; Tăng Thị Chính và cs,
1999; Hoàng Quốc Khánh và cs, 2003; Nguyễn Văn Tuân, 2009). Những
nghiên cứu này chủ yếu dừng lại ở vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và
đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase .
Công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật là cơ sở để
sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp như vaccine, hormone, enzyme Việc
cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp
DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi, trong đó có tạo dòng và sản xuất
glucanase. Điều này đã mở ra một hướng đi mới trong việc tăng cường khả
năng phân hủy các phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose nhưng vẫn an toàn
đối với môi trường.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng gen mã
hóa glucanase từ Trichoderma asperellum” nhằm tạo cơ sở bước đầu cho
việc sản xuất glucanase ứng dụng trong công - nông nghiệp.
3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ GLUCANASE
Dựa vào hoạt tính của enzyme đối với cơ chất, người ta phân chia
glucanase thành nhiều loại khác nhau như β-1,3-glucanase, β-1,4-glucanase,
β-1,6-glucanase. Jesus và cs (1995) đã mô tả các cơ chất khác nhau và loại
liên kết chính của chúng. Các cơ chất khác nhau được sử dụng làm nguồn
carbon trong môi trường nuôi cấy một số loài nấm, trong đó liên kết glycoside
hiện diện trong cơ chất quyết định sự biểu hiện của enzyme glucanase cụ thể.
1.1.1. β-1,3-Glucanase

β -1,3-glucan là một trong những thành phần cấu trúc chính của thành tế
bào nấm, β-1,3-glucanase đã được chứng minh là enzyme quan trọng trong sự
phân giải thành tế bào của nấm gây bệnh ở thực vật (Elad và cs, 1983).
Glucanase biểu hiện hoạt tính (in vitro) ở cấp độ micromol (~50 µg/ml) chống
lại một số lớn loại nấm, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh ở người và thực
vật (Coutos và cs, 1993). Mặc dù các enzyme phân giải glucan được phân bố
trong một số họ enzyme thủy phân glycoside, nhưng chỉ có các gen mã hóa
glucanase trong họ 5 và 55 từ các loài Trichoderma được mô tả đặc tính
(Dong-Jinkim và cs, 2002).
β-1,3-Glucanase phân bố rộng rãi ở vi khuẩn, nấm và thực vật bậc cao,
trong đó nhiều enzyme đã được tinh sạch và xác định hoạt tính (Copa-
Patino và cs, 1989; Kauffmann và cs, 1987). Chúng được phân loại như exo-
β-1,3-glucanase [β-1,3-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.58)] và endo-β-
1,3-glucanase [β-1,3-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.6 hoặc EC
3.2.1.39)]. Exo-β-1,3-glucanase giải phóng liên tục glucose từ đầu không khử
của cơ chất, trong khi endo-β-1,3-glucanase có khả năng phân cắt liên kết β-
1,3-glycoside ngẫu nhiên ở phía trong dọc theo chuỗi polysaccharide, giải
4
phóng các đoạn oligosaccharide ngắn. Các chức năng sinh lý của β-1,3-
glucanase phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Ở thực vật, các enzyme này
được xem như là hệ thống phòng thủ chống lại các loại nấm gây
bệnh (Grenier và cs, 1993). Trong nấm, β-1,3-glucanase dường như có nhiều
chức năng khác nhau. Đầu tiên, có vai trò phát sinh hình thái trong suốt quá
trình phát triển và phân hóa của nấm (Peberdy và cs, 1990). Thứ hai, β-1,3-
glucanase có liên quan đến sự huy động β-glucan trong điều kiện nguồn
carbon và năng lượng bị cạn kiệt, lúc này chức năng của chúng giống như các
enzyme tự phân (Rapp P., 1992). β-1,3-glucanase cũng có tác động đến nấm
gây bệnh ở thực vật bằng cách phân giải callose (β-D-1,3-glucan) trong mô
mạch của vật chủ trong quá trình tấn công của mầm bệnh (Shaeffer và
cs, 1994). Cuối cùng, vai trò dinh dưỡng trong hoại sinh và ký sinh cũng đã

được nghiên cứu (Sivan và Chet, 1989) .
1.1.2. β-1,4-Glucanase
Thành tế bào thực vật là nguyên liệu có khả năng tái tạo, dồi dào nhất
trên trái đất (Himmel và cs, 1999; Saleem và cs, 2008) và là nguồn dự trữ
chính của carbon trong tự nhiên (Yang và cs, 2007). Thành phần chính của
thành tế bào thực vật là cellulose - 40% trọng lượng khô, hemicellulose - 33%
và lignin - 23% (Han và cs, 2003; Sa-Pereira và cs, 2003). Sinh khối thực vật
là nguồn hóa học và nguyên liệu thay thế tự nhiên với chu kỳ tuần hoàn ngắn
đủ để đáp ứng nhu cầu của thị trường nhiên liệu trên thế giới. Cellulase là
enzyme quan trọng được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghiệp (Hanif
và cs 2004; Jamil và cs, 2005) và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu
vì các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực như: công nghiệp dệt, chế biến
tinh bột, sản xuất rượu, bia, mạch nha, chiết xuất nước ép trái cây và rau củ,
(Gao và cs 2008; Zhou và cs, 2008) , sản xuất acid hữu cơ (Cheryan và cs,
1997), sản xuất dung môi hữu cơ (Dũrre, 1988), sản xuất thức ăn gia súc,
5
công nghiệp sản xuất giấy và trong công nghệ xử lý môi trường (Tăng Thị
Chính và cs, 1999) .
Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do
đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc
thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên,
nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn có khả năng phân
hủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase . Ngoài ra,
endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài
động vật không xương sống khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có
cấu trúc khác nhau. Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và
điều kiện phản ứng tối ưu của các enzyme.
1.1.3. β-1,6-Glucanase
Ngoài thành phần β-1,3-glucanase, thành tế bào nấm còn chứa glucan
phân nhánh với liên kết β-1,6-glycoside (Peberdy và cs, 1990 và Hrmova

Fincher, 1993). Bên cạnh các enzym thủy phân β-1,3-glucan đã được nghiên
cứu rộng rãi (Benitez và cs, 1998), thì những đặc tính sinh hóa và phân tử của
β-1,6-glucanase (1,6-β-D-glucan glucanohydrolases, EC 3.2.1.75) cũng đã
được mô tả (Pitson và cs, 1996).
Như các enzym thủy phân ngoại bào khác, β-1,6-glucanase có thể có một
vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của nấm, bởi sự phân giải các glucan ở
dạng polymer trong môi trường sống của chúng. Nấm ký sinh tiết ra các
enzyme này có khả năng phân giải thành tế bào vật chủ của chúng. β-1,6-
glucanase được tiết ra bởi T. harzianum được xem là một thành phần hoạt
động hổ trợ cùng với các enzyme thủy phân khác trong quá trình ký sinh của
loài này .
6
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI β-1,4-GLUCANASE
1.2.1. Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự
nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm
men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật
Arabidopsis , ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống
khác như mối , ở động vật thân mềm như Mytilus edulis .
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn
cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất vượt xa so với
enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng
rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme.
Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme
với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo
ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật
sinh trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình

sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa,
enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Đối
với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn
enzyme.
1.2.2. Phân loại
Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc
tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân,
7
nhóm 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, phân nhóm 1: thủy
phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry and
Molecular Biology, 1992; />Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan
điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành
các nhóm khác nhau. Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm
enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi
cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx được chia
thành hai loại: exo β-1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt
gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo β-1,4-glucanase
(3.2.1.4) hoạt động xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử
cellulose .
Hiện nay cellulase được phân thành ba loại: endoglucanase hoặc
carboxymethyl cellulase (CMCase) (endo-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4),
exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (exo-1,4-glucanase, EC 3.2.1.91) và
glucosidase (D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) (Gielkens và cs, 1999;
Kang và cs, 1999; Parry và cs, 1983). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên
cầu nối 1,4-D-glycoside ở trong phân tử cellulose (Siddiqui và cs, 2000). Kết
quả làm giảm nhanh chóng chiều dài của polymer và nồng độ của đường khử
gia tăng chậm. Exoglucanase thủy phân cellulose bằng cách loại bỏ các đơn vị
cellobiose từ đầu không khử của cellulose (Han và cs, 1995; Akiba và
cs, 1995).
Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được sắp xếp thành các họ. Trước

đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase được
chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F . Sau đó, cellulase được chia thành 9 họ: A,
B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác . Hiện nay, các
cellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 .
8
1.3. ỨNG DỤNG CỦA β-1,4-GLUCANASE
1.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những hướng tiến
bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch
quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ
có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục.
Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các
polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách
chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong
chế phẩm enzyme Viscozyme 120L được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ
màng tế bào đậu tương . Trong quá trình sản xuất nước cà rốt thường sử dụng
endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường,
protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose
và β-glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm.
Người ta thường sử dụng β-glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các
chế phẩm như Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger, β-glucanase từ
Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong
sản xuất bia.
Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất
bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola
insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho
bánh mỳ. Glucanase từ T. reesei, A. niger được ứng dụng trong sản xuất
fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng
(prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có nhiều lợi

ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khi được bổ
9
sung vào cơ thể người và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan
trọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ
các chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh, tăng
khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển
của các vi sinh vật trong khoang miệng . Các phế phụ phẩm nông nghiệp như
lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất các
oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có
nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các
nước trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các
oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm .
1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam.
Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông
nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm như trứng, thịt,
sữa cho thị trường mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành
trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo,
nâng cao đời sống cho người dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp
nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn. Một trong
những vấn đề cần được giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng
suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi
trường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con người.
Trước tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã được đưa ra và một trong
những giải pháp được nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức
ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học như sản xuất và bổ
sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm
enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và
10
hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trưởng phát triển, nâng

cao chất lượng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn được
tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lượng vốn có, tiết kiệm chi phí
chăn nuôi, đồng thời làm giảm lượng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng
trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa
nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thường không được tiêu hóa
triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thụ
các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung β-
glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải
phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp
thụ và chuyển hóa thức ăn . Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung
glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi
làm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi.
Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase
và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử
lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so
với đối chứng (là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme) như sau: khả năng
tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate
tăng 59-70% .
Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự
quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế
phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến như: Rovazyme G2
(DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme
(cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products
Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease,
amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF,
11
Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-CF
(Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase,
amylase, protease, lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại

thị trường Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase, phytase, α-
amylase, pectinase, protease và xylanase .
Ở Việt Nam đã có nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi. Chu
Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men
trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc .
1.3.3. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trước khi lên
men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế
phẩm enzyme đã được sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase
0,5L có chứa β-glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng
thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp
glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ,
acetic acid , sản xuất acetone, butanol và isopropanol .
1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được
nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau
chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy
cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì được giữ lại. Phương pháp
thông thường là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một
phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần chlor
tồn dư trong nước thải. Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mới
được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống, đó là sử dụng các chế
phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy.
12
Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm
thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm
khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý
glucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ
ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ,
tăng hiệu quả khử lignin . Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase

được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng
đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh .
1.3.5. Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa
Cellulase và hemicellulase cùng với protease, lipase, amylase được ứng
dụng để sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải là
nơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tính đến năm
2002 đã có nhiều cellulase được sản xuất dùng cho bột giặt như:
endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous .
1.3.6. Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh
Trong công tác bảo vệ môi trường, enzyme được sử dụng trong xử lý
chất thải, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các chất thải
thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua, các chủng vi sinh vật sinh tổng
hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác
thải sinh hoạt.
Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cs đã phân lập và tuyển chọn được
các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể
ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều
chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu
quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam .
Nhiều chế phẩm vi sinh có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã
13
được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix
3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm
một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành
khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh
dưỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải
được phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật cố định đạm có ích tạo
thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần
nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm
môi trường .

Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm gây
bệnh cây trồng như cellulase của T. harzianum, từ đó ứng dụng sản xuất thuốc
bảo vệ thực vật sinh học .
1.4. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP β-1,4-GLUCANASE
Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các
nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng
cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh
trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác
động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường,
nguồn carbon, nguồn nitrogen.
Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể
sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có
loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi
hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau.
Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức
tạp như glucan, tinh bột, cellulose.
14
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon
thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn
chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích
hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn
CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là
lactose; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa. Nguồn
carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưa ấm là vỏ lạc hoặc rơm .
Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh
tổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên,
đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn
carbon thích hợp nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là
mùn cưa . Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A.

flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử
dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cưa được
xem là nguồn cơ chất tối ưu.
Các loài Penicillium pinophilum , P. persicinum, P. brasilianum sinh
tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với
nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém
. Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích
hợp nhất cho chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 là rơm .
Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau
đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả
nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài.
Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất
trong môi trường chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men .
Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh
15
tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase từ 46
đến 76 U/g . Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho thấy, các chủng A.
niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như: urea, peptone,
ammonium nitrate. Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng
sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này .
Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các
loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài
ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong
điều kiện dưới 15
o
C, các loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở
khoảng nhiệt độ 20-37
o
C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và
phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50

o
C.
Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ
bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở
điều kiện nhiệt độ 45-55
o
C và có thể chịu được nhiệt độ 65-80
o
C . Nghiên cứu
của Nguyễn Lan Hương và cs

(2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ
khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50
o
C . Acharya và
cs (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên
men trong điều kiện 28
o
C, pH 4,0-4,5 .
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp
các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố
khác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào
ban đầu.
1.5. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA β-1,4-GLUCANASE
16
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt
mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức
độ chịu ảnh hưởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại
cũng có sự khác nhau.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng

lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu
trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt
độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50
o
C. Ở nhiệt độ cao, enzyme
bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấp
dưới 0
o
C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa
về nhiệt độ thích hợp .
Cellulase từ A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất ở 50
o
C , trong khi
đó cellulase từ A. niger Z10 là 40
o
C , hoạt tính xúc tác của endoglucanase III
từ T. reesei đạt tối đa ở 55
o
C . Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs
(1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất
trong dải nhiệt độ 45-55
0
C .
Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc
vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH
thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo các
nghiên cứu cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ A. niger
NRRL-363 là 5,5 ; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 ; của endoglucanase III
từ T. reesei là 4,0-5,0 ; của endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 . Khi
nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ưa

acid A. terreus M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt
động trong dải pH 2-5, trong đó pH 2 là tốt nhất .
Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc
17
hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất
định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và
cs (1995) nhận thấy, ion Ca
2+
làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp.
D04 lên 40% so với đối chứng; Mg
2+
làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và
Zn
2+
ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với
đối chứng) . Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A.
terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg
2+
(2 mM), 59% khi ủ với
Cu
2+
(2 mM) .
Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh
mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng
như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động
của enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng
Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol,
isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-
butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy
rửa tween 20, tween 80 và SDS đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ

khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% .
1.6. CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP TRONG SẢN XUẤT ENZYME
Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự
phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình
sinh học ở mức độ phân tử. Đây là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định
vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp
được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn
xa nhau. Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công
nghệ gen hay kỹ thuật gen…) bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử
được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA .
18
Kỹ thuật tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấp
những hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động của
gen. Mục đích của việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản
phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự
biểu hiện của các gen trong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó các
vector biểu hiện thích hợp đã được thiết kế cho phép gen ngoại lai biểu hiện ở
mức độ cao hơn.
Vào những năm 1990, nhiều enzyme đã được sản xuất bởi công nghệ
DNA tái tổ hợp. Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chủ động về
nguyên liệu cung cấp enzyme ban đầu; nâng cao hiệu suất sản xuất, chất
lượng của enzyme; dễ dàng công nghệ hóa quá trình sản xuất và nhờ đó làm
giảm giá thành sản phẩm. Để sản xuất enzyme tái tổ hợp, các nhà nghiên cứu
phải tạo dòng được gen mã hóa cho enzyme quan tâm, thiết lập hệ thống biểu
hiện và tiếp theo là cải tiến hệ thống biểu hiện để enzyme được sản xuất nhiều
hơn theo một cơ chế điều hòa đơn giản .
Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản
phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Năm
1993, hơn 50% thị trường enzyme công nghiệp được cung cấp bởi các quá
trình tái tổ hợp , với doanh thu đạt 140 triệu USD . Năm 2002, có khoảng 140

protein được dùng để chữa bệnh có nguồn gốc từ các quá trình tạo dòng và
biểu hiện gen được thừa nhận ở Mỹ và Châu Âu, trong đó chủ yếu là các
enzyme . Hơn 60% các loại enzyme được sử dụng trong các ngành công
nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm và tinh bột là các sản phẩm tái tổ hợp
. Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp mà việc sản xuất phytase, được sử dụng như
một loại thức ăn cho khoảng 50% tổng số lợn ở Hà Lan trong nấm A. niger,
đã gia tăng 1000 lần so với phương pháp sản xuất truyền thống .
19
1.7. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GLUCANASE TÁI TỔ HỢP
Glucanase được phân bố rộng rãi trong số các loài vi khuẩn, nấm và thực
vật bậc cao, nhiều trong số chúng đã được tinh sạch và mô tả đặc tính. Trên
thế giới, việc tạo dòng và biểu hiện các gen này trong một đối tượng khác
nhằm khai thác tối đa hiệu suất của gen glucanase đã được quan tâm nghiên
cứu. Các vật chủ thường được chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có
khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh như E. coli, nấm men Tuy nhiên,
ở Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen
glucanase được công bố.
Hai gen mã hóa endo-β-1,4-glucanase, egl1 và egl3, từ nấm T. reesei đã
được Penttila biểu hiện trong nấm men Saccharomyces cerevisiae từ năm
1987 dưới sự điều khiển của promoter gen mã hóa phosphoglycerate kinase .
De la Cruz và cs (1995) đã phân lập và tạo dòng gen mã hóa endo-β-1,3-
glucanase, BGN13.1, từ chủng T. harzianum CECT 2413 trong S. cerevisiae.
Enzyme này có trọng lượng phân tử 77,927 Da . Fuglsang và cs (2000) đã
phân lập và tạo dòng gen mã hóa α-1,3-glucanase (mutanase) từ hai chủng T.
harzianum CBS 243.71 và P. purpurogenum CBS 238.95 trong A. oryzae
JaL142 và JaL125 . Trong khi đó, tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa exo-α-
1,3-glucanase (AGN13.2) từ T. asperellum T32 cũng đã được mô tả (Luis S.
và cs, 2004) .
Ganiger và cs (2008) đã tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa
endoglucanase từ những loài Trichoderma trong S. cerevisiae INVSc1 sử dụng

vector tạo dòng pTZ57R/T và vector biểu hiện pYES2/CT. Kết quả cho thấy
hoạt tính của β-1,6 endoglucanase của dòng tái tổ hợp từ T. reesei tăng ba lần,
từ T. harzianum và T. virens tăng hai lần so với đối chứng . Gen mã hóa
enzyme ngoại bào exo- β-1,3-glucanase (tag83) được sản xuất bởi T. viride
20
(Kulminskaya và cs, 2001) , và từ T. asperellum (Marcello và cs, 2010) cũng
đã được nghiên cứu. Hoạt tính của enzyme này được phát hiện trong tất cả
các nguồn carbon, nhưng hoạt tính cao nhất được tìm thấy khi sử dụng tinh
bột và thành tế bào của R. solani. Khi điện di không biến tính đã cho thấy có
sự xuất hiện một băng đậm của enzyme này. Các thí nghiệm sử dụng RT-PCR
cho thấy exo-β-1,3-glucanase cảm ứng trong T. asperellum xảy ra ở mức độ
dịch mã và sự biểu hiện của gen tag83 tăng lên có ý nghĩa khi có sự hiện diện
của R. solani .
Zhou và cs (2010) đã sử dụng Bombyx mori (tằm) để sản xuất endo-β-
glucanase II tái tổ hợp (rEGII). Gen mã hóa EGII (egl2) được tạo dòng từ T.
reesei và chèn vào genome của B. mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) sử
dụng vector biểu hiện BmNPV/Bac-to-Bac. Để biểu hiện rEGII, tế bào BmN
và ấu trùng của B. mori được cho nhiễm với virus tái tổ hợp, sản lượng rEGII
thu được là 386 µg/ấu trùng và hoạt tính của rEGII tinh sạch khoảng 352
U/mg. Hoạt tính tối ưu của enzyme này đạt được ở 55
o
C và pH 4 .
Huang và cs (2010) đã tạo dòng và biểu hiện cDNA của gen egVIII từ T.
viride AS3.3711trong S. cerevisiae sử dụng vector IpYEMα-xegVIII. cDNA
này có kích thước 1,317 bp, mã hóa 438 amino acid với trọng lượng phân tử
46,86kDa và Pi 4,32. Sự dịch mã của gen egVIII trong T. viride AS3.3711 có
thể được cảm ứng bởi CMC-Na, sucrose, cellulose tinh thể và bị ức chế bởi
glucose, fructose. Endoglucanase EGVIII tái tổ hợp có hoạt tính tối ưu tại
nhiệt độ 60
o

C, pH 6,0 và vẫn duy trì hoạt độ khi ủ ở 35
o
C đến 70
o
C trong 1
giờ (h). Hoạt tính của EGVIII tái tổ hợp đạt cao nhất khi được kích hoạt bởi
75 mM Zn
2+
. Chủng nấm men chuyển gen IpYEMα-xegVIII có thể được sử
dụng trong ngành công nghiệp nhiên liệu tái tạo .
21
Sử dụng phương pháp PCR-based exon splicing, Li và cs đã tạo dòng và
biểu hiện gen mã hóa EGI, EGIII, EGIV và EGV từ T. viride trong B. mori sử
dụng hệ thống biểu hiện baculovirus đột biến Bac-to-Bac/BmNPV có cải tiến,
vector này thiếu gen chiA và v-cath. Sau 84h gây nhiễm ấu trùng tằm với
baculovirus tái tổ hợp mBacmid/BmNPV/EGIII, kết quả thu được protein
enzyme EGI có trọng lượng 49 kDa, hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 50
o
C và pH
7,0 . Glucanase EGIII thu được sau 48h gây nhiễm tế bào BmN với
baculovirus tái tổ hợp mBacmid/BmNPV/EGIII, kết quả thu được protein
enzyme EGIII có trọng lượng 45 kDa, hoạt tính đạt cao nhất tại nhiệt độ 50
o
C
và pH 8,0 . Trong khi đó trọng lượng phân tử của endoglucanase EGIV là
42kDa, EGV là 36 kDa và các enzyme này có khả năng duy trì hoạt độ ở pH
5,0-10,0 .
Ngoài các chủng Trichoderma sp., các gen mã hóa glucanase từ các loài
khác cũng đã được nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện. Bacillus sp. D04 sản
xuất cellulase với trọng lượng phân tử 35 kDa, enzyme này có khả năng phân

giải CMC, cellotetraose, cellopentaose, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside và
avicel PH101. Gen mã hóa cellulase (cel) có kích thước 1461 bp của Bacillus
sp.D04 đã được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli BL21(DE)pLysS .
Tan và cs (2008) đã phân lập cDNA của gen mã hóa endo-β-glucanase II
(EGII) từ chủng nấm Humicola insolens H31-3 bằng phương pháp RT-PCR,
sau đó tạo dòng trong vector biểu hiện pGAPZαA. Plasmid tái tổ hợp này
được đưa vào Pichia pastoris GS115 bằng phương pháp điện biến nạp, khi
phân tích SDS-PAGE cho thấy protein biểu hiện có trọng lượng khoảng 55
kDa .
1.8. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG E. coli
22
Theo Baneyx (1999), E. coli là một trong những vật chủ được sử dụng
rộng rãi để biểu hiện các sản phẩm protein ngoại lai từ các sinh vật khác .
Hiện nay, việc tạo dòng và biểu hiện gen trong E. coli được rất nhiều nhà
khoa học trên thế giới thực hiện, Trình tự cDNA mã hóa cho quinone
reductase của chuột bị viêm gan được phân lập, tạo dòng trong vector pKK
233.2 và biến nạp vào chủng E. coli JM109. Sau đó, enzyme này được Shiuan
và cs (1994) phân tích trình tự amino acid, kết quả cho thấy đây là một
protein dài 273 amino acid, nó có trình tự tương đồng với protein có chức
năng tương tự ở người .
Protein hALR tái tổ hợp đã biểu hiện thành công trong hệ thống biểu
hiện pET28a(+) của E. coli BL21, vector pET28a (+)/hALR mang đoạn
cDNA đầy đủ của hALR được khuếch đại bằng phương pháp RT-PCR và
chứa trình tự mã hóa cho đuôi His, quá trình tiết hALR được cảm ứng bằng
IPTG 2h ở 37
o
C . Đoạn gen mã hóa cho catalase được Yang và cs (2003)
phân lập từ Helicobacter pylori bằng PCR sau đó tạo dòng vào vector pET-
22b (+) và được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3), kết quả cho thấy catalase
tái tổ hợp chiếm 24,4% hàm lượng protein tổng số sau khi cảm ứng bằng

IPTG trong 3 giờ ở 37
o
C. Như vậy, enzyme này đã có hoạt tính cao khi biểu
hiện trong E. coli .
Guang và cs (2004) đã tạo dòng gen B7-H3 vào vector pGEX-5X-3 và
biến nạp vào E. coli để nghiên cứu chức năng sinh học của protein B7-H3
trong việc hoạt hóa tế bào lympho T . Human beta-defensin-4 (hBD4) là một
protein có tác dụng chống nhiễm khuẩn ở người, Zhinan và cs (2006) đã
thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gen này vào E. coli, sử dụng
vector biểu hiện pET32-smhBD4, phân tích sự biểu hiện của gen mã hóa
hBD4 cho thấy, khi nuôi E. coli mang vector pET32-smhBD4 trong môi
trường MBL ở 34
o
C, cảm ứng IPTG nồng độ 0,4 mM và sau 6 giờ nuôi cấy
23
protein hBD4 đạt 2,68 g/l . Jinshu và cs (2006) đưa được gen mã hóa GnRH
vào hệ thống biểu hiện dựa trên T7 RNA polymerase trong vector pED-
GnRH3, GnRH là hormone điều hòa quá trình tiết hormone kích thích nang
trứng (FSH) và hormone kích thích thể vàng (LH), do vậy việc biểu hiện được
gen mã hóa GnRH trong E. coli có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị bệnh liên
quan đến hormone này .
Ở một hướng nghiên cứu khác, trình tự RNA đối mã của rpoS với tác
dụng ức chế sự biểu hiện của gen rpoS đã được Guozhu và cs (2003) tạo dòng
thành công. Kết quả này đã chứng minh rằng việc sử dụng một trình tự làm ức
chế sự biểu hiện của gen là hiệu quả, mở ra một hướng mới trong việc tạo ra
các tác nhân kháng khuẩn hiệu quả . Wu và cs (2008) cũng chỉ ra rằng việc sử
dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong nghiên cứu các tác nhân để kháng bệnh
là rất có triển vọng. Gen tương đồng thanatin (th1) mã hóa đoạn peptide dài
20 amino acid được biến nạp vào E. coli nhờ vector pET32a-TH1 đã biểu
hiện protein với hàm lượng 0,416 g/L, đem đến một triển vọng lớn trong việc

điều trị bệnh bằng sản phẩm của công nghệ DNA .
Protein porcine zona pellucida 3β (pZP30 β) được tạo dòng và biểu hiện
vào E. coli BL21 (DE3) pLysS sử dụng vector pET-3c. Protein tái tổ hợp
được phát hiện bằng phương pháp Western blot, sau khi phân tích hoạt tính
cho thấy nó chiếm 10% hàm lượng protein hòa tan tổng số . Gen gdhA mã
hóa cho hexaneric glutamate dehydrogenase (GDH) của Pyrococcus furiosus
được tạo dòng bằng vector pET11-d và biểu hiện vào E. coli. Ở hệ thống này
enzyme biểu hiện với lượng chiếm 15% so với hàm lượng protein hòa tan
tổng số .
Toxoplasmosis là bệnh gây ra bởi loài ký sinh trùng Toxoplasma gondii,
còn biết đến như là hiện tượng nhiễm một loại giun sán ở người nói riêng và
các động vật máu nóng nói chung. Bệnh này ảnh hưởng đến sức khỏe của con
24
người và nhất là đối với thai nhi. GRA2 của T. gondii gây đáp ứng miễn dịch
ở người và chuột làm tăng lượng kháng thể sản sinh ra để chống lại sự phát
triển của loài ký sinh trùng này. Golkar và cs (2004) đã nghiên cứu tạo ra
được protein GRA2 tái tổ hợp trong chủng E. coli BL21 pLysS. Sau khi phân
tích sự biểu hiện của protein này bằng Western blot và xem khả năng gây đáp
ứng miễn dịch ở chuột bằng thử nghiệm in vivo trên chuột, kết quả cho thấy
lượng kháng thể thuộc loại IgG2a và IgG1 đều tăng lên, có tác dụng chống lại
sự có mặt của TRX-GRA2 .
25
Chương 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Bốn chủng nấm Trichoderma asperellum CH2, SH16, PQ34 và TN42 do
PGS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc (Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ
sinh học, Đại học Huế) cung cấp.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định chủng T. asperellum sinh endo-β-1,4-glucanase ngoại bào
mạnh

2.2.1.1. Sản xuất endo-β-1,4-glucanase
Nuôi cấy các chủng nấm T. asperellum trên đĩa Petri chứa môi trường
Czapeck-Dox, ủ ở nhiệt độ 28
o
C trong 48 giờ để thu bào tử.
Bào tử nấm T. asperellum được thu từ đĩa Petri bằng nước cất vô trùng,
pha loãng mẫu đến 10
7
bào tử/mL, cấy 2 mL dịch bào tử nấm T. asperellum
vào 100 mL môi trường lỏng Czapeck-Dox. Mẫu được nuôi ở 28
o
C trong 72
giờ với tốc độ lắc 180 vòng/phút. Sợi nấm được rửa sạch bằng MgCl
2
và nuôi
trong môi trường lỏng Czapeck-Dox, trong đó glucose được thay bằng CMC
1% (w/v) (trong đệm sodium acetate 0,1M; pH 5,0) để cảm ứng sinh tổng hợp
glucanase, điều kiện nuôi cấy là 28
o
C trong 96 giờ với tốc độ lắc 150 rpm
(Ahmed và cs, 2005) .
Dịch nuôi cấy được ly tâm 10.000 rpm, trong 10 phút, ở 4
o
C (Ali và cs,
2009), loại bỏ sinh khối nấm, enzyme thô thu được bảo quản ở 4
o
C cho các thí
nghiệm tiếp theo.
2.2.1.2. Đánh giá hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
Chủng T. asperellum sinh endo-β-1,4-glucanase ngoại bào mạnh được

tuyển chọn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.