tìm hiểu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm sú giống

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






PHẠM LAN HƢƠNG









TÌM HIỂU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY
TRÊN TÔM SÚ GIỐNG (Penaeus monodon)









LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN












2013

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






PHẠM LAN HƢƠNG

TÌM HIỂU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY
TRÊN TÔM SÚ GIỐNG (Penaeus monodon)








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN





CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGs.Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH






2013

i

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm tạ Thầy, Cô trƣờng Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng
dạy trong thời gian em học ở đây.
Đặc biệt chân thành cảm ơn cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hƣớng dẫn
em thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Cũng xin cảm ơn đến các anh chị ở bộ môn Bệnh Thủy sản và các bạn lớp
Bệnh học thủy sản K35 và đã giúp đỡ và động viên trong khoảng thời gian học
tập tại trƣờng.

ii
TÓM TẮT
Đề tài đƣợc thực hiện nhằm tìm hiểu sự xuất hiện của bệnh AHPNS và
sự tƣơng quan của AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống. Sau khi
tiến hành kiểm tra 111 mẫu tôm sú giống ở các tỉnh ĐBSCL phát hiện 50%
số tôm bị nhiễm MBV khi soi tƣơi và tỷ lệ cƣờng độ nhiễm nhẹ, trung bình
và nặng lần lƣợt là 33%, 12% và 2%. Có đến 46% tôm nhiễm một loài vi
khuẩn hình cầu, Gram âm. Hầu hết tôm của các tỉnh đều bị nhiễm khuẩn cao
từ 31% đến 100%. Không phát hiện ký sinh trùng và vi khuẩn qua các mẫu
kính phết nhuộm Giemsa. Có 16/35 mẫu nhiễm virus chiếm tỷ lệ 46%. Tỷ lệ
mẫu nhiễm các loại virus MBV, IHHNV, WSSV lần lƣợt là 17%, 26% và 3%
và không phát hiện YHV/GAV. Đặc biệt có hiện tƣợng nhiễm kép MBV-
IHHNV. Phát hiện đƣợc 6 mẫu có xuất hiện thể ẩn MBV trên gan tụy tôm sú
giống, 2 mẫu có dấu hiệu hoại tử gan tụy và 2 mẫu xuất hiện cả dấu hiệu của
hoại tử gan tụy và thể ẩn MBV khi quan sát tiêu bản mô. Biểu hiện của hoại
tử gan tụy là mất cấu trúc tế bào hay tập trung tế bào máu ở giữa ống gan tụy.
Có 2 mẫu tôm có dấu hiệu hoại tử gan tụy bị nhiễm vi khuẩn, 3 mẫu có dấu
hiệu hoại tử gan tụy bị nhiễm virus, trong đó có 1 mẫu nhiễm IHHNV, 2 mẫu
nhiễm MBV, đặc biệt có một mẫu nhiễm cả vi khuẩn và MBV.

iii
MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH HÌNH v
DANH SÁCH BẢNG vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1
CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2
2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam hiện nay 2
2.3 Sơ lƣợc về AHPNS 3
2.3.1 Phân bố và thiệt hại 3
2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 4
2.3.3 Đặc điểm bệnh lý 4
2.3.4 Các nghiên cứu và nhận định 5
2.3.5 Phƣơng pháp phòng và quản lý bệnh 7
2.4 Phƣơng pháp kính phết 8
2.5 Phƣơng pháp PCR 9
2.6 Phƣơng pháp mô học 9
CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
3.1 Thời gian thực hiện đề tài 9
3.2 Địa điểm thực hiện 9
3.3 Vật liệu nghiên cứu 9
3.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 9
3.3.2 Dụng cụ 9
3.3.3 Hóa chất 9
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 10

3.4.1 Phƣơng pháp nhuộm nhanh phát hiện MBV (Lightner et al., 1983) 10
3.4.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram, Giemsa quan sát vi khuẩn 10
3.4.3 Phƣơng pháp mô học (Lightner, 1996) 11
3.4.4 PCR 12
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20
4.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống khi kiểm tra bằng phƣơng pháp soi
tƣơi 20
4.1.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống ở ĐBSCL 20
4.1.2 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống của từng tỉnh 21
4.2 Kết quả kính phết 23
4.2.1 Nhuộm Gram quan sát vi khuẩn 23
4.2.2 Nhuộm Giemsa 25
4.3 Kết quả PCR 25
4.3.1 Kết quả PCR phát hiện MBV, IHHNV, WSSV, YHV/GAV 26
4.4 Kết quả mô học 27
4.5 Sự tƣơng quan giữa hoại tử gan tụy và các mầm bệnh trên tôm giống 32
4.6 Chất lƣợng tôm giống 33
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34
5.1 Kết luận 34
5.2 Đề xuất 34
PHỤ LỤC 35

iv
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

v
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Tôm chân trắng ở Việt Nam: tôm bên phải nhiễm AHPNS, tôm bên
trái bình thƣờng (nguồn: D Lightner). 4
Hình 2.2 Gan tụy tôm chân trắng teo và nhợt nhạt, biểu hiện của AHPNS

(nguồn: D Lightner). 4
Hình 2.3 A: Tế bào gan tụy bị tróc; B: thiếu hoạt động phân bào trong tế bào
E; C: không có tế bào B, F và R; D: nhân tế bào trƣơng to; E: Tế bào máu tập
trung; và F: nhiễm khuẩn thứ cấp (Nguồn: Eduado và Mohan, 2012 trích dẫn
bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012). 5
Hình 2.4 Mô gan tụy dạng hoại tử 1 và 2 (nguồn: Lê Hữu Tài và ctv)
5
Hình 3.1 Minh họa kết quả chạy PCR chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000
18
Hình 4.1 Thể ẩn MBV khi soi tƣơi (40X) 20
Hình 4.2 Vi khuẩn trong mẫu kính phết gan tụy khi quan sát ở vật kính 100X
24
Hình 4.3 Kết quả PCR phát hiện MBV, WSSV, IHHNV, YHV/GAV 26
Hình 4.4 Ống tiểu quản gan tụy còn bình thƣờng hình sao và Ống tiểu quản
gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (10X) 29
Hình 4.5 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (10X) 30
Hình 4.6 Ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (40X) 30
Hình 4.7 Cấu trúc ống gan tụy bị hoại tử với sự tập trung của tế bào máu ở
giữa ống gan tụy (10X) 31
Hình 4.8 Cấu trúc ống gan tụy bị hoại tử với sự tập trung của tế bào máu ở
giữa ống gan tụy (40X) 31
Hình 4.9 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc và thể ẩn MBV (10X) 32
Hình 4.10 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc và thể ẩn MBV (40X) 32
Đồ thị 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc tại
ĐBSCL 21
Đồ thị 4.2 Tỷ lệ tôm sú giống nhiễm MBV của từng tỉnh 22
Đồ thị 4.3 Tỷ lệ tôm nhiễm vi khuẩn của từng tỉnh 25

vi
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện IHHNV (Yang
et al., 2006) 10
Bảng 3.2 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher
and Young, 1998) 10
Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện WSSV (Kimura,
1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) 13
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình
PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006) 14
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình PCR phát hiện MBV (Yang et al., 2006) 15
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình PCR phát hiện WSSV (Kimura, 1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết
Hoa, 2011) 15
Bảng 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc từ
các tỉnh ĐBSCL 21
Bảng 4.2 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc từng
tỉnh 22
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn 23
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm các mầm bệnh virus trên tôm giống 27
Bảng 4.5 Kết quả chẩn đoán bệnh trên tôm sú giống 32

vii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome
BL Bạc Liêu
BT Bến Tre
CM Cà Mau
CT Cần Thơ
ctv cộng tác viên
dd dung dịch

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EMS Early Mortality Syndrome
EtBr Ethidium bromide
GAV Gill Associated Virus
HTGT Hoại tử gan tụy
HPV Hepatopancreatic Parvo Virus
H&E Hematoxyclin và Eosin
IHHNV Hypothermal and Hematopoietic Necrosis Virus
MBV Monodon Baculo Virus
MG Malachite green
PCR Polymerase Chain Reaction
ST Sóc Trăng
TG Tiền Giang
TSV Taura syndrome virus
TV Trà Vinh
WSSV White Spot Syndrome Virus
YHV Yellow Head Virus

1
CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
Châu Á là khu vực nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới
nhƣng nghề nuôi trồng thủy sản nơi đây liên tục gặp phải các dịch bệnh nguy
hiểm gây ra những tổn thất to lớn. Trong vài thập niên qua một số dịch bệnh
nhƣ phát sáng, hội chứng đốm trắng, đầu vàng, hội chứng Taura đã từng tàn
phá nghề nuôi tôm nƣớc lợ của khu vực. Gần đây một căn bệnh mới xuất hiện
đƣợc gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome-EMS) hay
còn gọi là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Syndrome-AHPNS) đƣợc báo cáo là đã gây ra thiệt
hại đáng kể cho ngƣời nuôi tôm ở Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia và Thái

Lan (Leaño và Mohan, 2012).
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng nuôi tôm nƣớc lợ chủ yếu
của cả nƣớc. Trong đó tôm sú là đối tƣợng nuôi chính từng mang lại nhiều
ngoại tệ cho đất nƣớc và góp phần cải thiện đời sống cho nhiều nông dân.
Những năm gần đây, do việc thả nuôi ồ ạt không có quy hoạch cộng với việc
suy thoái môi trƣờng đã làm cho dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều gây
thiệt hại nghiêm trọng, trong đó phải kể đến các bệnh nhƣ hội chứng đốm
trắng, đầu vàng, bệnh gây kết dính mang, bệnh còi, phân trắng…Trƣớc sự diễn
biến phức tạp của dịch bệnh đặc biệt là sự xuất hiện của AHPNS mà đến nay
vẫn chƣa biết tác nhân càng làm cho nghề nuôi tôm nƣớc lợ gặp nhiều khó
khăn.
Tôm nhiễm EMS/AHPNS có dấu hiệu hoại tử gan tụy (HTGT) sau khi
thả giống từ 10-45 ngày và tỷ lệ tôm chết cao có thể lên đến 100% (Đặng Thị
Hoàng Oanh, 2012). Đặc biệt tôm chết rất nhanh sau khi xuất hiện dấu hiệu
hoại tử 2-3 ngày (Lê Hữu Tài và ctv, 2012). Có và một vài nơi nông dân thả
tôm lặp lại 2-3 lần sau khi cải tạo ao nuôi nhƣng tôm vẫn chết. Phần lớn tôm
chết khi còn nhỏ và chƣa đạt kích cỡ thƣơng phẩm. Do tác nhân đến nay vẫn
chƣa đƣợc xác định và mức độ nguy hiểm của bệnh nên việc tìm hiểu sự xuất
hiện AHPNS trên tôm giống có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán phát
hiện bệnh, đó là lý do đề tài “Tìm hiểu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm sú
giống (Penaeus monodon)” đƣợc thực hiện.
Mục tiêu đề tài: Tìm hiểu sự xuất hiện của AHPNS và sự tƣơng quan của
AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống.
Nội dung đề tài: Xác định bệnh AHPNS trên tôm sú giống bằng cách kiểm tra
vi sinh vật trên tôm bằng phƣơng pháp kính phết, mô học và kiểm tra một số
virus thƣờng gặp trên tôm bằng phƣơng pháp PCR.

2
CHƢƠNG 2
LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Châu Á là khu vực sản xuất tôm lớn, đặc biệt tôm sú chiếm 46% sản
lƣợng toàn cầu (Theo Thefishsite trích dẫn bởi Phạm Yến, 2009). Các quốc gia
dẫn đầu về diện tích và sản lƣợng tôm nuôi là Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia,
Thái Lan và Việt Nam (FAO, 2010). Tuy nhiên, việc chuyển sang nuôi tôm
chân trắng của Trung Quốc và Thái Lan đã khiến loài tôm này trở nên có ý
nghĩa hơn trong sản lƣợng thủy sản nuôi toàn cầu. Sản lƣợng tôm chân trắng
đã tăng mạnh và chiếm 63% sản lƣợng tôm nuôi toàn cầu năm 2006. Chính
điều này đã đƣa Thái Lan và Trung Quốc lên vị trí đầu bảng trên thế giới về
sản lƣợng tôm nuôi (Theo Thefishsite trích dẫn bởi Phạm Yến, 2009). Tổng
sản lƣợng tôm nuôi thế giới năm 2012 ƣớc đạt 2,02 triệu tấn, giảm 13% so với
2011 do dịch bệnh EMS và biến đổi khí hậu (Ong Thị Kim Ngân, 2012).
2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam hiện nay
Trong năm 2010 mặc dù gặp không ít khó khăn nhƣng ngƣời nuôi tôm
trong nƣớc vẫn thu đƣợc lợi nhuận. Diện tích nuôi tôm nƣớc lợ cả nƣớc trong
năm 2010 đạt trên 639.000 ha, bị thiệt hại hơn 60.000 ha và sản lƣợng đạt gần
470.000 tấn. Sản xuất tôm giống đạt 43 tỷ con (Thanh Sang, 2011).
Năm 2011, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng tăng lên khá nhanh thay
thế nhiều diện tích nuôi tôm sú bị dịch bệnh. Do đó, dù sản lƣợng nuôi tôm sú
giảm nhƣng tổng sản lƣợng tôm nuôi nƣớc lợ vẫn tăng lên. Theo Tổng cục
Thủy sản, diện tích nuôi tôm nƣớc lợ cả nƣớc là 656.425 ha, sản lƣợng đạt
495.657 tấn (tăng 2,71% diện tích và 5,48% sản lƣợng so với năm 2010).
Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lƣợng 319.206 tấn
(bằng 95,81% năm 2010); tôm chân trắng là 33.049 ha, đạt sản lƣợng 176.451
tấn (bằng 129,06% năm 2010). ĐBSCL chiếm 91,8% diện tích nuôi tôm cả
nƣớc với tổng diện tích là 602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và
18.498 ha nuôi tôm thẻ chân trắng) (Thành Công, 2012).
Theo Cục Thú y, trong năm 2011 dịch bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại
cho 13 tỉnh, thành trên cả nƣớc với tổng diện tích 869 ha; trong đó Ninh Thuận
là địa phƣơng bị thiệt hại nặng nề nhất với 216 ha. Bệnh HTGT đã gây thiệt

hại nặng nề ở hầu hết các vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nƣớc (Đ.T.Chánh,
2012). Dịch bệnh lây lan trên diện rộng tại ĐBSCL khiến cho diện tích nuôi
tôm bị thiệt hại lớn nhất từ trƣớc tới nay (97.691 ha). Nghiêm trọng nhất là
Sóc Trăng có hơn 25.000 ha tôm nuôi bị mất trắng (Thành Công, 2012). Khi
tôm sú đối tƣợng bị thiệt hại nặng nề nhất thì nông dân có xu hƣớng chuyển
sang nuôi cá kèo và tôm thẻ chân trắng. Đây chỉ là những thay đổi nhất thời
trƣớc diễn biến khó lƣờng của dịch bệnh, tôm sú vẫn đƣợc đánh giá là đối
tƣợng chủ lực trong tƣơng lai (Thành Công, 2012).
Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2012 cả nƣớc có 30 tỉnh
thành nuôi tôm nƣớc lợ: diện tích thả nuôi là 658 nghìn ha (bằng năm 2011),

3
sản lƣợng 500 nghìn tấn (tăng 0,9% so với năm 2011). Trong đó, diện tích
nuôi tôm sú là 619.000 ha (gần bằng năm 2011) đạt sản lƣợng 310.000 tấn
(giảm 6,4%), diện tích nuôi tôm chân trắng là 38.000 ha (tăng 15,7%)
đạt sản lƣợng 190.000 tấn (tăng 7,3%) (Thu Hiền, 2012). ĐBSCL vẫn là vùng
nuôi tôm sú chủ yếu của cả nƣớc, chiếm 93,6% diện tích (579.997 ha), 94%
sản lƣợng (280.647 tấn) (FICen, 2012).
Về sản xuất giống năm 2012, nhu cầu giống tôm sú khoảng 35-40 tỷ
con, tôm thẻ chân trắng 15-20 tỷ con, trong khi cả nƣớc sản xuất đƣợc hơn 37
tỷ tôm sú giống và gần 30 tỷ tôm thẻ chân trắng giống. Hiện có 1.529 cơ
sở sản xuất giống (giảm 319 cơ sở). Số lƣợng giảm so với năm 2011 nhƣng
quy mô một số cơ sở sản xuất giống lớn hơn (Thu Hiền, 2012).
Năm 2012 nhiều nơi nuôi tôm nƣớc lợ bị dịch bệnh trên diện rộng, gây
thiệt hại to lớn. Dịch bệnh gồm AHPNS, đốm trắng, đầu vàng… Dịch bệnh
xảy ra ở hầu hết các tháng trong năm, mức độ dịch bệnh trầm trọng nhất từ
tháng 4 đến tháng 7 (Anh Đức, 2012). Các tỉnh bị dịch bệnh nhiều nhất là: Sóc
Trăng, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau. Dù công tác phòng chống dịch
bệnh tôm đã đƣợc triển khai sớm, nhƣng vẫn còn tản mạn, cơ chế quản lý và
phối hợp chƣa tốt (FICen, 2012). Tổng diện tích tôm bị thiệt hại là 104.000 ha

(tăng 3,2% so với năm 2011), trong đó tôm sú là 91.000 ha (giảm 2,2%) và
tôm chân trắng là 9.000 ha (tăng gấp 2,25 lần năm 2011). Phần lớn dịch bệnh
xảy ra trên diện tích quảng canh cải tiến nhƣng vẫn thu hoạch đƣợc một phần
(Thu Hiền, 2012). Dịch bệnh trên tôm năm 2012 xảy ra trên diện rộng, kéo dài
(FICen, 2012) và đến nay vẫn chƣa ngừng lại.
2.3 Sơ lƣợc về AHPNS
2.3.1 Phân bố và thiệt hại
Theo các nghiên cứu của Lightner et al. và Flegel thì EMS/AHPNS
xuất hiện ở Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010) rồi đến Malaysia (2011)
(Lightner et al. và Flegel, 2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012).
Gần đây bệnh đƣợc báo cáo là ảnh hƣởng đến tôm ở phía đông Vịnh Thái Lan
(Flegel, 2012 trích dẫn bởi Leaño và Mohan, 2012).
Một số tỉnh nuôi tôm ở Trung Quốc nhƣ Hải Nam, Quảng Đông, Phúc
Kiến và Quảng Tây đã bị thiệt hại hơn 80% trong nửa đầu năm 2011
(Panakorn, 2012 trích dẫn bởi Leaño và Mohan, 2012). Ở Malaysia,
EMS/AHPNS bùng phát dẫn đến sự sụt giảm sản lƣợng tôm thẻ chân trắng từ
70.000 triệu tấn vào năm 2010 xuống còn 40.000 triệu tấn vào năm 2011
(Leaño và Mohan, 2012). Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện từ năm 2010 ở ĐBSCL
nhƣng gây thiệt hại nặng và đƣợc báo cáo từ tháng 3 năm 2011. EMS/AHPNS
gây ảnh hƣởng đến các vùng sản xuất tôm chính nhƣ Tiền Gang, Bến Tre,
Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau với tổng diện tích khoảng 98.000
ha. Trong tháng 6 năm 2011 diện tích nuôi tôm sú bị thiệt hại ở Bạc Liêu là
11.000 ha, Trà Vinh 6.200 ha (làm mất trên 12 tỷ đồng) và Sóc Trăng 20.000
ha (làm mất 1,5 tỷ đồng) (Mooney, 2012 trích dẫn bởi Leaño và Mohan,
2012). Theo Tổng cục thủy sản hiện tƣợng tôm chết ở ĐBSCL năm 2011 xảy

4
ra nghiêm trọng từ tháng 2 đến đầu tháng 6, tôm nhiễm HTGT chết sau khi thả
giống từ 15-40 ngày (Thành Công, 2012).
Theo điều tra của Tổng cục Thủy sản năm 2012, AHPNS chiếm 45,7%

diện tích thiệt hại và xảy ra chủ yếu trên diện tích nuôi tôm công nghiệp, phần
còn lại là do bệnh đốm trắng, đầu vàng. AHPNS đã xảy ra ở 19 tỉnh, thành ven
biển miền Bắc, miền Trung và Nam bộ nhƣng gây thiệt hại nặng nhất là
ĐBSCL (Anh Đức, 2012). Mặc dù ngƣời nuôi đã sử dụng con giống đảm bảo
chất lƣợng, nuôi theo đúng quy trình kỹ thuật nhƣng tôm vẫn chết, thậm
chí tôm nuôi tới 60-90 ngày tuổi, gần đến vụ thu hoạch vẫn bị chết mà không
biết nguyên nhân (Thu Hiền, 2013).
2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh đƣợc ghi nhận xuất hiện trên hai loài tôm sú và tôm thẻ sau khi thả
giống 10-45 ngày. Bệnh gây tỉ lệ chết cao có thể lên đến 100%. Tôm bệnh có
dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, gan tụy teo và nhợt nhạt, ngoài ra tôm còn biểu hiện
mềm vỏ, sẫm màu và có đốm đen trên vỏ đầu ngực (Lightner, 2012 trích dẫn
bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012). Ngƣời ta nhận thấy rằng gan tụy tôm khó bị
nghiền bởi 2 đầu ngón tay, tôm sắp chết thƣờng chìm xuống đáy ao và ruột
tôm có thể đứt đoạn hay trống rỗng (Lightner, 2012).



2.3.3 Đặc điểm bệnh lý
Lightner (2012) mô tả chi tiết về bệnh lý học của AHPNS là tình trạng
thoái hóa của gan tụy tiến triển cấp tính, kèm theo là sự thiếu hoạt động phân
bào trong tế bào E, rối loại chức năng ở các tế bào trung tâm của tổ chức gan
tụy (tế bào B, F và R), dễ thấy những tế bào có nhân trƣơng to, bong tróc các
tế bào biểu mô hình ống và giai đoạn cuối bao gồm sự tập trung tế bào máu ở
giữa ống gan tụy và nhiễm trùng vi khuẩn thứ cấp (Flegel, 2012 trích dẫn bởi
Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012). Đặc điểm mô bệnh học tƣơng tự đƣợc
Prachumwat et al. (2012) mô tả khi quan sát mẫu tôm bệnh thu ở Thái Lan
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012).
Hình 2.1 Tôm chân trắng ở Việt
Nam: tôm bên phải nhiễm

AHPNS, tôm bên trái bình thƣờng
(nguồn: D Lightner)

Hình 2.2 Gan tụy tôm chân trắng
teo và nhợt nhạt, biểu hiện của
AHPNS (nguồn: D Lightner)


5



Hình 2.3: A: Tế bào gan tụy bị tróc; B: thiếu hoạt động phân bào trong tế
bào E; C: không có tế bào B, F và R; D: nhân tế bào trƣơng to; E: Tế bào
máu tập trung; và F: nhiễm khuẩn thứ cấp (Nguồn: Eduado và Mohan,
2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012)
Theo Lê Hữu Tài và ctv. (2012) dựa trên kết quả nghiên cứu diễn biến
của hội chứng HTGT ở huyện Trần Đề (Sóc Trăng) cho biết có hai dấu hiệu
hoại tử ở tôm bệnh khi phân tích mô học: dấu hiệu 1 là các tế bào ống gan tụy
bị thoái hóa hoàn toàn và bong tróc vào trong lòng ống, không tìm thấy sự
hiện diện của các tác nhân gây bệnh hữu sinh, không có những biến đổi bệnh
lý đặc trƣng trên tế bào gan tụy khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Dấu
hiệu 2 là có hiện tƣợng melanin hóa, viêm quanh các ống gan tụy với sự xuất
hiện của vô số tế bào máu và sự hiện diện của trực khuẩn Gram âm trong vùng
hoại tử.

Hình 2.4 Mô gan tụy dạng hoại tử 1 và 2 (nguồn: Lê Hữu Tài & ctv.,
2012)
2.3.4 Các nghiên cứu và nhận định

6
Năm 2011 tôm chết xảy ra trên diện rộng ở hai tỉnh Sóc Trăng, Bạc
Liêu với những biểu hiện gan nhũn, teo hoặc sƣng. Đến năm 2012, tôm chết
cũng xảy ra ở các vùng nuôi nhƣ Cầu Ngang, Duyên Hải (Trà Vinh), Kiên
Lƣơng (Kiên Giang), Bình Đại (Bến Tre) với những biểu hiện về lâm sàn và tổ
chức mô học giống nhƣ năm 2011. Đại diện cục Thú y cho biết dịch bệnh
HTGT năm 2012 xảy ra sớm hơn năm 2011 (tháng 1/2012 đã xảy ra tôm chết)
(Cao Thành Trung, 2012).
Trung Quốc cho rằng nguyên nhân gây EMS/AHPNS do độc tố môi
trƣờng, Malaysia thì cho rằng do độc tố tảo (Cao Thành Trung, 2012). Vào
năm 2011 ở Việt Nam, giả thuyết đƣợc đông đảo cho là do nông dƣợc
cypermethrin. Độc chất này tích tụ lâu trong bùn, khi các yếu tố môi trƣờng
bất lợi thì gây nên ngộ độc (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, 2011).
Tổng cục thủy sản cho biết, thuốc bảo vệ thực vật nhƣ cypermethrin,
deltamethrin, có trong nƣớc và bùn đáy ở hầu hết các ao nuôi tôm ở các địa
phƣơng. Lƣợng thuốc bảo vệ thực vật tồn dƣ trong ao tƣơng đƣơng hoặc cao
hơn nồng độ đã gây chết tôm giống trong điều kiện thực nghiệm (Anh Đức,
2012).
Nguyễn Thị Hiền và ctv. (2011) qua nghiên cứu cho rằng cypermethrin
có ảnh hƣởng đến hiện tƣợng HTGT dạng 1 của tôm sú nuôi trong nhà kín.
Tôm đối chứng và tôm chết cấp tính do nồng độ cypermethrin quá cao (0,05
ppb) không có dấu hiệu HTGT dạng 1. Tôm chết bắt đầu có dấu hiệu HTGT
dạng 1 vào các ngày 7, 16, 12 lần lƣợt ở các nghiệm thức cypermethrin nồng
độ 0,01 ppb; 0,01 ppb; 0,001 ppb. Tôm chết qua phân tích mô học có tỉ lệ
HTGT dạng 1 lần lƣợt là 13,8%; 14,3%; 42,9%. Dấu hiệu hoại tử 1 có biểu
hiện các tế bào của ống gan tụy bị thoái hoá, co lại và rơi vào trong lòng ống.
Các tế bào bị thoái hoá này có thể bị hiện tƣợng tự hủy do các enzyme nội
bào. Có những trƣờng hợp toàn bộ các tế bào hình thành nên cấu trúc ống gan
tụy bị mất hoàn toàn chỉ còn lại bộ khung là các tế bào nền. Dấu hiệu hoại tử 2
trên tôm có dấu hiệu lâm sàng là gan teo, dai và sậm màu, cấu trúc ống gan

hoàn toàn biến mất, số lƣợng các tế bào gan tụy giảm chỉ còn lại sự hiện diện
của vô số tế bào máu bao bọc xung quanh khối hoại tử. Bên trong khối hoại tử
là các tế bào chết và vô số trực khuẩn Gram âm khi quan sát tiêu bản nhuộm
bằng Giemsa và nhuộm Gram. Có hiện tƣợng melanin hoá xung quanh khu
vực hoại tử này.
Lê Hữu Tài và ctv. (2011) phân tích mô bệnh học và siêu cấu trúc của
hội chứng HTGT trên tôm nuôi ở ĐBSCL đã cho rằng tác nhân tiên phát gây
nên dấu hiệu hoại tử 1 có khả năng là các hoá chất hoặc độc tố trong ao nuôi.
Sự nhiễm khuẩn gây nên dấu hiệu hoại tử dạng 2.
Nhƣng giả thuyết cho rằng cypermethrin gây ra AHPNS vẫn chƣa
thuyết phục vì AHPNS cũng đã xảy ra ở những nơi mà cypermethrin đã bị
cấm sử dụng từ lâu nhƣ Thái Lan (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012) và kết quả
kiểm nghiệm 14 mẫu nƣớc và bùn trong 5 đợt thu mẫu tại các vùng nuôi tôm
của tỉnh Tiền Giang từ ngày 18/4/12 đến ngày 18/5/12 đều không phát hiện dƣ
lƣợng Cypermethrin (Nga Thi, 2012). Đến giữa tháng 8/2012 tại Hội thảo
bệnh HTGT cấp tính ở Bangkok có kết luận cypermethrin không gây AHPNS

7
sau khi tiến hành thử nghiệm. Hội thảo này cũng thông tin thêm là không tìm
thấy các loại virus thƣờng gặp nhƣ WSSV, YHV, IMNV hoặc TSV khi chẩn
đoán bằng PCR.
Lê Hồng Phƣớc và ctv. (2011) đã nghiên cứu diễn biến của hội chứng
HTGT trong ao nuôi tôm thâm canh ở huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng cho thấy
HTGT xuất hiện rất sớm trên tôm nuôi (sớm nhất là 17 ngày tuổi). Tỷ lệ xuất
hiện HTGT trong ao nuôi có tôm chết dao động từ 9-90%.
Theo Chalor Limsuwan (2012) cho biết AHPNS gây chết tôm nuôi ở
Thái Lan giai đoạn 15-50 ngày đầu sau khi thả giống và không liên quan gì
đến các bệnh khác thƣờng xuất hiện trên tôm (nhƣ đốm trắng, đầu vàng, teo
gan). Tôm bị AHPNS thƣờng chết trong giai đoạn 15-20 ngày sau khi thả
giống (Thành Công, 2012).

Flegel et al., (2012) qua nghiên cứu thấy tôm bệnh ở Việt Nam có sự
hiện diện một số vi khuẩn mới (ít nhất 5 loài vi khuẩn, Delftia và Ralstonia
thuộc nhóm Burkholderiales), và trên mẫu tôm bệnh có sự hiện diện của
bacteriophage. Theo Đại học Cần Thơ, một số mẫu thu đƣợc khi phết gan tụy
trên kính có sự hiện diện rất nhiều vi khuẩn. Và hƣớng nghiên cứu tiếp theo là
phân lập loại vi khuẩn gì trên gan tôm bệnh (Cao Thành Trung, 2012).
Nguyễn Văn Hảo (2012) cho rằng AHPNS xảy ra do sự kết hợp của hai
yếu tố, đầu tiên là do độc tố làm mất chức năng của gan, sau đó nhóm vi
khuẩn Vibrio sẽ xâm nhập gây tôm chết hàng loạt và lan rộng (Thành Công,
2012).
Ban đầu Lightner cho rằng nguyên nhân gây ra EMS/AHPNS là do độc
tố từ môi trƣờng nuôi, thức ăn và vi khuẩn nhƣng sau khi tiến hành các thí
nghiệm thì ông khẳng định thức ăn và độc tố không gây ra AHPNS. Trong
một báo cáo của ông vào năm 2012 cũng thông tin rằng gan tụy tôm bị hoại tử
và rối loạn chức năng khi mắc AHPNS. Giai đoạn cuối có sự bong tróc các tế
bào biểu mô hình ống, tế bào máu ở tập trung giữa ống gan tụy và nhiễm trùng
vi khuẩn thứ cấp (Vibrio spp).
Khi nghiên cứu nguyên nhân gây hội chứng HTGT trên tôm nuôi ngƣời
ta nhận thấy tôm giống có chất lƣợng xấu (nhiễm Vibrio, có dấu hiệu bất
thƣờng gan tuỵ, thậm chí đã bị HTGT cấp) và tôm đƣợc thả nuôi trong điều
kiện môi trƣờng bất lợi (hiện diện của thuốc bảo vệ thực vật, oxy hoà tan thấp,
độ mặn cao, ô nhiễm hữu cơ ) (Nhật Hồ, 2012).
Các nghiên cứu đã đƣợc triển khai trên nhiều nhân tố nhƣ nguồn giống,
môi trƣờng, độc tố, vi sinh vật, dịch tễ nhằm tìm ra nguyên nhân gây bệnh,
giải pháp chẩn đoán và phòng trị (Phạm Văn Tuấn, 2012 trích dẫn bởi Cao
Thành Trung, 2012).
2.3.5 Phƣơng pháp phòng và quản lý bệnh
Trung Quốc có giải pháp để hạn chế bệnh này là nuôi luân canh, nuôi
mật độ thấp (Cao Thành Trung, 2012). Do chƣa biết tác nhân gây bệnh nên
phòng bệnh tổng hợp là chủ yếu. Để hạn chế bệnh HTGT, Viện nghiên cứu

8
nuôi trồng thủy sản II khuyến cáo ngƣời nuôi tôm phải chuẩn bị tốt ao nuôi
bằng cách: xử lý bùn đáy; tiệt trùng nguồn nƣớc đầu vào; kiểm soát đƣợc sự
nở hoa của tảo ở trong ao nuôi; thả giống tốt; kiểm soát đƣợc lƣợng thức ăn
trong ao; bổ sung lƣợng carbon vô cơ nhằm cung cấp năng lƣợng cho vi sinh
vật hiếu khí thực hiện quá trình nitrat hóa… Những biện pháp này đã đƣợc
khảo nghiệm thực tế và bƣớc đầu mang lại hiệu quả rất khả quan (Sỹ Tuyên,
2012).
2.4 Phƣơng pháp kính phết
Muốn quan sát rõ hình dạng vi khuẩn thƣờng phải nhuộm màu cho vi
khuẩn và quan sát dƣới kính hiển vi. Phƣơng pháp nhuộm Gram và Giemsa
thƣờng đƣợc dùng trong thủy sản giúp ta phân biệt, quan sát hình dạng và sự
phân bố của vi khuẩn, kí sinh trùng. Nhuộm Gram còn giúp phân biệt hai loại
vi khuẩn Gram dƣơng và âm dựa trên sự khác biệt cấu tạo thành tế bào. Ngoài
ra nhuộm Giemsa còn đƣợc dùng để quan sát và phân biệt các tế bào máu.
Kính phết máu tôm đƣợc thực hiện bằng cách rút máu tôm, phết lên
lame kính rồi soi tƣơi hoặc nhuộm Gram hay H&E để kiểm tra hình thái hồng
cầu, sự hiện diện của vi trùng và kí sinh trùng trong máu (Graindorge và
Flegel, 1999 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011). Những biến đổi nhƣ
nhân bị co lại thƣờng có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc đầu vàng. Nhân bị vỡ
và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trƣng của sự nhiễm virus
YHV. Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thƣờng đƣợc tìm thấy trong
máu. Kính phết mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đƣợc thực hiện bằng cách
đặt mẫu lên lame cho vào một giọt dd cố định Davidsion, phết đều, để khô và
nhuộm H&E. Phƣơng pháp này có thể phát hiện các thể ẩn của virus trong
trƣờng hợp tôm bị nhiễm nặng. Ngoài ra cũng có thể phát hiện nhóm Vibrio và
vi bào tử trùng (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011).
Phƣơng pháp nhuộm nhanh bằng Malachite green (MG) 0,05-0,1%
đƣợc Lightner et al. đề ra năm 1983 nhằm phát hiện nhanh các thể ẩn của

MBV trong vòng 5 phút nhƣng có hạn chế là chỉ kiểm tra đƣợc những con tôm
bị nhiễm bệnh cấp tính hoặc trƣớc cấp tính trong một quần đàn có tỷ lệ nhiễm
cao (Lightner et al., 1989 trích dẫn bởi Quảng Thị Mỹ Duyên, 2009). Kính
phết mẫu gan tụy nhuộm bằng Malachite green (Lightner, 1996) hiện đang
đƣợc sử dụng rất phổ biến để phát hiện virus MBV và HPV ở tôm sú (Đặng
Thị Hoàng Oanh, 2011).
Cũng theo Quảng Thị Mỹ Duyên (2009) khi so sánh kết quả phát hiện
MBV trên tôm sú bằng phƣơng pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR thì
cho thấy đối với mẫu tôm giống bị nhiễm MBV nặng khi đƣợc phát hiện bằng
3 phƣơng pháp đều cho kết quả dƣơng tính. Nhƣng đối với mẫu tôm giống bị
nhiễm nhẹ hoặc nhiễm vừa thì có sự sai khác nhau về kết quả. PCR thì tiện lợi
hơn hai phƣơng pháp còn lại vì có thể phát hiện mầm bệnh ở bất kỳ giai đoạn
nào. Nhƣng hai phƣơng pháp nhuộm thì lại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán
nguyên nhân gây bệnh, đặc biệt nhuộm MG thì thời gian thực hiện ngắn và
đơn giản hơn nhuộm H&E.

9
2.5 Phƣơng pháp PCR
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật đƣợc phát minh và đặt tên bởi Mullis và các
cộng sự năm 1985 dựa trên nguyên tắc tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch
khuôn DNA với sự hiện diện của những mồi chuyên biệt, enzyme tổng hợp
DNA, các nucleotid tự do, dd đệm theo các chu kỳ nhiệt. Đây là kỹ thuật rất
nhạy và cho phép xác định nhanh chóng sự có mặt của các gen trong tế bào.
PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kì lập lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kì
gồm ba bƣớc:
- Bƣớc 1 (giai đoạn biến tính): phân tử DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn
nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA, thƣờng là 92-95
o
C trong 30-60 giây.
Mạch đôi DNA tách ra thành hai mạch đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp các

đoạn mồi.
- Bƣớc 2 (giai đoạn gắn mồi): trong bƣớc này nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt
độ nóng chảy, các đoạn mồi sẽ bắt cặp mạch đơn DNA khuôn ở vị trí bổ sung.
Nhiệt độ này dao động từ 45-65
o
C khoảng một phút. Nhiệt độ này có thể thay
đổi nếu thay đổi cặp mồi.
- Bƣớc 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
o
C giúp cho DNA
polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Lúc này các đoạn mồi đã bắt cặp
DNA khuôn mẫu sẽ đƣợc kéo dài. Thời gian bƣớc này tùy thuộc độ dài của
trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Mỗi chu kì trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng
gấp đôi mẫu của lần trƣớc. Đây là sự lập lại theo cấp số nhân, tối đa là 40 chu
kỳ với khoảng 10
6
bản sao.
Sau phản ứng PCR các DNA đƣợc nhuộm bởi EtBr và có thể quan sát
thấy qua việc điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và đọc kết quả dƣới tia
UV (Khuất Hữu Thanh, 2003 trích dẫn bởi Trần Việt Tiên, 2007).
2.6 Phƣơng pháp mô học
Mô bệnh học là phƣơng pháp xác định sự biến đổi cấu trúc mô tế bào
(vi thể) ở cá thể bị bệnh đƣợc so sánh với cấu trúc mô ở cá thể bình thƣờng và
đối chiếu với các tổn thƣơng, biểu hiện lâm sàng của vật chủ. Dựa trên kết quả
của phƣơng pháp mô bệnh học và các phƣơng pháp chẩn đoán khác có thể tìm
hiểu mối quan hệ giữa mầm bệnh và vật chủ. Theo Đặng Thị Hoàng Oanh
(2011) nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thƣơng bên ngoài mà không có các
thông tin liên quan đến mô và tế bào thì không thể có kết luận chính xác vì
nhiều bệnh khác nhau có sự tổn thƣơng hình thái giống nhau.

Kỹ thuật mô bệnh học có vai trò quan trọng trọng nghiên cứu bệnh trên
các động vật thủy sản đặc biệt là tôm. Hầu hết các bệnh thƣờng gặp đều cần
chẩn đoán xác định bằng phƣơng pháp này. Tuy nhiên nó có những hạn chế
nhất định nhƣ thời gian chẩn đoán chậm… Phƣơng pháp mô học chỉ nên sử
dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trƣờng và sức khỏe tôm để xác định
tác nhân gây bệnh (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003).
CHƢƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian thực hiện đề tài
Từ tháng 6 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013
3.2 Địa điểm thực hiện
Phòng thí nghiệm của Bộ môn Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trƣờng
Đại học Cần Thơ.
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Tôm sú giống đƣợc các nông dân từ một số tỉnh ở ĐBSCL mang đến bộ
môn Bệnh học thủy sản-Trƣờng Đại học Cần Thơ xét nghiệm.
3.3.2 Dụng cụ
- Vợt lƣới, pen, kim mũi nhọn, kính hiển vi, eppendorf, ống nhỏ giọt, viết
lông dầu, cốc thủy tinh, lame, lamella.
- Keo nhựa, khuôn đúc mẫu, cassette, viết chì, sổ ghi chép, găng tay, máy
xử lý mô, máy đúc khối, máy cắt lát mỏng (Microtome), khay nhuộm
mẫu, kính hiển vi, tủ lạnh, tủ hút, máy ảnh,…và các dụng cụ cần thiết để
làm tiêu bản mô.
- Máy chu kì nhiệt, máy so màu quang phổ, pipet tự động, que nghiền, máy
lắc, máy ủ, máy li tâm, máy điện di, lò vi ba, cân điện tử, bàn đọc UV,
máy chụp hình gel…
3.3.3 Hóa chất
Kính phết: Malachite green 0,1%, Davidsion AFA, Davidsion không có acid
acetic, acid 1%, dd nhuộm Gram, Giemsa.

Mô học: Nƣớc cất, cồn tuyệt đối, cồn 70%, formaline, acid acetic, xylen,
paraffin, sáp ong, thuốc nhuộm Haematocyline và Eosin, keo dán Enterlan.
PCR: Lysis buffer, ethanol, dd đệm PCR, dNTPs, Taq DNA polymerase, Mg-
Cl
2
, mồi, nƣớc cất, chloroform, 95% ethanol, nƣớc cất, iso-propanol, agarose,
dd nạp mẫu Loading dye 6X, dd điện di TAE, ethidium bromide,
Trình tự mồi sử dụng trong quy trình PCR


Tên mồi
Trình tự
IHHNV
I 2814
5'-TAA TGA AGA CGA AGA ACA CGC CGA AGG-3'
I 3516
5'-TGG GTA GAC TAG GTT TCC AAG GGA TGG TT-3'
Bảng 1.1 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện IHHNV
(Yang et al., 2006)

10

Tên mồi
Trình tự
MBV
361F
5′-TCC AAT CGC GTC TGC GAT ACT-3′
361R
5′-CGC TAA TGG GGC ACA AGT CTC-3′
Bảng 1.2 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV

(Belcher and Young, 1998)
Bƣớc
Tên mồi
Trình tự
Deca
(CSIRO, 2008)
20a2
5’-ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT-3’

20s9
5’-GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A-3’
Bƣớc 1
(Kimura et al, 1996)
P1
5’-ATC-ATG-GCT-GCT-TCA-CAG-AC-3’

P2
5’-CGC-TGG-AGA-GGA-CÂ-GAC-AT-3’
Bƣớc 2
(Kimura et al, 1996)
P3
5’-TCT-TCA-TCA-GAT-GCT-ACT-GC-3’

P4
5’-TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3’
Bảng 1.1 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện WSSV
(Kimura et a.l, 1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2011)
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Phƣơng pháp nhuộm nhanh phát hiện MBV (Lightner et al., 1983)
Chỉ dùng tôm còn sống. Số tôm quan sát trên mỗi mẫu là 25-40 con. Dùng

pen và kim mũi giáo tách giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đƣa lên lame
tán mỏng. Nhỏ 1 giọt dd MG lên và quan sát các thể ẩn MBV dƣới kính hiển
vi ngay trong vòng 5 phút. Các thể ẩn MBV có dạng cầu, đơn lẻ hay kết thành
chùm. Nhân và giọt lipid của tế bào không bắt màu dƣới kính hiển vi.
Theo Lightner và Redman, 1983 (trích dẫn từ Thanh Dung, Trần Thị
Tuyết Hoa và Phạm Minh Đức, 2008) chia cƣờng độ cảm nhiễm MBV ra làm
4 mức (tính cƣờng độ theo thị trƣờng quan sát):
o Cƣờng độ cảm nhiễm nhẹ (+): một vài tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn
của virus.
o Cƣờng độ cảm nhiễm trung bình (++): 10-30% tế bào gan tôm bị nhiễm
thể ẩn của virus.
o Cƣờng độ cảm nhiễm nặng (+++): 30-60% tế bào gan tôm bị nhiễm thể
ẩn của virus.
o Cƣờng độ cảm nhiễm rất nặng (++++): 60-80% tế bào gan tôm bị
nhiễm thể ẩn của virus.
3.4.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram, Giemsa quan sát vi khuẩn
3.4.2.1 Chuẩn bị tiêu bản
Tôm dùng làm kính phết phải còn sống, mỗi mẫu lấy 15-20 con. Tách lấy
khối gan tụy trên lame. Nhỏ vào khối gan tụy 1 giọt dd cố định Davidsion
không có acid acetic, dùng lamella đặt một góc 45
o
với lame rồi kéo một lần từ
đầu đến cuối lame. Sau khi khô, cố định lame đã phết bằng acid 1% trong 1
phút. Tiếp tục để khô.

11
3.4.2.2 Nhuộm Gram (Gram, 1884 có chỉnh sửa)
Tiêu bản đƣợc nhuộm Gram theo trình tự:
o Bƣớc 1: nhỏ dd Crystal violet (dd 1). Để 1 phút. Rửa lại với nƣớc
cất cho hết màu tím trên lame. Vẩy cho ráo. Lƣu ý không xịt nƣớc

vào ngay vết phết vi khuẩn.
o Bƣớc 2: nhỏ dd Iodine (dd 2) lên. Để 1 phút. Nghiêng lame cho trôi
hết dd 2.
o Bƣớc 3: tẩy màu bằng cách nhỏ từ từ dd cồn-aceton (dd 3) đến khi
giọt nƣớc cuối cùng trên lame không còn màu tím. Rửa và vẩy cho
ráo nƣớc. Lƣu ý không nhỏ dd 3 liên tục vì sẽ làm trôi phẩm nhuộm
dd 1 đẫn đến sai kết quả.
o Bƣớc 4: nhỏ dd Safranin (dd 4) lên lame. Để 30 giây đến 1 phút.
Rửa và vẩy cho ráo nƣớc. Để khô ở nhiệt độ phòng.
Quan sát tiêu bản ở vật kính 100X. Vi khuẩn Gram dƣơng bắt màu xanh
tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng đỏ.
3.4.2.3 Nhuộm Giemsa (Wolbach, 1922 cải tiến bởi Luna, 1968)
Trình tự các bƣớc nhuộm Giemsa
- Bƣớc 1: ethanol 95%, 5 phút
- Bƣớc 2: nƣớc máy, 1 phút
- Bƣớc 3: dd giemsa, 25-30 phút.
- Bƣớc 4: aceton nguyên chất, 1 phút
- Bƣớc 5: aceton nguyên chất, 1 phút
- Bƣớc 6: xylen, 1 phút
Quan sát tiêu bản ở vật kính 100X.
3.4.3 Phƣơng pháp mô học (Lightner, 1996)
3.4.3.1 Cố định mẫu
Mẫu tôm dùng trong phƣơng pháp mô học phải còn sống. Cố định mẫu
tôm bằng dd Davidson tỷ lệ 1:10 theo thể tích. Ngâm trực tiếp tôm giống vào
dd cố định. Thời gian cố định từ 12-24 giờ, sau đó chuyển sang cồn 70% để
bảo quản lâu dài.
3.4.3.2 Cắt tỉa và định hƣớng mẫu
Đối với tôm giống nhỏ hơn 3cm cần phải cắt bỏ những phần phụ và
chia tôm làm đôi. Sau đó lấy phân nửa của tôm cho vào khuôn nhựa xử lý
mẫu.

3.4.3.3 Xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu mô đƣợc cài đặt trong máy xử lý mô tự động gồm
các giai đoạn: loại nƣớc, làm trong mẫu và tẩm paraffin (Phụ lục B).
3.4.3.4 Đúc khối

12
Cho mẫu đã xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy trên máy đúc
khối, để trong paraffin 30 phút. Cho một ít paraffin nóng chảy vào khuôn inox,
bỏ mẫu vào và chỉnh cho ngay ngắn. Đặt khuôn nhựa có kí hiệu mẫu lên trên.
Đƣa khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại.
3.4.3.5 Cắt mẫu
Gắn khối mẫu vào máy sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt. Có thể bắt đầu
với những lát cắt 12-16µm, sau khi cắt bằng mặt khối mẫu đến vị trí mong
muốn, điều chỉnh độ dày về 2µm.
3.4.3.6 Dán mẫu lên lame
Đƣa những lát cắt vào khay nƣớc ấm (40-50
o
C). Chọn những đoạn mẫu
mong muốn, dùng lame đã thoa dd Mayer albumin vớt lát cắt ra khỏi nƣớc.
Sau đó sấy lame mẫu với bàn sấy ở 37
o
C trong 12 giờ.
3.4.3.7 Nhuộm mẫu
Quy trình nhuộm mẫu bằng Hematoxyclin và Eosin (H&E) (phụ lục B).
3.4.3.8 Dán tiêu bản và đọc kết quả
Dùng keo dán Enterlan để dán tiêu bản. Khi dán lamella cần tránh bọt
khí. Mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở nhiều độ phóng đại khác nhau.
3.4.4 PCR
3.4.4.1 Ly trích DNA
- Nghiền tôm (20-25 con) trong ống eppendorf 1.5µl với 500µl dd đệm ly

trích DNA.
- Nung nóng các tuýp ở 100°C trong 10 phút.
- Để tuýp nguội trong vài phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 5
phút.
- Chuyển 100µl dịch nổi chứa DNA sang tuýp mới có sẵn 200µl cồn 100%.
- Trộn đều mẫu, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bỏ phần dịch nổi và làm khô viên DNA.
- Hòa tan viên DNA bằng 500µl nƣớc cất vô trùng.
Đo hàm lƣợng DNA
Hàm lƣợng DNA của mẫu đƣợc xác định bằng máy so màu quang phổ
sử dụng bƣớc sóng 260nm. Sử dụng 500µl nƣớc cất để tạo mẫu blank, đo mẫu
blank trƣớc khi đo mẫu DNA. Dùng 500µl dd DNA li trích (pha loãng với
nƣớc cất tỉ lệ 5:495) để đo. Đọc kết quả trên máy. Tính hàm lƣợng DNA theo
công thức: [DNA] (µg/ml) = Giá trị đo đƣợc ở 260 nm x 50 x độ pha loãng.
3.4.4.2 Ly trích RNA

13
Cho mẫu (mang hoặc 5, 10 tôm bột) vào ống túyp 1.5ml có chứa 500µl
dd li trích RNA.
- Nghiền mẫu trong túyp bằng que nghiền, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5
phút.
- Thêm 100µl CHCl
3
, lắc kỹ trong 20 giây. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 3
phút, sau đó li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
- Chuyển 200µl phần trong phía trên sang một túyp 0.5ml mới có chứa
200µl isopropanol.
- Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút rồi rút bỏ iso-propanol.
- Rửa phần viên bằng 0.5ml methanol 75%, sau đó ly tâm ở 7500 vòng/phút
trong 5 phút, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô phần viên.

- Hoà tan phần viên với nƣớc cất tiệt trùng.
Hoà tan RNA
Do các mẫu có nguồn gốc khác nhau có hàm lƣợng RNA khác nhau,
cần điều chỉnh nồng độ RNA bằng cách hoà tan với lƣợng nƣớc cất:
Nguồn mẫu Liều lƣợng
Tôm bột 500 µl
Mang 200 µl
3.4.4.3 Thực hiện phản ứng khuếch đại
a. Quy trình PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006)
Hóa chất
Nồng độ
Thể tích
10X dung dịch đệm
1 X
2.5 µl
25mM MgCl2
2 mM
2 µl
10mM dNTPs
0.2 mM
0.5 µl
5U/µl Taq DNA polymerase
1.25 U
0.25 µl
10µM Mồi I 2814
0.4 µM
1 µl
10µM Mồi I 3516
0.4 µM
1 µl

Nƣớc cất 2 lần

16.75 µl
ADN khuôn
200 ng / µl
1 µl
Tổng

25µl
Bảng 2.1 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui
trình PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006)
Cách chuẩn bị phản ứng
Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng PCR đƣợc thực hiện dựa theo số
lƣợng mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị mẫu có thêm mẫu đối chứng
dƣơng và 1 đối chứng âm (nƣớc cất 2 lần tiệt trùng).
- Trộn đều hóa chất theo các thành phần nhƣ bảng trên
- Cho 24 µl hỗn hợp vừa trộn vào ống eppendorf 0,5 ml đã đƣợc ghi tên.
- Thêm 1 µl ADN khuôn hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng.
- Thực hiện phản ứng PCR theo chu kỳ nhiệt:

14
94
o
C trong 5 phút
Sau đó
94
o
C trong 30 giây
56
o

C trong 30 giây
72
o
C trong 1 phút
Lặp lại 30 chu kì.
72
o
C trong 5 phút
Giữ ở 20
o
C cho đến khi kết thúc.
b. Quy trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998)
Cách chuẩn bị phản ứng
Các đối chứng: Trong mỗi lần khuếch đại nên kèm theo 2 đối chứng
dƣơng (DNA mạch khuôn của MBV) và các đối chứng âm (không có mạch
khuôn của MBV và DNA mạch khuôn của tôm).

Hóa chất/dung dịch
Nồng độ
Thể tích
Nƣớc

16 µl
Dung dịch đệm 10X
1X
2.5 µl
MgCl2 (25mM)
1.5 mM
1.5 µl
dNTP (10mM)

0.2 mM
0.5 µl
Taq DNA polymerase (5U/μl)
2.5 U/μl
0.5 µl
Mồi MBV-1.4F (10μM)
0.4 µM
1 µl
Mồi MBV-1.4R (10μM)
0.4 µM
1 µl
DNA khuôn MBV
200 ng/µl
2µl
Tổng

25 µl
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của
quy trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998)
Điều kiện phản ứng:
95
o
C trong vòng 5 phút
Sau đó
95
o
C trong vòng 30 giây,
60
o
C trong vòng 1 phút,

72
o
C trong vòng 1 phút
Lặp lại chu kỳ trên 35 lần
72
o
C trong vòng 5 phút
Giữ ở 20
o
C cho đến khi kết thúc.
b. Quy trình PCR phát hiện WSSV
Bảng 3.2 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của
quy trình PCR phát hiện WSSV (Kimura et al., 1996 chuẩn hóa bởi Trần
Thị Tuyết Hoa, 2011)
- Thành phần hóa chất tham gia phản ứng: 20 μl/phản ứng

15

Bƣớc 1:


Nồng độ
Thể tích
Nƣớc

9.7 μl
PCR buffer 10X
1X
2 μl
MgCl2 (25mM)

1,5 mM
3 μl
dNTP mix (10 mM)
200 μM
1 μl
Mồi P1 (20 pmol)
20 pmol
1 μl
Mồi P2 (20 pmol)
20 pmol
1 μl
Mồi 20a2 (20 pmol)
10 pmol
0,5 μl
Mồi 20s9 (20 pmol)
10 pmol
0,5 μl
Taq DNA polymerase (5 UI/μl)
1,5 UI
0,3 μl
Hàm lƣợng DNA khuôn
(200 ng /μl)
1 μl

Bƣớc 2:

Hóa chất
Nồng độ
Thể tích
Nƣớc

9.7 μl
PCR buffer 10X
1X
2 μl
MgCl2 (25mM)
1,5 mM
3 μl
dNTP mix (10 mM)
200 μM
1 μl
Mồi P3
20 pmol
1 μl
Mồi P4
20 pmol
1 μl
Mồi 20a2 (100 μM)
10 pmol
0,5 μl
Mồi 20s9 (100 μM)
10 pmol
0,5 μl
Taq DNA polymerase (5 UI/μl)
1,5 UI
0,3 μl
Sản phẩm PCR bƣớc 1

1 μl

Điều kiện phản ứng:
94
o
C trong 5 phút
Sau đó
94
o
C trong 30 giây
56
o
C trong 30 giây
72
o
C trong 1 phút
Lặp lại chu kì trên 30 lần
72
o
C trong 5 phút cho kết thúc ở vòng cuối cùng
c. Quy trình phát hiện YHV và GAV bằng kit IQ2000YHV/GAV
(thực hiện theo tài liệu hƣớng dẫn của nhà sản xuất Farming Intelligene
Corporation, Đài Loan)