PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hệ GLYCOPROTEIN TRONG HUYẾT THANH xác ĐỊNH BỆNH UNG THƯ máu

I. TỔNG QUAN
I.1. Bệnh ung thư máu
I.1.1. Khái niệm về huyết thanh người
Huyết tương – plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được
khi máu chống đông đã được laoij bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là
thành phần quan trong của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả tế trong
cơ thể, chiếm 55 – 60% thể tích máu.
Huyết thanh – serum là phần dịch lỏng trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại
bỏ các thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay các phần còn lại của huyết tương
sau khi đã loại bỏ các yếu tố đông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các
enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác … Nhue vậy, huyết thanh rất giống huyết
tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng
miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhieuf hoạt động sinh lý quan trong khác trong
cơ thể.
Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sang mà còn thêt hiện rất nhiều đặc
tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích
tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học.
I.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người
Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 – 5 lit huyết thanh vơi khoảng 200 -250
gr protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất
hiện trong huyết thanh tại một thười điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở
nồng độ rất thấp, cỡ mg/ml. Đây là mẫu rất giầu protein với hàm lượng thay đổi từ 60
-80mg/ml.
Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99%
lượng protein tổng số, trong đó có albumin, immunoglobin, transferring, haptoglobin,
lipoprotein, … Ngoài ra còn có rất nhiwwuf protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc
rất thấp nhưng lại giữ các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả
của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật, … Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết
thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương
pháp nghiên cứu khác nhau đề phát hiện chúng.
Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở

người. Một số protein có hàm lượng cao ( mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ
35 – 50 mg/ml ( chiếm từ 50 – 70%), do sự tổng hợp hang ngày ở gan ( khoảng 12g) và
có thời gian bán hủy là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy
dinh dưỡng. Immunoglobulin (IgG ) khoảng 5 – 7 mg/ml chiếm từ 8 – 10%. Các protein
có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như
interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 ( CA – 125), β
2
– microglobulin …
thông thường thay đổi từ 0 – 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao
trong chuẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý.
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị
sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ưng thư buồng trứng ( CA 15 – 3 ),
ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan ( α – fetoprotein ) và các bệnh về tim mạch ( c
– reactive protein). Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng
nhỏ các chỉ thị sinh học này được phát hiện và sử dụng cho mục đích chuẩn đoán.
I.1.3. Chức năng của protein trong huyết thanh
Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là
môi trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp,
chứ hang nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau. Dựa theo chức năng, có thể
phân chia protein huyết thanh các nhóm sau:
Chức năng miễn dịch: bao gồm các Ig ( đó là IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ
thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như: tăng thực bào, phản ứng đạc hiệu với kháng
nguyên ( peptide, vi khuẩn, virus, …).
Chức năng đông máu: gồm các chất đông máu và các chất chống đông ( AT III,
protein C, protein S … ) tham gia vào quá trình đông máu và bảo vệ cơ thể.
Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: trong huyêt thanh, protein tạo thành dung
dịch keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm.
Chức năng xúc tác: enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá
trình sinh học từ đơn gian đến phức tạp nhất.
Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và

vận chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hóa như: transferring
vận chuyển sắt, haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol. Vận
chuyển các protein cần thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô.
Chức năng điều hòa: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ ( mg/ml) nhưng
có vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone,
cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme.
I.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam
Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam ( 1975 1987) đã phân loại vá protein
trong huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết ra từ các mô rắn, các
immunoglobulin miễn diuchj, các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất
tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai.
Hệ thống phân laoij này được thừ nhậ rộng rãi và trích dẫ lại trong các nghiên cứu
của Abderson ( 2002).
I.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh
Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lướn nhất và cũng là
một mẫu nghiên cứu hấp dẫn. Sựu hấp dẫn của huyết thương đối với việc chuẩn đoán
bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu
không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái cảu cơ thể ở một
thời điểm đặc biệt nào đó. Trong khi đó, những mấu khác như nước bọt, nước mắt, nước
tiểu, da, tóc chỉ được coi là một tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương
và phản ánh hoạt động cảu tế bào.
Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứ nhiều protein có nuồn
gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác
nhau trong cơ thể. Chính vì vậy phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ
nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn mang lại nhiều
thông tin bổ ích đẻ phát triển các công tác nghiên cứu, chuẩn đoán và chữ trị nhiều bệnh
khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư.
Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến
các quá trình bệnh lý ( bảng 1). Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa
đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử

dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang được minh
chứng qua những thành tự được trong nhiều thập kỷ qua.
Thực tế là nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi
chứng ta biết đến sự tồn tại của gen. Năm 2002 Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc
ký lỏng khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh. Năm
2004, Chan và cộng sự bằng phương pháp điện di, sắc ký lỏng đa chiều – khối phổ đã
phát hiện được 1444 protein và gần đây nhất 2005, theo kết quả xác định và so sánh của
35 phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO ( Human
Proteome Organization), cin số này đã là 3020. Lượng thông tin phong phú do các nghiên
cứu về proteome huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền về
các nghiên cứu genome. Với những cải tiến nhanh chóng, cá kỹ thuật phân tích
proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genome. Với những cải tiến nhanh
chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của
genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo
trong những nghiên cứu về sinh – y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm
chuẩn đoán và chữa bệnh tương lai.
I.2. UNG THƯ MÁU
I.2.1. Ung thư máu là gì
Ung thư máu như máu trắng, ung thư hạch, đa u tủy đáp ứng thuốc tốt hơn so với
các khối u rắn. Đa u tủy (hoặc u tủy) là một loại ung thư máu trong tủy xương cũng có
loại thuốc mới nhắm thắng vào khối u và có thể kéo dài thời gian thuyên giảm. Ung thư
máu được coi là hiếm, khi nó xếp hạng thứ 9 và 10 trong danh sách của hầu hết các bệnh
ung thư phổ biến. Trong số đó, đa u tủy phổ biến thứ 2, tỉ lệ 1/100,000 người mắc bệnh u
tủy. Tại Singapore, hàng năm có khoảng 80 đến 100 trường hợp. Tích lũy lại, sẽ có
khoảng 500 đến 700 người u tủy tại một thời gian nhất định vì nó có thể được điều trị tầm
xoát (không hoàn toàn khỏi bệnh) và giúp bệnh nhân kéo dài tuổi thọ lâu hơn.
Trong khi ung thư hạch là một túi hỗn hợp của hơn 40 loại bệnh ung thư máu, u
tủy liên quan đến bệnh ung thư của các tế bào huyết tương chiếm khoảng một phần trăm
các tế bào trong tủy xương. Chức năng của các tế bào huyết tương giúp sản xuất kháng
thể để chống nhiễm trùng.

Trong u tủy, cơ thể sản xuất lượng bạch cầu quá mức dẫn đến sự hình thành của
khối u trong tủy xương được gọi là myelomas. Nó có thể ăn vào xương gây đau xương
hoặc gãy xương và cũng có thể gây suy thận vì protein quá nhiều trong máu và thiếu
hồng cầu. Sự phát triển tế bào u tủy thường ảnh hưởng đến những người trong độ tuổi 60
và cao hơn mặc dù bệnh nhân có thể là trẻ ở tuổi 40, có một tỷ lệ thấp trong số các người
châu Á tuy nhiên so với người Mỹ da đen thì nguy cơ mắc bệnh cao hơn người da trắng.
“Tuy nhiên, u tủy thường phát hiện sớm và trở thành nặng theo quá trình lão hóa.
Mặc dù hầu hết các bệnh nhân thường có dấu hiệu đau xương, thiếu máu hoặc suy thận.
Đây không phải triệu chứng bình thường được chẩn đoán khi bệnh nhân phát hiện khi
kiểm tra sức khỏe tổng quát, và có dấu hiệu bất thường trong máu”: bác sĩ Daryl Tan giải
thích.
Một bệnh nhân của ông, 56 tuổi là một trường hợp bệnh nhân thiếu máu và lượng
protein trong máu cao và có nhiều dấu hiệu bất thường trong máu. Sau đó, ông được gởi
cho bác sĩ Daryl Tan làm sinh thiết tủy xương và phát hiện u tủy giai đoạn đầu. Khi
chúng tôi nhận bệnh nhân, ở giai đoạn đầu ông đã không phát triển các vấn đề về thận
hoặc gãy xương và ông ta đang được hóa trị liệu.
I.2.2. Nguyên nhân gây ung thư máu
I.3. Proteomic trong ung thư máu
Phần này nói về các biomarker
Proteomics trong nghiên cứu ưng thư là nghiên cứu hệ protein để tìm kiếm những protein
chỉ thị cho các phương pháp chẩn đoán mới, kháng nguyên để tạo vaccine cũng có thể là
những yếu tố tác nhân gây độc khác, hay được gọi là biomarker.
Phần này các cậu cop lại hộ d với. hix từ bản tl proteomic trong phát hiện ung thư đó
được mấy trang đó.
II. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HỆ GLYCOPROTEIN TRONG HUYẾT THANH
XÁC ĐỊNH BỆNH UNG THƯ MÁU
Tiến bộ gần dây trong nghiên cứu protein đã cung cáp cơ họi cho việc tìm kiếm các
biomarker trong huyết thanh. SELDI-TOP-MS là công cụ mới đã được chứng minh rằng
cso khả năng mạnh me trong việc phát hiện các biomarker tiềm năng. Gần đây SELDI-
TOP-MS đã được sử dụng thành công để xây dựng các biomarker đối với các bệnh ung

thư khác nhau như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bàng quang, ung thư buồng trứng, ung
thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư vú và ung thư tuyến tụy….
Sử dụng SELDI-TOP-MS để phân tịch các proteome các dòng tế bào bạch cầu, dòng
hỗn hợp (MLL) và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Sự khác biệt trong biểu hiện protein được
báo cso trong tất cả các dong MLL, AML, và ALL. Một số protein 8,3kDa đã được tìm
thấy thể hiện ở mức độ cao trong ALL và đã được xác định như 1 mẫu đầu C bị cắt ngắn
sau khi bị ubiquitin hóa và thủy phân bằng trypsin.
Trong nghiên cứu của 1 nhóm tác giả người Trung Quốc gần đây lần đầu tiên sử dụng
công nghệ SELDI-TOF MS cho tất cả các mẫu huyết thanh thu thập được sau đó tinh
khiết các peak protein của các biomarker tiềm năngn bởi HPLC và cuối cùng xác định
chúng bằng LC-MS/MS.
II.1. Chuẩn bị mẫu
178 mẫu huyết thanh được thu thập từ 94 bệnh nhân bị bệnh bạch cầu lympho cấp tính
(ALL), 30 bệnh nhân bị bệnh bạch cầu u tủy cấp tính (AML) và 54 người khỏe mạnh.
Mẫu huyết thanh thu thập được ngay lập tức ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4°C trong 10
phút. Sau đó phân phối các mẫu vào các tube (20µl/tube) và được bảo quản ở -80°C để
phục vụ cho các phương pháp nghiên cứu tiếp theo.
II.2. Phân tích hệ protein trong mẫu huyết thanh bằng phương pháp
SELDI-TOF-MS
Các loại protein trong mẫu huyết thanh đã được xác định bởi SELDI-TOF-MS
bằng cách sử dụng 8 loại đánh dấu định dạng tại chỗ WCX2 (trao đổi cation yếu) trên bản
proteinchip arrays.
Quy trình được thực hiện như sau:
1. Mẫu huyết thanh được giã đông từ từ trên đá, ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4°C trong
5 phút.
2. Lấy 10µl mẫu được biến tính bằng cách bổ sung 20µl dung dịch đệm U9 (9 M
urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris-HCl, 1% DTT, pH 9.0), votex ở 4°C trong 30 phút.
3. Mẫu pha loãng trong 108µl dung dịch đệm (0.1 M sodium acetate, pH 4.0).
4. Lấy 100µl mẫu huyết thanh đã pha loãng lai với WCX2 trên bản proteinchip. Các
mẫu được giữ bởi 1 bioprocessor (Ciphergen Biosystems) và được kích hoạt hai

lần với 150µl đệm (0.1 M sodium acetate, pH 4.0) ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Mẫu huyết thanh pha loãng để phản ứng với bề mặt của chip WCX2 trong 60 phút
ở nhiệt độ phòng.
5. Sau đó, mỗi điểm được rửa 3 lần với bộ dung dịch đệm ở những PH khác nhau và
loại bỏ các loại protein không lai.
6. Làm khô bề mặt mảng chip trong không khí. Bổ sung 1µl giá thể axit bão hòa
(SA) trong ACN50% và TFA 0,5%, để khô.
7. Phân tích khối phổ được thực hiện trên PBS II proteinchip đọc (Ciphergen
Biosystems). Phát hiện các peak của phổ khối đã được phân tích bằng cách sử
dụng phần mềm ProteinChip Biomarker version 3.1 (Ciphergen Biosystems). Các
quang phổ khối lượng của các protein được tạo ra bằng cách sử dụng trung bình
của 90 bức ảnh tia laser tại một cường độ laser 150-160 đơn vị tùy ý, và độ nhạy
phát hiện đã được thiết lập ở mức 8. Đối với thu thập dữ liệu của các protein trọng
lượng phân tử thấp, phạm vi phát hiện đã được thiết lập 5-20 kDa cho tất cả các
mẫu. M / z của mỗi đỉnh được định lượng (tỷ lệ S / N> 5) đã được xác định theo
tiêu chuẩn bên ngoài hiệu chuẩn (Ciphergen Biosystems). M / z đỉnh mẫu với hơn
2000 m / z được bình thường hóa với Biomarker wizard để biên dịch tất cả quang
phổ và tự động phát hiện định lượng đỉnh khối lượng.
8. Tin sinh học và thống kê sinh học
9. Mẫu huyết thanh được chia thành hai nhóm, một nhóm thực nghiệm và 1
nhóm thử nghiệm. Bốn mươi lăm mẫu từ bệnh nhân bị bệnh ALL và 34 người
khỏe mạnh đã được chọn ngẫu nhiên cho nhóm mẫu thực nghiệm. Để đánh giá
tính chính xác và hợp lệ của các cây phân loại, 49 mẫu từ bệnh nhân bị bệnh ALL
và 50 mẫu để so sánh (20 mẫu từ người khỏe mạnh và 30 mẫu từ bệnh nhân bị
bệnh AML) được lựa chọn cho các thiết lập thử nghiệm.
10.
11. Tập hợp các phổ của các mẫu huyết thanh của mẫu thực nghiệm được đơn
giản hóa nhờ phần mềm Ciphergen ProteinChip (phiên bản 3.1). Các peak được
thực hiện bởi phần mềm Biomarker Wizard. Hai mẫu thử nghiệm được sử dụng để
so sánh cường độ khác nhau của các trường hợp và của các nhóm mẫu. Giá trị tới

hạn p=0,05. Cường độ của các peak được lựa chọn được chuyển đến phần mềm
Pattern Biomarker (BPS) để xây dựng cây phân loại của bệnh ALL. Căn cứ vào độ
cao của các peak, một ngưỡng đã được xác định bởi BPS để phân loại các nút gốc
thành 2 nút con. Nếu cường độ đỉnh cao của một mẫu mù thấp hơn hoặc bằng
ngưỡng, đỉnh cao này sẽ được dán nhãn là "nút con bên trái." Cường độ cao điểm
cao hơn ngưỡng này sẽ được đánh dấu là "nút con bên phải." Sau khi ra quyết
định, tập mẫu thực nghiệm đã được tìm thấy sẽ được phân biệt với lỗi ít nhất.
12. Tất cả các cường độ protein cao điểm của các mẫu trong tập mẫu thử nghiệm
được đánh giá bởi BPS sử dụng mô hình phân loại. Các mẫu ALL và kiểm soát sau
đó được phân biệt dựa trên những đặc điểm cá nhân proteomic của họ. Nhạy cảm
đã được định nghĩa là xác suất dự đoán tất cả các trường hợp, và đặc hiệu đã được
định nghĩa là xác suất dự đoán các mẫu kiểm soát. Một tiên đoán giá trị tích cực
phản ánh xác suất của tất cả các kết quả xét nghiệm là dương tính.
II.3. Phân đoạn Protein
Mẫu huyết thanh từ người khỏe mạnh và bệnh nhân đã được lựa chọn cho việc
tinh sạch của bốn loại protein biomarker. Mẫu huyết thanh được trộn với dung dịch
đệm U9 (9 M urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris-HCl, 1% DTT, pH 9.0) và ủ trong 30
phút ở nhiệt độ phòng. Mẫu sau đó được pha loãng trong 5ml dung dịch đệm WCX
(50 mM NaAc, pH 4.0) và được nạp vào cột CM Ceramic Hyper D WCX SPE (6 × 10
mm, Pall Life science, USA). Sau khi rửa với 2ml dung dịch đệm WCX, cột sẽ được
rửa với 5ml dung dịch đệm rủa giải (2 M NaCl, 50 mM NaAc, pH 4.0) với tốc độ
dòng chảy là 5 ml/phút. Các phần rửa giải sẽ được tinh chế tiếp bằng phương pháp
HPLC.
II.4. Tinh sạch các chỉ thị protein bằng phương pháp HPLC
HPLC được thực hiện bằng cách sử dụng máy SCL-10AVP (Shimadzu, Japan)
với 1 cột C18 Sunchrom (250 x 4,6mm, kích thước hạt 5µm, 300A°) và 1 cột bảo vệ C18
(10 x 3 mm). Giai đoạn di động bao gồm các dung môi A (ACN 5%, TFA 0,1% ) và
dung môi B (ACN 90%, TFA 0,1%). Tách HPLC đã đạt được với một gradient dung môi
tuyến tính: 100% (0 phút) -15% B (15 phút) 65% B (65 phút) -100% B (100 phút) với
tốc độ dòng chảy 0,5 ml /phút. Các chất rửa giải ra ngoài được phát hiện ở nhiều bước

song 214, 254 và 280 nm. Mỗi peak được thu thập và tập trung sử dụng SpeedVac, và
sau đó phân tích bằng cách sử dụng AXIMA-CFRTM kết hợp với MALDI-TOF-MS
(Shimadzu/Kratos, Manchester, UK) trong chế độ tuyến tính để theo dõi các protein chỉ
dấu sinh học với α-cyano-4-hydrorycinnamic acid (CHCA).
II.5. Xác định các protein biomarker bằng phương pháp LC-MS/MS
Trong giải pháp tiêu hóa của mỗi phần nhỏ tập trung, trong đó có chứa một protein
biomarker, được thực hiện với một giao thức chuẩn. Mỗi phần nhỏ được hòa tan trong 25
mM NH4HCO3, giảm 10 DTT mM trong 1 giờ, và Alkylated 40 iodacetamide mM trong
tối trong 45 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 40 mM DTT đã được bổ sung để làm dịu cơn
iodacetamide trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Protease K (0,1 mg, Tổng công ty
Promega, USA) sau đó đã được thêm vào dung dịch mẫu và ủ trong 45 phút ở 37 °
C. Tiêu hóa đã được ngừng lại bằng cách thêm axit formic đến một nồng độ cuối cùng là
0,1%. Các mẫu tiêu hóa đã được nạp vào một cột C18 tự chế (100 mm x 100 micromet)
đóng gói với các vật liệu đóng gói Sunchrom (SP-120-3-ODS-A, 3 micron) và tiếp theo
nano-LC-ESI-MS/MS phân tích. Quang phổ kế LTQ đại chúng được hoạt động ở chế độ
phụ thuộc vào dữ liệu đầu tiên MS ban đầu quét ghi lại phổ khối lượng (m / z) tỷ lệ của
các ion trên phạm vi khối lượng từ 400-2000 Da. Năm ion nhiều nhất đã được tự động
lựa chọn để sau đó va chạm kích hoạt phân ly. Tất cả các dữ liệu MS / MS được tìm kiếm
đối với một cơ sở dữ liệu protein của con người tải về từ cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng
chương trình SEQUEST (nhiệt, USA)
II.6. Xác nhận proteinr biomarker bằng cách sử dụng immunoassays
ProteinChip
Để xác nhận danh tính của các chỉ thị sinh học protein, các kháng thể cụ thể (chống
PF4 kháng thể thỏ, ab49735, chống NAP-2 kháng thể chuột, ab58142, chống C3a kháng
thể chuột, ab11872) đã được áp dụng cho từng vị trí của tiền -kích hoạt PS20 các mảng
ProteinChip (Ciphergen hệ thống sinh học) và ủ qua đêm ở 4°C trong một căn phòng
ẩm.Sau khi ngăn chặn với BSA và rửa, tráng điểm kháng thể được ủ với 1,5 ml mẫu
huyết thanh và 3 ml dung dịch đệm (0,1 M Na 3 PO 4 , 0,5 M urea, chaps 0,5%, pH =
7,2) cho 90 phút. Điểm Nóng sau đó rửa sạch với PBST (0,5% Triton X-100), PBS và
nước khử Ion hóa hai lần trước khi sấy. Phân tích SELDI-TOF-MS đã được thực hiện

trên của PBS II ProteinChip đọc với CHCA
II.7.
III. MỘT SỐ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC TRONG NGHIÊN CỨU
Đề bài của chúng mình là xây dwungj phương pháp vậy có cần nói phần này ko hay
nếu nói thì nói như thế nào
III.1. Hồ sơ và dữ liệu protein huyết thanh
Tất cả các mẫu huyết thanh từ người bệnh đã chọn sau đó được cho vào các ống
nghiệm mỗi ống 20ml huyết thanh, bảo quản ở -80
o
C đến khi sử dụng. Các thí nghiệm
SELDI-TOP-MS được hoàn thành trong 3 tháng sau khi các mẫu được lấy về và bảo
quản. Không có sự thay đổi về protein có ý nghĩa nào trong quá trình bảo quản khi phân
tích SELDI-TOP-MS và MALDI-Top-MS.
Các mẫu huyết thanh từ tập hợp đó được đánh giá bằng cách so sánh các kết quả thu
được bằng SELDI-TOP-MS với kết quả từ WCX2-chip. Tất cả các dữ liệu MS được lưu
trữ và bình thường hóa bằng cách sử dụng toàn bộ ion hiện có. Các nhóm peak được tạo
ra bởi phần mền Biomarker Wizard. 26 peak khác nhau cso ý nghĩa thống kê giữa bệnh
nhân và người khỏe mạnh ( mức ý nghĩa p <0,05). Trong nhóm bệnh nhân ALL, 5 peak
protein được tìm thấy là trên quy định và 21 peak là dưới quy định. Bảng 1 chỉ ra hồ sơ
protein của huyết thanh từ tất cả các mẫu bệnh nhân và mẫu kiểm soát. Kết quả cho tháy
2 peak protein ( 8137 m/z, p=6,07E-5 và 8937 m/z, p=5,13E-5) là cao hơn quy định ở
nhóm người bệnh ALL, trong khi đó 2 peak khác là 7769 m/z và 9290 m/z là nhỏ hơn
quy định ở người bình thường.
III.2. Phát hiện và xác nhận các peak protein
Để phát triển mô hình biomarker, cường độ các peak protein trong tập hợp mẫu ( the
training set) được đưa đến BPS. Tổng cộng 7 peak ( 9,290 m/z, 7769 m/z, 15,110 m/z,
7564 m/z 4469 m/z, 8937 m/z, 8137 m/z) có cường độ khác biệt cao nhất để lựa chọn tự
dộng cho việc xây dựng biểu đồ cây phân loại.
Hình 2 cho thấy cấu trúc biểu đồ cây và sự phân bố mẫu. Biểu đồ cây phân loại sử
dugnj sự kết hợp cảu 5 peak đã xác định 45 đối tượng ALL và 34 người khỏe mạnh với

độ nhạy 96% và độ đặc hiệu là 98%.
Để xác định tính chính xác và tính hợp lý của mô hình phân loại lấy từ tập hợp mẫu,
chúng tôi áp dụng cây phân loại gốc từ 1 dữ liệu thí nghiệm gồm 49 đối tượng ALL và 34
đối tượng khỏe mạnh với độ nhạy là 91,8% và dộ dặc hiệu là 90% , giá trị dự đoán dương
được tìm thấy là 90%.
III.3. Tinh sạch và nhận biết các biomarker có khả năng
Mẫu huyết thanh từ các bệnh nhân được sử dụng để tinh sạch 2 biomarker protein trên
quy định ( 8137 m/z và 8937 m/z); mẫu huyết thanh từ các đối tượng sức khỏe được kiểm
soát được sử dụng để tinh sạch 2 biomarker protein dưới quy định ( 7769 m/z và 9296
m/z) trong huyết thanh của các bệnh nhân ALL sử dụng phần mềm WCX SPE và HPLC
C18.
Hình 3 chỉ ra kết quả phân tích MALDI-TOP-MS của 4 biomarker protein đã tinh
sạch
Sau khi thủy phân bằng protease, hỗn hợp peptide được phân tích bằng nano LC-
MS/MS. Hình 4 chỉ ra kết quả của LC-MS/MS. (A): MS/MS quang phổ của 2 peptide
xác định (B,C): từ protein ( 9290 m/z). Bảng 3 chỉ ra kết quả việc xác định 4 biomarker
CTA-III ( mảnh tiền tiểu cầu dựa trên protein tiền thân, PBP,9290 m/z), PF4 ( yếu tố tiểu
cầu 4, 7769) và 2 mảnh của C3a ( một trong những bổ sung, 8137 và 8937 m/z). Sự kết
hợp của đảm bảo trình tự cao và sự chính xác của phép đo khối lượng của phương pháp
MALDI-TOP-MS cung cấp đầy đủ trình tự của 4 biomarker protein.
III.4. Xác nhận 4 biomarker
Để xác nhận danh tính của 4 laoij protein PF4, CTAP-III và 2 hai mảnh C3a chúng tôi
thực hiện phân tích kháng nguyên ( immunoassay) với kháng thể đặc hiệu chống lại 4
protein cố định trên Proiein Chip.
Kết quả chỉ ra rằng CTAP-III và PF4 bị bắt giữ và phát hiện trong huyết thanh người
khhoer mạnh nhưng không trong tất các bệnh nhân, và các mảnh của C3a có trong huyết
thanh bệnh nhân nhưng không có trong người khỏe mạnh.
Hình 5
IV. THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu tác giả thu được quang phổ khối của protein huyết thanh từ

người bệnh và người thường bằng cách sử dụng SELDI-TOP-MS trong suốt quá trình
nghiên cứu. Chúng tôi đã thử trên các chip SCX2, WCX, IMAC-Cu, IMAC-Ni và H4 cho
các mẫu huyết thanh. Cuối cùng tìm thấy các protein được phát hiện nhiều hơn khi sử
dụng protein chip WCX cho mẫu nghiên cứu huyết thanh ( dữ liệu không được nêu trong
bài này).
Dự trên hồ sơ hệ protein huyêt thanh chúng tôi xây dựng mô hình phân laoij để
phân biệt tất cả các bệnh nhân ALL từ nhóm sức khỏe được kiểm soát. Chúng tôi sử dụng
cách tiếp cận 2 bước sang lọc biomarker protein. Đầu tiên chúng tôi sử dụng chương trình
để xác định các protein biểu hiện khác nhau và sự phân biệt cá peak protein từ BPS cho
việc xây dựng cây phân loại. Mô hình phân loại phân biệt bệnh nhân với ALL từ các đối
tượng sức khỏe kiểm soát và AML với độ nhạy 91,8 % và dộ đăch hiệu 90%.
- 2 biomarker dưới quy định nhận biết là PF4 và CTAP-III
- 2 biomarker trên quy định nhận biết là 2 mảnh của C3a.
Trong số các protein được xác định bằng LC/MS/MS, cả PF4 và CTAP-III đều là
các chemokine có nguồn gốc từ tiểu cầu. PF4 còn được goi là CXCL 4 có mặt trong α hạt
tiểu cầu và được giải phóng trong quá trình tập hợp tiểu cầu. PF4 cũng bị giải phóng từ
sự hoạt hóa tế bào lympho T và tế bào mast. PF4 được cho rằng có ảnh hưởng đến nhiều
quá trình sinh học bao gồm phát triển tế bào mô, sự di cư và sự hình thành mạch. PF4 có
thể dưới quy định khi tăng sinh tế bào và giải phóng cytokine, do đso nó ức chế chức
năng tế bào T và có thể hỗ trợ sự sống còn cảu các tiền chất tạo máu bình thường, bảo vệ
chúng khỏi độc tính của các tác nhân hóa trị liệu.
CTAP-III là một sản phẩm phân cắt đầu N của PBP, cái được tổng hợ từ
mekaryocytes. CTAP-III, β-theomboglobulin và NAP-2 có nguồn gốc từ PBP thông qua
sự phân giải protein thuộc về 1 nhóm tương đồng và miễn dịch qua phản ứng protein có
nguồn gốc từ α hạt tiểu cầu. Có báo cáo cho rằng CTAP-III có thẻ hỗ trợ tế bào máu gốc.
Cả PF4 và CTAP-III có thể bảo vệ sớm tế bào gốc khỏi những ảnh hưởng độc hại của các
tác nhân hóa trị liệu khác nhau. Vermencilen cho rằng mức trung bình PF4 và CTAP-III
dưới quy định trong huyết thanh của các bệnh nhân phơi nhiễm benen so với các đối
tượng sức khỏe được kiểm soát.
Cấu tử bổ sung đóng vai trò quan trọng như tác nhân trung gian của đáp ứng viêm

và đáp ứng miễn dịch. Cấu tử 3, cái được hình thành từ chuỗi α và β là thành phần bổ
sung nhiều nhất trong huyết thanh (1,2mg/ml). Emzyme Complement 3 convertase có thể
căt C3 tại Arg726 –Ser727, tăng C3b và C3a. C3a được cho là 1 chất trung hòa trung gian
chứng viêm của phản ứng miễn dịch bẩm sinh. C3a đại diện cho 1 biomarker của chứng
viêm. C3a được tìm thấy trong các dịch ascetic của bệnh nhân ung thư buồng trứng, Lee
cho rằng C3a bị gia tăng ở bệnh nhân viêm gan C, ung thư biểu mô tế bào gan HCV liên
quan. Mảnh C3a 8,1kDa ddowcj tìm thấy ở lần đầu tiên.
Tóm lại chúng tôi xác định được 1 tập hợp các peak protein từ các mẫu huyết
thanh của bênh nhân ALL. Từ các peak protein cụ thể của các đối tượng chúng tôi xác
định các yếu tố tiểu cầu PF4, 1 đoạn của tiền tiểu cầu CTAP-III và C3a là biomarker
protein tiềm năng cho phát hiện bệnh ở bện nhân ALL. Bảng số liệu các marker này có
thể được giới hạn để phân biệt bệnh nhân ALL từ người khỏe mạnh và từ người AML.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Jae-Yong Kwak , Tian-Ze Ma ,Min-Jeong Yoo , Bok Hee Choi , Han-Gyu Kim , So-
Ri Kim , Chang-Yeol Yim , Yong-Geun Kwa , “The comparative analysis of serum
proteomes for the discovery of biomarkers for acute myeloid leukemia”,
Experimental Hematology, Volume 32, Issue 9 , Pages 836-842, September
2004.
2. Linan Shi
1,2†
, Jun Zhang
3†
, Peng Wu
1
, Kai Feng
3
, Jing Li
1,2
, Zhensheng Xie

1
,
Peng Xue
1
, Tanxi Cai
1
, Ziyou Cui
1,2
, Xiulan Chen
1,2
, Junjie Hou
1,2
, Jianzhong
Zhang
3*
and Fuquan Yang
1
, “Discovery and identification of potential biomarkers
of pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia”, Proteome Science 2009, 7:7.
3. M. Francisco, H. Peter. Plant proteome analysis. Proteomics 4 (2004): 285-298.
4. Sigrun M Hjelle
1
, Rakel B Forthun
1
, Ingvild Haaland
1
, Håkon Reikvam
1
, Gry
Sjøholt

3
, Øystein Bruserud
1,2
and Bjørn T Gjertsen, “Clinical proteomics of
myeloid leukemia”, Genome Med 2010, 2:41.
5.
6.
7.
8.