bước đầu nghiên cứu xác định sự sai khác di truyền trên gen mc1r quy định màu sắc lông trên một số cá thể dê thuộc các giống dê alpine, dê beetal, dê boer, dê jamnapari

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
I. Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề.
Khoa học di truyền đạt được những đỉnh cao ngay từ đầu thế kỷ 21, thế kỷ của
sinh học với những thành tựu nổi bật của sinh học phân tử đặc biệt là công nghệ
gen. Nhờ các kỹ thuật di truyền phân tử: kỹ thuật tách ADN, kỹ thuật nhân gen
PCR (Polymeraza Chain Reaction), kỹ thuật cắt gen RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphisms) và giải trình tự gen cho phép chúng ta tiến hành xác định
một kiểu gen nào đó và gọi tên chính xác kiểu gen có liên quan đến tính trạng mà
ta cần nghiên cứu ở mức phân tử. Các nhà khoa học đã chứng minh sự biểu hiện
của các tính trạng là do gen quy định. Mỗi tính trạng có thể do một hoặc nhiều gen
tác động và từ đó tạo nên tính đa dạng cho quần thể. Sự đa hình của các nucleotit
hay chính là sự sai khác về trình tự các nucleotit làm nên sự đa dạng di truyền của
mỗi gen.
Melanocortin receptor 1 (MC1R) là một gen được biết đến với vai trò điều
khiển màu lông ở động vật có vú. Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu
về gen quy định màu lông ở động vật có vú bao gồm nghiên cứu trên trâu bò
(Klungland và cs, 1995), trên ngựa (Marklund và cs, 1996), cáo (Vage và cs, 1997),
gà (Takeuchi và cs, 1997) cũng đã có nghiên cứu về MC1R trên dê (Li và cs,
2002). Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tử
vào trong chăn nuôi đã và đang được triển khai rộng rãi. Tuy nhiên công việc này
chủ yếu thực hiện trên lợn, bò và gia cầm. Chăn nuôi dê ở Việt Nam ngày càng phát
triển với cả các giống dê nội và ngoại nhập. Các giống dê nhập ngoại hiện đang
nuôi ở nước ta có đặc điểm ưu việt về tính trạng sản xuất sữa, thịt hoặc cả hai. Màu
lông của chúng thường đồng nhất. Bộ lông là biểu hiện bên ngoài của một con vật.
1
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
Bộ lông óng mượt và có màu sắc đặc trưng của giống chứng tỏ con vật đó sinh
trưởng phát triển tốt. Thậm chí màu sắc lông còn tham gia trong quá trình chọn lọc
giống và định hướng sử dụng giống vật nuôi. Bộ lông mà con vật sở hữu có thể là
kết quả tổng hợp của nhiều yếu tố như dinh dưỡng, môi trường chăn nuôi, khả năng

thích ứng với môi trường sống và một yếu tố được coi là nguồn gốc làm nên màu
sắc bộ lông giúp chúng ta phân biệt giống này với giống khác chính là gen MC1R.
Nhằm hướng tới đánh giá sự đa dạng di truyền trong quần thể vật nuôi nói chung,
loài dê nói riêng đồng thời để có định hướng trong chọn lọc và sử dụng một số
giống dê ngoại nhập có năng suất cao cũng như góp phần làm phong phú đa dạng
quỹ gen vật nuôi trên ngân hàng gen thế giới, việc tìm hiểu về MC1R, xem xét mối
tương quan của MC1R với màu lông của dê là cần thiết. Sử dụng các kỹ thuật di
truyền phân tử chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu xác
định sự sai khác di truyền trên gen MC1R quy định màu sắc lông trên một số cá
thể dê thuộc các giống dê Alpine, dê Beetal, dê Boer, dê Jamnapari nuôi ở Trung
tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây- Hà Nội”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
• Tìm hiểu vể gen MC1R
• Hiểu và thao tác các kỹ thuật di truyền phân tử: phương pháp tách chiết ADN,
phương pháp nhân gen PCR, phương pháp giải trình tự.
• Xác định vị trí sai khác trên gen MC1R quy định màu sắc lông ở một số cá thể
dê nhập ngoại nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây- Hà Nội.
2
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
II. Tổng quan tài liệu
2.1. Khái niệm về gen
Tính trạng nếu được truyền từ thế hệ này sang thế hệ kế tiếp theo một phương
thức nhất định được gọi là tính trạng di truyền. Toàn bộ tính trạng biểu hiện bên
ngoài mà ta có thể quan sát hoặc đo đếm được gọi là kiểu hình, còn toàn bộ yếu tố
di truyền tạo nên kiểu hình được tiềm ẩn bên trong được gọi là kiểu gen. Tác động
kiểu gen lên kiểu hình thường rất khác nhau có những tính trạng được kiểm soát
đơn giản, nhưng cũng có tính trạng lại chịu tác động phức tạp.
Khái niệm về gen như một đơn vị di truyền tách biệt được phát hiện nhờ phép
phân tích lai của Mendel được W.Johansen đưa ra vào năm 1900. Theo Johannsen
tính trạng của cơ thể được xác định bởi mầm mống đặc biệt, tách biệt và độc lập,

nói ngắn gọn hơn bởi cái chúng ta gọi là “gen”. Quan niệm đó về gen tồn tại suốt
cả giai đoạn phát triển của di truyền học kinh điển. Từ đó đến nay bản chất của gen
là vấn đề trung tâm của di truyền học, luôn luôn phản ánh ở dạng cô đọng nhất
mức độ phát triển, thành tựu và những vấn đề chưa được giải quyết của di truyền
học.
Trong khoảng thời gian đó không những người ta tìm ra cơ sở vật chất của gen
mà chính bản thân gen là một đoạn của phân tử ADN đã trở thành đối tượng và
phương tiện kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học. Người ta giải mã được cấu
trúc sơ cấp của hàng ngàn gen, làm sáng tỏ những đặc điểm cơ bản và tính đa dạng
trong cấu tạo của chúng ở các đối tượng khác nhau. Ngày nay chúng ta biết rằng
“gen không phải là đơn vị tái tổ hợp mà là đơn vị cấu trúc của thông tin di truyền
không thể phân nhỏ hơn nữa về phương diện chức năng”.
3
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
Gen hiện nay được hiểu theo nghĩa đơn giản là một đoạn của phân tử ADN mã
hoá cho phân tử ARN chức năng.
Một gen là một thực thể hoàn chỉnh và bền vững nhưng cũng có thể bị thay đổi
trong trình tự nucleotit, thay đổi đó được gọi là đột biến.
Gen sắp xếp theo trình tự nối tiếp nhau trong nhiễm sắc thể. Năm 1910 Morgan
đã phát hiện ra gen nằm trong nhiễm sắc thể. Trong thực tế số lượng gen của một
cơ thể lớn hơn rất nhiều số lượng nhiễm sắc thể có trong tế bào. Nhiễm sắc thể
chứa một phân tử ADN dài liên tục bao gồm những vị trí đột biến trên phân tử
ADN làm cho trình tự nucleotit thay đổi.
Vậy một nhiễm sắc thể phải chứa nhiều gen. Các gen được xắp xếp và tương
tác với nhau.
2.2. Cấu trúc ADN
Ở phần lớn sinh vật, vật chất di truyền là chuỗi xoắn kép ADN. ADN có những
đặc điểm sau: Một là bền vững, vì thông tin di truyền cần hoạt động chức năng
trong khoảng thời gian 100 năm hoặc hơn nữa. Hai là ADN có khả năng sao chép,
đảm bảo thông tin di truyền trong các tế bào mới sinh ra được duy trì trong các quá

trình sinh trưởng và phát triển. Ba là, vật chất di truyền có khả năng bị biến đổi
chút ít (đột biến) điều này tạo điều kiện cho quá trình tiến hoá.
Axit nucleic là các heteropolymer cấu thành từ các monomer là các nucleotit.
Các monomer lại được cấu thành từ 3 thành phần: đường, nhóm photphat và bazơ
nitơ. Hai loại axit nucleic (ADN và ARN) có sự khác nhau trong hai thành phần
đường của nucleotit: một loại có đường deoxyribonucleic nên gọi là axit
deoxyribonucleic (ADN); còn một loại có đường ribonucleic vì vậy gọi là axit
ribonucleic (ARN). Các thành phần đường - photphat của nucleotit có tầm quan
4
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
trọng đối với việc xác định đặc điểm cấu trúc của polynucleotit, còn các bazơ nitơ
thì quy định thông tin chứa trong chúng.
Các nucleotit có thể được nối với nhau bằng mối liên kết photphodieste, làm
cho polynucleotit mang tính định hướng. Như vậy, đầu 5’ của một phân tử sẽ có
nhóm photphat tự do, còn đầu 3’ sẽ có nhóm hydroxyl. Trong phân tử mạch kép
của ADN chuỗi đường photphat được sắp xếp theo kiểu đối song song với 2 sợi có
định hướng ngược chiều nhau.
Các bazơ nitơ là những thành phần quan trọng của axit nucleic do chức năng
mã hoá của chúng. Trong ADN, các bazơ đó là Adenin (A), Guanin(G), Cytosin
(C) và Thymin (T). Trong ARN, Thymin (T) được thay thế thành Uracil (U) là bazơ
có chức năng tương đồng. Về phương diện hoá học, Adenin và Guanin thuộc nhóm
purin, chúng có cấu trúc mạch vòng kép, trong khi Cytosin, Thymin và Uracil
thuộc nhóm pyrimidin, chúng có cấu trúc mạch vòng đơn, và bởi cấu trúc không
gian của phân tử ADN do vậy sự bố trí duy nhất thoả mãn mọi điều kiện là sự kết
cặp các bazơ theo kiểu purin đi với pyrimidin. Các bazơ được duy trì vị trí của
mình bởi các mối liên kết hydro, có 2 mối liên kết như thế trong cặp bazơ A-T và
có 3 mối liên kết như thế trong cặp bazơ G-C.
Phân tử ADN trong cơ thể thường tồn tại ở dạng chuỗi xoắn kép phải gọi là
dạng B. Đó là cấu trúc do Watson và Crick tìm ra vào năm 1953.
5

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
Hình 1: Sơ đồ chuỗi xoắn kép ADN
2.3. Cấu trúc của gen
Thuật ngữ gen được dùng như một đoạn của thông tin di truyền được phiên mã
sang một phân tử ARN đơn lẻ, và tiếp đó thông tin di truyền từ phân tử này được
dịch mã sang một polypeptit nhất định. Các gen nằm trên các nhiễm sắc thể, và vị
trí trên nhiễm sắc thể nơi một gen định vị được gọi là locus của gen đó. Ở các sinh
vật lưỡng bội, các nhiễm sắc thể sắp xếp thành các cặp tương đồng. Trên cặp nhiễm
sắc thể tương đồng tại các vị trí tương ứng tồn tại các dạng khác nhau cùa cùng một
gen gọi là các alen. Phân tử ADN mạch kép có thể mang thông tin di truyền ở cả 2
6
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
sợi. Hiện nay có khá nhiều thuật ngữ dùng để chỉ 2 sợi của ADN mạch kép ví dụ
như sợi có nghĩa/ sợi đối nghĩa, sợi cộng/ sợi trừ, sợi phiên mã/ sợi không phiên
mã, sợi khuôn / sợi không làm khuôn. Tuy nhiên theo hướng dẫn của Liên đoàn hoá
sinh quốc tế (IUB) và Liên đoàn quốc tế về hoá học cơ bản và ứng dụng (IUPAC)
thì các thuật ngữ nên dùng là sợi mã hoá/ sợi không mã hoá. Các thuật ngữ sợi
khuôn/ sợi không làm khuôn được sử dụng để mô tả các sợi ADN khi không cần
nói đến chức năng mã hóa. Như vậy thông tin di truyền được biểu hiện phiên mã
sợi không mã hoá của ADN tức là sản sinh ra phân tử mARN. Có một khởi điểm để
bắt đầu quá trình phiên mã, nằm cạnh vị trí mà ADN-polymeraza bám vào, gọi là
khởi điểm (promoter), đó là điểm đặc hiệu để bắt đầu quá trình phiên mã. Đoạn từ
điểm bắt đầu T
C
đến điểm kết thúc t
C
đôi khi được gọi là đơn vị phiên mã, tức là
đoạn ADN dùng để làm khuôn sao chép ARN . Bên trong đơn vị phiên mã có
những điểm điều hoà dùng cho quá trình dịch mã gọi là điểm bắt đầu T
L

và kí hiệu
dừng t
L
. Các đoạn khác tham gia vào điều khiển sự biểu hiện của gen có thể nằm ở
phía ngược dòng hoặc xuôi dòng của gen.
2.4. Khái niệm mã di truyền
Nhóm phân tử nucleotit chịu trách nhiệm mã hoá cho một axit amin gọi là mã
di truyền. Xác định số lượng nucleotit của một mã là một vấn đề được nghiên cứu
và nhiều khó khăn. Ngay thời gian đầu người ta có thể phán đoán, suy luận được số
lượng nucleotit trong mã căn cứ vào số lượng amino axit tìm thấy trong tự nhiên.
Giả thiết nếu cứ hai nucleotit tạo thành một mã để mã cho một axit amin thì cứ hai
nucleotit tạo thành một mã để mã hóa một axit amin thì số mã sẽ bằng tổ hợp 2 của
4 nucleotit (4
2
=16). So với tổng số 20 axit amin khác nhau biết được hiện nay trong
tự nhiên thì số mã thiếu sẽ là 4. Trong trường hợp chúng tổ hợp 3 nucleotit cho một
mã, số lượng mã thu được là 4
3
= 64, nhiều hơn số axit amin trong tự nhiên. Dự
7
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
đoán này có thể được nhiều người ủng hộ hơn. Năm 1981 Sydney và Francis Crick
đã nghiên cứu một số lượng lớn các dạng đột biến của thực khuẩn thể T4 tạo ra qua
việc thêm vào hoặc bớt đi từng cặp bazơ và rút ra kết luận mỗi một mã di truyền
chứa 3 nucleotit.
Như vậy ta biết rằng trình tự các bazơ nitơ trên ADN quyết định trình tự các
axit amin trên polypeptit tương ứng. Tất cả có 20 loại axit amin trong các protein,
nhưng chỉ có 4 bazơ nitơ trong ADN như vậy nếu hai bazơ xác định một axit amin
thì số axit amin chỉ là 4
2

=16, còn thiếu 4 axit amin chưa được xác định. Vậy tối
thiểu phải 3 bazơ nitơ xác định một axit amin như thế số tổ hợp bộ ba có thể có của
4 bazơ nitơ là 4
3
= 64. Vậy nếu mã di truyền là mã bộ 3 sẽ xảy ra trường hợp nhiều
bộ ba xác định một axit amin.
Mãi tới năm 1966 mã di truyền mới được khẳng định một cách đầy đủ khi
Gobind Khorana tìm cách thiết kế các mã qua việc sử dụng sao chép trùng lặp:
GUGUGU, AAGAAG và GUUGUU. Ông đã có một số kết luận về mã di truyền
sau đây:
• Tất cả các mã chứa ba nucleotit kế tiếp nhau là mã di truyền.
• Mỗi amino axit có thể được mã hoá bởi hai hay nhiều mã di truyền.
Trong trường hợp này gọi là thoái hoá mã di truyền. Trong tất cả 64 tổ hợp của
ba nucleotit có 61 tổ hợp được sử dụng cho các amino axit. Có 3 mã không được
mã hoá cho bất kỳ một axit amin nào cả, đó là UAA, UAG, UGA. Chúng chịu trách
nhiệm cung cấp tín hiệu ngừng hoặc chấm dứt quá trình tổng hợp protein. Mã AUG
mã hoá Methionin và cũng là mã cung cấp tín hiệu khởi đầu cho quá trình tổng hợp
protein.
8
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
2.5. Phiên mã di truyền
Phiên mã thông tin di truyền từ ADN sang phân tử ARN là nhờ sự xúc tác của
một hệ thống Enzym quan trọng nhất là ARN-polymeraza và Trancriptaza. Quá
trình phiên mã diễn ra nhiều công đoạn. Trước hết là sự gắn ARN-polymeraza vào
phân tử ADN. Vị trí để ARN-polymeraza tiếp xúc với ADN gọi là Promotor. Vùng
Promotor này chứa khoảng 20 - 30 cặp nucleotit và có một đặc điểm dễ nhận biết là
tỷ lệ bazơ A và T cao (có 16 - 20 nucleotit loại này). Trên một đoạn gen bất kỳ
thường bắt đầu bằng vùng khởi động rồi tiếp đến vùng điều khiển tiếp theo là vùng
exon (vùng chưa mã hoá) và vùng intron (vùng không chứa mã di truyền) xen kẽ
nhau. Sau khi ARN-polymeraza gắn xong, quá trình phiên mã diễn ra ở một trong

hai chuỗi polynucleotit của ADN. Đồng thời men ADN-polymeraza hoạt động khôi
phục tổng hợp lại phân tử ADN sau khi đã làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp ARN.
Trong quá trình tổng hợp ARN, ngoài sự tham gia của hệ thống enzym kể trên còn
có các phân tử cao năng như ATP, GTP.
Sự tổng hợp ARN được ARN-polymeraza dẫn dắt theo dọc chuỗi ADN, ARN-
polymeraza kéo dài đến hai đầu chuỗi ADN tách ra. Sau khi ARN được tổng hợp,
chúng lại khép lại ARN-polymeraza kéo trên băng ADN từ vị trí 3
’
- 5
’
và mARN
được hình thành theo hướng ngược lại từ 5
’
- 3
’
.
2.6. Kỹ thuật PCR (Polymeraza Chain Reaction)
2.6.1. Khái niệm về PCR
Công nghệ nhân gen PCR còn gọi là phản ứng PCR (Polymeraza Chain
Reaction) là phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là quá trình nhân gen, quá trình
nhân ADN đặc hiệu do Kary Mulis phát minh vào giữa những năm 1980 (James và
9
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
cộng sự, 1993). Kỹ thuật này được xem là một trong những kỹ thuật quan trọng
nhất trong việc nghiên cứu và phân tích gen.
PCR là kỹ thuật invitro cho phép nhân một vùng ADN đặc biệt nằm giữa hai
vùng sinh trình tự đã biết tạo ra một số lượng lớn bản sao của đoạn ADN cần lựa
chọn mà không cần tách dòng và nhân dòng.
Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sinh tổng hợp ADN. Hiện
nay người ta dùng phương pháp PCR để có thể nhân bất kỳ đoạn gen trong cơ thể

sinh vật, chỉ cần sử dụng hai đoạn nucleotit ở đầu 5
’
- 3
’
nếu gen đó đã biết trước
được trình tự sắp xếp các nucleotit của nó, hoặc có thể dùng một đoạn mồi bất kỳ
để nhân ngẫu nhiên bất kỳ một gen. Sau đó phân tách bằng điện di trên gel thạch
rồi thanh lọc để sử dụng.
Tóm lại PCR là một kỹ nghệ nhằm nhân bản phân tử ADN hoặc đoạn ADN
nhất định lặp đi lặp lại qua nhiều chu kỳ trong ống nghiệm đến khi thu được một số
lượng ADN mong muốn.
2.6.2. Nguyên lý kỹ thuật nhân gen PCR
Phương pháp PCR cho phép khuếch đại một số lượng bản sao của gen (hay
một đoạn ADN) trong thời gian ngắn.
Nguyên tắc của phản ứng: Sử dụng enzyme ARN-polymeraza chịu nhiệt để
tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong môi trường có
các deoxyribonucleotit triphotphat (dNTPs) và các cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn
ADN mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, số
lượng đoạn ADN khuôn được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể đủ số lượng phục
vụ cho những mục đích nghiên cứu tiếp theo.
10
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
Quá trình nhân gen gồm 3 giai đoạn lặp đi lặp lại nhiều lần như sau:
Giai đoạn biến tính (denaturation): ở nhiệt độ cao 90
o
C – 95
o
C, làm các liên
kết hydro của phân tử ADN bị đứt, hai mạch của phân tử tách rời nhau. Căn cứ vào
ADN khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính và thời gian biến tính phù hợp.

Giai đoạn gắn mồi (annealing): ở nhiệt độ 50
o
C - 65
o
C các mồi bắt cặp với
các mạch đơn ADN khuôn ở đầu 3’. Giai đoạn này khoảng 30 giây - 60 giây.
Giai đoạn tổng hợp (elongation): giai đoạn này có nhiệt độ 70
o
C - 72
o
C thích
hợp với hoạt động của Enzym taq polymeraza. Enzym này xúc tác các hoạt động
tổng hợp gắn thêm các nucleotit vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài trên cơ
sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung, tạo nên các mạch đơn mới.
Thời gian giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của đoạn ADN có thể từ 30 giây
đến vài chục phút. (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.6.3. Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR
2.6.3.1. Đoạn ADN mẫu (template)
Có thể là mạch đơn hay mạch đôi của chuỗi ADN hoặc ARN thường dài hơn
300bp, được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi.
• PCR có phản ứng khuyếch đại tối ưu xảy ra trên ADN thật tinh sạch, nhưng
nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với ADN thu nhận
trực tiếp từ dịch tế bào.
• Lượng ADN mẫu có thể giảm (1µg – 100µg ) khi sử dụng các polymeraza
hiệu quả cao. Giảm lượng mẫu ADN ban đầu còn có tác dụng hạn chế các
khuyếch đại ký sinh tạo các sản phẩm phụ không mong muốn.
11
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
• PCR cho phép khuyếch đại cả các mẫu ADN không bảo quản tốt, đã bị phân
huỷ từng phần (vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hoá thạch, tóc, móng tay

móng chân người chết).
Mặc dầu kích thước ADN khuôn không phải là yếu tố quan trọng nhưng nếu
dùng ADN hệ gen có phân tử lượng cao, người ta thường cắt thành từng đoạn nhỏ
hơn bằng enzym giới hạn như Not I hay Sfi I.
Thông thường lượng ADN làm khuôn cho một phản ứng nên:
< 1 mg với ADN tổng số
< 1ng với ADN tách dòng
2.6.3.2. Đoạn mồi
Đoạn mồi (primer ) là chỉ tiêu quan trọng nhất để khuếch đại đặc trưng và có
hiệu quả cao. Chọn mồi là giai đoạn quyết định của PCR, chọn mồi phải tuân thủ
một số nguyên tắc sau:
Mồi gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (Reverse primer).
Xuôi và ngược là so với chiều sao mã của gen.
Trình tự mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi
với mồi ngược và không có bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi
(trình tự của chúng không được bổ trợ cho nhau).
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách xa nhau
Mồi phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với các
trình tự lặp lại trên gen. Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn.
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự < 1kb
12
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
Xét về bản chất hoá sinh học mồi là những đoạn oligonucleotit, mạch đơn dài
6 - 30bp, có trình tự bổ sung với trình tự bazơ của hai đầu đoạn khuôn để khởi đầu
quá trình tổng hợp ADN. Mồi cần mang tính đặc thù, để tăng tính đặc hiệu của
phản ứng. Mồi càng dài, khả năng tổng hợp chính xác đoạn ADN đích càng lớn. Số
lượng 4 loại bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, tránh những vùng trình tự không
bình thường, hoặc trình tự lặp đi lặp lại.
2.6.3.3. Các nuleotit (dNTP)
Là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP, làm nguyên liệu cho phản ứng

tổng hợp ADN. Ngoài ra, có thể sử dụng một số nucleotit đã được thay đổi như gắn
thêm biotin hoặc dioxigenin , tuỳ thuộc mục đích sử dụng sản phẩm PCR.
Nồng độ dNTP thường dùng khoảng 100μM, tuy nhiên với nồng độ thấp thì
Taq AND - polymeraza hoạt động chính xác hơn. Nồng độ cao dễ xảy ra khuếch
đại ký sinh. Hơn nữa, nồng độ tối ưu của chúng phụ thuộc rất nhiều yếu tố như phải
xác định cho từng phản ứng qua nhiều giai đoạn thử nghiệm:
Nồng độ MgCl
2
, nồng độ ion Mg
2+

Nồng độ đoạn mồi
Độ dài sản phẩm được khuếch đại
Số chu kỳ phản ứng PCR
Sự mất cân bằng trong thành phần các nuleotit làm tăng lỗi sao chép của
ARN-polymeraza
2.6.3.4. Enzym ADN-polymeraza chịu nhiệt - Taq ADN polymeraza
Trong diễn biến các chu kỳ của phản ứng PCR có giai đoạn cần nhiệt độ cao
tới hơn 90
0
C nên phải sử dụng loại enzym chịu nhiệt, được tách chiết một loại vi
13
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus, nước suối nóng 94
0
C - 100
0
C. Taq
ADN-polymeraza không bị phá huỷ ở nhiệt độ cao, nhiệt độ biến tính và xúc tác sự
tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Taq ARN-polymeraza có trọng lượng

phân tử 94 kDa, có hoạt tính 5
’
- 3
’
exonucleaza và hoạt động tốt nhất ở 70
0
C - 80
0
C
Trong 1 giây, trung bình nó gắn được 75 nucleotit. Ngoài ra, còn có một số enzym
đáp ứng yêu cầu trên như Vent
TM
ADN-polymeraza, Pfu ADN, UIT ma
TM
ADN.
2.6.3.5. Dung dịch đệm
Thành phần dung dịch đệm (buffer) có thể thay đổi tuỳ loại enzym được sử
dụng, thành phần quan trọng nhất của dung dịch đệm là ion Mg
2+
. Nó hình thành
một phức hợp hoà tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác
cho enzym ADN-polymeraza, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch
kép.
Nồng độ MgCl
2
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5 mM,
nồng độ tối ưu là 1 - 1,5mM. Trong một số trường hợp, nồng độ này có thể thay
đổi.
Nồng độ MgCl
2

có ảnh hưởng tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng.
Ngoài Mg
2+
còn một số chất như AMSO, DMSO, fomamide được thêm vào nhằm
tạo sản phẩm PCR có kích thước lớn.
2.6.4. Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn:
Giai đoạn một: số lượng bản sao tăng lên theo cấp số mũ, tỉ lệ với lượng mẫu
ban đầu.
Giai đoạn hai: hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
14
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
• Phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
• Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
• Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp nhau.
• Số chu kỳ phản ứng tùy thuộc số lượng bản mẫu ban đầu: Số bản mẫu là 10
5
thì cần 25 - 30 chu kỳ. Số bản mẫu là 10
2
- 10
3
thì số chu kỳ phải là 35 - 40
2.7. Kỹ thuật xác định trình tự
Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngày nay
đều dựa trên phương pháp của Frederick Sanger (1977), có cải tiến. Phương pháp
này còn được gọi là phương pháp enzym học hay phương pháp dideoxy.
Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá
trình kéo dài ADN khi tổng hợp. Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleotit
triphotphat (ddNTP). Các ddNTP có thể kết hợp vào chuỗi ADN đang tổng hợp qua
nhóm 5-triphotphat nhưng lại không thể tiếp tục kết hợp được với phân tử

deoxynucleotit triphotphat tiếp theo. Do đó khi trộn lẫn lượng nhỏ dideoxynucleotit
triphotphat với 4 loại deoxynucleotit triphotphat rồi tiến hành tổng hợp ADN nhờ
ADN-polymeraza thì sẽ thu được một loạt các đoạn ADN được kết thúc đặc hiệu
bởi gốc dideoxynucleotit. Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗi phản ứng bổ sung 1
loại dideoxynucleotit khác nhau sẽ thu được các đoạn ADN có kết thúc bằng các
dideoxynucleotit khác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit. Chạy điện di các đoạn
này rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định trình tự của chuỗi ADN quan tâm
(Nguyễn Quang Thạch, 2004).
15
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
2.8. Vai trò của màu lông ở động vật
Màu lông là một trong những biểu hiện kiểu hình có thể quan sát dễ dàng ở
các loài vật. Màu lông của các loài khác nhau là khác nhau, thậm chí trong cùng
một giống cũng có sự sai khác nhất định. Sự sai khác này làm nên sự phong phú
trong màu sắc các loài động vật. Màu sắc lông còn có vai trò như dấu hiệu của tiến
hóa. Động vật có màu lông như hiện nay một phần là kết quả chiến thắng quá trình
đào thải của chọn lọc, thích nghi với các yếu tố sinh thái và môi trường sống. Sự
biểu hiện của màu sắc lông, da là một phản ứng tự vệ. Một con sâu sống trên thân
cây sẽ hình thành màu xanh trên thân chúng để tránh kẻ thù phát hiện. Ngoài ra
trong giao phối tự nhiên màu sắc lông còn được sử dụng để kêu gọi bạn tình mà
chúng ta gặp điển hình ở loài Công. Những con Công đực thường có bộ lông sặc sỡ
hơn những con công cái. Ở loài chim sắc tố màu lông có chức năng sinh lý quan
trọng, bao gồm chống oxy hóa, điều chỉnh miễn dịch, và thuộc tính bảo vệ quang
học. Sắc tố cũng được nhiều loài chim sử dụng như chất nhuộm màu, và chịu trách
nhiệm cho màu đỏ, cam và vàng. Cụ thể, sắc tố đỏ ở loài chim có tác dụng như tín
hiệu thể hiện tình trạng sức khỏe và dinh dưỡng của một cá thể và khả năng tìm
kiếm những nguồn thức ăn tốt của nó. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự biến
đổi sắc tố diễn ra trực tiếp trong kén khi lông phát triển. Hiểu rõ sự biến đổi cơ chế
hình thành màu sắc giữa các loài có thể là chìa khóa để hoàn chỉnh quá trình tiến
hóa khác nhau bao gồm tín hiệu màu sắc.

Trong chăn nuôi màu sắc lông có vai trò rất lớn. Đó là tính trạng rất quan
trọng được sử dụng trong chọn giống. Ở gà, các giống gà siêu thịt thường có lông
màu trắng, các giống gà đẻ trứng thương phẩm thường có lông màu nâu. Màu lông
còn dùng để phân biệt gà trống, mái khi mới nở (autosexing), chẳng hạn ở các
giống gà siêu trứng hiện nay như Hy line, Gold line con trống thương phẩm có màu
16
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
trắng, con mái có màu nâu. Ở trên bò người ta còn phát hiện một mẫu thịt bò không
rõ nguồn gốc có phải là thịt của bò đen hoặc trắng Hostlein hay thịt bò xám
Hungary nhờ phản ứng PCR - RFLP sử dụng cặp mồi MCRE1/MCRE2. Theo đó
các nhà khoa học khẳng định các phân tích đa hình gen MC1R là công cụ tốt để
phân biệt các sản phẩm thịt bò đen và trắng Hostlein và bò xám Hungary từ đó
ngăn chặn các nguy cơ gian lận (Radacsi A và cs, 2008). Đối với nhiều loài gia súc
như cừu, dê…bộ lông của chúng còn có tác dụng với nghành công nghiệp dệt may.
Ở nước ta hiện nay chăn nuôi dê đang phát triển đặc biệt là những giống dê
cao sản nhập từ các nước khác về. Chăn nuôi dê hiện nay không những theo hướng
lấy thịt hoặc sữa mà còn để lấy lông. Dê có một bộ lông tơ mịn bao phủ khắp thân.
Bộ lông có thể chỉ có một màu hoặc nhiều màu, thường là màu đen, xám, trắng,
nâu Lông dê dài ngắn tùy theo loài và tùy theo các khu vực địa lý khác nhau mà
chúng sống, ví dụ như những loài dê sống ở vùng nóng thì lông ngắn và thưa, còn
những loài dê sống ở vùng lạnh thì lông dài và rậm hơn (như ở các vùng đồi núi
hoặc những nơi cao hơn mực nước biển. Dê được nuôi không chỉ để lấy thịt, lấy
sữa, để hạn chế cỏ dại hay có ích trong việc trồng mới lại các bãi cỏ mà bộ lông của
chúng cũng có giá trị ().
2.9. Một số đặc điểm cấu tạo và chức năng của MC1R
Melanocortin 1 receptor (MC1R), còn có tên gọi khác như melanocyte-
stimulating hormone receptor (MSHR), hoặc melanin-activating peptit receptor, là
một thụ thể xuyên màng, bám với một lớp hormone peptit được tiết ra từ tuyến yên,
được biết đến như các melanocortin, trong đó gồm có hormone adrenocorticotropic
và các dạng khác nhau của hormone melanocyte-stimulating (MSH). MC1R là một

trong những protein then chốt tham gia vào quá trình điều chỉnh màu da và lông ở
động vật có vú. Protein này định vị trên màng plasma của tế bào melanocyte,
17
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
những tế bào tạo ra sắc tố melanin thông qua quá trình melanogenesis. Thông qua
sự điều chỉnh kiểu melanin được tạo ra và sự hoạt hóa của quá trình làm tế bào
melanocyte chuyển đổi việc tạo ra phaeomelanin có màu vàng hoặc đỏ thành
eumelanin có mầu đen hoặc nâu (Garcia-Bronron và cs, 2005).
Khi được hoạt hóa bởi một trong nhiều loại MSH, thường là α-MSH, MC1R
khởi động một phức hệ các nấc truyền tín hiệu, dẫn đến sự hình thành mầu nâu
hoặc đen do sắc tố eumelanin. Ngược lại, thụ thể này cũng có thể bị trung hòa/ gây
tác dụng ngược bởi peptit tín hiệu Agouti (ASIP), kết quả các tế bào trở lại trạng
thái sản xuất ra phaeomelanin có mầu vàng hoặc đỏ.
Hình 2: Sơ đồ hoạt hóa MC1R
A: MC1R bị bất hoạt bởi Agouti (bị bám vào), phaomelanin (sắc tố màu
vàng hoặc đỏ) được tổng hợp.
B: Không có Agouti, α-MSH bám vào MC1R, eumelanin (sắc tố màu nâu
hoặc đen) được sinh ra
18
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
Những tín hiệu truyền tới MC1R thông qua ASIP tạo ra các kiểu lông dải
mầu vàng hoặc đen, được quan sát thấy trên lông ở phần lớn động vật có vú. Ở một
số loài, tín hiệu ASIP không hoạt động tự nhiên mà bị giới hạn trong những vùng
chính. Sự riêng biệt này có mặt ở ngựa, ví dụ lông ngựa có thể là màu đen ở chân,
bờm và đuôi, nhưng có màu đỏ ở thân (). Tuy nhiên, các đột
biến của gen MC1R có thể tạo nên một thụ thể “trơ” ngay khi không bị kích thích
hoặc có hoạt động ở mức thấp hơn. Các alen MC1R hoạt động chủ yếu được di
truyền trội và tạo ra mầu lông đen, trong khi các alen MC1R có chức năng không
bình thường thể hiện tính trạng lặn sẽ tạo ra màu lông sáng. Các thay đổi ở MC1R
liên quan tới màu đen, đỏ/ vàng và trắng/ kem ở một số loài động vật đã được công

bố, như chuột (Robbins L.S và cs, 1993), bò (Klungland H và cs, 1995), người
(Valverde P và cs, 1995), lợn (Kijas J.M và cs, 1998), cáo (Vage D.I và cs, 1999),
gấu (Ritland K và cs, 2001), chó (Schmutz S.M và cs, 2002), gà (Kerje và cs,
2003), chim (Mundy N.I và cs, 2003), Li và cộng sự đã xác định màu đỏ ở đầu và
cổ của dê Boer được điều khiển bởi một gen lặn di truyền qua các thế hệ (Li Xiang-
long và cs, 2002). Ngoài ra màu lông trắng trên thân con dê Boer được dự đoán là
do sự đột biến của nucleotit số 676 (C thay cho A) (Zhao-Long Wu và cs, 2006).
Ở nhiều động vật có vú, việc tăng chức năng do các thay đổi trên gen MC1R
có liên quan đến sự cường hóa quá trình tạo ra eumelanin, trong khi việc giảm chức
năng do các điểm đa hình có liên quan đến sự tạo ra phaeomelanin có màu đỏ/
vàng. Sự mất chức năng do điểm đa hình cũng liên quan đến sự xuất hiện mầu lông
trắng ở gấu (Ritland K và cs, 2001). Thêm nữa, các đa hình trên MC1R tìm thấy
trên người với màu tóc đỏ (Valverde P và cs, 1995). Cũng ở trên người các nghiên
cứu đã chỉ ra nhiều thay đổi di truyền trong gen MC1R tăng nguy cơ phát triển ung
thư da, hình thức nghiêm trọng của bệnh ung thư da mà bắt đầu trong melanocytes
19
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
(melanoma). Sửa đổi trong MC1R gene làm gián đoạn khả năng của các
melanocortin 1 receptor để phá vỡ khả năng sản xuất eumelanin trong melanocytes.
Bình thường eumelanin thường bảo vệ da khỏi các tác hại của bức xạ UV, thiếu
eumelanin da dễ bị tổn thương nhiều hơn do bức xạ của ánh nắng mặt trời. Da chịu
ảnh hưởng lớn gây ra bởi bức xạ UV từ ánh sáng mặt trời là một yếu tố nguy cơ lớn
để phát triển melanoma (ung thư da) và các hình thức khác của bệnh ung thư da. Ở
trên người các tác giả tìm thấy vị trí mà gen MC1R định vị là 16q24.3 từ cặp
nucleotit số 88.512.526 đến 88.514.885 (Harding, R.M và cs, 2000).
Gen MC1R quy định sự hình thành chuỗi protein MC1R gồm 317
axitamin .Dưới đây là hình ảnh chuỗi protein MC1R ở một số loài động vật .
Hình 3: Sơ đồ chuỗi protein MC1R ở một số loài động vật
20
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50

Tại các vị trí có các màu tô đậm khác nhau là vị trí có sự sai khác nhau trong
cấu trúc gen MC1R ở các loài khác nhau.
Tuy nhiên, các đa hình trên MC1R ở dê hiện vẫn chưa được công bố trên
ngân hàng gen (Genbank). Với mục đích tìm ra mối liên quan giữa gen MC1R với
màu lông trên dê, việc phân tích đa hình trên MC1R được tiến hành.
Sự đa dạng màu sắc đặc biệt phong phú ở động vật nuôi, trong cùng loài
cũng như khác loài. Đặc điểm này được ứng dụng trong các nghiên cứu cơ bản về
sắc tố và mối liên quan giữa kiểu hình và kiểu gen trên mô hình động vật nuôi.
Việc tổng hợp màu sắc có một số chức năng như trong phối giống, trong ngụy trang
kẻ thù và để thích nghi điều kiện môi trường. Và hệ quả là, gen MC1R rất bảo thủ
và được coi là công cụ cho các nghiên cứu về tiến hóa.
2.10. Nguồn gốc, phân bố và phân loại động vật học chung của dê
Về nguồn gốc và theo phân loại động vật, dê là gia súc nhai lại nhỏ thuộc lớp
động vật có vú (Mammalia), bộ móng chẵn (Artiodactyla), bộ phụ nhai lại
(Ruminantia), họ sừng rỗng (Bovidae), họ phụ dê cừu (Capra rovande), loài dê
(Capra hircus), giống dê.
Dê rừng (Capra aegagrus) trên thế giới được chia làm ba nhóm: Nhóm 1 là
Bezoar (C. a eagagrus), nhóm 2 là: Ibex (C. a Ibex) và nhóm 3 là: Markhor. Dê
rừng phân bố rộng ở vùng núi và bán sơn địa, phạm vi phân bố tự nhiên của nhóm
Bezoar là vùng Tây Á. Nhóm Ibex phân bố ở vùng Tây Tạng, đông Châu Phi và
Châu Á. Nhóm Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir - Karakorum
Với những dẫn liệu đặc biệt tìm thấy được gần đây, người ta cho rằng nơi
thuần hóa các giống dê đầu tiên bắt nguồn từ Châu Á, vào thiên niên kỷ thứ 7 - 9
trước công nguyên tại vùng Tây Á.
Theo tài liệu của Herre và Robrs 1973 thì dê là loài vật nuôi sớm nhất của
loài người. Giống như các loài vật nuôi khác dê sau khi thuần hóa đầu tiên được
nuôi với mục đích lấy thịt, lấy sữa cũng là một hướng sử dụng sớm của con người
21
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
thậm chí còn sớm hơn cả nuôi bò lấy sữa vì vắt sữa dê còn dễ hơn vắt sữa bò.

Trung tâm nuôi dê sớm nhất xuất hiện ở các nước Trung Đông sau đó đến Ấn Độ
và Ai Cập tiếp đến các nước phương Tây, châu Á và châu Phi. Trung tâm nuôi dê
lớn nhất mới hình thành ở Đông Nam Châu Á (Đinh Văn Bình, 2000)
2.11. Đặc điểm một số giống dê ngoại nuôi ở Việt Nam.
2.11.1. Dê Alpine
Nguồn gốc, phân bố:
• Tên tiếng anh là dê Alpine.
• Đây là giống dê được tạo từ vùng núi Alpine (Pháp). Nhập từ Pháp về nước
ta năm 1998, nhập từ Mỹ năm 2002.
• Phân bố: Hiện nay giống dê này được nuôi ở Trung tâm Nghiên Cứu dê và
Thỏ Sơn Tây – Hà Nội và Ninh Thuận.
Đặc điểm hình thái:
Dê Alpine có màu lông đa dạng nhưng chủ yêú là nâu hoặc đen có loang trắng
và kết hợp các loại màu trên, lông ngắn. Con đực thường có lông dài hai xương
sống. Tai cuộn tròn và dựng đứng. Khối lượng dê sơ sinh 2,7 - 3,0 kg/con. Lúc
trưởng thành dê cái cao: 0.75 m và nặng 50kg. Dê đực cao: 0.85 - 1,0 m, nặng 75
kg/con.
Hình 4: Dê Alphine
22
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
2.11.2. Dê Boer
Nguồn gốc, phân bố:
• Tên tiếng anh là Dê Boer.
• Được nhập từ Mỹ vào Việt Nam năm 2002.
• Phân bố: Hiện nay đang nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây -
Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh.
Đặc điểm hình thái:
Thân màu trắng, cổ, đầu tai màu nâu đỏ, trán và mặt trắng. Tai to và cụp,
sừng thường uốn cong về phía sau. Đầu to khoẻ, mắt màu nâu. Lúc trưởng thành
con đực nặng khoảng 110 - 135kg và dê cái nặng 90 - 100 kg/con.

Hình 5: Dê Boer
23
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
2.11.3. Dê Beetal
Nguồn gốc, phân bố:
• Tên tiếng anh là dê Beetal.
• Nguồn gốc : từ các vùng Punjab Ấn Độ, Rawalpindi và Lahore Pakistan.
Được nhập vào Việt Nam từ năm 1994.
• Phân bố : Đầu tiên nuôi ở Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây –Hà
Nội. Hiện nay còn nuôi thêm ở cả một số tỉnh miền Trung và miền Nam.
Đặc điểm hình thái:
• Màu lông dê Beetal thường hung đỏ, có các điểm trắng và cũng có các màu
khác như màu đen. Mũi gồ và tai dài, con đực thường có bộ râu cằm đặc
trưng mà con cái không có.
• Lúc trưởng thành con đực cao khoảng 89cm, con cái cao khoảng 84cm. Lúc
trưởng thành con đực nặng khoảng 60 kg và con cái nặng khoảng 40 kg.
Hình 6: Dê Beetal
24
Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh CNTYA - K50
2.11.4. Dê Jamnapari
Nguồn gốc, phân bố:
• Tên tiếng anh là dê Jamnapari.
• Được nhập từ Ấn Độ vào Việt Nam năm 1994.
• Phân bố: Dê Jamnapari hiện đang được nuôi ở Trung tâm nghiên cứu dê và
thỏ Sơn Tây - Hà Nội.
Đặc điểm hình thái:
Toàn thân màu trắng, tai và má có những đốm đen, tai to cụp. Con đực trưởng
thành có khối lượng 60 - 75 kg, con cái trưởng thành khối lượng 40 - 50 kg.

Hình 7: Dê Jamnapari
25