Báo cáo thư viện gen và thư viện CDNA

THƯ VIỆN BỘ GEN
VÀ
THƯ VIỆN cDNA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MH. KỸ THUẬT DI TRUYỀN
GVHD: TS. Trần Thị Dung
NỘI DUNG CHÍNH
THƯ VIỆN
cDNA
THƯ VIỆN
BỘ GEN
THƯ VIỆN BỘ GEN
KHÁI NIỆM
QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP
KHÁI NIỆM
•
Chia nhỏ DNA bộ gen và chèn chúng vào tế bào
chủ.
•
Chứa tất cả DNA bộ gen của sinh vật .
Thư viện gen
(Ngân hàng gen)
QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP
TÁCH CHIẾT DNA
CẮT
GẮN VECTOR
ĐƯA VÀO TẾ BÀO
TẠO DÒNG

SÀNG LỌC
TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNA
»
Lấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độ thấp).
»
Phá vỡ màng tế bào và màng nhân.
»
Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng
phenol).
»
Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay iso-propanol lạnh.
»
Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ
thấp).
PHÂN CẮT DNA BỘ GEN
•
Sử dụng enzyme cắt giới hạn RT (Reverse Transcriptase)
•
Mỗi loại enzyme cắt tại một vị trí đặc hiệu trên DNA và vector chuyển gen.
=> Tạo ra 2 thư viện gen khác nhau khi cắt bằng 2 loại enzyme RT.
•
Sử dụng enzyme Alkaline phosphatase
•
Enzyme được dùng để :

Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA trước khi đánh dấu phóng xạ.

Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA. Không bị nối vòng khi cắt bằng RT


T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase thường được sử dụng đồng thời
trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kỉ thuật tạo dòng.
TẠO DNA TÁI TỔ HỢP
•
Sử dụng enzyme nối Ligase
ENZYME LIGASE
E.Coli DNA ligase
T4 DNA ligase
T4 RNA ligase
T4 POLYNUCLEOTIDE
KINASE
ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ
•
Mục đích:
–
Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao
.Tuỳ thuộc loại tế bào chủ , người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp.
–
Tách chiết plasmid cho thí nghiệm tạo dòng.
ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ
•
Loại tế bào chủ
1.
E. coli
2.
Eukaryote
ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ
•
Phương pháp thực hiện:

–
Hóa biến nạp: CaCl2 + sốc nhiệt
–
Điện biến nạp: dòng điện cao thế cục bộ
TẠO DÒNG
•
Tế bào được nuôi cấy tạo thành những dòng mới chứa DNA tái tổ hợp.
•
Môi trường nuôi cấy tạo dòng thường là:
–
M9 (Thành phần dinh dưỡng xác định)
–
LB (Thành phần dinh dưỡng chưa xác định)
•
Chuẩn bị cho giai đoạn sàng lọc
SÀNG LỌC THƯ VIỆN ĐỂ NHẬN TRÌNH TỰ ĐÍCH
•
Sau khi thư viện gen được tạo ra. Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng:
–
Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh
phóng xạ.
–
Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc
thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng.
THƯ VIỆN cDNA
KHÁI NIỆM
PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ
ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU
KHÁI NIỆM

DNA bổ trợ (complementary DNA)
DNA tổng hợp từ mRNA với xúc tác của enzyme RT (reverse
transcriptase)
cDNA
KHÁI NIỆM
•
Tập hợp các cADN tổng hợp từ các mARN.
•
Thiết lập trên vector (plasmid hoặc phage lambda)
•
Đối tượng áp dụng: eukaryote
Thư viện cDNA
(Ngân hàng cDNA)
KHÁI NIỆM
THƯ VIỆN GEN THƯ VIỆN cDNA
1. Tập hợp các phân đoạn của DNA bộ gen
2. Chứa toàn bộ DNA của sinh vật
3. Tạo DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào vật chủ.
4. Vật chủ: E.coli, Eukaryote
5. Vector: plasmid
1. tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN
2. thiết lập từ một tế bào xác định
3. gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN
4. Vector: phage lambda; plasmid
PHƯƠNG PHÁP
PHÂN LẬP RNA
TÁCH CHIẾT mRNA
TỔNG HỢP cDNA
TẠO DÒNG cDNA
XÁC ĐỊNH DÒNG

THÀNH LẬP DỮ LIỆU cDNA
PHÂN LẬP RNA
TÁCH mRNA
•
Thu mRNA trưởng thành từ nhiều loại RNA (tRNA, rRNA, mRNA chưa trưởng thành)
•
Phương pháp:
–
Cho đuôi poly(A) của phân tử mRNA liên kết bắt cặp base với chuỗi olygo(dT) trong
cột.
–
Các RNA khác trôi khỏi cột. mRNA được giữ lại.
–
Biến tính để thu hồi mRNA.