đặc điểm mô bệnh học gan của tôm dưới tác động của nông dược

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN









LÊ KIM TRONG









ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM
DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN







2012



TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN








LÊ KIM TRONG

ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM
DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN








CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH





2012
i

LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn tôi xin chân thành cảm ơn:
Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến
thức chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện
luận văn.
Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong bộ môn Sinh học và
Bệnh Thủy Sản đã hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn.
Xin cảm ơn tập thể lớp Bệnh học thủy sản K34, các bạn đã giúp đỡ và
trao đổi kiến thức trong quá trình học tập.

ii
TÓM TẮT
Thí nghiệm cảm nhiễm của tôm sú với Decis và WSSV đƣợc thực hiện
nhằm tìm hiểu những biến đổi mô bệnh học ở cơ quan gan tụy tôm và một số
chỉ tiêu miễn dịch dƣới ảnh hƣởng của Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin
và sự cảm nhiễm WSSV. Thí nghiệm đƣợc bố trí với 5 nghiệm thức gồm
nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức có nồng độ Decis 0,001 µg/L có tiêm
0,1 ml WSSV sau 24 giờ, nồng độ Decis 0,01 µg/L có tiêm WSSV sau 24
giờ, nồng độ Decis 0,1 µg/L có tiêm WSSV sau 24 giờ và nghiệm thức chỉ
tiêm WSSV sau 24 giờ. Kết quả thu mẫu đƣợc ở thời gian 0 giờ, 24 giờ và 48
giờ sau khi gây cảm nhiễm, sau khoảng 54 giờ tôm chết ở các nghiệm thức có
Decis và WSSV. Các chỉ tiêu phân tích miễn dịch máu tôm kết quả cho thấy
giá trị tổng bạch cầu giảm khác biệt có ý nghĩa sau khi tiêm WSSV. Giá trị
của RES ở các nghiệm thức có Decis và WSSV tăng dần qua 24 giờ và 48
giờ, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) tại 48 giờ so với lúc 0 giờ. Giá trị SOD ở
các nghiệm thức có nồng độ Decis khác nhau tăng khác biệt có ý nghĩa ở 24
giờ, sau đó giảm ở 48 giờ sau khi tiêm WSSV, riêng nghiệm thức chỉ tiêm
WSSV thì nồng độ SOD tăng dần từ 0 giờ đến 48 giờ và khác biệt có ý nghĩa
lúc 48 giờ so với 0 giờ. Giá trị PO tăng cao ở các nghiệm thức có Decis lúc 24

giờ, qua 48 giờ hàm lƣợng PO giảm xuống khác biệt có ý nghĩa thấp hơn giá
trị lúc 0 giờ. Bên cạnh đó khi phân tích mô học cơ quan gan tụy của tôm sú và
tôm càng xanh cảm nhiễm với Decis và WSSV kết quả mô học cho thấy ống
gan tụy của hai loại tôm đều bị hoại tử, quan sát thấy có sự hiện của thể vùi
WSSV trong dạ dày và mang của tôm sú, biểu hiện sƣng phồng mang ở tôm
càng xanh.















iii
MỤC LỤC

Lời cảm tạ i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh sách bảng iv
Dang sách hình v
PHẦN I 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Nội dung đề tài 2
PHẦN II 3
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Phƣơng pháp mô học 3
2.2 Sơ lƣợc các nghiên cứu về mô gan tụy của tôm. 4
2.3 Sơ lƣợc những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm 6
2.4 Đáp ứng miễn dịch trên giáp xác. 6
2.4.1 Quá trình thực bào 7
2.4.2 Quá trình phong tỏa 7
2.4.3 Hệ thống Prophenoloxydase (proPO) 8
2.4.4 Chất chống oxy hóa 8
2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn 8
2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hƣởng đến động vật thủy sản 8
2.5.1 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên cá 8
2.5.2 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên tôm 9
2.6 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 10
2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis 11
2.6.2 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 2,5 EC dùng nghiên cứu 12
PHẦN III 13
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 13
3.2 Vật liệu nghiên cứu 13
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13
3.2.2 Dụng cụ 13
3.2.3 Hóa chất 13
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 13
3.3.1 Phƣơng pháp nuôi dƣỡng tôm 13

3.3.2 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 13
3.3.3 Pha nồng độ thuốc dùng thí nghiệm 14
3.3.5 Phƣơng pháp mô học 16
3.3.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 19
iv
PHẦN IV 20
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20
4.1 Kết quả miễn dịch tôm sú cảm nhiễm với Decis và WSSV 20
4.1.1 Kết quả của quá trình gây cảm nhiễm 20
4.1.2 Kết quả các chỉ tiêu miễn dịch của tôm với Decis và WSSV 20
4.2 Kết quả mô bệnh học của tôm cảm nhiễm với Decis và WSSV. 23
4.2.1 Đặc điểm mô học cơ quan gan tụy của tôm 23
4.2.2 Những biến đổi mô học trên gan tụy của tôm. 24
PHẦN V 28
5.1 Kết luận 28
5.2 Đề xuất 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO 29
PHỤ LỤC 32


v

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Các dạng bạch cầu ở giáp xác và chức năng trong đáp ứng miễn dịch
7
Bảng 3.1 Quy trình xử lý mẫu tự động 17
Bảng 3.2 Nhuộm mẫu theo phƣơng pháp Mayer’s Hematoxyline & Eosin 18
vi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu 15
Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lƣợng tổng bạch của tôm sú giữa các nghiệm thức
và các ngày thu mẫu. 20
Hình 4.2 Biểu đồ so sánh hoạt tính Respiratory burst của tôm sú giữa các
nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu. 21
Hình 4.3 Biểu đồ so sánh hoạt tính superoxide dismutase của tôm càng xanh
giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu 22
Hình 4.4 Biểu đồ so sánh hoạt tính Phenloloxidase của tôm sú giữa các
nghiệm thức và các ngày thu mẫu. 23
Hình 4.5 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm sú bình thƣờng ở mặt cắt ngang
(H&E) Mẫu nghiệm thức đối chứng 23.
Hình 4.6 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm càng xanh bình thƣờng ở mặt cắt
ngang. 24
Hình 4.7 Cơ quan gan tụy tôm sú bị hoại tử mất cấu trúc ( ) (10X) 25
Hình 4.8 Các tế bào máu bao xung quanh ống gan tụy bị hoại tử (40X) 25
Hình 4.9 Thể vùi WSSV trên tôm sú (100X). 26
Hình 4.10 Gan tụy tôm càng xanh bị hoại tử (10X). 26
Hình 4.11 Sợi mang tôm càng xanh sƣng phồng ( ), sợi mang bình thƣờng
( )(10X). 27

1
PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1Giới thiệu
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng diện tích có khả năng
nuôi trồng thủy sản khoảng 1,1 triệu ha, là vùng nuôi thủy sản trọng điểm
chiếm 55% tổng diện tích nuôi của cả nƣớc (Đào Bá Cƣờng, 2010). Trong đó
diện tích nuôi tôm chiếm khoảng 550.000 ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh Cà
Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh và Bến Tre (Cục NTTS,

2009). Tính đến hết tháng 7/2010 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,49
tỷ USD. Cơ cấu xuất khẩu thủy sản của Việt Nam chủ yếu tập trung các mặt
hàng: tôm, cá Tra, cá Basa, mực và các sản phẩm cá. Nhìn chung, xuất khẩu
các mặt hàng này chiếm 97% kim ngạch thủy sản cả nƣớc, trong đó xuất khẩu
tôm chiếm cao nhất 37,4% (Tổng cục Hải Quan, 2010), trong khi đó cá Tra và
cá Basa chiếm 32% (ABS, 2010). Trong các đối tƣợng nuôi, tôm sú đƣợc xem
là đối tƣợng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu cao mang lại
nguồn thu ngoại tệ đáng kể.
Bên cạnh những giá trị đạt đƣợc về mặt kinh tế thì nghề nuôi tôm ở
ĐBSCL đang phải đối mặt với nguy cơ suy thoái môi trƣờng và dịch bệnh
xảy ra hàng năm. Một trong những nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm nuôi
ở ĐBSCL nhƣ bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử
gan tụy (HPV)…
Từ giữa năm 2010 đến nay, hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú diễn
biến khá phức tạp ở ĐBSCL và gây thiệt hại lớn cho ngƣời nuôi đặc biệt ở hai
tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
(Số: 5330/TB-BNN-VP) tính đến tháng 10/2011 diện tích thiệt hại tôm ở
ĐBSCL khoảng 80.000 ha. Tôm chết có các biểu hiện nhƣ: gan nhạt màu,
nhũn, sƣng, gan bị teo, dai và sậm màu, quan sát tiêu bản mô học thấy có biểu
hiện hoại tử. Theo kết quả nghiên cứu của viện nuôi trồng thủy sản II: một
trong những nguyên nhân gây tôm chết hàng loạt và hội chứng hoại tử gan
tụy trên tôm nuôi thời gian qua ở ĐBSCL là do việc sử dụng hóa chất nông
dƣợc. Phần lớn các hộ bị thiệt hại thƣờng dùng các sản phẩm có thành phần
nông dƣợc là Deltamethrin, Cypermethrin để diệt giáp xác và cải tạo ao nuôi,
thậm chí một số hộ còn sử dụng trực tiếp các loại thuốc bảo vệ thực vật nhƣ:
Padan, visher…
Theo quan niệm của ngƣời nuôi tôm việc sử dụng các hóa chất để phòng
trị bệnh, tiêu diệt địch hại, kích thích tôm lột xác lớn nhanh là việc cần thiết
và sử dụng rất phổ biến. Theo Nguyễn Thị Phƣơng Nga (2004) chi phí thuốc
và hóa chất sử dụng trong ao nuôi chiếm khoảng 20,8-21%. Do đó nhằm giảm

chi phí thuốc, hóa chất ngƣời nuôi đã sử dụng thuốc trừ sâu để diệt tạp, giáp
xác và kích thích tôm lột xác. Trong đó thuốc trừ sâu Decis chứa hoạt chất
Deltamethrin đƣợc đƣợc ngƣời nuôi sử dụng khá phổ biến (Nguyễn Hữu Đức,
2007). Độc tính của Deltamethrin thƣờng gây chết sinh vật ở nồng độ rất
thấp.
2
Hiện nay đã có một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của Deltamethrin đối
với đặc điểm sinh lý, sinh trƣởng của tôm và cá nhƣng nghiên cứu về đặc
điểm mô học thì chƣa có. Chính vì vậy, đề tài “Đặc điểm mô bệnh học gan
tụy của tôm dƣới tác động của nông dƣợc” đƣợc thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Tìm hiểu những biến đổi mô học gan tụy của tôm dƣới tác động của
thuốc trừ sâu Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin.
1.3 Nội dung đề tài
- Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của Deltamethrin lên tôm ở
nhiều nồng độ khác nhau.
- Xác định những biến đổi mô học của gan tụy dƣới ảnh hƣởng của
Deltamethrin.

3
PHẦN II
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Phƣơng pháp mô học
Là phƣơng pháp mô tả những đặc điểm biến đổi bệnh lý đặc trƣng dƣới
mức độ vi thể ở các cơ quan mô bệnh học và đặc điểm mô học bình thƣờng,
từ kết quả của kỹ thuật mô học cùng với kết quả của các phƣơng pháp khác để
đánh giá mức độ phù hợp và chính xác của bệnh. Quy trình nhuộm
Hematoxyline và Eosin trên mô đƣợc thực hiện theo Lightner và ctv (1996)

và hình ảnh mô thu thập qua phân tích đem đối chiếu với CD hƣớng dẫn các
phƣơng pháp chuẩn đoán bệnh tôm sú do FAO & Multimedia Asia Co.Ltd
phát hành năm 1999 (Phạm Trần Nguyên Thảo & ctv, 2004).
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) mô bệnh học là phƣơng pháp xác
định các tổn thƣơng ở các mô tế bào dựa trên những thủ thuật nhuộm tế bào
và quan sát dƣới kính hiển vi. Phƣơng pháp này cho phép ngƣời phân tích kết
luận tính chất của các vùng bị tổn thƣơng. So sánh và đối chiếu với các kết
quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có một chẩn đoán đúng.
Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thƣơng bên ngoài mà không có các dữ
kiện khác liên quan đến tôm cá bệnh thì thƣờng có những kết luận sai lầm vì
những hình thái tổn thƣơng của vài bệnh có thể giống nhau và gây lầm lẫn
trong chẩn đoán. Phƣơng pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển
vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phƣơng thức mô học đề cập
tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng
trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trƣờng hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán
đƣợc bằng phƣơng pháp này. Tuy nhiên nó có những hạn chế nhất định, thao
tác chậm. Phƣơng pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu
về môi trƣờng và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh.
Một số ứng dụng của mô học (trích dẫn từ Nguyễn Thùy Ngân, 2008).
Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong
việc hệ thống bệnh thƣờng gặp trong nuôi tôm Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et
al., 1992). Thời gian sau Wang và ctv (1997) chứng minh sự hiện diện của
virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc
quan sát tiêu bản mô học dƣới kính hiển vi quang học và điện tử. Năm 1998
Sudha và ctv bằng phƣơng pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các
loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển Ấn Độ. Nguyễn Văn Hảo (1999)
nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phƣơng pháp mô học
và PCR, bằng việc kết hợp hai phƣơng pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc
điểm mô học của các tác nhân gây bệnh trên tôm sú, năm 2000 ông cũng ứng
dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu đề tài bệnh đỏ mang trên tôm bố mẹ.

Phƣơng pháp mô học cũng đƣợc Hòa (2001) ứng dụng trong việc xác định
cƣờng độ cảm nhiễm MBV. Bùi Quang Tề (2003) ứng dụng kỹ thuật mô học
vào chuẩn đoán bệnh tôm và đƣa ra phƣơng pháp phòng trị. Phạm Trần
4
Nguyên Thảo (2003) ứng dụng kỹ thuật mô học trong chuẩn đoán bệnh đốm
trắng trong tôm sú.
2.2 Sơ lƣợc các nghiên cứu về mô gan tụy của tôm.
Theo Lightner et al. (1992) bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn xuất hiện
tại trại nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), Texas-Hoa kỳ lần đầu
tiên vào năm 1985, làm tôm hao hụt 20-90% trong các trại nuôi, tác nhân gây
bệnh gồm hai chủng: Rickettsia hình que và Seliberia hình que hoặc hình
xoắn.
Theo Bhavan và Gieraldine (2000) (trích dẫn từ Nguyễn Kim Cƣơng,
2006) nghiên cứu mô bệnh học trên gan tụy và mang tôm càng xanh khi tiếp
xúc với endosulfan. Kết quả biến đổi mô bệnh học trên gan tụy và mang bao
gồm: sự tích tụ của các tế bào máu trong khe của các xoang, ống gan tụy bị
hoại tử; tấm mang không bình thƣờng bị phát triển quá mức, bị hoại tử.
Theo Nguyễn Khắc Lâm (2004) nghiên cứu về bệnh “phân trắng teo
gan” trên tôm sú nuôi thƣơng phẩm tại Ninh Thuận. Tôm bệnh thƣờng có
những dấu hiệu: thải phân trắng, đƣờng ruột tôm bị đứt quãng hoặc trống
rỗng, có những chấm vàng nhạt trong ruột. Sau giai đoạn thải phân trắng tôm
chuyển sang giai đoạn teo gan, lúc này tôm có hiện tƣợng bỏ ăn kéo dài và
bắt đầu chết. Kiểm tra gan tôm thấy có hai dấu hiệu đặc trƣng: gan bị chai
cứng và teo nhỏ lại bằng 1/3 thể tích gan bình thƣờng; dấu hiệu còn lại là gan
tôm nhũng ra giống nhƣ sữa. Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều tác nhân
gây ra bệnh “phân trắng, teo gan” gồm: vi khuẩn, virus, tảo độc, nguyên sinh
động vật. Vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio gây hoại tử gan tụy với tần suất 80%,
virus HPV với tần suất 36%, tảo lam là loại tạo có chất độc với tần suất
45,5% và môi trƣờng ao nuôi không tốt cũng là nguyên nhân gây ra bệnh.
Theo FAO (2005) đặc điểm mô bệnh học của bệnh gan tụy do vi khuẩn

có biểu hiện: khối gan tụy teo lại từ ít đến hoàn toàn của tuyến niêm mạc và
sự hình thành các dạng vi khuẩn thông qua các tiêu bản mô. Xảy ra hiện
tƣợng viêm hồng cầu trong lòng các tuyến để phản ứng lại hoại tử, tiêu hủy tế
bào và hiện tƣợng lột vỏ tế bào biểu mô tuyến gan tụy. Biểu mô tuyến gan tụy
bị teo lại rõ rệt, tạo nên vùng bị phù thủng rộng trong gan tụy. Chúng chứa ít
hoặc không còn chứa các giọt lipid, giảm đáng kể hoặc không còn các không
bào.
Theo Hoàng Tuấn (2007) xác định mầm bệnh virus phân lập trên tôm sú
(Penaeus monodon) bị bệnh phân trắng cho kết quả thấy có sự xuất hiện
MBV và HPV trên mẩu phân tích và sự xuất hiện của MBV cao hơn so với
HPV. Tuy nhiên dấu hiệu biểu hiện bệnh trên tiêu bản mô học tƣơng đối
giống nhau là tạo thể vùi trong nhân (đối với HPV) hoặc thể ẩn (đối với
MBV) trên một cơ quan gan tụy.
Theo Hoàng Quốc Trung Tuấn (2007) khi tôm bị nhiễm HPV không có
dấu hiệu đặc trƣng, nhƣng nếu tôm nhiễm nặng thì gan có màu hơi trắng. Ở
giai đoạn đầu gan tụy phì đại nhƣng về sau teo lại nhỏ hơn bình thƣờng. HPV
chỉ nhiễm chủ yếu ở ở tế bào E nằm ở đỉnh đầu của ống tiểu quản gan tụy,
5
HPV làm cho các nhân trong tế bào biểu mô gan tụy hoại tử dƣới hình thức
tạo thể vùi trong nhân phì đại, sự phát triển thể vùi trong nhân làm chuyển đổi
vị trí hạch nhân. Thông thƣờng HPV chỉ tạo 1 thể vùi trong nhân phì đại
nhƣng đôi khi có thể quan sát thấy 2 thể vùi trong nhân phì đại. Giai đoạn đầu
thể vùi bắt màu kiềm nhẹ, kích thƣớc nhân phì đại tƣơng đối nhƣng về sau thể
vùi bắt màu kiềm đậm hơn và nhân phì đại chiếm gần hết thể tích của tế bào.
Một số biến đổi mô học của tôm sú bị nhiễm HPV thu ở ĐBSCL giống với
các nghiên cứu của Lightner (1994), Flegel et al., (2000), Chayaburakul et al.,
(2004) là tạo thể vùi trong nhân biểu mô gan tụy và đặc biệt là tế bào phôi. Số
lƣợng thể vùi do bệnh HPV tạo ra (1-2) thấp hơn thể ẩn MBV (5-7). HPV bắt
màu tím của Haematoxylin, thể ẩn MBV bắt màu hồng của Eosin, HPV có
kích thƣớc lớn hơn MBV.

Theo Nguyễn Thùy Ngân (2008) kết quả nghiên cứu đặc điểm mô bệnh
học tôm sú bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV)
nhƣ sau. Mô liên kết gan tụy tôm sú nhiễm IHHNV xuất hiện thể vùi Cowdry
loại A. Thể vùi này không tìm thấy ở tế bào gan tụy cũng nhƣ tổ chức
lympho. Đồng thời ở mô liên kết gan tụy có hiện tƣợng hoại tử làm mất liên
kết giữa các ống tiểu quản gan tụy, tạo nhiều khoảng trống giữa các ống tiểu
quản.
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv. (2008). Nghiên cứu về đặc điểm mô
bệnh học tôm sú (Penaeus monodon) có dấu hiệu bệnh phân trắng nuôi ở một
số tỉnh ĐBSCL. Tổng số 220 mẫu đƣợc thu ở các tỉnh: Bạc Liêu, Sóc Trăng,
Bến Tre có dấu hiệu thải phân trắng nổi trên mặt nƣớc, ruột rỗng và đứt
quãng, tôm giảm ăn nhanh. Sau giai đoạn thải phân trắng gan tôm teo lại, ốp
vỏ, bơi lờ đờ và tấp mé ao. Kết quả phân tích mô học 220 mẫu tôm thu thấy
sự hiện diện của nhiều loại mầm bệnh bao gồm kí sinh trùng loa kèn, trùng
hai tế bào, vi khuẩn, HPV và MBV. Kí sinh trùng kí sinh trên mang gây tổn
thƣơng và biến đổi cấu trúc mang, tạo không bào do nhiễm Zoothamnium và
Epistylis, trùng hai tế bào gây hoại tử niêm mạc ruột giữa và xuất huyết. Vi
khuẩn tấn công nhiều nhất ở cơ quan gan tụy kế đến cơ quan lympho và ít
nhất là mang, vi khuẩn tấn công gây hoại tử, có hiện tƣợng melanin hóa và
tạo bào nang bao lấy vi khuẩn, mô gan nhiễm khuẩn thì xoang mạch máu bị
giãn nỡ và hoại tử tế bào. Cơ quan tấn công của HPV và MBV là gan tụy,
quan sát mô học MBV tạo thể ẩn bắt màu Eosin hay tụ tập ở trong nhân phì
đại của tế bào gan tụy hoặc tế bào biểu mô ruột giữa, HPV bắt màu kiềm tạo
thể vùi trong nhân tế bào gan tụy làm chuyển đổi vị trí của hạch nhân. Tỉ lệ
nhiễm trùng loa kèn cao nhất trong các mầm bệnh. Tỉ lệ chết cao nhất do
nhiễm kép HPV và vi khuẩn (18,03%), kế đến nhiễm kép HPV và trùng hai tế
bào (12,03%).
Theo Bùi Quang Tề (2010) bệnh gan tụy xảy ra trên tôm có nhiều tác
nhân: virus (MBV, WSSV, HPV, BMN) làm nhân tế bào gan tụy trƣơng to
hoặc làm nhân tế bào thoái hóa kết đặc (YHV), vi khuẩn Rickettsia, kí sinh

trùng (vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei) kí sinh trong tế bào chất của tế
bào gan tụy. Nghiên cứu về tình hình tôm chết hàng loạt ở tỉnh Sóc Trăng và
Bạc Liêu. Mẫu tôm bệnh thu vào tháng 8/2010 ở các tỉnh: Hải Phòng, Nghệ
6
An, Thừa Thiên Huế, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau. Tôm bệnh
có dấu hiệu hoạt động yếu, tấp bờ, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% trong 2-3
ngày, gan tụy tôm bệnh nặng bị hoại tử, khi tôm yếu và chết gan tụy thối rữa
rất nhanh. Bằng các phƣơng pháp chuẩn đoán mô bệnh học, kính hiển vi điện
tử, sinh học phân tử trên tôm bệnh có các biểu hiện: gan tụy bị hoại tử và có
thể chứa các giọt mỡ, một số tế bào trên mô hình ống trƣơng to chứa đầy các
hạt nhỏ, nhân phân hóa, tôm hầu nhƣ không bị nhiễm những bệnh do virus
(MBV, WSSV, YHV, HPV,…) nhƣng trong tế bào gan tụy của tôm có chứa
các bào tử trƣởng thành. Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh ở
tôm sú là vi bào tử thuộc giống Enterocytozoon, họ Enterocytozoonidae kí
sinh nội bào.
2.3 Sơ lƣợc những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm
Theo Flegel và ctv. (1997) bệnh đốm trắng do tác nhân white spot
syndrome virus (WSSV) gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất và
gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành công nghiệp nuôi tôm trên thế giới. Đây
là bệnh lây trên các loài tôm thuộc họ Penaedae.
Theo Lightner (1996) cơ quan đầu tiên và cũng là cơ quan đích mà
WSSV tấn công là lớp biểu mô mang bao gồm: biểu mô dƣới vỏ, biểu mô dạ
dày và biểu mô mang. Trong trƣờng hợp nhiễm cấp tính tôm không có biểu
hiện bệnh lý rõ ràng, chỉ thấy tôm lờ đờ và giảm ăn. Sau khi tôm bị nhiễm
WSSV có dấu hiệu giảm ăn 1 – 2 ngày thì hiện tƣợng tôm chết bắt đầu xảy ra
và từ 3 – 10 ngày tỉ lệ tôm chết lên đến 100%.
Phạm Trần Nguyên Thảo (2003), ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong
chẩn đoán bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Kết quả là khi tôm bị bệnh
đốm trắng ở mức độ vi thể thì thấy thể vùi trong nhân phì đại ở các tế bào
biểu mô dạ dày, dƣới da và mang.

Nghiên cứu về sự nhạy cảm của WSSV đối với tôm càng xanh ở tất cả
các giai đoạn: tôm Post-larvae, tôm giống, tôm tiền trƣởng thành và tôm
trƣởng thành. Kết quả mô học cho thấy rằng có những biểu hiện tƣơng tự với
những dấu hiệu tìm thấy trên tôm sú. Tuy nhiên sự hoại tử và thể vùi trong
mô ít hơn so với tôm sú. (Kiran và ctv, 2002)
Nghiên cứu của Lê Hữu Thôi (2011) nhằm đánh giá và so sánh khả năng
đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm càng xanh với WSSV và vi rút gây bệnh
đục cơ (MrNV/XSV). Kết quả bƣớc đầu cho thấy tôm càng xanh không có
khả năng kháng với MrNV/XSV nhƣng lại có thể kháng lại WSSV.
2.4 Đáp ứng miễn dịch trên giáp xác.
Đáp ứng miễn dịch ở động vật thủy sản gồm 2 dạng: đáp ứng miễn dịch
đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Trong hệ thống miễn dịch của
giáp xác thiếu những yếu tố cần thiết cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu nhƣ tế
bào lympho T, phân tử MHC và Ig cho nên sự đề kháng cơ thể ở giáp xác chủ
yếu dựa vào các cơ chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Ở giáp xác không
7
có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, đáp ứng bảo vệ chúng tồn tại đƣợc trong tự
nhiên đƣợc thực hiện chủ yếu bởi các tế bào máu chuyên hóa nhƣ: thực bào,
quá trình phong tỏa, sự sản sinh các chất kháng hay diệt khuẩn (Bảng 2.1).
Bảng 2.1 Các dạng bạch cầu ở giáp xác và chức năng trong đáp ứng miễn dịch

(Söderhäll và Cerenius,
1992)


Bạch cầu
Chức năng
Thực bào
Phong tỏa
Độc tế bào

Hoạt hóa hệ
thống ProPO
Không hạt
Có
Không
Chƣa biết
Không
Bán hạt
Hạn chế
Có
Có
Có
Có hạt
Không
Rất hạn chế
Có
Có
Bạch cầu là loại tế bào máu có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn
dịch của giáp xác. Bạch cầu gồm có 3 loại: bạch cầu không hạt, bạch cầu bán
hạt và bạch cầu có hạt. Mỗi loại có một chức năng riêng và chức năng chung
của 3 loại bạch cầu là sự đông tụ, thực bào và tạo melanin bằng hệ thống
Prophenoloxydase (proPO).
Ngoài các cơ chế đáp ứng miễn dịch tƣ nhiên tƣơng tự nhƣ ở động vật
có xƣơng sống, một số cơ chế khá đặc thù ở giáp xác bao gồm: hình thành
khối u, khả năng phong bế, khả năng sản sinh các protein kháng khuẩn (còn
gọi là các peptit kháng khuẩn), phản ứng đông máu có thể bị kích thích bởi
lipopolysaccharide (LPS) của vi khuẩn, khả năng sử dụng các enzym thủy
phân, các chất kháng với nguyên sinh động vật và đặc biệt là hệ thống
Phenoloxydase (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phƣơng, 2007).
2.4.1 Quá trình thực bào

Thực bào là một cơ chế đáp ứng miễn dịch chính của động vật không
xƣơng sống vì nó có khả năng nuốt và tiêu hóa các vi sinh vật hoặc các vật
thể lạ xâm nhập vào cơ thể. Quá trình thực bào đƣợc chia làm 3 giai đoạn: di
chuyển đến tác nhân gây bệnh, sau đó các tế bào thực bào sẽ bám chặt vào tác
nhân gây bệnh, cuối cùng là ăn vào, phá hủy tác nhân gây bệnh và đào thải ra
bên ngoài (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phƣơng, 2007).
2.4.2 Quá trình phong tỏa
Theo Söderhäll và Cerenius (1992) đƣợc trích dẫn từ Lê Hữu Thôi
(2011), tế bào có chức năng phong tỏa và hình thành khối u là bạch cầu bán
hạt. Bạch cầu bán hạt nhận ra các tác nhân gây bệnh xâm nhập vào và phong
tỏa bằng các protein (76 kD). Những protein này hoạt động nhƣ một quá trình
giải phóng hạt trong bạch cầu, là một chất hoạt hóa sự phong tỏa. Các khối u
8
này đƣợc hình thành trong gan tụy và mang khi quá trình thực bào không thể
tiêu diệt những vi sinh vật hay kháng nguyên có kích thƣớc lớn.
2.4.3 Hệ thống Prophenoloxydase (proPO)
Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể của giáp xác thì chúng gặp
phải bạch cầu, hiện tƣợng thực bào xảy ra sẽ kích hoạt enzyme protease có
trong huyết thanh. Protease cùng với hiện tƣợng thực bào là tín hiệu để kích
hoạt men pro-phenoloxidase thành dạng hoạt hóa phenoloxidase. Khi
phenoloxidase hoạt hóa thì sẽ chi phối quá trình sản sinh quinone melanin
một cách mạnh mẽ, gây ra hiện tƣơng melanin hóa trên vỏ của giáp xác khi
vật lạ tấn công. Ngoài ra, khi protease hoạt động nó còn kích thích quá trình
opsonin để thu hút các thực bào tập trung lại chổ ấy, thúc đẩy hiện tƣợng
thực bào diễn ra mạnh mẽ hơn. (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật
Phƣơng, 2007).
2.4.4 Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa gồm những enzyme catalase, glutathione
peroxidase, superoxide dismutase, ascorbate, β- carotene Trong các chất đó
thi superoxide dismutase (SOD) là một trong nhũng chất chống lại sự sốc oxy

hóa bởi sự ô nhiễm, sự nhiễm bệnh, sự giảm hoặc tăng oxy trong cơ
thể…(Neves et al., 2000)
2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn
Pepit kháng khuẩn (AMPs) là một dạng đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở
động vật không xƣơng sống, chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng độc tố…
Peptit kháng khuẩn là những protein cation có trọng lƣợng phân tử thấp.
Những peptit này có khả năng tƣơng tác trực tiếp với bề mặt tế bào vi sinh vật
tạo nên những lỗ thủng, gây mất sự ổn định các ion và năng lƣợng của vi sinh
vật. (Marshall và Arenas, 2003)
2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hƣởng đến động vật thủy sản
2.5.1 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên cá
Theo Murty (1985) đƣợc trích dẫn từ Lê Quốc Việt (2002) các loại hóa
chất có gốc clo hữu cơ độc với cá hơn các loại hóa chất có gốc phosphat hữu
cơ. Mỗi loài cá có khả năng chịu đựng khác nhau đối với chất độc, cá rô phi
(Oreochromis niloticus) chịu đựng Methy parathion (MP) tốt hơn cá Chép
(Cyprinus carpio). Thuốc trừ sâu gốc chlor hữu cơ ở nồng độ dƣới mức gây
chết kích thích quá trình tiêu thụ oxy nhƣng ở mức gây chết lại ngăn cản quá
trình lấy oxy của cá. Đối với thuốc gốc lân hữu cơ làm suy giảm tiêu thụ oxy
của cá liên tục.
Theo Nguyễn Thanh Phƣơng và Đỗ Thị Thanh Hƣơng (1997) cá rô phi
(Oreochromis niloticus) giống sau khi tiếp xúc với môi trƣờng có thuốc
Methy parathion (MP) ở nồng độ thuốc 17mg/L và 24mg/L dần dần bị bất
9
động và chìm xuống đáy bể sau 2 giờ; 1-2 giờ sau cá di chuyển lên mặt nƣớc
đớp khí, sau đó hoạt động yếu dần và bắt đầu chết.
Các số liệu đƣợc trích dẫn từ Phƣơng Ngọc Tuyết (2009). Giá trị LC
50
-
96 giờ của cá rô phi (Guineesis) đối với Deltamethrin là 0,002µg/L và tỉ lệ
chết tăng dần khi cá tiếp xúc với nồng độ cao và thời gian kéo dài. Theo

Yildirim et al., (2006) tìm ra giá trị LC
50
-48 giờ của cá rô phi (Oreochromis
niloticus) với Deltamethrin là 4,85µg/L. Viran et al., (2003) tìm ra giá trị
LC
50
-48 giờ của Deltamethrin với cá guppies đực đã trƣởng thành (Poecilia
reticulata) là 5,13µg/L và khẳng định Deltamethrin rất độc với cá, LC
50
-96
giờ của cá (Poecilia reticulata) với Deltamethrin là 5,13µg/L. Theo Metres et
al., (1992) LC
50
-96 giờ của Deltamethrin đối với cá hồi (Salmo gairdneri) là
0,39µg/L, cá chép (Cyprinus carpio) là 1,84µg/L và rô phi (Sarotherodon
mossambica) là 3,5µg/L. Theo Bradbury et al. (1989) LC
50
-96 giờ của
Deltamethrin đối với cá hồi nƣớc ngọt là 0,5µg-1,97µg/L.
2.5.2 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên tôm
Theo Collins và Cappello (2006) giá trị LC
50
-96 giờ của tôm nƣớc ngọt
(Palaemonets argentinus) đối với Cypermethrin là 0,0020µg/L
Theo Trần Thị Chi và Hồ Thị Xuân Thu (1990) giá trị LC
50
-96 giờ của
tôm càng xanh đối với Sumithion, Methy parathion, Kitazin và Sherpa lần
lƣợt là 5,16µg/L, 3,3µg/L, 2,2µg/L và 0,068µg/L.
Theo Nguyễn Việt Phƣơng (1995) khi nghiên cứu về ảnh hƣởng của

Saponin lên một số loài tôm cá, đã nhận định rằng tôm càng xanh có sức chịu
đựng cao nhất rồi đến tôm sú và tôm thẻ. Giá trị LC50-96 giờ của Saponin đối
với tôm thẻ là 1,03 mg/L, tôm sú là 1,59 mg/L, tôm càng xanh là 1,89 mg/L
Theo Lignot et al., (1997) giá trị LC
50
-96 giờ ở từng giai đoạn tôm he
Nhật Bản (Penaeus japonicus) đối với thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ
(Fenitrothion) nhƣ sau PL1 là 1,8µg/L, PL5 là 0,6µg/L, PL7 là 0,3µg/L, PL15
là 0,4µg/L và ấu niên là 0,8µg/L.
Theo Lê Quốc Việt (2002) giá trị LC
50
-96 giờ của Dipterex, BKC,
formalin đối với tôm sú (P
30
) lần lƣợt là 0,021 ppm; 1,45 ppm; 36,87 ppm.
Giá trị LC
50
-96 giờ của Dipterex thấp hơn rất nhiều lần so với BKC và
formalin. Tôm có biểu hiện ngộ độc nhanh với BKC và chậm nhất là
Dipterex, nhƣng sau 12 giờ thì độc tính của BKC giảm đáng. Khi mới ngộ
độc tôm bơi lội và búng lên mặt nƣớc, lờ đờ, sau đó tăng cƣờng hô hấp và
tôm suy yếu dần.
Theo Chang et al., (2006) đƣợc trích dẫn từ Ngô Thanh Toàn (2009) giá
trị LC
50
của Chlor hữu cơ Trichlorfon đối với tôm càng xanh ở 24, 48, 72 và
96 giờ lần lƣợt là 0,7739; 0,3513; 0,2697 và 0,2555µg/L. Ở nồng độ dƣới
ngƣỡng gây chết, Trichlorfon làm ảnh hƣởng đến sinh lý, sinh hóa của tôm
càng xanh, sau 24 giờ tiếp xúc với Trichlorfon ở nồng độ 0,1-0,3µg/L, hoạt
tính acetylcholinesterase, glycogen, Na

+
, osmolality, Cl
-
, pCO
2
, HCO
3
-
trong
máu đều giảm thấp hơn đối chứng nhƣng hàm lƣợng glucose trong huyết
10
tƣơng trong thịt tăng; hàm lƣợng lactate trong huyết tƣơng và trong cơ cũng
gia tăng đáng kể. Qua đó cho thấy lân hữu cơ làm gia tăng nhu cầu năng
lƣợng của tôm và có thể dẫn đến giảm sinh trƣởng.
Theo Ngô Thanh Toàn (2009) nghiên cứu ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu
chứa hoạt chất Diazinon lên hoạt tính enzyme cholinesterase (ChE) và sinh
trƣởng của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) kết quả nhƣ sau
Diazinon rất độc đối với tôm càng xanh, giá trị LC
50
-96 giờ là 390µg/L. Giá
trị NOEC (nồng độ không thấy ảnh hƣởng) và giá trị LOEC (nồng độ thấp
nhất thấy đƣợc ảnh hƣởng) đối với hoạt tính ChE sau 48 giờ tiếp xúc với
Diazinon lần lƣợt là 39µg/L và 97,5µg/L, mức độ ức chế ChE trong thịt bởi
Diazinon cao hơn ChE trong mắt và thời gian phục hồi trong thịt cũng lâu hơn
trong mắt. Tỉ lệ ChE bị ức chế phụ thuộc vào thời gian, nồng độ tiếp xúc và
đạt cao nhất trong khoảng 24-48 giờ tiếp xúc, ChE phục hồi đến mức trên
80% sau 12 ngày (ở mắt) và trên 70% sau 18 ngày (ở thịt). Tôm chết khi hoạt
tính ChE bị ức chế trên 80% ở mắt và 80% ở thịt. Dƣới tác dung của Diazinon
tiêu hao oxy của tôm giảm ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng 97,5µg/L và tăng ở
nồng độ 195µg/L, sự bắt mồi hay tính thèm ăn của tôm giảm theo sự gia tăng

nồng độ Diazinon, sau 4 ngày thay nƣớc tôm bắt mồi bình thƣờng trở lại.
Tôm chậm lột xác hơn lô đối chứng khi nồng độ Diazinon lớn hoặc bằng
97,5µg/L và tốc độ tăng trƣởng tƣơng đối của tôm bị ức chế 33,47% ở nồng
độ lớn hơn hoặc bằng 195µg/L.
Theo Phƣơng Ngọc Tuyết (2009). Dƣới ảnh hƣởng của Deltamethrin
tôm tập trung lột xác ở nồng độ 0,75-1,25µg/L sau 24 giờ. Giá trị LC
50
-48 giờ
của tôm sú đối với Deltamethrin là 1,18µg/L, LC
50
-96 giờ là 1,05µg/L do đó
sử dụng Deltamethrin để kích thích tôm lột xác là cách không phù hợp vì có
thể gây chết tôm. Nồng độ Deltamethrin 0,01µg/L và 0,52µg/L ảnh hƣởng
đến điều hòa áp suất thẩm thấu và ion (Na
+
, K
+
và Cl
-
) của tôm sú ở độ mặn
15%o và 35%o, ở độ mặn 25%o không làm ảnh hƣởng đến khả năng điều hòa
áp suất thẩm thấu và ion Na
+
, Cl
-
nhƣng làm ảnh hƣởng đến điều hòa ion K
+
.
Tôm sống trong môi trƣờng nƣớc có nhiễm Deltamethrin nhở hơn hoặc bằng
0,52µg/L ở độ mặn 25%o thì mất năng lƣợng ít hơn ở độ mặn 15%o và 35%o.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của Deltamethrin lên sự tăng trƣởng của tôm có nồng
độ 0,01µg/L, 0,1µg/L và 0,52µg/L ở độ mặn 25%o cho kết quả khác biệt
không có ý nghĩa so với lô đối chứng, điều đó cho thấy sử dụng Deltamethrin
không gây ảnh hƣởng đến tăng trong tôm mà làm tăng tỷ lệ chết và kéo dài
thời gian lột xác.
2.6 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis
Decis là thuốc trừ sâu thuộc nhóm Pyrethroid đƣợc tổng hợp từ thực vật.
Trên cơ sở bắt chƣớc của hoạt chất Pyrethrin có trong cây cúc sát trùng,
ngƣời ta đã tổng hợp và phát triển thành nhóm thuốc trừ sâu Pyrethroid (hiện
có trên 30 hoạt chất) với hoạt tính trừ sâu và độ bền quang học cao hơn. Các
hợp chất Pyrethrin đều là tan mạnh trong chất béo, gần nhƣ không tan trong
nƣớc, nên chúng có hiệu lực tiếp xúc mạnh hơn hiệu lực vị độc. Hầu hết
11
thuốc trừ sâu Pyrethrin có điểm sôi khá cao, ở dạng lỏng nhầy, áp suất hơi
thấp (trừ Allethrin, Prothrin, Pyrethrin I).
Các sản phẩm Pyrethrin đã trải qua 4 thế hệ: (1) Allethrin đƣợc tổng hợp
đầu tiên năm 1949, đƣợc dùng làm hƣơng mũi và phun sol khí để trừ ruồi
muỗi trong y tế; trong nông nghiệp chúng đƣợc dùng trừ rệp, bọ cánh cứng,
sâu, rầy, bảo quản hạt và các mục đích khác. (2) Thế hệ thứ 2 có Dimethrin
(1961), Tetramethrin (Phthalthrin, 1965), Resmethrin, Bioresmethrin và
Biolethrin (1969) có tính quật ngã cao, phổ rộng nhƣng bị phân hủy nhanh
dƣới ánh sáng và không khí nên chúng ít đƣợc sử dụng trong nông nghiệp,
Phenothrin (Sumithrin) sản phẩm cuối 1973 dùng trừ côn trùng trong nhà. (3)
Các sản phẩm thế hệ thứ 3 nhƣ Permethrin, Cypermethrin, Deltamethrin và
Fenvalerat bền dƣới ánh sáng nhất (tổng hợp năm 1971, đƣa ra thị trƣờng
1980) đƣợc dùng nhiều trong nông nghiệp. (4) Các sản phẩm thứ tƣ đƣợc đƣa
ra thị trƣờng vào các năm 1975-1983 dùng để trừ côn trùng hại bông
(Flucythrinat, Cyfluthrin, Fluvalinat), một số sản phẩm khác đƣợc dùng để trừ
ngoại ký sinh hại gia súc (Cyhalothrin, Cypothrin) và nhiều sản phẩm khác
đang đƣợc nghiên cứu (Cycloprothrin và Penpyridin). (Nguyễn Trần Oánh &

ctv, 2007)
2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis
- Tên thông thƣờng của Decis: Deltamethrin (ISO, BSI)
- Tên thƣơng mại: deltamethrin, Decis®, K-Othrin®, NRDC 161, OMS
1998, RU-22974.
- Nhóm hóa học: pyrethroid (nhóm họ cúc)
- Tên hóa học: (s)-α-[14C]cyano-3-phenoxybenzyl-(1R,3R)-3-(2,2-
dibromo-vinyl)-2,2-dimethyl-cyclopropane-carboxylate.
- CTPT: C
22
H
19
Br
2
NO
3

- CTCT:



- Tính chất lý và hóa học: Decis 2,5EC là loại thuốc thuộc nhóm cúc
tổng hợp (Pyrethroid) ở dạng bột tinh thể với nhiệt độ nóng chảy 98-
100
o
C, không màu, không vị. Hoạt chất không tan trong nƣớc, dễ tan
trong aceton, cồn, dioxan và các dung môi nhân thơm khác. Decis
tƣơng đối bền với nhiệt độ, nó không bị phá hủy ở nhiệt độ (40
o
C

khoảng 6 tháng). Ánh sáng và không khí không phá hủy đƣợc Decis
nhƣng Decis không ổn định trong môi trƣờng kiềm .Tuy nhiên hoạt
12
chất Deltamethrin bị thủy phân phụ thuộc vào pH, nếu pH 8,0 (23
o
C)
là 31 ngày và pH 9,0 (25
o
C) là 25 ngày (European commission, 2002).

2.6.2 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 2,5 EC dùng nghiên cứu

Thuốc trừ sâu Decis do công ty Bayer Việt Nam sản xuất. Decis chứa
hoạt chất gây hại là Deltamethrin và thuộc nhóm độc II. Theo chỉ dẫn, Decis
dùng để trị sâu cuống lá (đẩy bật sâu cuống lá ra khỏi nơi ẩn nấp hoặc làm tổ).
Diệt sâu nhanh chỉ trong vòng vài giây nên sâu hại không có cơ hội phá hoại.
Sau khi phun thì thuốc thƣờng bám rất chắc trên lá nên khó bị rữa trôi khi
mƣa. Thời gian cách ly 3 ngày. Hƣớng dẫn sử dụng.
- Đối với bọ xít hôi gây hại cho lúa: pha 25-30 ml cho bình 16 L.
- Đối với sâu cuống lá lúa: Pha 25-30 ml thuốc cho bình 16 L.
- Phun ít nhất 2 bình cho 1000 m2
- Phun khi sâu non tuổi 1-2 hoặc 5-7 ngày sau khi bƣớm rộ.

13


PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
- Địa điểm : Các phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học & Bệnh Thủy
Sản, Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.

- Thời gian thực hiện : từ tháng 1/2012 đến tháng 7/2012
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Tôm sú có trọng lƣợng 7 - 13g đƣợc chọn mua từ các ao nuôi tôm
3.2.2 Dụng cụ
- Bể dùng chứa tôm và bố trí thí nghiệm.
- Bộ dụng cụ tiểu phẩu. khay nhựa, lame, lamelle, keo nhựa, cốc thủy tinh,
khuôn đúc mẫu, cassette, viết chì, sổ ghi chép, găng tay,…và các dụng cụ
cần thiết để làm tiêu bản mô.
- Máy xử lý mô, máy đúc khối, máy cắt lát mỏng (Microtome), khay nhuộm
mẫu, kính hiển vi, tủ lạnh, tủ hút, máy ảnh,…
3.2.3 Hóa chất
- Thuốc trừ sâu Decis 2,5EC chứa hoạt chất Deltamethrin
- Nƣớc cất, cồn tuyệt đối, formaline, acid acetic, xylen, paraffin, sáp ong,…
- Dung dịch nhuộm mẫu Haematocyline và Eosin (H&E).
- Keo dán Enterlan.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phƣơng pháp nuôi dƣỡng tôm
Tôm sú có trọng lƣợng từ 7 – 13g mua từ các ao nuôi tôm đƣợc chuyển
về phòng thí nghiệm, dƣỡng trong bể 1m
3
, 2m
3
, 200L có chứa nƣớc với độ
mặn 10%o. Cho tôm ăn 3 lần trong ngày lúc 7giờ, 17giờ, 21giờ bằng thức ăn
Tomboy và cung cấp sục khí đầy đủ. Hằng ngày theo dõi tôm chết, siphon
chất cặn, thức ăn thừa trong bể và bổ sung nƣớc sau khi cho tôm ăn xong.
3.3.2 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu
Dƣỡng tôm sau 10 ngày tiến hành bố trí thí nghiệm. Chuẩn bị bể nhựa
200L có qua vệ sinh bằng xà phòng và Chlorine. Cấp nƣớc với độ mặn 10%o

14
vào bể. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẩu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm
thức lặp lại 3 lần, mỗi bể bố trí 30 con tôm.
Thu mẫu lúc 0h, thu ngẫu nhiên 3 con ở 3 bể khác nhau. Sau đó cho
Decis vào bể ở các nồng độ khác nhau cho mỗi nghiệm thức. Sau khi thu mẫu
lúc 24h tiến hành tiêm 0,1ml WSSV vào mỗi con tôm.
Theo dõi lƣợng tôm chết và tiến hành thu mẫu sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
và 96 giờ bằng cách chọn ngẫu nhiên 3 con từ mỗi bể. Máu dùng để phân tích
các chỉ tiêu miễn dịch, phần đầu tôm cố định trong dung dịch Davidson’s
AFA để phân tích mô học. Thí nghiệm đƣợc bố trí với các nồng độ Decis nhƣ
sau:
1. Nghiệm thức Đối chứng
2. Nghiệm thức I: 0,001 µg/L + 0,1ml WSSV sau 24 giờ
3. Nghiệm thức II: 0,01 µg/L + 0,1ml WSSV sau 24 giờ
4. Nghiệm thức III:0,1 µg/L + 0,1 ml WSSV sau 24 giờ
5. Nghiệm thức IV: Không có Decis, tiêm 0,1ml WSSV sau 24 giờ
3.3.3 Pha nồng độ thuốc dùng thí nghiệm
- Thuốc trừ sâu Decis 2,5EC, thuốc chứa 25g/L hoạt chất Deltamethrin và
975g/L chất phụ gia.
- Thuốc đƣợc chuẩn bị bằng cách pha dung dịch mẹ có nồng độ 2.500µg/L.
Dung dịch mẹ đƣợc sử dụng để pha thành các nồng độ thí nghiệm dựa vào
thể tích nƣớc trong bể thí nghiệm.
Áp dụng công thức: C
1
V
1
= C
2
V
2

để pha nồng độ thuốc. Trong đó:
C
1
là nồng độ thuốc cần trong thí nghiệm
V
1
là thể tích dung dịch trong bể thí nghiệm
C
2
là nồng độ dung dịch mẹ
V
2
là thể tích dung dịch mẹ cần cho vào bể.
Để pha dung 1 L dung dịch mẹ có nồng độ 2.500µg/L từ thuốc trừ sâu
Decis 25g/L thì thể tích dung dịch Decis cần phải pha là:
V
2
= (C
1
xV
1
)/C
2
= (2.500µg x 1.000mL)/25.000.000µg = 0,1mL (100µL)
C
1
là nồng độ dung dịch mẹ
V
1
là thể tích dung dịch mẹ cần pha

C
2
là nồng độ thuốc trừ sâu Decis
V
2
là thể tích thuốc trừ sâu Decis.
Áp dụng công thức trên để pha các nồng độ 0,001 µg/L, 0,01 µg/L,
0,1µg/L cho thí nghiệm với bể 200L có chứa 50L nƣớc.
3.3.4 Phƣơng pháp phân tích miễn dịch
3.3.4.1 Tổng tế bào máu
15
- Tổng số bạch cầu đƣợc đếm theo phƣơng pháp của Le Mollac et al. (1997)
điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv. (2011)
- Máu tôm đƣợc thu bằng cách dùng kim tiêm vô trùng có chứa 900µl dung
dịch chống đông rút 100µl máu.
- Mật độ tế bào máu đƣợc xác định bằng buồng đếm hồng cầu và quan sát
dƣới kính hiển vi (40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 buồng
đếm (vùng kí hiệu chữ C), đƣa vào giữa thị trƣờng, chuyển sang vật kính
40X (Hình 3.1 ). Đếm 2 lần lặp lại




Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu
Cách tính tổng tế bào máu: TBC = C x 10 x 5 x 10 (tb/mm
3
) (Trong đó C
là tổng số tế bào máu trên 5 vùng đếm).
3.3.4.2 Hoạt tính của Phenoloxidase (PO)
Hoạt tính của Phenoloxidase xác định theo phƣơng pháp của Herández-

López et al. (1996) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv. (2011).
-
Ly tâm 200µl máu ở 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C. Loại bỏ
phần dịch phía trên. Rửa phần viên, hòa tan nhẹ nhàng trong trong
1ml cacodylate-citrate buffer. Sau đó ly tâm 2,000 vòng/phút trong
10 phút ở 4
o
C. Phần viên đƣợc hòa tan với 200µl cacodylate
buffer. Ủ 100µl mẫu với 50µl trypsin (1 mg/ml) trong 10 phút ở 25
– 26
o
C. Thêm 50µl L-DOPA (3 mg/ml). 5 phút sau thêm 800µl
cacodylate buffer
.
- Mẫu đối chứng gồm 100µl mẫu, 50µl cacodylate (thay thế
trypsin), 50µl L-DOPA.
- Đo mẫu bằng Microplate reader ở bƣớc sóng 490 nm.
- Đọc kết quả sau 1 phút hoặc khi độ hấp thụ trong mẫu đối chứng
khoảng 0.02 – 0.05.
3.3.4.3 Hoạt tính của Respiratory burst (RES)
Hoạt tính của Respiratory burst xác định theo phƣơng pháp của Song và
Hsieh (1994) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv. (2011)
- Cho 100µl máu trong dung dịch chống đông đƣợc làm lắng xuống
16
trong eppendorf 0.2 ml có chứa 100 µl dung dịch poly-L-lysine
(0,2%) để tăng sự kết dính của tế bào.
- Ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ huyết tƣơng.
- Thêm vào 100 µl zymosan (0,1% trong Hanks’ solution minus

phenol red).
- Để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ zymosan.
- Tế bào máu đƣợc rửa 3 lần với 100µl Hanks’ solution.
- Nhuộm với 100 µl NBT solution (0,3%) trong 30 phút ở nhiệt độ
phòng. Loại bỏ NBT solution, tế bào máu đã đƣợc cố định.
- Rửa 3 lần với 100 µl methanol 70%, để khô.
- Hòa tan bằng cách thêm vào 120 µl KOH 2M và 140 µl dimethyl –
sulphoxide.
- Đo 3 lần ở bƣớc sóng 630 nm bằng Microplate reader.
3.3.4.4 Hoạt tính của Superoxide dismutase (SOD)
Hoạt tính của Superoxide dismutase đƣợc xác định theo phƣơng pháp
của Beauchamp và Fridovich (1971) điều chỉnh theo Lê Hữu Thôi và ctv
(2011).
- Cho 100 µl dung dịch máu vào 1 ống eppendorf lạnh có chứa 500 µl
phosphate buffer (50mM, pH 7,8).
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Chuyển phần dịch phía trên sang 1 ống eppendorf mới. Ủ 5 phút ở
65
o
C.
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4
o
C. Chuyển phần dịch phía
trên sang 1 eppendorf mới và trữ ở -20
o
C.
- 2 ml dung dich SOD và từ 100µl dịch chiết tách thô đƣợc so màu bằng
máy so màu quang phổ ở bƣớc sóng 560nm.

- Đọc kết quả sau 1 phút hoặc đến khi độ hấp thụ trong tuýp đối chứng
khoảng 0.2 – 0.25.
3.3.5 Phƣơng pháp mô học
3.3.5.1 Cố định mẫu
Mẫu phân tích đƣợc cố định trong dung dịch Davidson’s AFA với tỉ lệ
thể tích 1 mẫu: 10 Davidson’s AFA, sau 24 giờ chuyển sang cồn 70%

, trữ ở
nhiệt độ phòng. Phƣơng pháp mô học thực hiện theo quy trình của Lighter
(1996), có chỉnh sửa cho phù hợp với phòng thí nghiệm theo cô Đặng Thị
Hoàng Oanh.
3.3.5.2 Cắt tỉa và định hƣớng mẫu
Mẫu sau khi chuyển sang cồn 70% phần đầu tôm đƣợc cắt với độ dày 3-
5mm, sau đó cho vào cassette để xử lý mẫu.
17
3.3.5.3 Xử lý mẫu
Khử nƣớc: Mục đích của khử nƣớc là loại nƣớc hoàn toàn trong mô mà
không làm mô và các tế bào bị teo hoặc vị trí của các thành phần cấu tạo
trong mô không bị thay đổi. Vì thế mẫu sẽ đƣợc chuyển sang các lọ cồn có
nồng độ tăng dần từ 80%, 95%, 100% để quá trình xử lý nƣớc không xảy ra
quá nhanh.
Làm trong mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử
nƣớc thì cồn cũng đƣợc loại ra khỏi mẫu. Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô
đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên
những lỗ trên lát cắt. Do đó, mẫu mô sẽ đƣợc ngấm trong dung môi trung gian
(xylen) có thể hòa tan cồn và paraffin.
Ngấm paraffin: Paraffin là chất nền để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên
hình dạng khi cắt. Vì thế sau khi làm trong, mẫu mô sẽ đƣợc ngấm paraffin
nóng chảy (57-60
o

C) bằng cách chuyển mẫu qua nhiều lọ paraffin.
Quy trình xử lý mẫu mô đƣợc cài đặt trong máy xử lý mô tự động
(microm, STP 120-2) qua các bƣớc sau:
Bảng 3.1 Quy trình xử lý mẫu tự động












Sau khi hoàn thành các bƣớc cài đặt chƣơng trình xử lý mô thì tiến hành cho
sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số 1 và tiến hành quy trình xử lý.
3.3.5.4 Đúc khối
Chuyển cassette chứa mẫu đã đƣợc xử lý vào khoang chứa paraffin nóng
chảy trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút. Mẫu mô
STT
Hóa chất sử dụng
Thời gian

1
Cồn 80%
20 phút
20 phút
30 phút

40 phút
40 phút
40 phút
60 phút
20 phút
30 phút
60 phút
60 phút
60 phút
2
Cồn 95%
3
Cồn 95%
4
Cồn 100%
5
Cồn 100%
6
Cồn 100%
7
Cồn 100%
8
Xylen
9
Xylen
10
Paraffin + xylen (7:3)
11
Paraffin + sáp ong (1:1)
12

Paraffin + sáp ong (7:3)