Luận văn thạc sỹ: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme endo glucanase nhằm ứng dụng trong sản xuất ethanol thế hệ 2

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề:
Năng lượng đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của kinh tế- xã hội và an ninh
quốc gia. Vì vậy trong chính sách phát triển kinh tế, xã hôi thì chính sách năng lượng
cũng được đặt lên hàng đầu.
Theo tính toán của các chuyên gia kinh tế năng lượng, dầu mỏ và khí đốt chiếm khoảng
60-80% cán cân năng lượng thế giới. Với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trữ lượng dầu
mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng bị cạn kiệt trong vòng 40-50 năm nữa.
Diễn biến phức tạp của giá xăng dầu gần đây là do nhu cầu dầu thô ngày càng lớn và
những bất ổn chính trị tại các nước sản xuất dầu mỏ. Để đối phó với tình hình đó, cần tìm
ra các nguồn năng lượng thay thế, ưu tiên hàng đầu cho các nguồn năng lượng tái sinh và
thân thiện với môi trường.
Trong số nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió,
năng lượng mặt trời,…) năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là các
nước nông nghiệp và nhập khẩu nguyên liệu.Trongđó Ethanol sinh học( Bio-ethnol) là
một loại nhiên liệu sinh học dạng cồn, là nguyên liệu thay thế xăng. Được sản xuất bằng
con đường sinh học, chủ yếu bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc có
chứa tinh bột để chuyển hóa thành đường đơn. Ethanol thế hệ thứ nhất thường được sản
xuất từ các loại cây nông nghiệp có hàm lượng đường cao như : bắp( ở Mỹ), lúa mì, lúa
mạch, mía( ở Brazinl).Tuy nhiên việc phát triển Ethanol thế hệ 1 đang đối mặt với nhiều
thách thức do sự bất ổn về an ninh lương thực và hạn chế đất trồng, đồng thời chi phí
lương thực ngày càng cao. Để phát triển công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học một cách
bền vững, cả thế giới chuyển sang lựa chọn nguyên liệu thứ 2, được sản xuất từ nguồn
nguyên liệu sinh khối lignocelluloses[] . Các nguyên liệu này chủ yếu có nguồn gốc từ
chất thải nông nghiệp, chất thải rừng, các sản phẩm phụ từ quá trình chế biến thực phẩm
hoặc loại cỏ sinh trưởng nhanh như rơm rạ,bã mía… Sinh khối lignocelluloses gồm 3
thành phần: cellulose,hemicelluloses và lignin.
Qúa trình sản xuất cồn trải qua 3 giai đoạn : tiền xử lý, thủy phân và lên men, trong đó
quá trình thủy phân đóng vai trò quan trọng. Và hiện nay phương pháp thủy phân bằng
enzyme đang được nghiên cứu rộng rãi do ít tạo các ảnh hưởng xấu đến dịch lên men và
không ăn mòn thiết bị, an toàn với môi trường. Qúa trình thủy phân cellulose trong sinh

khối lignocelluloses là kết quả của sự tác động hiệp đồng ít nhất 3 loại enzyme chính:
endo-1,4-β-glucanase, exo-1,4-β-glucanase, β- D-glucosidase.Trong đó enzyme endo –
glucanase cắt các liên kết trong phân tử cellulose, tạo điều kiện cho các enzyme khác
tiếp cận cơ chất dễ dàng.
Vì vậy, để góp phần vào việc phát triển nhiên liệu sinh học thế hệ 2, đề tài của tôi
chọn là “ Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme Endo- glucanase
nhằm ứng dụng trong sản xuất ethanol thế hệ 2”
2. Nội dung nghiên cứu:
o Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc tạo enzyme endo-glucanase
o Tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme endo cao
o Khảo sát ứng dụng của chủng trong sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ 2
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1.1.Thành phần chính của vật liệu lignocellulose
Lignocelluloselà một hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phong phú , bền vững và khó phân giải
trong điều kiện tự nhiên Hàng năm có khoảng 4*10
10
tấn sinh khối thực vật được tạo ra,
trong đó lignocelluloses chiếm 50%.
Lignocellulose là thành phần chính trong thực vật thân gỗ và thân thảo được cấu tạo từ 3
hợp phần chính là cellulose, hemicelluloses và lignin. Dưới đây là thành phần nguyên
liệu lignocelluloses trong tự nhiên ( hình 1.1)
Hình 1.1 Thành phần nguyên liệu lignocelluloses
Hàm lượng của cellulose, hemicelluloses và lignin là khác nhau giữa các loài, trong cùng
một cây hay các cây khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây
và các điều kiện khác.
Bảng 1.1 Thành phần của một số loại nguyên liệu lignocelluloses[46]
Nguồn nguyên liệu Cellulose Hemicelluloses Lignin
Gỗ cứng 40÷55% 24÷40% 18÷25%
Gỗ mềm 45÷50% 25÷35% 25÷35%
Rơm rạ 30÷43% 22÷35% 15÷23%

Bã mía 40÷55% 25÷40% 5÷25%
Cỏ 25÷40% 35÷50% 10÷30%
1.1.1.Cellulose
Cellulose là nguồn tài nguyên tái tạo dồi dào nhất, bao gồm khoảng 45% trọng lượng gỗ
khô.Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C
6
H
10
O
5
)
n,
và là thành phần chủ
yếu của thành tế bào thực vật. Cấu trúc của cellulose là polysaccharit đồng thể mạch
thẳng cấu tạo bởi các tiểu đơn vị glucose liên kết với nhau bởi các liên kết loại O-β- 1,4-
glycozit. Các mạch này được định hướng và có một đầu khử với nhóm chức hydroxyl ở
vị trí C1 tự do. Đầu còn lại là đầu không khử, nhóm chức hydroxyl ở vị trí C1 bị bao vây
trong một liên kết O-glycozit.Các mạch cellulose được nhóm lại với nhau dưới dạng vi
sợi bền bởi các liên kết hydro nội và ngoại phân tử.[3]
Hình 1.2 Công thức hóa học của cellulose
Hình 1.3 sơ đồ cấu tạo sợi cellulose
Cellulose gồm từ 1.400÷10.000 gốc β-D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-
glucozit tạo thành dạng chuỗi. Cấu trúc của cellulose bao gồm đồng thời vùng tinh thể và
vùng vô định hình. Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi đậm đặc, chiếm
khoảng
¾
cấu trúc cellulose. Tỷ lệ vùng kết tinh và vùng vô định hình tùy thuộc vào
nguồn gốc xuất xứ của nguyên liệu. Trong vùng tinh thể các phân tử cellulose liên kết
chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại
trong vùng vô định hình, các phân tử cellulose iên kết không chặt chẽ với nhau nên dễ

dàng bị tấn công.Tuy nhiên, việc thủy phân cellulose chỉ diễn ra khi cellulose được tách
khỏi các thành phần cùng cấu tạo nên thành tế bào thực vật.
1.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose là hợp chất polysaccharid chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau cellulose.
Lượng hemicellulose được tạo thành trên thế giới được đánh giá là 3.900 triệu tấn/năm.
Ngược lại cellulose, hemicellulose là một loại polymer phân nhánh, độ trùng hợp khoảng
70 đến 200 có cấu trúc phức tạp hơn đơn phân. Là các polysaccharid tan trong kiềm, liên
kết với cellulose trong cấu trúc thành tế bào thực vật. Cấu tạo từ nhiều nhóm đường
monomer, chủ yếu chứa những nhóm đường D-pentose khác nhau như: xylose, mannose,
galactose, và arabinose . Trong đó Xylose, Mannose là những thành phần chính.Khác với
Cellulose, Hemicellulose bao gồm những chuỗi mắt xích ngắn (200 đơn vị đường).
Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose
Tùy thuộc vào tỉ lệ của các thành phần monomer cơ bản, hemicellulose còn được gọi là
mannan (chứa mannose), xylan (chứa xylose) hoặc galactan (chứa galactose). Các
monose trong hemicellulose liên kết với nhau thông qua các liên kết β-1,3, -1,6 và -1,4
glycozid, thường bị acetyl hóa. Xylan, polymer của xylose, là thành phần chiếm tỷ trọng
lớn cấu tạo nên hemicelulose trong các vật liệu lignocellulose. Thủy phân hoàn toàn hợp
chất này sẽ tạo ra các nguyên liệu có giá thành thấp phục vụ cho các ngành công nghiệp
hoặc trực tiếp cho lên men cồn[5]
1.1.3. Lignin
Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ
yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin là một trong các polymer hữu
cơ phổ biến nhất trên trái đất, chiếm khoảng 15 tới 25% các vật liệu lignocellulose,
khoảng 10
11
-10
12
tấn/năm.
Khác với cellulose và hemicelluloses, lignin là những hợp chất cao phân tử rất phức tạp,
có cấu trúc không gian ba chiều, vô định hình, được tổng hợp bởi thực vật bậc cao,chiếm

23- 32% trọng lượng khô trong các mô của cây thân gỗ. Lignin được cấu thành từ các
đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl
alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary
alcohol
Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin
Các nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm phenolic hydroxyl tự
do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu mạch thẳng và nhóm
carbonyl ( Hình 1.6).Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringy
Hình 1.6. Cấu trúc lignin
Sự có mặt của lignin trong sinh khối gây khó khăn cho việc thủy phân nguyên liệu thành
đường do cản trở sự tiếp xúc của cellulase với cellulose sinh khối. Do vậy phân hủy
lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả cellulose. Mặt khác, lignin lại là một trong
các nguyên liệu quý được sử dụng trong công nghiệp như nhiên liệu.Thu hồi lignin giúp
nâng cao giá trị sử dụng sinh khối thực vật.[2]
1.2.Các loại nấm mốc phân hủy lignocelluloses:
Nấm mốc phân hủy lignocelluloses có 3 loại : nấm mục nâu, nấm mục trắng, nấm mục
xốp. Trong đó, nấm mục trắng và nấm mục nâu thuộc nhóm Basidiomycetes là nhóm có
khả năng phân hủy lignocelluloses cao nhất trong tự nhiên
1.2.1.Nấm mục xốp:
Các loài nấm tạo ra mục xốp chủ yếu phân huỷ polysaccarit. Loại này không tấn công
lignin mà chỉ phân hủy cellulose, hemicellulose và tạo thành các vết mục trắng làm cho
gỗ bị xốp như bọt biển. Có thể tìm thấy chúng trên gỗ ở những nơi ẩm ướt như hàng rào,
bậu cửa, cây gỗ mục… Chúng bao gồm một số loài thuộc chi Ascomycota và một số loài
khác như Chaetomium,Ceratocystis, Lulworthia, Halosphaeria và Pleospora[4]. Các loài
nấm này phân hủy mạnh cellulases ngay từ đầu. Sợi nấm có khả năng phát triển trong lớp
của thành tế bào thực vật.
Trong nhóm nấm này,khả năng sản sinh các enzym phân huỷ cellulose cũng khác nhau.
Loài nấm có khả năng sản sinh hàng loạt enzym phân huỷ cellulose và được nghiên cứu
kỹ là T.reesei[17] T.reesei sản sinh ít nhất ba enzym endoglucanaza, hai exoglucanaza và
một hoặc hai enzym β-glucosidaza. Nhiều loại nấm mục xốp khác cũng đã được nghiên

cứu.
Các loài thuộc Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzym khác nhau,có khả năng phối
hợp để phân huỷ tinh thể cellulose.
1.2.2.Nấm mục trắng:
Là loại nhóm nấm dị tản thuộc nhóm nấm Basidiomycete có khả năng phân hủy
lignocellulose. Các nấm mục trắng khác nhau có tốc độ phân hủy lignin và carbohydrate
trong gỗ khác nhau đáng kể. Có hai dạng nấm mục trắng chủ yếu, phân loại dựa trên tính
đặc hiệu khi tấn công. Dạng thứ nhất là phân hủy có chọn lọc, ở giai đoạn đầu lignin
được phân hủy nhanh hơn so với cellulose và hemicellulose, khiến cho gỗ mất màu
nhưng vẫn giữ được một phần cấu trúc, chẳng hạn như Phellinus nigrolimitattus. Dạng
thứ hai là phân hủy đồng thời, hệ enzyme naỳ do những loài nấm này sinh ra có thể phân
hủy cả ba thành phần chính với tốc độ gần như nhau, thân gỗ bị phá hủy hoàn toàn, trở
thành dạng mùn trắng như nấm cổ linh chi Ganoderma applatanum và Heterobasidion
annosum.[13]
1.2.3. Nấm mục nâu :
Hơn nấm mục xốp loại này phân hủy một phần lignin, chủ yếu sử dụng dinh dưỡng bằng
cách phân hủy cellulose và hemicellulose từ gỗ. Nấm mục nâu chủ yếu thuộc chi
Basidiomycota. Đại diện của nhóm này bao gồm những loài như Schizophyllum commune,
Fomes fomentarius và Serpula lacrymans. Vì cellulose và hemicellulose đã bị nấm sử
dụng, lignin chỉ bị sử dụng một phần, phần còn lại lignin tạo ra màu nâu cho gỗ. Khác với
enzym cellulase của nấm mục xốp, nấm mục nâu hầu như không tác động đến cellulose ở
điều kiện tự nhiên mà phân hủy cellulose bằng quá trình oxy hóa sử dụng H
2
O
2
giải phóng
ra khi phân giải hemicenlulose. Vì là phân tử nhỏ nên H
2
O
2

dễ dàng khuyếch tán qua thành
tế bào thực vật và làm mục gỗ. [4]
1.3. Hệ Enzyme phân hủy lignocelluloses
1.3.1. Hệ ezyme phân hủy hemicelluloses:
Để thủy phân hoàn toàn hemicelluloses thành monosaccharides cần sự kết hợp của một
số loại enzyme. Chúng bao gồm β-D-xylanases, β- D- galactanases, β- D- mannanases.
- Các enzyme phân hủy xylan:
Để thủy phân hoàn toàn polymer xylan phân nhánh cần có một số loại enzyme khác nhau
như: endo-β- D- xylanases, β-xylosidases, α- glucuronidases, α- arabinosidases, và
acetylxylan esterases. Endo-xylanases tấn công mạch chính của xylan và các oligome
chứa nhóm thế hoặc không chứa nhóm thế, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết 1,4-
β-D-xylopyranozyl của xylan như: L- arabino-D-xylan, L-arabino-D-glucurono-D-xylan
và D-glucorono-D-xylan.
β-xylosidases có tác dụng chuyển hóa các oligome thành xylose . Enzyme nàycũng phối
hợp hoạt động với endoxylanases,α-arabinosidases và acetylxylan esterases để thủy phân
hoàn toàn xylan thành monosaccharides.
- Các enzyme phân hủy mannan:
1,4-β-D- mannoses có khả năng thủy phân liên kết 1,4-β-D-mannopyranozyl của D-
mannan và D-glacto-D-mannan
Endo-mannanase làm xúc tác cho quá trình thuỷ phân β-D-mannan thành D-manose và
hàng loạt mannooliansaccarit.
1,4-β-mannosidase ( β-D-1,4-mannozit manohydrolase) làm xúc tác cho quá trình thuỷ
phân ,tách nhóm β-D-mannozyl liên kết 1-4 khỏi phần không khử của cơ chất.Enzym này
cũng phân huỷ mannooligosaccarit và glycopeptit chứa mannose.Sự vắng mặt các enzym
này sẽ dẫn tới tich luỹ các oligosaccarit trong quá trình thuỷ phân mannan.
α-galactosidase : tồn tại rộng khắp trong vi sinh vật,thực vật và động vật.Enzym làm xúc
tác cho quá trình thuỷ phân melibiose ,metyl-,etyl-,phenyl- và o-nitrophenyl-α-D-
galactozit.Enzym này thuỷ phân α-D-galactopyranozit thông thường nhưng không giải
phóng ra D-galactose từ galactoglucomannan của gồm nhựa cây. [6]
1.3.2.Hệ enzyme phân hủy lignin:

Hệ enzyme giữ vai trò chủ yếu trong phân hủy lignin là manganese peroxidase( MnP) và
lignin peroxidase(LiP) và laccases . Các enzyme này tạo ra những chất oxi hóa mạnh
mạng lưới lignin [ 3].
• Lignin peroxidase(EC 1.11.1.14) lần đầu tiên được tìm thấy trong môi trường
nuôi cấy P. chrysosporium[ Glenn- Tien công bố năm 1983]. Hiện nay có thể tìm
thấy enzym này trong một số loài nấm làm mục gỗ khác như Phlebia radiate,
Phlebia tremellose, Trametes versicolor và xạ khuẩn Streptomyces viridosporus,
Thermomonospora fusc. Enzyme này xúc tác cho các quá trình oxi hóa khác nhau
trong mối liên kết ary của phức hợp lignin, phân hủy liên kết ete β- O-4 và liên kết
C
α
và C
β
của nhánh bên lignin. LiP xúc tác tiến trình decacboxyl hóa axit
phenylaxetic, oxy hóa rượu có OH ở C
α
thành hợp chất C
α
- oxo, hydroxyl hóa, tạo
quinon và xúc tác cho phản ứng mở vòng thơm.[10]
• Manganese peroxidase(EC 1.11.1.13) được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P.
chrysosporium, được Kuwahara và cộng sự công bố năm 1984 [12]. Manganese
peroxidase có trọng lượng phân tử khoảng từ 40-48 kDal và có điểm đẳng điện pI
2,9-7,0. Ngoài P. chrysosporium, MnP còn được tìm thấy trong nấm mục trắng
khác T. versicolor, P. radiata, Ceriporiopsis cubvermis, Agarious bisporus,
Nematoloma frowadic. MnP là enzyme duy nhất trong số các enzyme peroxidase
mà các cơ chất chủ yếu của nó là các acid hữu cơ có ion Mn
+
. Enzyme này hoạt
động như một phenoloxydase trên cơ chất phenol bằng cách sử dụng Mn

3+
/ Mn
2+

làm cặp oxy hóa khử trung gian.Nhiệm vụ chính của enzyme này là tham gia vào
phản ứng oxy hóa hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenol của lignin. MnP tấn
công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc oxy
hóa có trọng lượng phân tử thấp theo con đường oxy hóa khử Mn.
• Laccase(EC 1.10.3.2) là một oxidase chứa đồng. Có khả năng xúc tác phản ứng
chuyển hóa hợp chất phenol thành những phenoxyl, oxi hóa những hợp chất
không rượu trong điều kiện nhất định Đa số những nấm gây mục trắng đều có thể
sinh laccase.
• Ngoài ra còn có các enzyme phát sinh H
2
O
2
: nấm mục trắng cũng tạo ra một số
enzyme có khả năng phát sinh H
2
O
2
. Các enzyme nội bào này là glucose-1-
oxidase, glucose-2-oxidase, methanol oxidase và axyl- CoA oxidase. Các enzyme
ngoại bào phát sinh H
2
O
2
là glyoxal oxidase. Các enzyme này được
P.chrysosporium tiết ra [6]
1.3.3.Hệ enzyme phân hủy cellulose::

Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc
thủy phân liên kết 1,4-β- glucoside trong cellulose. Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm
Bảng 1.2. Hệ enzyme phân hủy cellulose:
Loại enzyme Cơ chất tối ưu Khối
lượng
phân tử
(kDa)
Nhiệt độ
tối ưu
PH tối ưu Tài liệu
tham khảo
Endo-1,4-β-glucanases Cellulose vô
định hình
22-45 50-70 4-5 33, 35,44
Cellobiohydrolases(CBH) Cellulose tinh
thể
50-65 37-60 4-5 33,35,44
Β-glucosidases Cellobiose,
Cellodextrins
35-450 45-75 Thay đổi 33,35,44
-Enzyme endo –β-1,4- glucanases hay carboxymethyl cellulase(CMCase) (EC 3.2.1.4)
cắt ngẫu nhiên tại liên kết 1,4 trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do
và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh
thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp
cận
- Exo-β-1,4-glucanases hay cellobiohydrolase(EC 3.2.1.19) xúc tác phân cắt liên tiếp các
đơn vị đường từ đầu không khử hoặc đầu khử của phân tử cơ chất, giải phóng các
oligosaccharide, cellobiose và glucose.
- β- glucosidases hoặc β- glucosidase glucohydrolase( EC 3.2.1.21) thủy phân cellobise
và cellodextrine tạo glucose .

Ba enzyme này xúc tác cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình thủy phân cellulose tạo
glucose.[30],[39],[45]
1.4. Giới thiệu về Endo- glucanases:
1.4.1 Nguồn gốc:
Endo-β-1,4- glucanases(EC 3.2.1.4) có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau
trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất
nâahiều chủng vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn, và một số loại nấm men có khả năng sinh
tổng hợp endo-β-1,4- glucanase.
Nấm mốc là một trong những vi sinh vật có khả năng tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Tricoderma, Penicillium,
Phanerochaete đã được nghiên cứu có khả năng tổng hợp endo- β-1,4-glucanase mạnh
như: Aspergillus niger[25], A. flavus, A. fumigates[27], Trichoderma reesei [53]…
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng được xem là một trong những đối tượng có khả năng
sản sinh Endo-β-1,4- glucanases khá phong phú. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã được
nghiên cứu là Acidothemus cellulobuticus[22]
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis [23], ở
động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối , ở động vật
thân mềm như Mytilus edulis .[63]
Trong số các nguồn sinh Endo-β-1,4-glucanases như trên thì vi sinh vật được xem là
nguồn cung cấp enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật như:
- Là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn, cũng là nguồn
nguyên liệu con người có thể tạo ra được
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn ( từ 16-100 giờ)
- Vi sinh vật phát triển nhanh, tỷ lệ enzyme trong tế bào cao vì thế sản xuất chế
phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi
1.4.2. Cấu trúc không gian của enzyme endo-glucanase:
Hình 1.7: Cấu trúc không gian enzyme endoglucanase
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối
lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi

polypeptide. Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp
trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng
liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của
các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng[7]]
1.4.3. Tính chất hóa lý của Endo-β-1,4-glucanase:
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính của enzyme đạt mạnh nhất ở
nhiệt độ và pH nhất định. Độ bền nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnh
hưởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại cũng có sự khác nhau.
1.4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn
nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ
thích hợp,khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C. Ở nhiệt độ
cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấp
dưới 0°C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ
thích hợp.[4]
Hoạt tính xúc tác của endoglucanase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55°C. Theo kết
quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A.oryzae
KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55°C [22].
1.4.3.2. Ảnh hưởng của pH
Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng.Tùy thuộc
vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm
hoặc acid.
Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ
A. niger NRRL-363 là 5,5 [21]; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5
[25]; của endoglucanase từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [22]; của
endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [23].
1.4.3.3. Ảnh hưởng của kim loại:
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion
kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch
enzyme. Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A. terreus M11 bị

giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg
2+
(2 mM), 59% khi ủvới Cu
2+
(2 mM) [24].
1.4.3.4.Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ:
Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và
mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình
Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ
methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là
n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween
20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau,
trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% [25].
1.4.4. Cơ chế xúc tác của endo- β-1,4- glucanases:
Hình 1.8 cơ chế thủy phân của celluases
Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulases tham gia thủy phân theo một cơ chế riêng.
Tuy nhiên mỗi enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn cơ chất
thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose.
Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở
bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác.
Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các
liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các
oligosaccharide, cellobiose và glucose. D-Glucosidase thủy phân các phân tử
cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose.[58]
1.4.5. Ứng dụng của enzyme Endo- β-1,4-glucanases:
1.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm:
Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những hướng tiến bộ có triển vọng
nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường
chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho
dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào,

thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình
tách chiết và làm trong.
Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần
đường, protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như
cellulose và D-glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản
phẩm. Người ta thường sử dụng D-glucanase để loại bỏ những thành phần
này.
Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì, và thực
phẩm chức năng. Glucanase từ Trichoderma reesei, A. nigerđược ứng dụng trong sản
xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng , được sản
xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Khi được bổ sung vào cơ thể người và động vật, có
nhiều tác động sinh lý quan trọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật
gây bệnh,bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết
thanh,tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển
của các vi sinh vật trong khoang miệng . Các phế phụ phẩm nông nghiệp như lõi ngô, bã
mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất các oligosaccharide.Các
enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc.Hiện nay,
nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các nước trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản,
nhu cầu hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm .[
1.4.5.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc:
Bổ sung chế phẩm enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa
thức ăn và hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trưởng phát triển, nâng
cao chất lượng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn được tiêu hóa
triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lượng vốn có, tiết kiệm chi phí chăn nuôi, đồng thời
làm giảm lượng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu ô nhiễm
môi trường. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi.
Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men trong chế
biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc [26].
1.4.5.3. Trong công nghiệp sản xuất dung môi :
Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trước khi lên men đã làm

tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme đã được
sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase 0,5L có chứa D-glucanase sử dụng
trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi
Clostridium sinh tổng hợp glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất
dung môi hữu cơ, acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [27].
1.4.5.4. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy:
Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu
hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho
quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý glucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột
hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất
vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin . Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy,
glucanase được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng
đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh
1.4.6. Một số nghiên cứu
1.4.6.1. Một số nghiên cứu về các chủng sinh enzyme endoglucanase
Bảng 1.3 : Một số nghiên cứu về enzyme endo- glucanase
Nguồn gốc
enzyme
Khối lượng(Dalton) pH Nhiệt độ(°C)
Tài liệu tham khảo
A.niger 26.000 4.0 4.5 Theo Hurt( 1997)
Ruminococcu
s albus
_ 5.8 47
Leathrewood(1965)
Clostridium
thermocellum
76.000 7.0 70
[1]
Actinomyces

griseus
_ 6.7 58
Nguyễn Đức Lượng
và cs(1999)
A. awamori
VTCC-F-099
32kDa 5 50
Nguyễn Văn
Tuân(2009)
Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về cellulase nói chung và
endo-β-1,4-glucanase nói riêng. Các nghiên cứu được tiến hành trên nhiều phương diện
khác nhau liên quan đến loại enzyme này. Phạm Thị Ngọc Lan và cs đã tiến hành nghiên
cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi
có khả năng phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các
chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng
phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [34]. Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một
trong những đối tượng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng
nấm sợi có khả năng phân hủy cellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase
của chúng đang là vấn đề được nhiều tác giả quan tâm.
1.4.5.2. Một số nghiên cứu liên quan đến sản xuất Ethanol sử dụng endoglucanase
CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu :
Mẫu rơm được lấy tại Thường Tín- Hà Tây
2.2. Dụng cụ và thiết bị :
Nghiên cứu được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm-
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Tên thiết bị Xuất xứ
Máy đo Ph Trung quốc
Máy votex Model L46, Thái Lan
Bình ổn nhiệt Trung Quốc

Máy lắc ổn nhiệt Shellab , Mỹ
Và một số thiết bị khác
2.3. Hóa chất :
+ Môi trường Crapex
Thành phần Số lượng(g/l)
Saccarose 30
NaNO
3
3
KH
2
PO
4
.7H
2
O 1(1.3255)
MgSO
4
.7H
2
O 0.5(1.025)
KCl 0.5
FeSO
4
0.01(0.0182)
Aga 20
Kháng sinh 0.1
+ Môi trường cấy chuyển sử dụng cơ chất đặc hiệu (CMC):
Thành phần Số lượng(g/l)
NaNO

3
3
KH
2
PO
4
1(1.3255)
MgSO
4
0.5(1.025)
KCl 0.5
FeSO
4
0.01(0.0182)
CMC 10
Aga 20
+ Môi trường nuôi lỏng :
Thành phần Số lượng(g /l)
CMC 10
(NH
4
)
2
SO
4
1.4
KH
2
PO
4

2
MgSO
4
0.3
CaCl.2H
2
O 0.3
Pepton 1
Cao nấm men 0.5
Tween 80 1ml
Oligo 1ml
Đệm citrat pH 4
2.4. Các phương pháp nghiên cứu :
• Sơ đồ phân lập và tuyển chọn :
Cân
Đục thạch nuôi lỏng trên MT Crapek

Phân lập nuôi trong môi trường Crapek ở 30°C trong 2-3 ngày
Cân
Tách khuẩn lạc cấy chấm điểm trên MT Crapek chứa cơ chất CMC
Nuôi lỏng trong MT Crapek ở 50°C, 5 ngày
Thu dịch enzyme
Xác định hoạt độ enzyme( phương pháp đo đường kính thủy phân)
Cấy thu bào tử
Thu dịch enzyme
Tuyển chọn và bảo quản giống
Mẫu
2.4.1. Phương pháp phân lập
Mẫu pha loãng từ 10
-1

÷10
-10
Chang trên đĩa petri
Quan sát hàng ngày
Tách bằng que cấy
Thuần
Giữ trên đĩa petri(4°C)
Tuyển chọn
2.4.2. Phương pháp tuyển chọn
2.5. Phương pháp phân tích :
2.5.1. Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch bằng phương pháp DNS :
• Nguyên tắc :
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid
dinitrosalysilic( DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ
đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành với bước sóng 540nm. Dựa
theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm
lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
• Xây dựng đường chuẩn glucose :
Nuôi lỏng trên MT Crapek có CMC trong 5 ngày
Thu dịch ly tâm(1000 rpm,3´)
Để 2h cho dịch thấm đều vào thạch sau đó chờ phản ứng ở
50°C, 20h
Đưa dịch vào giếng thạch
Bổ sung lugol trong 1 phút
Quan sát và đo đường kính thủy phân