Thực tập hóa sinh lâm sàng Y Phạm Ngọc Thạch

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
ĐẠI HỌC Y KHOA PHAM NGỌC THẠCH
Bộ môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử






THỰC TẬP




(Tài liệu lưu hành nội bộ)










Năm học: 2014 - 2015
Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
1
CHẨN ĐOÁN HEMOCHROMATOSIS BẰNG
RFLP

I. GIỚI THIỆU VỀ HEMOCHROMATOSIS NGUYÊN PHÁT
(Hereditary hemochromatosis)
- Hemochromatosis nguyên phát là bệnh di truyền nhiễm sắc thể thường với
đặc điểm rối loạn chuyển hoá sắt. Bệnh biểu hiện bằng việc rối loạn hấp thụ
sắt tại niêm mạc ruột non (tá tràng). Gia tăng sắt ở mô có thể làm tử vong
nếu không được chẩn đoán kòp thời.
- Hemochromatosis là bệnh di truyền hay gặp, chiếm từ 1/200 đến 1/400
dân số Bắc Âu, với số người lành mang bệnh ước tính là 1/8 đến 1/10 người.
- Sắt lắng đọng chính trong nội tạng như gan, tụy đưa đến rối loạn chức
năng và bệnh như xơ gan, tiểu đường. Ngoài ra còn gây gia tăng sắc tố
melanin ở da.

- Gen HFE nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 giải mã ra protein
HFE tham gia vào quá trình điều hòa việc hấp thu sắt của cơ thể. Protein
HFE - 348 acid amin gồm 3 phần chính: 3 thành phần 1, 2, 3, phần xuyên
màng tế bào và phần bên trong màng tế bào (Hình 1).
- Chức năng protein HFE: tác động tương hổ với một số trên bề mặt tế bào
để xác đònh lượng sắt trong cơ thể; điều hòa hepacidin (peptide hormone) được
HOOC
HOOC
NH
2
NH
2

Ngoại
bào
Tế bào chất
His 63 → Asp
Cys 282 → Tyr
Màng tế
bào
Hình 1: Cấu trúc và cơ chế xuyên màng của Protein
HFE
Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
2
tiết từ gan để điều hòa lượng sắt hấp thu từ thực phẩm và phóng thích sắt dự
trữ; tác động tương hổ với transferrin receptor để điều hòa sắt nhưng cơ chế
chưa biết rõ ràng.

Đột biến C282Y:
Đây là đột biến hay gặp nhất (Zhang và cộng sự, 2003). Cystein ở vò trí 282 bò

thay thế bởi Tyrosin, gây nên:
o Ngăn chặn tạo thành cầu nối S-S giữa C282 và C255, từ đó làm cho
phần  3 không thể liên kết được với beta-2-microglobulin.
o Do đó ngăn chặn không cho protein HFE xuyên màng. Việc điều hòa
hấp thu sắt bò rối loạn.
- Khi nghiên cứu ở chuột bò khuyết gen HFE hay beta-2-microglobulin đều
bò gia tăng sắt trong cơ thể như bệnh Hemochromatosis ở người.
- Bệnh cảnh lâm sàng của Hemochromatosis di truyền là: Xơ gan, tiểu
đường, suy tim, tăng sắc tố da, thấp khớp và loãng xương ở nam giới. Bệnh
khởi phát vào 40 tuổi ở nam và vào 50 tuổi ở nữ. U gan là biến chứng quan
trọng ở người già.
- Người bình thường có 4g sắt trong cơ thể, chứa trong hồng cầu (1,5 - 3g)
và trong các mô khác. Khoảng 0,5 g được dự trữ trong tế bào gan.
Hemochromatosis có thể gây ứ đọng đến 50 g sắt trong cơ thể, trong đó 1/3 là
chứa trong gan.
- Đònh lượng nồng độ Ferritin/huyết thanh, độ bão hòa Transferrin/huyết
thanh (là 1ß globulin chuyên chở sắt của huyết tương), và sinh thiết gan được
xử dụng để chẩn đoán Hemochromatosis nguyên phát .

Đột biến H63D:
- Histidin bò thay thế bởi Aspartic ở vò trí 63, làm cho phần 2 của protein
HFE không thể liên kết với thụ thể transferrin (TfR: Transferrin Receptor),
do đó không ức chế sự hấp thụ sắt, gây gia tăng hấp thụ sắt của tế bào ruột
non.
- Hai đột biến này giúp phát hiện bệnh sớm khi chưa có biểu hiện lâm sàng.
- Phát hiện bệnh sớm rất cần thiết để điều trò kòp thời bằng cách rút máu
điïnh kỳ trước khi nội tạng bò hư hại bởi sắt.

Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
3

II. PHƯƠNG PHÁP RFLP CHUẨN ĐOÁN Hemochromatosis
NGUYÊN PHÁT:
- Trong vùng gần C282, DNA bình thường có một điểm bò cắt bởi enzym
Rsa1 (Rhodopseudomonas sphaeroides), đột biến C282Y tạo 1 điểm cắt thứ
hai.
- Dùng 2 đoạn mồi khuyếch đại đoạn DNA chứa C282 gồm 390 đôi base.
Sau đó đem ủ với enzym Rsa1.
- Có 3 trường hợp xảy ra khi điện di trên gel agarose (hình 2):
 Người bình thường: có 2 đoạn 250 và 140 đôi base.
 Dò hợp tử: có 4 đoạn là 140ø, 250, 111 và 29 đôi base.
 Đồng hợp tử: có 3 đoạn là 250, 111 và 29 đôi base.








RSa1

C282
140 250

RSa1 RSa1

C282Y
29 111 250

RSa1

RSa1

5’. . . . . . . G T A C . . . . . . . . 3’
3’. . . . . . . C A T G . . . . . . . . 5’
250
140
111

Hình 2: Điện di trên Gel của Hemochromatosis
Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
4
III. TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG:
Lưu ý: Phải đeo găng tay cao su trong khi thực hành thí nghiệm
Sử dụng mẫu DNA bệnh nhân do bộ môn cung cấp. Xác đònh bệnh nhân
này có liên quan tới Hemochromatosis tại đột biến Cys282Tyr ?: là người bình
thường (-\-); người bệnh dò hợp tử [Heterozygotes(-\H)]; người bệnh đồng hợp
tử [Homozygotes(H\H)].

1. Khuyết đại vùng C282 bằng PCR
 Tube eppendorf chạy PCR do bộ môn cung cấp cho mỗi nhóm chứa 5 µl
DNA để trong đá.
 Thêm vào tube 20 µl mix đã pha sẵn
 Thành phần của mix trong 20 µl:
 2,5 µl Tampon Taq 10x (Tris – HCl, pH 8,5)
 2 µl MgCl
2
(25 mM)
 2,5 µl Primers G176 A/B (50 ng/µl)
 0,5 µl dNTP’s (10 mM)
 0,1 µl Taq polymerase (5 U/µl)
 12,4 µl H
2
O cất vô trùng
 Vortex tube eppendorf trong 5 giây để bảo đảm sự trộn đều các thành
phần trong dung dòch.
 Quay ly tâm tube eppendorf trong 10 giây ở máy ly tâm nhỏ
(microfuge). Lưu ý sự cân bằng các tube khi quay ly tâm.
 Đặt tube eppendorf vào máy PCR và sử dụng chương trình sau đây:

94
o
C 3 phút

94
o
C 30 giây (Denaturation) (tách rời hai chuỗi )
55
o

C 30 giây (Hybridization) (xác nhập cặp mồi vô chuỗi) 30 chu kỳ
72
o
C 1 phút (Elongation) (kéo dài chuỗi)

72
o
C 3 phút
4
o
C 3 phút
Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
5
 Khi tất cả các tube đã được đặt trong máy Thermal Cycler. Nhấn nút
khởi động máy
 Sau khi chương trình hoạt động kết thúc, tiếp tục thực hiện bước tiếp
theo

2. Tác động của Enzym phân cắt Rsa1
 Lấy 20 µl sản phẩm của PCR cho vào tube eppendorf có chứa 2 µl Rsa1.
 Quay ly tâm tube eppendorf trong 10 giây ở máy ly tâm nhỏ
 Ủ tube eppendorf trong 30 phút ở 37
o
C.

3. Điện di các đoạn DNA trên thạch agarose

 Dùng máy điện di mini có chứa dung dòch TBE 0,5% (Tris– acetate
0,04M, EDTA 0,001M, pH 8) và một miếng thạch agarose 2%
 Thêm vào tube 2 µl dung dòch xanh bromophenol. Trộn đều (bằng

cách hút pipette lên xuống nhiều lần) và ly tâm trong 10 giây
 Lấy 20 µl dung dòch trên cho vào giếng trên thạch agarose
 Lấy 20 µl dung dòch thang đo 100bp (ladder) cho vào giếng tiếp
theo
 Chạy điện di ở dòng điện một chiều, 100 Volt trong 30 phút.
 Xem kết quả thạch agarose dưới ánh sáng đèn UV, chụp hình thạch
agarose và ghi chú trên hình những băng DNA được quan sát.
 Biện luận kết quả.