MÔ HÌNH RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM để NGHIÊN cứu LAI tạo và gây đột BIẾN THỰC vật

CÓ THỂ SỬ DỤNG MÔ HÌNH RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM ĐỂ NGHIÊN
CỨU LAI VÀ GÂY TẠO ĐỘT BIẾN THỰC VẬT?
I: Mô hình ra hoa ở cây Browalia americana (Dalat Forget-me-not).
Nguyễn Tiến Thịnh, Võ Thuỳ Trang, và Lê Văn Thức
Phòng Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu hạt nhân, Đà lạt
Tóm tắt
Vòng đời hoàn tất của cây hoa Đà Lạt Forget-me-not (Browalia americana L.) kể
từ lúc gieo hạt tạo thành cây con đến khi sinh hoa, quả, và hạt đời sau đã được tái tạo
thành công trong điều kiện ống nghiệm. 100% cây con vô tính 4 tuần tuổi cảm ứng tạo ra
hoa hữu thụ và kế là hạt có sức sống trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Chu trình kín này
cho phép nghiên cứu không chỉ quá trình lai tạo in vitro, mà còn là việc gây ra đột biến
phóng xạ ở những giai đoạn phát sinh cá thể khác nhau của cây như: giai đoạn giao tử
(hạt phấn, tế bào trứng), giai đoạn hợp tử và tiền phôi, và giai đoạn sinh trưởng sinh
dưỡng. Các kết quả bước đầu cho thấy việc lai chéo in vitro qua lại giữa hai dạng
Forget-me-not tím và trắng tự nhiên ở Đà Lạt cho quả và hạt lai F1 có sức sống; cũng
như, đáp ứng của cây đối với bức xạ gamma (2-4Krad) là khác nhau ở những giai đoạn
sinh trưởng phát triển khác nhau. Qua khảo nghiệm bước đầu này, một số biến dị về hoa
lý thú đã được thu nhận và chọn lọc cho những nghiên cứu xa hơn.
Từ khoá:
vòng đời ra hoa ống nghiệm lai in vitro giao tử hợp tử tiền phôi
sinh dưỡng đột biến
Giới thiệu
Một trong những hiện tượng đáng chú ý của tế bào và mô thực vật nuôi cấy in
vitro là khả năng cảm ứng phát sinh cơ quan sinh dục (hoa) ngay trong ống nghiệm. Tuỳ
theo điều kiện nuôi cấy, sự ra hoa có thể diễn ra ở mô sẹo, lát cắt tế bào lớp mỏng, phôi
soma, đốt thân (1, 2, 3, 4) vv Với những đặc điểm như vô trùng, có thể chủ động điều
khiển khi cần, kích cỡ nhỏ gọn, cho đến nay hoa trong ống nghiệm đã là vật liệu thích
hợp cho nhiều nghiên cứu cơ bản và ứng dụng như nghiên cứu sự thụ phấn và thụ tinh in
vitro, nghiên cứu hiện tượng bất dục, ứng dụng trong lai xa, và khảo sát sự phát triển
phôi (5). Về phương diện gây ra đột biến, hoa in vitro, với các giao tử 1n đực (hạt phấn),
cái (tế bào trứng), và xa hơn nữa là hợp tử hay phôi ở những giai đoạn phát triển sớm, có

số lượng tế bào hợp thành nhỏ, sẽ cũng là vật liệu lý tưởng tạo ra các đột biến thuần, mà
có thể thể hiện những tính trạng thay đổi ngay trong thế hệ M1 đầu tiên (6, 10). Tuy vậy,
rất đáng ngạc nhiên là hiện vẫn chưa thấy có công bố nào theo hướng nghiên cứu đột biến
phóng xạ vận dụng khả năng phát sinh hoa in vitro này.
Gần đây, ở cây hoa Browalia americana L. (Dalat Forget-me-not, kể từ đây viết
tắt là DFMN), chúng tôi đã xây dựng được qui trình làm phát sinh 100% hoa hữu thụ,
bình thường ở cây con nuôi cấy in vitro. Do bản chất tự thụ phấn, các hoa DFMN trong
ống nghiệm đều tạo được quả và hạt có sức nảy mầm tương tự như trong thiên nhiên.
Vận dụng hệ thống ra hoa in vitro này, chúng tôi đã và đang khảo sát: i/ khả năng lai tạo
giữa hai dạng DFMN có màu tím và trắng (vốn trong thiên nhiên chúng không lai chéo
với nhau do bản chất tự thụ phấn); ii/ tìm hiểu khả năng gây ra thêm biến dị di truyền (đột
1
biến) trong quá trình lai tạo, sử dụng hạt phấn và noãn chưa thụ tinh (có và không có xử
lý với bức xạ gamma); và iii/gây ra đột biến ở hoa vừa mới thụ tinh (noãn chứa phôi ở
những giai đoạn sớm).
Bài báo này lần đầu tiên giới thiệu việc áp dụng hệ thống ra hoa in vitro ở cây
DFMN trong nghiên cứu gây tạo đột biến.
Vật liệu và Phương pháp
1.Vật liệu
Vật liệu khởi đầu là hạt của hai dạng DFMN màu tím và trắng được thu lượm từ
những cây mọc tự nhiên tại Đà lạt.
2.Phương pháp
Hạt được gieo thành cây con vô trùng trên môi trường Murashige và Skoog (MS,
1962) (7). Cây con khoẻ mạnh được dòng hoá vô tính bằng kỹ thuật microcutting trên
cùng môi trường. Cây con vô tính 4 tuần tuổi được cảm ứng ra hoa trên môi trường ½ MS
có bổ sung 5% dung dịch ra hoa alpha (quy trình chưa công bố). Việc lai chéo in vitro
được tiến hành ‘trực tiếp’ khi hạt phấn bố được rãi đều trực tiếp lên bề mặt của noãn chưa
thụ tinh đã được bóc tách ra khỏi bầu noãn của hoa mẹ, hay ‘gián tiếp’ khi hạt phấn bố
được đặt lên nuốm nhụy cái của hoa mẹ (có bao phấn đã bị loại bỏ) giống như sự thụ
phấn trong tự nhiên. Trong các thí nghiệm với bức xạ gamma, hoa in vitro được chiếu xạ

vô trùng với 2 liều hấp thụ 2 và 4 Krad ở suất liều từ 19-22 rad/sec trước hay sau lúc đã
lai tạo. Ở giai đoạn cây con, khoảng liều xạ khảo nghiệm là 1, 2 và 4 Krad. Cho mỗi tổ
hợp lai, 3-5 + 3-5 hoa (mẹ+bố) được sử dụng. Trong thí nghiệm chiếu xạ cây con, 20-25
cây con/liều xạ được áp dụng. Mọi mẫu cấy đều được nuôi ủ ở chế độ 12/12 giờ sáng/tối
bằng đèn huỳnh quang ánh sáng trắng, với cường độ sáng 2500 lux, và ở nhiệt độ phòng
dao động từ 22-25
o
C.
Kết quả và Thảo luận
1.Sự ra hoa và lai tạo in vitro
Sau cỡ 4 tuần trên môi trường cảm ứng, các cây DFMN tạo nụ hoa; và khoảng 2
tuần sau, nụ hoa này lần lượt trải qua những giai đoạn phát triển sau: hoa dạng ống với
cánh hoa chớm hình thành (hoa A), hoa dạng ống với cánh hoa đã hình thành, nhưng hoa
chưa nở hoàn toàn (hoa B), và hoa nở hoàn toàn (hoa C). Quan sát cho thấy, hoa A có
bao phấn chưa bung, và hạt phấn chưa chín (chưa có khả năng nảy mầm), sự tự thụ phấn
chưa xảy ra; hoa B có bao phấn đã mở và hạt phấn có sức sống cao nhất, sự tự thụ phấn
đang xảy ra; và hoa C đã tự thụ, phôi đang phát triển. Các giai đoạn phát triển hoa này
được thấy là tương tự giữa hoa DFMN hình thành in vitro và ex vitro; do vậy quy trình
gây tạo hoa ống nghiệm đã xây dựng được không gây ra những xáo trộn bất bình thường
trong sinh trưởng phát triển của cây DFMN. Các giai đoạn phát triển của hoa DFMN mô
tả ở trên cũng khá đặc trưng cho nhiều loài trong họ cà Solanacea (8). Căn cứ vào ghi
nhận đó, để chủ động lai chéo in vitro và tránh hiện tượng tự thụ phấn, các hoa A và hoa
B được sử dụng làm mẹ và làm bố một cách tương ứng.
Hình 1 và Bảng 1 cho thấy, cách lai gián tiếp hiệu quả hơn cách lai trực tiếp qua
noãn tách lộ khi có tỉ lệ đậu quả (hạt) và tỉ lệ hạt có sức nảy mầm cao hơn hẵn. Nhu cầu
dinh dưỡng phức tạp và tinh tế cần thiết trong quá trình phát triển của noãn tách lộ đã thụ
tinh (đạm, vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng) (5), có thể đã là lí do giải thích cho sự
kém hiệu quả của mô hình lai trực tiếp. Để cải tiến mô hình lai trực tiếp này có lẻ cần có
2
những nghiên cứu chi tiết hơn về đáp ứng dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) cho noãn

sau lúc thụ tinh. Bảng 2 cũng cho thấy việc lai chéo giữa hai nhóm cây DFMN màu trắng
và màu tím vẫn cho quả và hạt hữu thụ bình thường, chứng tỏ rằng chúng cùng thuộc một
loài; và với xu hướng là các tổ hợp lai có mẹ màu tím bao giờ cũng cho kết quả tốt hơn
hẳn. Hiện quần thể cây lai F1 in vitro giữa hai dạng màu này đang trong giai đoạn cảm
ứng ra hoa, hứa hẹn có nhiều kết quả thú vị khi chú ý rằng trong tự nhiên chúng không
giao phấn với nhau do bản chất tự thụ bắt buộc.
Hình 1: Trái qua phải, hoa A của DFMN trắng làm mẹ nhận phấn in vitro của hoa B
DFMN tím sau 1 tuần, tạo quả non sau 2 tuần, và tạo hạt trưởng thành sau 3 tuần.
Bảng 1: Ảnh hưởng của phương pháp lai in vitro lên khả năng tạo hạt có sức sống.
Lai in vitro qua nuốm nhụy cái
Tổ hợp lai % tạo quả No.hạt TB/quả* % hạt nảy mầm
Tím x Trắng 100 32,5 79,7
Trắng x Tím 100 18,3 61,6
Lai in vitro trực tiếp qua noãn bóc lộ
Tổ hợp lai % tạo quả No.hạt TB/quả* % hạt nảy mầm
Tím x Trắng - 11,3 12,3
Trắng x Tím - 8,6 2,5
*TB = Trung bình
2.Lai chéo sử dụng giao tử (hạt phấn/noãn chưa thụ tinh) có và không có chiếu xạ
Để nâng cao tần suất cũng như phổ biến dị ở con lai, hoa mẹ (mang noãn) hoặc
hoa bố (mang hạt phấn) được xử lý với liều hấp thụ 2 và 4Krad bức xạ gamma trước lúc
tiến hành lai tạo. Bảng 2 cho thấy trong khoảng liều gamma này: i/ trong 3 chỉ tiêu theo
dõi, bức xạ gamma ảnh hưởng mạnh mẽ nhất đến sức sống của hạt lai F1 (% hạt nảy
mầm), khi liều xạ tăng, sức sống của hạt nhanh chóng giảm thiểu; ii/ trong hai loại giao
tử của phép lai, hạt phấn (hoa bố) nhạy cảm hơn nhiều với bức xạ gamma so với noãn
(hoa mẹ) khi mọi tổ hợp lai có hoa bố đã xử lý bức xạ đều không thể hình thành quả
(hạt); và iii/ mọi phép lai đều không hữu hiệu (hạt F1 không có sức sống) khi cả noãn
(hoa mẹ) lẫn hạt phấn (hoa bố) đều chịu xử lý bức xạ gamma. Các số liệu trong thí
nghiệm này một lần nữa cũng cho thấy nhìn chung các tổ hợp lai có mẹ là dạng màu tím
có sức sống mạnh mẽ hơn như đã chú ý ở mục lai tạo in vitro bên trên. Chúng tôi cho

rằng khoảng liều gamma khảo nghiệm (2-4Krad) có thể đã là quá cao so với vật liệu sử
dụng trong thí nghiệm, đặc biệt là đối với hạt phấn. Về phương diện này, khả năng chống
chịu bức xạ kém của hạt phấn cũng đã được ghi nhận (10). Hiện tượng hạt F1 được tạo ra
3
nhưng không thể nảy mầm có thể là do hạt mang phôi phát triển bất thường như đã được
chứng minh ở cây Arabidopsis (9).
Bảng 2: Khả năng tạo quả và hạt có sức sống in vitro khi chiếu xạ giao tử.
Lai chéo in vitro dùng chỉ hoa mẹ hoặc (hoa bố) đã chiếu xạ
a
Tổ hợp lai và liều
gamma áp dụng
% tạo quả No.hạt TB/quả
b
% hạt nảy mầm
Tím x Trắng 2Krad 100 (0) 24,5 (0,0) 45,3 (0,0)
Trắng x Tím 2Krad 100 (0) 11,3 (0,0) 12,3 (0,0)
Tím x Trắng 4Krad 100 (0) 14,3 (0,0) 11,6 (0,0)
Trắng x Tím 4Krad 100 (0) 17,5 (0,0) 0,0 (0,0)
Lai chéo in vitro dùng cả hoa mẹ và hoa bố đã chiếu xạ
Tổ hợp lai và liều
gamma áp dụng
% tạo quả No.hạt TB/quả % hạt nảy mầm
Tím x Trắng 2Krad 33,3 3,0 0,0
Trắng x Tím 2Krad 0,0 0,0 0,0
Tím x Trắng 4Krad 33,3 3,0 0,0
Trắng x Tím 4Krad 0,0 0,0 0,0
a: Số liệu trong ngoặc là kết quả lai khi hoa làm bố có xử lý bức xạ. b: TB = trung bình
3.Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên hợp tử (phôi)
Nhằm mục đích gây ra đột biến ở phôi hạt lai F1 trong những giai đoạn phát triển
phôi khác nhau (hợp tử, tiền phôi), các hoa sau khi thụ phấn 1, 2, 3, và 6 ngày được xử lý

với bức xạ gamma ở các liều hấp thụ như trên (2 và 4 Krad). Số liệu trong Bảng 3 cho
thấy: i/ sự phát triển phôi bị triệt tiêu hoàn toàn ở giai đoạn sớm của sự hình thành và
phát triển (1 ngày sau thụ phấn) bởi bức xạ gamma áp dụng; ii/ khả năng chống chịu bức
xạ tăng dần khi phôi có thời gian phát triển trước lúc chịu ảnh hưởng của bức xạ (2-6
ngày); iii/ liều xạ càng cao sự phát triển phôi càng bị ảnh hưởng; và iv/ có rất ít hạt F1 tạo
thành có sức sống chứng tỏ rằng phôi hạt có lẽ đã được hình thành một cách bất thường
do tác động của bức xạ gamma. Các kết quả này cũng như của thí nghiệm với giao tử bên
trên đề xuất việc cần thiết phải khảo nghiệm gây tạo đột biến sử dụng các vật liệu sinh
dục (hạt phấn, noãn, hợp tử, tiền phôi) bằng những dải liều xạ có cường độ thấp hơn
(<2Krad). Nghiên cứu gây tạo đột biến ex vitro ở những giai đoạn sớm của quá trình phát
sinh cá thể cây Nigella cũng đã có những ghi nhận tương tự (10).
Bảng 3: Khả năng tạo quả và hạt có sức sống in vitro khi chiếu xạ hợp tử, phôi non.
Tổ hợp lai: Tím x Trắng (Trắng x Tím)
a
- 2Krad
Thời gian chiếu xạ
sau lai tạo (ngày)
% tạo quả No.hạt TB/quả
b
%hạt nảy mầm
1 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
2 66,6 (33,3) 11,5 (22,0) 0,0 (0,0)
3 100 (33,3) 16,3 (14,0) 2,5 (0,0)
6 100 (66,6) 16,3 (17,5) 5,5 (0,0)
Tổ hợp lai: Tím x Trắng (Trắng x Tím)
a
- 4Krad
1 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
2 33,3 (33,3) 16,0 (9,0) 0,0 (0,0)
4

3 33,3 (33,3) 19,0 (20,0) 0,0 (0,0)
6 66,6 (33,3) 24,0 (17,0) 0,0 (0,0)
a: Số liệu trong ngoặc là kết quả của tổ hợp Trắng x Tím. b: TB = trung bình
4.Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng
Nhằm khảo sát khả năng gây ra đột biến ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (giai
đoạn cây chưa mang hoa), cây mạ in vitro DFMN màu tím đời V
0
1 tháng tuổi được
chiếu xạ gamma với liều hấp thụ 1, 2 và 4 Krad. Biểu đồ 1 cho thấy: i/ Khi liều xạ càng
tăng, các chỉ tiêu sinh trưởng của cây tái tạo đời M
1
V
1
càng suy giảm. Trong đó, ở liều xạ
4Krad, chỉ có khoảng 28% mẫu nuôi cấy tái tạo được cây con đời M
1
V
1
. ii/ Ở liều xạ 1, 2,
và 4 Krad, sức sinh trưởng của cây M
1
V
1
(chiều cao cây, số mầm nách lá) suy giảm tương
ứng khoảng 30, 40, và 60% so với đối chứng không chiếu xạ (cây V
1
). iii/ Tỉ lệ bất
thường về hình thái ngọn cây tái tạo đời V
1
tăng dần từ 0 đến 13, 41, và 73% tương ứng ở

đối chứng (0Krad), 1, 2 và 4Krad. Căn cứ vào những số liệu này và theo hướng dẫn kỹ
thuật của IAEA (6), các liều xạ 1 và 2Krad tỏ ra phù hợp trong việc gây ra đột biến ở giai
đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của DFMN bằng bức xạ gamma.
Áp dụng kỹ thuật phân lập đột biến đến đời M
1
V
4
và cảm ứng ra hoa in vitro, hiện
chúng tôi đã thu được đến 63 thể biến dị về màu sắc và cấu trúc hoa từ khảo nghiệm này
(số liệu chưa công bố). Các thể biến dị này đang được khảo nghiệm tiếp tục nhằm chứng
minh bản chất đột biến của chúng. Hình 2 bên dưới giới thiệu một vài biến dị thu thập
được.
Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên sinh trưởng cây DFMN màu tím.

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 4 Krad
5
A B C D
%/10 mẫu V
0

tái tạo V
1
Chiều cao trung bình (cm) V
1
%/10 biến dị ngọn cây V
1
Hình 2: Một số biến dị hoa DFMN đời M
1
V
4
in vitro thu được qua xử lý cây con
V
0
với 1-2 Krad bức xạ gamma. A: hoa đối chứng (5 cánh), B: biến dị 6 cánh hoa,
C: biến dị 3 cánh hoa, và D: biến dị 6 cánh màu trắng.
Kết luận
Tuỳ theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển trong vòng đời của mình, và tuỳ
thuộc cả vào loại vật liệu thực nghiệm, cây hoa DFMN sẽ có những độ nhạy cảm khác
nhau đối với bức xạ gamma. Do vậy, trong gây ra đột biến thực nghiệm, cần thiết phải
khảo sát độ nhạy cảm phóng xạ tương ứng. Kết quả của nghiên cứu cũng đề xuất rằng,
mô hình ra hoa DFMN trong ống nghiệm rất thuận tiện cho những nghiên cứu cơ bản về
sinh lý và di truyền cây DFMN nói riêng và thực vật có hoa nói chung.
Thư mục tham khảo
1.Meeks-Wagner DR, Dennis ES, Van TTK, Peacock WJ (1989) Tobacco genes
expressed during in vitro floral initiation and their expressed during normal plant
development. Plant Cell. 1: 25-35
2.Mulin M, Van TTK (2004) In vitro flower formation from thin epidermal cell layers of
a partial somatic hybrid between Petunia hybrida and Nicotiana plumbaginifolia (Viv.).
Plant Cell Tiss. Org. Cult., Vol. 16, No. 3.
3.Singh B, Sharma S, Rani G, Virk GS, Zaidi AA, Nagpal A (2006) In vitro flowering in

embryogenic cultures of Kinnow mandarin. Afri. Jour. Biotech., Vol. 5 (16): 1470-1474.
4.Mohapatra A, Rout GR, Das P (2005) Rapid clonal propagation from nodal explants
and in vitro flowering of three rose cultivars. Pro. Ornam. Plants, 5(4): 219-223.
5.Van Tuyl JM, Van Dieen MP, Van Creij GM, Van Kleinweet CM, Bino RJ (1991)
Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture, and embryo rescue for
overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses. Plant Sci., Vol. 74 (1):
115-126.
6.IAEA (1977) Manual on Mutation Breeding. 2
nd
Edi., Tech. Rep. Ser. No. 119.
FAO/IAEA, Vienna, Austria.
7.Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with
tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15: 473-497.
8.Brukhin V, Hernould M, Gozalez N, Nouras A (2003) Flower development schedule in
tomato. Sex. Plant Reproduc., Vol. 15 (6): 311-320.
9.Franzmann DA, Patton DA, Meinke DW (1989) In vitro morphogenesis of arrested
embryos from lethal mutants of Arabidopsis thaliana. Tag. Vol. 77 (5).
10.Phai P (1976) Efficiency of induced mutagenesis at early stages (gametes, zygotes,
proembryos) of ontogenesis in Nigella damascena. Tag. Vol. 48 (4).
Abstract
The complete life cycle of Jamaican forget-me-not (Browalia americana L.), a self-
pollinated species, from seedling till blooming and seed setting was successfully
reestablished in in vitro condition. All 4-month old clonal plantlets cultured in vitro
were observed to be able of flowering and producing fertile seeds. This allowed the
investigations of not only the in vitro crossing, but also of the effects of gamma-rays
irradiation on various stages of plant ontogenesis (gametes, zygotes, and proembryos), to
be carried out with ease. Along this line, the reciprocal in vitro pollinations of the two
6
natural forms of Jamaican forget-me-not found in Dalat, the purple and the white, have
resulted in normal fruits and F1 hybrid seeds. And, treating the in vitro plants of

different developmental stages with 2-4Krad of gamma-rays also revealed their
differences in radiosensibility. Some interesting flower variants have been obtained and
selected from such the experiment of gamma-rays irradiation for further study.
7