tiểu luận kỹ thuật di truyền- phương pháp ssr

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN: KĨ THUẬT DI TRUYỀN
TS: Trần Thị Dung
Sinh viên thực hiện:
Ngô Thị Dung-61203022
Nguyễn Kim Dung-61203023
Nguyễn Hoàng Thêm-61203134
Chủ đề: PHƯƠNG PHÁP SSR
NỘI DUNG
I. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP
SSRs
II. ĐẶC ĐIỂM
III. CƠ CHẾ ĐỘT BiẾN HÌNH THÀNH
MICROSATELLITES
IV. CÁC LOẠI SSRs
V. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MICROSATELLITES (SSRs)
VI. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
MICROSATELLITES (SSRs)
VII. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA
MICROSATELLITES
VIII. ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG
PHÁP MICROSATELLITES
IX. TÀI LIỆU THAM KHẢO
I.KHÁI NIỆM:
• Microsatellite là những trình tự đặc biệt của DNA mà có chứa sự lặp lại
nối tiếp từ 2 đến 6 bp
còn gọi là SSR (simple sequence repeats), STR (short tandem repeats),
VNTR (variable number of tandem repeats).

Ví dụ:
• GTGTGTGTGTGT
• hay (GT)6 CTGCTGCTGCTGCTG
• hay (CTG)5 ACTCACTCACTCACTC
• hay (ACTC)4
II.ĐẶC ĐIỂM:
Microsatellite là marker được lựa chọn trong việc lập bản đồ phân tử, sự xác
định những giống cây trồng, đánh giá nguồn gốc tổ tiên của cây trồng cho mục
đích nghiên cứu quần thể cây trồng và sự tiến hóa là vì
• Có tính đa alen và biến dị cao
• Là marker đồng trội
• Phân bố ngẫu nhiên khắp bộ gen sinh vật
• Dễ dàng xác định bằng PCR sử dụng các primer đặc biệt.
Một cá thể có một locus đồng hợp sẽ có cùng số lần lặp lại trên cả hai nhiễm
sắc thể, trong khi một cá thể dị hợp sẽ có số lần lặp lại khác nhau trên hai
nhiễm sắc
thể. Những vùng xung quanh locus của microsatellite, được gọi là vùng hai
bên (flanking region) có thể có cùng trình tự. Điều này rất quan trọng bởi vì
những vùng hai bên có thể được dùng như primer của phản ứng PCR khi
nó sẽ khuếch đại microsatellite, và vùng hai bên này sẽ bảo tồn giữa các
giống hay thỉnh thoảng giữa các họ.
• (SSRs có thể được khuếch đại để xác định phản ứng dây chuyền
polymerase (PCR) quá trình, bằng cách sử dụng chuỗi duy nhất
• DNA liên tục bị làm biến tính ở nhiệt độ cao để tách các sợi đôi, sau đó
làm lạnh để cho phép ủ mồi và phần mở rộng của trình tự nucleotide
thông qua SSRS
• Quá trình này cho kết quả nhìn thấy trên gel agarose hoặc
polyacrylamide , chỉ một lượng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại
bởi vì theo cách này thermocycling tạo ra một sự gia tăng theo cấp số
nhân trong phân đoạn nhân rộng.

NGUYÊN LÝ CỦA SSR MARKER
• Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc biệt
và thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gen không phân biệt
cá thể trong cùng một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số
lần lặp lại của đơn vị lặp lại là khác nhau. Từ đó, thiết kế các cặp mồi
đặc hiệu để nhân bản các cặp DNA trên gen chứa các trình tự lặp lại.
Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau
giữa các cá thể trong cùng loài.
III. CƠ CHẾ ĐỘT BIẾN HÌNH HÀNH MICROSATELLITE
Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites vẫn chưa được hiểu biết một
cách đầy đủ. Tuy nhiên có hai giả thuyết được nhiều người chấp nhậm là
do 1) quá trinh bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân và
2) quá trình trượt lỗi trong quá trình sao mã.
1. Sự trượt lỗi của polymerase (Polymerase slippage)
-Khi DNA tái bản, enzyme polymerase không tìm thấy vị trí của nó và cắt
bớt đơn vị lặp lại hay thêm vào quá nhiều đơn vị lặp lại.
- Kết quả là sợi mới có số lần lặp lại khác với sợi bố mẹ. Điều này
giải thích cho những sự thay đổi nhỏ trong số lần lặp lại (thêm vào hoặc bớt
đi một hay nhiều lần lặp lại).
-Sự trượt lỗi có thể khuếch đại những trình tự lặp lại ngắn này thành
nhiều lần lặp lại qua các thế hệ kế tiếp.
-Bên cạnh đó, hiệu quả của hệ thống sửa chữa cho sự bắp cặp sai cũng
đóng một vai trò quan trọng trong tốc độ biến đổi của microsatellite.
2. Sự bắt cặp không đồng đều trong giảm phân
Cơ chế này giải thích cho những thay đổi lớn hơn trong số lần lặp lại.
Trong sơ đồ dưới, nhiễm sắc thể A có quá nhiều sự lặp lại, và nhiễm sắc thể
B thì có quá ít sự lặp lại.
Nguyên nhân tồn tại của microsatellite
-Microsatellite là DNA vô nghĩa, và sự biến đổi phần lớn không có tính chất
rõ rệt.Chúng thường không có tác động có thể đo lường được trên kiểu

hình, và khi chúng đột biến, thông thường là gây hại và không có lợi. Ở
người, 90% những microsatellite đã biết được tìm thấy trong vùng không
mã hóa của bộ gen. Khi tìm thấy ở vùng mã hóa ở người, microsatellite
được biết là gây bệnh. Thú vị là khi tìm thấy trong vùng mã hóa,
microsatellite thường là sự lặp lại ba nucleotide. Sự giải thích có
thể là do những dạng nucleotide lặp lại khác sẽ gây hại nhiều cho vùng mã
hóa, vì nó sẽ gây ra sự đột biến xê dịch khung.
- Microsatellite cung cấp nguồn cần thiết cho sự đa dạng di truyền.
Ở vi khuẩn, sự biến đổi alen của microsatellite trong vùng mã hóa được cho
là để thích nghi với những môi trường khác nhau. Nghĩa là một alen ngắn
có thể thích nghi với một môi trường, và một alen dài với nhiều lần lặp lại
có thể thích nghi với một môi trường khác. Đặc biệt là, sợi nhỏ protein
ngắn có thể làm cho vi khuẩn ít nhớt, và một sợi nhỏ protein dài hơn có
thể làm nó dính hơn và gây bệnh hơn (Moxon và Wills, 1999). Do đó, có sự
đa dạng trong quần thể sẽ đảm bảo sự sống sót của quần thể vi khuẩn trong
những môi trường khác nhau. Tương tự, Kashi và Soller (1999) tin rằng sự
đa dạng của microsatellite có thể là một cách để đền bù cho sự mất đi tính
đa dạng di truyền do
bởi sự chọn lọc di
IV. CÁC LOẠI SSRs
• Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide
repeat) chúng ta có tri nucleotide loại di nucleotide được tìm thấy
nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT,
AT/TA
• Chúng ta có thể phân ra làm 3 loại (hoàn hảo không có sự ngắt
quãng trong trình tự phối hợp và ngắt quãng bao gồm kết hợp
nhiều loại lặp lại, ngắt quãng bị chèn bởi 1 hay nhiều base.
i). Satellites là đoạn trình tự lặp lại 1 lần mà có thể cấu tạo tới vài
phần trăm của genome có thể lớn tới 5 Mb. Satellites thường tập trung ở
vùng tâm động của nhiễm sắc thể do đó nó it khi được sử dụng trong phân

biệt kiểu gen của các cá thể mà được sử dụng nhiều trong quá trình lập bản
đồ gen ở gần vùng tâm động
ii). Minisatellites có mặt tại hàng trăm hoặc hàng nghìn vị trí khác
nhau trên gennome mà ở đó một đơn vị lặp lại từ 10 bp cho tới 0,5-30 kb.
Để phát hiện ra minisatellite người ta có thể dùng phương pháp mẫu dò
phóng xạ. Những thông tin này có thể tạo nên thông tin đặc biệt riêng cho
từng cá thể như kiểu "dấu vân tay" ở người. Nó được sử dụng để xác định
quan hệ trong gia đình và nguồn gốc của các mẫu vật
iii). Microsatellite là các đoạn lặp lại ngắn 2-6bp và kích thước mỗi
locus là 20-100 bp.
Microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân
bố đều trên genome.
Các thông tin về đa allen của một locus cũng như trên nhiều locus
cùng một lúc có thể được phân tích một cách đơn giản và nó có thể đủ lớn
cho các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc
quần thể, hệ phả, khoa học hình sự.
Microsatellite có tính đa hình rất cao (chiều dài) là những allen đồng
trội nó có các tính chất cần thiết cho một marker.
Tần số đột biến lớn, nó tuân theo định luật menden, vị trí của nó trên
nhiễm sắc thể có thể xác định được bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ.
IV. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MICROSATELLITES (SSRs)
Để tìm và xác định Microsatellites ta có một số các thủ tục xác định như sau:
1.Cắt nhỏ ADN genome bằng các enzym giới hạn.
2.Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gen thạch agarose 1%,
phân tách các đoạn từ 300- 500bp
3. Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot.
4. Dùng các mẫu dò là các đoạn ADN đã được đánh dấu cho lai ghép
với màng lai, các mẫu dò là các trình tự ADN tương ứng với trình tự
Microsatellite mà chúng ta quan tâm.
5. So sánh và khôi phục các vạch AND tương ứng với Microsatellite mà

chúng ta quan tâm
6. Chuyển vào một vector sequencing.
7. Sequencing và xác định SSR cũng như trình tự ADN nằm ngoài trình
tự SSR, đây là vùng để thiết kế mồi
8. Tổng hợp mồi và kiểm tra sự đa hình của Microsatellite. kích thước
của các alen chỉ khác nhau từ hai nucleotide trở lên mặt khác trong quá trình
tổng hợp PCR, polymeraza có thể tạo thêm hoặc có thể bỏ sót một đơn vị lặp
lại một nucleotide A nữa. Do vậy để xác định kích thước các alen đòi hỏi quá
trình điện di phải dùng gel có độ phân tách cao
Tạo Microsatellites mồi:
-Nếu biết được vị trí cụ thể của bộ gen, ví dụ như trong một exon của một gen,
mồi có thể được thiết kế bằng tay.
-Mồi SSR ngẫu nhiên có thể được phát triển bởi các phân đoạn nhân bản ngẫu
nhiên của DNA từ các loài đầu mồi.
-Các phân đoạn này ngẫu nhiên được đưa vào một plasmid hoặc vi khuẩn
vector ,sau đó được cấy vào vi khuẩn ecoli.
VI. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA MICROSATELLI
Trong chuẩn đoán bệnh:
- Vì ADN Microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự phát triển của một
số bệnh ung thư, chúng là những marker rất hữu ích trong việc dò tìm, phát
hiện ung thư sớm. Bởi vì tính đa hình của chúng hữu ích trong sự nghiên
cứu các liên kết để định vị những Gen chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật
tự di truyền học
Nghiên cứu quần thể :
- ADN Microsatellite có thể được sử dụng để phát hiện ra thay đổi đột
ngột trong quần thể, hiệu ứng của sự phân đoạn quần thể và sự tương tác
của những quần thể khác nhau. Microsatellite hữu ích trong sự nhận ra của
những quần thể phôi thai và quần thể mới
VIII. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
1. Ưu điểm

-Thuận lợi to lớn của sự phân tích microsatellite là phương pháp này
biểu
hiện số lượng lớn sự đa hình. Một locus ở đậu nành (Glycine max)
được báocáo là có 26 alen . Hơn nữa, khá năng phân biệt các cá thể
khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp
này rất hữ
dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gen, xác định cây trồng và
phân tích mốiquan hệ cha con .
-Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng
được
xác định. Tính đồng trội của microsatllite sẽ gia tăng sự hiệu quả và
độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên
những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD.
Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân
tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn
-Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử
dụng
kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch đại SSR
giữa các loài nghĩa là sự xác định những primer SSR thích hợp
không cần thiết trong những loài có quan hệ gần.
Ví dụ, ba bộ primer microsatellite đã được thiết kế ở
Malus domestica (Rosaceae), các microsatellite này cung cấp 35
loci, trong số
đó có những primer có thể khuếch đại các loài Malus khác
2.Hạn chế
Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên
một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này
là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại.
Thứ nhất: Trình tự vùng flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác
nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer

microsatellite của loài này cho loài khác.
Thứ hai,: Do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân
tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể
kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài
phân ly từ tổ tiên của chúng là AC18 rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài
phân ly từ tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19. 40

IX.TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phạm Văn Duệ, 2005. Giáo trình kỹ thuật trồng cây ăn quả. Nhà xuất bản
Hà
Nội. Trang 105. –
XEM THÊM TẠI: />marker-microsatellite-tu-co-so-du-lieu-trinh-tu-est-
459.html#sthash.CyoXH41P.dpuf