xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Anh Lƣơng



XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ
PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ
ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






Hà Nội - 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Anh Lƣơng


XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ
PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ
ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. ĐINH ĐOÀN LONG



Hà Nội – 2011
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Khái quát về lƣợc lý phân tử 3
1.2. Các đích tác dụng của thuốc 3
1.3. Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR) 8
1.4. Thụ thể angiotensin II 12
1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định tƣơng tác thụ thể và phối tử 20
1.6. Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu 26
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 36
2.1. Vật liệu 35
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 37

2.2.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 37
2.2.2. Thu thụ thể màng 37
2.2.3. Xác định nồng độ protein sử dụng phƣơng pháp Bradford 38
2.2.4. Phƣơng pháp elisa để xác định lƣợng phối tử gắn fluorescein 39
2.2.5. Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay) 39
2.2.6. Phản ứng tƣơng tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích 40
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý kết quả 40
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan chuột 41
3.2. Tối ƣu phản ứng ELISA 43
3.3. Tối ƣu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết 45
3.4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa) 46
3.5. Phả ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết 47
3.6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật 48
Chƣơng 4. KẾT LUẬN 53
KIẾN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AT I Angiotensin I
AT II Angiotensin II
BSA Bovine serum albumin
ELISA Phản ứng miễn dịch hấp thụ liên kết enzym
F-AT II Fluorescein – angiotensin II (angiotensin II đánh dấu fluorescein
F-BSA Fluorescein – BSA (BSA đánh dấu fluorescein)
GPCR G protein - coupled receptor
IC
50
Nồng độ ức chế 50%
K
d
Hằng số phân ly cân bằng
K
i
Nồng độ chất gắn cạnh tranh mà liên kết với một nửa số vị trí
liên kết ở trạng thái cân bằng
YHCT Y học cổ truyền

MỞ ĐẦU
Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và
phong phú trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật
đã được xác định, với nhiều nhóm loài sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị
khoa học và thực tiễn lớn.
Xuất phát từ nền văn hóa đa dạng bản sắc với rất nhiều dân tộc sống trải dài
trên khắp lãnh thổ với các điều kiện tự nhiên và lịch sử riêng đã hình thành nên một
nền Y học cổ truyền với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với rất nhiều kinh nghiệm
trong sử dụng thuốc trong đời sống. Việc dùng thuốc trong nhân dân đã có từ rất lâu
đời, tích lũy dưới dạng kinh nghiệm, thường chỉ được truyền miệng qua nhiều thế
hệ. Hơn 3800 bài thuốc đã được sưu tầm lại, cùng với hàng nghìn bài thuốc lưu
truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số. Tuy nhiên,
rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc như vậy vẫn chưa được nghiên
cứu cơ chế tác động cũng như cơ sở khoa học vẫn chưa được xác định.
Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh
học trong phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phương pháp sử dụng
đồng vị phóng xạ (như
3
H,
125
I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc. Tuy
nhiên, những phương pháp này chưa được áp dụng trong điều kiện Việt Nam với
nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí nghiệm sinh dược học của ta thiếu trang

thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất phóng xạ.
Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phƣơng pháp đo
tƣơng tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ
định hƣớng phát triển thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này
nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ
các cây thuốc, bài thuốc được sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác
dụng chữa bệnh tương ứng.
2

Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể
angiotensin II, đây là đích tác dụng đã được biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ
huyết áp với cơ chế phân tử đã được nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu
tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết từ một số cây thuốc Việt Nam đã được
biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa huyết áp và điều trị các
chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn .

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về dƣợc lý phân tử
Dược lý phân tử (molecular pharmacology) là môn khoa học nghiên cứu về
tương tác của thuốc lên cơ thể sống ở cấp độ phân tử và tế bào, và gồm hai phân
môn chính là dược động học (pharmacokinetics) và dược lực học
(pharmacodynamics).
Dược lý phân tử bao gồm nhiều lĩnh vực nghiên cứu về tác dụng của phân tử
thuốc đến toàn bộ cơ thể. Dựa vào những hiểu biết về hóa sinh, sinh lý, bệnh học,
sinh học phân tử và hóa hữu cơ để thấy rõ tác dụng của thuốc ở mức độ phân tử đưa
đến áp dụng trong điều trị. Qua dược lý phân tử, chúng ta có thể hiểu sâu sắc cơ chế
phân tử tác dụng của thuốc, phát hiện thuốc mới, đề xuất những hướng dẫn sử dụng
thuốc an toàn, hiệu quả trong điều trị hoặc ngăn chặn những phản ứng có hại của
thuốc khi sử dụng. Nội dung chủ yếu của dược lý phân tử là dược lý học về tác
dụng của thuốc ở mức dưới tế bào [2].
Dược lý phân tử thể hiện ở nhiều giai đoạn của phân tử thuốc trong cơ thể,
hiện nay dược lý phân tử được nghiên cứu với các hướng chính đó là:
1) Nghiên cứu tác dụng thuốc lên màng tế bào
2) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử đối với thụ thể màng tế bào
3) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử đối với enzym tế bào
4) Nghiên cứu hóa sinh dược lý phân tử trên gen

1.2. Các đích tác dụng của thuốc
Theo phân tích của Overington và cộng sự [38] hơn 21.000 sản phẩm thuốc
lưu hành trên thị trường Mỹ, có nguồn gốc từ 1357 thuốc dưới các dạng thành phần,
các dạng muối, vitamin. Trong đó có 1204 các thuốc phân tử nhỏ, và 166 thuốc sinh
học. Khoảng 27% các thuốc này liên quan tới thụ thể kết cặp G protein, 13% tới thụ
thể nhân, 7,9% tới các thụ thể liên kết với kênh ion (hình 1.1) [38].

4


Hình 1.1. Phân bố các họ gen với đích tác dụng của các thuốc hiện nay. ( Nguồn:
Overington, 2006).
Hầu hết các thuốc tác dụng lên cơ thể, tế bào thông qua một số cơ chế phân tử
khác nhau. Mỗi cơ chế được thích ứng thông qua sự tiến hóa của các họ protein
riêng, giúp truyền được nhiều loại tín hiệu. Các họ protein này bao gồm các thụ thể
trên bề mặt và bên trong tế bào cùng với các enzym và thành phần khác giúp tạo ra,
khuếch đại, phối hợp và kết thúc các tín hiệu từ phân tử tác động là thuốc và các
chất nội sinh.
Có 5 cơ chế truyền tín hiệu qua màng tế bào cơ bản (hình 1.2) [28]. Mỗi loại
sử dụng một chiến lược khác nhau để vượt qua các rào cản là lớp kép phospholipid
của màng tế bào. Các chiến lược được sử dụng là (1) phối tử (ligand) tan trong lipid
vượt qua màng sinh chất và tác động lên một thụ thể nội bào; (2) protein thụ thể
xuyên màng có hoạt tính enzym nội bào được điều khiển dị lập thể bởi một phối tử
liên kết vào một vị trí trên miền ngoại bào của protein này; (3) thụ thể xuyên màng
liên kết và kích thích một protein kinase; (4) kênh ion liên kết với tương tác với
phối tử ( điều khiển hoạt động của kênh bằng liên kết với phối tử); hoặc (5) protein
Các thụ thể GPCR
Các thụ thể nhân
Các kênh ion liên kết phối tử
Các kênh ion điện thế
Protein liên kết penicillin
Enzyme giống như myeloperoxidase
Protein vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh
DNA topoisomerase typ II
Fibronectin typ III
Cytochrome P450
5

thụ thể xuyên màng kích thích G protein, từ đó điều khiển một chất truyền tin thứ 2
trong tế bào.

Hình 1.2. Các cơ chế truyền tín hiệu cơ bản. Cơ chế thứ nhất (1) Một phân tử tín hiệu
(phối tử) hóa học hòa tan trong lipid đi qua màng sinh chất và tác động lên các thụ thể nội bào (mà
có thể là một enzym hoặc một yếu tố điều hòa sự phiên mã của gen). (2) Phân tử tín hiệu liên kết
với miền ngoại bào của một protein xuyên màng, qua đó kích hoạt hoạt tính enzym của miền nội
bào của protein này. (3) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một thụ thể liên kết xuyên
màng với một protein kinase, làm kích hoạt protein kinase này. (4) Phân tử tín hiệu liên kết và trực
tiếp điều khiển việc mở một kênh ion. (5) phân tử tín hiệu liên kết với một thụ thể bề mặt tế bào mà
liên kết với một enzym tác động bởi một G protein. (A, C: cơ chất; B, D: sản phẩm; R: thụ thể; G:
G protein; E: tác động (enzym hoặc kênh ion); Y: tyrosine; P: phosphate). (Nguồn: Katzung,
2007)
Các đích phân tử chính của phần lớn các dược phẩm hiện nay bao gồm các
nhóm được nêu ở các mục dưới đây [48]:
1.2.1. Thụ thể kết cặp G protein (GPCR)
Hơn 26% các thuốc được bán trên thị trường có liên quan tới nhóm thụ thể
này; đây là nhóm thụ thể phổ biến được biểu hiện trên bề mặt của nhiều loại tế bào.
Protein liên kết vào màng tế bào thông qua 7 lần xuyên màng, do đó còn được gọi
với tên khác là thụ thể 7 lần xuyên màng (hay 7TM). Các G protein là các phân tử
kết cặp với loại thụ thể này để truyền tín hiệu được sinh ra sau khi phối tử (hay chất
gắn đặc hiệu) liên kết vào thụ thể rồi truyền tín hiệu vào trong tế bào. Hệ gen người
có hơn 1000 gen mã hóa cho các GPCR, trong đó ước tính có khoảng 400 GPCR có
6

tiềm năng là các đích tác dụng của các loại thuốc. Các nghiên cứu về vai trò, chức
năng của các thụ thể GPCR vẫn đang tiếp tục được triển khai và phát triển.
1.2.2. Các thụ thể nhân (NR)
Các thụ thể này liên kết với các phối tử bên trong tế bào và về số lượng có lẽ ít

hơn nhiều so với các thụ thể trên màng tế bào. Sau khi phối tử liên kết, một phức
hợp được hình thành giữa thụ thể và phối tử đi vào trong nhân tế bào để “đóng”
hoặc “mở” các gen đặc trưng. Các thụ thể nhân liên kết với các phân tử ưa lipid như
các dẫn xuất của steroid, retinoid (như các hoocmon giới tính và vitamin A) có ảnh
hưởng sâu sắc tới sinh lý con người. Hệ gen người mã hóa cho khoảng 50 thụ thể
nhân, một nửa số đó là các thụ thể độc thân (orphan receptor), nghĩa là các thụ thể
chưa xác định được phối tử đặc hiệu.
1.2.3. Thụ thể cytokine
Một họ các protein có nhiều hơn 1 chuỗi protein được nhúng vào màng tế bào.
Các phối tử cytokine là các protein như interleukin, interferon và các yếu tố tăng
trưởng. Vì các phân tử nhỏ không thể phá vỡ liên kết của cytokine liên kết với thụ
thể của nó, nên các thuốc được sử dụng thường là các protein lớn hơn. Đó là các
kháng thể hoặc các dạng tái tổ hợp của thụ thể mà hoạt động như những cái bẫy để
ngăn cản sự liên kết của phối tử vào thụ thể.
1.2.4. Các protease
Đó là những enzym cắt protein ở những điểm xác định bởi các trình tự axit
amin đặc hiệu. Các protease có nhiều vai trò trong cơ thể, như tham gia phản ứng
đông máu, sản xuất các hoocmon peptit và cần cho chu kỳ sống của các virut như
HIV. Mặc dù các thuốc ức chế protease hiện vẫn là một thách thức lớn trong nghiên
cứu thuốc, nhưng đã có một số thuốc đã được thương mại hóa có đích tác dụng là
lớp enzym này.
1.2.5. Các protein kinase
7

Đây là một họ enzym lớn giúp gắn nhóm photphat (-PO
3
) vào một phân tử
protein để họa hóa nó trong tế bào. Quá trình photphoryl hóa được dùng để chuyển
tín hiệu từ ngoài tế bào qua các thụ thể trên màng để đi vào nhân tế bào, ở đó chúng
khởi động sự biểu hiện của gen. Kinase có vai trò đặc biệt trong sự phát sinh ung

thư bởi vì các tế bào sinh trưởng phụ thuộc vào các yếu tố tăng trưởng bên ngoài là
một kết quả của các enzym kinase đặc hiệu trở nên hoạt hóa thường xuyên. Việc ức
chế protein kinase hiện nay là một hướng lớn trong tìm kiếm thuốc phân tử nhỏ.
1.2.6. Các protein phosphatase
Đây là những enzym có vai trò xúc tác các phản ứng ngược chiều so với các
enzym kinase, chúng loại bỏ nhóm photphat của protein. Đây cũng là một cơ chế
quan trọng để truyền tín hiệu tế bào, vì nó hoạt động như một “công tắc đóng” để
điều khiển các quá trình quá mức trong tế bào.
1.2.7. Các enzym khác
Các họ protein và enzym được liệt kê trên tạo nên phần lớn các đích tác dụng
của thuốc hiện nay. Ngoài ra còn các enzym khác, có thể kể đến các chất ức chế
HMG-CoA reductase (được biết như là các statin) làm giảm cholesterol và các chất
ức chế phosphodiesterase (PDE), trong đó Viagra là một ví dụ được biết nhiều nhất.
1.2.8. Các kênh ion
Các ion là những nguyên tử hay phân tử tích điện. Các ion kim loại, như Ca
2+
,
Na
+
và K
+
, đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh lý của cơ thể. Các ion
đi qua các lỗ trên màng tế bào còn được gọi là các kênh ion. Hai loại kênh ion chính
được biết là các kênh ion được đóng mở bởi phối tử và kênh ion được đóng mở bởi
điện thế (ligand-gated and voltage-gated ion channels.). Mỗi kênh có tính chọn lọc
cho một ion đặc trưng và cho phép các ion qua màng từ ngoài vào trong hoặc ngược
lại. Sự di chuyển của ion trong hoạt động của các tế bào thần kinh và liên quan tới
các điều kiện như động kinh, đau và rối loạn nhịp tim. Đó là những điều đáng quan
tâm nhất của các kênh ion là đích của thuốc, với một số các thuốc quan trọng được
lưu hành trên thị trường.

8

1.2.9. Các protein vận chuyển
Các protein vận chuyển làm nhiệm vụ vận chuyển các phân tử bên trong cơ
thể, đặc biệt là vận chuyển qua màng tế bào trong khi bình thường các phân tử đó sẽ
bị ngăn chặn bởi màng tế bào. Chẳng hạn như các phân tử chất dinh dưỡng được
vận chuyển qua dạ dày bởi các protein vận chuyển. Protein vận chuyển là mục tiêu
phân tử của thuốc điều trị một số bệnh, chẳng hạn như một số chứng bệnh trầm cảm
liên quan đến sự thiểu năng serotonin trong não. Các chất vận chuyển monoamine
loại bỏ serotonin từ tế bào thần kinh, nhưng chất dẫn truyền thần kinh này có thể
được duy trì ở mức cao hơn bằng cách ức chế vận chuyển bởi các loại thuốc như
fluoxetine (Prozac
®
), do đó làm giảm các triệu chứng trầm cảm. Các đích protein
vận chuyển khác được quan tâm như các chất vận chuyển glucose, khi bị ức chế có
thể có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh tiểu đường.
1.3. Về thụ thể kết cặp G protein
Thụ thể là các phân tử kích hoạt điều hòa một loạt các quá trình trao đổi chất
và sinh lý trong tế bào cũng như ở các tổ chức phức tạp hơn. Trong dược lý giác
quan, thụ thể là các protein chuyển đổi một chiều và có chọn lọc của một phân tử
truyền tín hiệu nội sinh hoặc các chất tổng hợp tương tự của chúng, trải qua biến đổi
thông tin, và sửa đổi một đáp ứng tế bào như một hệ quả. Nhóm thứ nhất là các thụ
thể nội bào của các siêu họ thụ thể nhân và các thụ thể hoocmon steroid, retinoid và
thyroid. Nhóm thứ hai là các thụ thể liên kết với màng tế bào, nhóm này rất đa
dạng. Các thụ thể này giúp chuyển đổi tín hiệu từ bên ngoài vào trong tế bào đáp
ứng. Siêu họ này gồm có các thụ thể kết cặp kênh ion, thụ thể kết cặp kinase và họ
lớn các thụ thể kết cặp G protein.
1.3.1. Cấu trúc của các thụ thể kết cặp G protein
Các thụ thể kết cặp G protein (GPCR) là các protein xuyên màng với đặc điểm
đặc trưng chung là xoắn 7 lần xuyên màng (cấu trúc bậc 2 xoắn ). Các phối tử nội

sinh của chúng có thể là các chất tín hiệu monoamine (epinephrine, acetylcholine,
9

serotonin, histamine, dopamine), lipid (các prostaglandin, các lipid nội sinh) các
peptid thần kinh (neuropeptide Y, cơ chất P, cholecystokinin, các opioid và các
hoócmôn peptide (glucagon, angiotensin, bradykinin) cũng như các protein nhỏ (các
chemokine) và các protein lớn (các hoocmon glycoprotein, thrombin). Tất cả các
GPCR chuyển các tín hiệu của chúng vào bên trong tế bào thông qua sự tương tác
với các G protein dị hình. Thêm vào đó, các protein giác quan quan trọng như thụ
thể rhodopsin và các thụ thể khứu giác cũng thuộc họ này. Kích thước của các loại
GPCR rất khác nhau, từ ít hơn 300 axit amin như thụ thể adrenocorticotropin, tới
hơn 1100 axit amin đối với các thụ thể metabotropic glutamate. Các thụ thể với các
biến đổi sau dịch mã khác nhau như glycosyl hóa, thường dẫn đến khối lượng phân
tử cao hơn so với các trình tự axit amin ban đầu. Các biến đổi khác bao gồm cầu
disulfide và palmitoyl hóa ở các vị trí đặc biệt. Đa số các GPCR được phân loại
bằng các trình tự tương đồng ban đầu và các họ phụ được đặt tên bằng những đặc
điểm đặc trưng nhất của các thành viên. Trong khi mức độ tương đồng thấp chỉ
được tìm thấy ở các đoạn vòng, thì các đoạn xoắn xuyên màng 7 lần có 20 - 25 axit
amin kỵ nước ở mức độ bảo thủ cao [6].
Cơ chế kinh điển hoạt động chức năng của GPCR được xác định bởi sự kết
cặp của chúng với các protein liên kết với nucleotide guanine (G protein) [9].
Thông thường, một GPCR ở trạng thái nghỉ ngơi hay ái lực thấp khi thiếu các
chất chủ vận (agonist). Sự liên kết của một chất chủ vận tới một thụ thể kích thích
một sự biến đổi trong cấu trúc của thụ thể và hình thành một phức hệ với các G
protein nội bào (hình 1.3). G protein dị hình có chứa một tiểu phần liên kết với
màng là G
α
và các tiểu phần di động là G
β
và G

γ
. Phân tích di truyền học hiện đại có
thể xác định được một số tiểu đơn vị G protein tạo thành 16 G
α
, 5 G
β
và 12 G
γ
như
hiện nay đã được nhân dòng và xác định trình tự [39]. Tiểu phần G
α
liên kết GTP và
GDP và nó gây ra thủy phân GTP. Các tiểu phần G
β
và G
γ
hình thành một phức hệ
theo tỉ lệ 1:1.
10


Hình 1.3. GPCR tuyền tín hiện thông qua các G protein. Sự tương tác với chất chủ vận
dẫn đến thay đổi cấu hình của thụ thể và tới sự kết cặp với các G protein. Kết quả là sự hoạt hóa
của chuỗi truyền tín hiệu thông qua tiểu đơn vị G
α
. G
β
và G
γ
cũng có thể gây ra các đáp ứng tế bào.

A: chất chủ vận (agonist) hoặc đối vận (antagonist). DAG: diacylglycerol. PI3Kγ: phosphoinositide
3-kinase-γ. PLCβ: phospholipase Cβ. PKA, PKC: protein kinase A và C. (Nguồn: Birnbaumer,
1990).
Sau khi GPCR và G protein tương tác (kết cặp), GDP được giải phóng và
được thay thế bởi GTP, sau đó tiểu phần G
α
được phân ly từ phức G
βγ
. Cả hai tiểu
phần G
α
và phức kép G
βγ
có thể hoạt hóa các phân tử gây ra đáp ứng nội bào. Ví dụ
G
α
có thể hoạt hóa enzym adenyl cyclase, dẫn đến làm tăng lượng cAMP; phân tử
này đến lượt nó làm giảm hoạt tính protein kinase A (PKA). PKA là một enzym
serine-threonine kinase có chức năng photphoryl hóa, qua đó hoạt hóa nhiều yếu tố
phiên mã, các kinase và các thụ thể GPCR khác.
Các chất truyền tin thứ 2
PLCβ, DAG, Ca
2+
, PKA, PKC
Các đáp ứng tế bào
Angiogenesis, ung thư, phát triển,
biệt hóa
Các chất truyền tin thứ 2
PLCβ, DAG, Ca
2+

, PKA, PKC
Các đáp ứng tế bào
Angiogenesis, ung thư, phát triển,
biệt hóa
11


Bảng 1.1. Các G protein và chức năng trong sự truyền tin của tế bào
G protein
Chức năng trong truyền tin tế bào
G
αq
, G
α11


Hoạt hóa phospholipase C; điều hòa hoạt động của phospholipase C
đặc hiệu phosphoinositide
G
α14
, G
α15
, G
α16

Hoạt hóa Rho GEF
G
αs

Hoạt hóa adenylyl cyclase; RGS-PX1 hoạt động như một protein

hoạt hóa GTPase cho G
αs

G
αo1f

Tương tác kênh Ca
2+
; kích hoạt c-Src tyrosine kinase
G
αi

Ức chế adenylyl cyclase; kích hoạt c-Src tyrosine kinase
G
αo

Hoạt hóa kênh K
+
; tăng K
+
dẫn đến phân cực quá mức
G
αz

Giao tiếp tế bào thông qua Rap1GAP1
G
α12

Hoạt hóa yếu tố Rho
G

α13

E-Cadherin; giải phóng β-catenin
G
αT

Tăng cGMP phosphodiesterase
G
αgust

G protein chuyên biệt tế bào vị giác
G
βγ

Hoạt hóa các kênh K
+
GIRK
GIRKs
Hoạt hóa adenylyl cyclase; hoạt hóa phospholipase C
(Nguồn: Lundstrom, 2006),
Các loại tiểu phần G
α
khác nhau đóng vai trò quyết định đến truyền tín hiệu và
có thể được chia thành bốn nhóm. Tiểu phần G
αs
kích thích adenylyl cyclase, trong
khi đó tiểu phần G
αi
ức chế adenylyl cyclase và hoạt hóa kênh điều chỉnh ion K
+

liên kết G protein (GIRK). G
αq
gây ra hoạt hóa phospholipase C và G
a12
hoạt hóa
các yếu tố trao đổi guanidine nucleotide của Rho (Rho GEFs). Phức kép G
βγ
có thể
12

độc lập hoạt hoá các kênh GIRK, adenylyl cyclase và các phospholipase. Các chức
năng khác của các tiểu phần G protein được nêu trên bảng 1.1 [32].
1.3.2. Thụ thể kết cặp G protein là đích của tìm kiếm thuốc
Khoảng 25% tổng số thuốc tân dược đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị
hiện nay có đích tác động là các GPCR; điều này làm cho GPCR trở thành các đích
phổ biến nhất trong việc tìm thuốc trong công nghiệp dược dẫn đến sự phát triển
của các loại thuốc bán chạy trên thị trường hiện nay bao gồm salmeterol,
olanzapine, clopidrogel, losartan và risperidone. Chúng và các thuốc khác nhắm vào
đích là các GPCR được dùng để điều trị nhiều trạng thái bệnh khác nhau tác động
lên hệ tim mạch và hệ thần kinh trung ương, hệ tiêu hóa và các chức năng tiêu hóa
cũng như ung thư, đau, và dị ứng.
Rất lâu trước khi chúng ta hiểu về các hoạt tính hóa học và phân tử của các
GPCR, con người đã sử dụng các sản phẩm tự nhiên của cà độc dược, của lúa mạch
và thuốc phiện từ các nguồn khác nhau của thực vật để tìm ra các tác động dược lý
ở các đích chưa biết để điều trị một số bệnh tật. Cho đến đầu thế kỷ 20, ý tưởng về
thụ thể được đặt ra khi Paul Ehrlich chỉ ra rằng các cơ chất thuốc có thể tương tác
với thụ thể hóa học (chemoreceptor) đơn lẻ và tạo ra các tác động dược lý. Các nhà
dược lý học hàng đầu khác bao gồm Henry Dale, Otto Loewi, R.P. Ahlquist, và
James Black đã có công trong việc miêu tả hoạt động của các hợp chất ở các thụ thể

về sau này được xác định là các GPCR, đặt nền móng cho việc thiết kế thuốc dựa
trên sự tương tác của chúng với các đích phân tử.
1.4. Thụ thể angiotensin
Angiotensin là một hoocmon peptide có vai trò quan trọng trọng cơ thể, gây co
thắt mạch và tăng huyết áp. Angiotensin là một phần của hệ renin-angiotensin, đây
là một đích chủ yếu của các thuốc điều hòa huyết áp. Angiotensin cũng kích thích
sự giải phóng aldosterone - một hoocmon khác từ vỏ tuyến thượng thận.
13

Aldosterone tăng cường sự lưu giữ natri trong ống sinh niệu ngoại biên ở thận, làm
huyết áp tăng.
Angiotensin có nguồn gốc từ phân tử angiotensinogen, một globulin huyết
thanh dài 452 axit amin, được sản xuất trong gan và có vai trò quan trọng trong hệ
renin - angiotensin. Angiotensin được phân lập một cách độc lập ở Indianapolis
(thuộc tiểu bang Indiana – Hoa kỳ) và Argentina vào cuối những năm 1930 (với tên
gọi tương ứng là „Angiotonin‟ và „Hypertensin‟).
Angiotensin I (AT I) được tạo thành bởi hoạt động của renin trên
angiotensinogen. Renin cắt liên kết peptide giữa leucine (Leu) và valine (Val) trên
angiotensinogen tạo ra chuỗi peptide gồm mười axit amin là angiotensin I.
Angiotensin I dường như không có hoạt tính sinh học và tồn tại chỉ như chất tiền
thân của angiotensin II (AT II). Angiotensin I được chuyển thành angiotensin II qua
việc loại bỏ 2 axit amin đầu C bởi enzym chuyển hóa angiotensin (ACE; đung cũng
là một kinase) mà chủ yếu thông qua ACE trong thận.
Angiotensin II hoạt động như một nội tiết tố hay hoocmon nội bào.
Angiotensin II làm tăng huyết áp bằng cách kích thích các protein G
q
trong các tế
bào cơ trơn mạch máu (lần lượt kích hoạt co bởi một cơ chế phụ thuộc vào IP
3
).

Angiotensin II tác động trực tiếp trên tiểu cầu (zona glomerulosa) của vỏ thượng
thận để kích thích sinh tổng hợp aldosterone. Ở nồng độ cao hơn, angiotensin II
cũng kích thích sự sinh tổng hợp glucocorticoid. Angiotensin II hoạt động trên thận
gây co mạch thận, tăng tái hấp thu natri ở ống lượn gần, và ức chế tiết renin.
Angiotensin II còn là yếu tố phân chia tế bào cho các tế bào cơ tim mạch và tim và
có thể đóng góp vào sự phát triển của phì đại tim mạch. Nó cũng tạo nên một loạt
các hiệu ứng quan trọng về nội mô mạch máu [28].
Angiotensin II bị suy biến thành angiotensin III bởi các enzym angiotensinase
có trong các tế bào hồng cầu và các mạch máu ở hầu hết các mô. Nó có thời gian
14

bán hủy ngắn trong khoảng 30 giây, trong khi đó, trong mô, nó có thể dài 15-30
phút.

Hình 1.4. Hệ renin – angiotensin – aldosterone.
(Nguồn
1.4.1. Thụ thể angiotensin II
Thụ thể angiotensin II làm trung gian tác động của hệ thống renin –
angiotensin, đóng vai trò quan trọng trong sinh lý (bệnh) tim mạch. Có 4 loại thụ
thể angiotensin II đã biết, trong đó thụ thể AT
1
và AT
2
là quan trọng nhất. Sự kích
thích của các thụ thể AT
1
dẫn đến một loạt các con đường tín hiệu trong một số loại
tế bào, mà cuối cùng dẫn đến quá trình như co mạch, viêm và phát bệnh. Các quá
trình này rất quan trọng trong nhiều bệnh liên quan tim mạch khác nhau, bao gồm
cao huyết áp, xơ vữa động mạnh và phì đại tâm thất.

Các thụ thể AT
2
chủ yếu được biểu hiện trong giai đoạn bào thai. Ở cá thể
trưởng thành, thụ thể AT
2
được biểu hiện tối thiểu trong những hoàn cảnh bình
thường. Vai trò của chúng đối với hệ thống tim mạch người trưởng thành vẫn chưa
được xác định rõ ràng, nhưng nó có tác động đối lập với thụ thể AT
1
.
15


1.4.1.1. Thụ thể AT
1
(the AT
1
receptor)
Gen mã hóa thụ thể AT
1
của người nằm ở băng số 22 ở vai dài của nst số 3 và
được nhân dòng lần đầu tiên vào năm 1992 [7,13]. Bao gồm 359 axit amin, là một
thành viên của siêu họ thụ thể kết cặp g protein đặc trưng bởi đặc điểm 7 lần xuyên
màng. Thụ thể AT
1
ở người không có các subtype, trong khi đó ở các loài gặm
nhấm, được chia thành các subtype là AT
1a
và AT
1b

.
Sơ đồ tổng quát truyền tín hiệu sau khi kích thích của thụ thể AT
1
được biểu
diễn trong hình 1.5. Khi chất chủ vận angiotensin II liên kết với thụ thể AT
1
, dẫn
đến sự thay đổi cấu hình của thụ thể AT
1
, điều này dẫn đến không kết cặp G
q
-
protein [35]. Điều này tăng cường sự hoạt động của phospholipase C (PLC) tạo ra
sự sản sinh của 1,4,5-inosioltriphosphate (IP
3
) và diacylglycerol (DAG). Cả IP
3
và
DAG đều có thể làm tăng nồng độ canxi nội bào. IP
3
giải phóng canxi từ các
khoang nội bào và DAG dẫn đến sự đi vào trong tế bào của canxi ngoại bào, bằng
sự kích thích protein kinase C (PKC). Canxi nội bào tăng lên sẽ làm co của các tế
bào cơ trơn thành mạch.
Thụ thể AT
1
cũng điều khiển các tyrosine kinase mà cần thiết cho các tác động
tăng trưởng của angiotensin II [8]. Các tyrosine kinase có thể là nguyên nhân của
phosphryl hóa của một số phân tử tín hiệu, dẫn đến hoạt hóa của các enzym kinase
của protein hoạt hóa phân chia (MAP-mitogen-activated protein). Các MAP kinase,

cũng như PKC và canxi nội bào mức độ cao, khởi động các yếu tố phiên mã gen,
như c-fos, c-myc và c-jun, dẫn đến tăng trưởng và phát triển tế bào.
Con đường thứ 3 được hoạt hóa bởi thụ thể AT
1
là sự cảm ứng của yếu tố
phiên mã nhân kappa-B (NF-κB), mà được trung gian thông qua Janus kinase
(JAK)/yếu tố cơ quan chuyển tín hiệu và yếu tố phiên mã (STAT factor), protein
hoạt hóa (AP-1), và phosphotyrosine kinase (PTK). Hoạt tính của NF-κB tăng lên
16

có liên quan đến sự thâm nhập của đại thực bào, sự biểu hiện của monocyte
chemoattractant protein-1 (MCP-1) [42].


Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp sự truyền tín hiệu của thụ thể AT
1
.
AP-1: Protein hoạt hóa – 1; AT1r: Thụ thể Angiotensin II typ 1; DAG: Diacylglycerol; IP
3
:
1,4,5-inositoltriphosphate; JAK: Janus kinase; MAP: protein hoạt hóa phân bào; NADH:
Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADPH: Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NF-
κB: yếu tố nhân κB; NO: Nitric oxide; OxLDL: Các lipoprotein mật độ thấp bị oxi hóa (Oxidized
low-density lipoprotein); ROS: các gốc oxi phản ứng; STAT: yếu tổ truyền tín hiệu và hoạt hóa
phiên mã; PKC: Protein kinase C; PLC: Phospholipase C; PTK: Phosphotyrosine kinase. (Nguồn
: Ruiz-Ortega, 2000).
Thụ thể AT
1
đóng vai trò quan trọng sinh lý bệnh tim mạch. Sự kích thích thụ
thể AT

1
dẫn đến sự hoạt động một loạt các enzym truyền tín hiệu, dẫn đến sự giảm
nitric oxide và tăng oxidized LDL, NF-κB, các yếu tố phiên mã gen và canxi nội
bào. Tùy thuộc vào các điều kiện vị trí, điều này dẫn đến co mạch, tăng tính
↑ Ca
2+
nội bào

↑ các yếu tố phiên mã
gen (c-fos, c-myc, c-jun)

Co mạch, viêm,
gây đông máu,
tăng sinh

Tăng vữa
động mạch
Viêm và phân chia
Co mạch
Sinh trƣởng các phân
chia

17

atherogenicity (xơ vữa), viêm. Những quá trình này quyết định đến các trạng thái
khác nhau của chứng xơ vữa động mạch và cũng quan trọng trong cao huyết áp, phì
đại tâm thất trái, suy tim mãn tính.
1.4.1.2. Thụ thể AT
2

Thụ thể AT
2
được tìm hiểu ít hơn so với AT
1
. Sự kích thích của thụ thể này
dẫn đến làm giảm các kinase MAP, và gây ra tăng cGMP, làm cho sự sinh trưởng tế
bào bị giảm đi và gây ra chết theo chương trình và giãn mạch. Do đó, thụ thể AT
2

thể hiện các quá trình ngược lại với thụ thể AT
1
.
Hình 1.6 biểu diễn quá trình dẫn truyền tín hiệu sau khi bị kích thích của AT
2
.
Angiotensin II liên kết với thụ thể AT
2
dẫn đến tách cặp (uncoupling) của G
i

protein. G
i
protein không kết cặp hoạt hóa serine/threonine phosphatase 2A (PP2A)
và phosphotyrosine phosphatase (PTP), tương ứng ức chế sự phosphoryl hóa
protein serine/threonine và protein tyrosine. Thông qua các con đường này, kích
hoạt các tác động của thụ thể AT
2
trong việc ngăn chặn hoạt động của MAP kinase
sau khi được kích thích bởi thụ thể AT
1

. Do đó, ức chế tác dụng của thụ thể AT
1

trong sinh trưởng tế bào [34]. Thụ thể AT
2
cũng có khả năng cảm ứng NF-κB,
thông qua việc sản xuất nội bào ceramide và ROS [24]. Các tác động của thụ thể
AT
2
trong sản xuất cGMP vẫn còn gây tranh cãi.
18


Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp con đƣờng truyền tín hiệu của thụ thể AT
2
.
AT2r : Thụ thể Angiotensin II type 2; BK : Bradykinin một trong những kinin huyết tương là
trung gian hóa học, có vai trò trong phản ứng viêm (gây giãn mạch, tăng tính thấm mao mạch, và
gây đau); cGMP : GMP vòng; MAP : Protein hoạt hóa phân bào; NF-kB : Yếu tố nhân κB; NO :
Nitric oxide; PP2A : Serin/threonin phosphatase 2A; PTP : Phosphotyrosine phosphatase; ROS :
Các các gốc oxi phản ứng. (Nguồn : Ruiz-Ortega, 2000).
Một số nghiên cứu trên các động vật mô hình đã chỉ ra rằng AT
2
có khả năng kích
thích con đường bradykinin/NO-cGMP, dẫn đến gây giãn mạch [12]. Tuy nhiên,
cho đến nay con đường này vẫn chưa được chứng minh trong hệ mạch của người.
Đưa ra những đặc điểm này, các angiotensin II type 1 receptor blocker (ARBs-
các thuốc chẹn thụ thể) có thể điều trị hiệu quả các bệnh đã được chỉ ra ở trên.
ARBs không chỉ làm việc bằng các làm giảm những tác động có hại của thụ thể
Viêm

Giảm sinh trƣởng tế bào
Tăng chết theo chƣơng trình
Giãn mạch

19

AT
1
, mà còn làm tăng nồng độ angiotensin II bằng vòng phản hồi âm tính (phản hồi
tiêu cực). Khi có mặt một ARB, sự tăng của angiotensin II sẽ hoạt động như là 1
chất chủ vận của thụ thể AT
2
, do đó đối chọi với các tác động của AT
1
. Đây là một
lợi thế lý thuyết của ARBs khi so sánh với các chất ức chế ACE.
Các ARB đã được chứng minh là có hiệu quả trong cao huyết áp. Cũng như
trong trụy tim và các trường hợp lắp van tim, các nghiên cứu đang được thực hiện,
nhưng chưa được kết luận. Để đánh giá giá trị của các ARB trong trụy tim, và ngăn
ngừa thứ phát ở các bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tim mạch cục bộ, nhiều thử
nghiệm ngẫu nhiên đã được thực hiên. Hơn nữa, tại thời điểm hiện tại thì vẫn chưa
đủ những hiểu biết về tác động của sự kích thích của thụ thể AT
2
.
Hệ renin – angiotensin – aldosterone đóng vai trò chủ đạo trong điều hòa cân
bằng máu và các chất điện giải và huyết áp. Có 2 nhóm thuốc tác động đặc hiệu trên
hệ renin – angiotensin, đó là nhóm các thuốc ức chế enzym chuyển hóa angiotensin
(ACE) và các thuốc ức chế cạnh tranh với angiotensin ở thụ thể của nó (losartan và
các chất đối vận không có bản chất peptid khác [28].
Các thuốc ACE ngăn cản hoạt tính của men chuyển qua đó ngăn angiotensin I

chuyển hóa thành angiotensin II. Trong khi đó các thuốc chẹn thụ thể angiotensin II
(ARB) cạnh tranh vị trí liên kết của angiotensin II tại thụ thể của nó. Các thuốc ức
chế men chuyển có các tác dụng phụ đó là: tăng kali máu, qua đặc tính giảm tiết
aldosterone của ức chế men chuyển. Hạ đường huyết do đặc tính nhạy cảm với
insulin của ức chế men chuyển. Tương tác với erythropoietin, ức chế men chuyển
có thể ngăn cản một phần hoạt tính của erythropoietin, do đó làm thiếu máu. Suy
giảm chức năng thận. Ho và co phế quản, đặc điểm là ho khan, từng cơn thường vào
buổi tối kèm cảm giác ngứa ở cổ họng.
Thuốc chẹn thụ thể angiotensin II đẩy angiotensin II ra khỏi thụ thể AT
1
do đó
làm mất tác dụng của angiotensin II làm hạ huyết áp, đồng thời trong khi nồng độ
angiotensin II tăng cao trong tuần hoàn làm chúng tác động lên đích thụ thể AT
2
,
20

gây ra tác dụng hạ huyết áp theo con đường thụ thể này. Do nguyên nhân là ngoài
còn đường men chuyển, angiotensin I còn có thể chuyển thành angiotensin II qua
đường men chymase và vài đường khác; do đó thuốc chẹn thụ thể angiotensin II sẽ
ngăn chặn angiotensin II hoàn toàn hơn so với ức chế men chuyển. Đồng thời có ít
các tác dụng phụ hơn [4].
1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu tƣơng tác thụ thể và phối tử
1.5.1. Tương tác phân tử thụ thể và phối tử
Nhiều quá trình sinh hóa, thiết yếu cho hoạt động chức năng và tồn tại của tế
bào và cơ thể, được điều khiển bởi hormone, các chất dẫn truyền thần kinh,
cytokine và các phân tử truyền tin khác. Sự điều hòa bắt nguồn bởi sự tương tác của
các phân tử được tìm thấy trong tự nhiên với các thụ thể có trên màng tế bào hoặc
có ở trong tế bào chất hoặc nhân tế bào.
Trong các thí nghiệm in-vitro, thụ thể được sử dụng với các mục đích khác

nhau, liên quan tới sàng lọc các thành phần hóa học mới hoặc để xác định và định
lượng các thuốc trong mẫu sinh phẩm. Kỹ thuật này được gọi là receptor assay
(phép thử thụ thể- hay thí nghiệm thụ thể). Các thụ thể trong các phân tích này có
thể dễ dàng thu được từ các nguồn động vật khác nhau. Trong phép thử thụ thể, một
phối tử được đánh dấu và chất phân tích sẽ cạnh tranh liên kết với thụ thể. Sau khi
cân bằng, các phần liên kết và không liên kết của phối tử đánh dấu phải được phân
tách. Có thể là bằng cách lọc hoặc bằng ly tâm, sau đó các phần đã liên kết và/hoặc
phần không liên kết sẽ được định lượng. Với các nồng độ tăng dần của chất cần
phân tích, lượng phối tử đánh dấu liên kết với thụ thể sẽ giảm. Đồ thị biểu diễn
phần đã liên kết của phối tử đánh dấu với các nồng độ chất cần phân tích tương ứng
tạo nên đường đồ thị ức chế, từ đó ái lực của chất phân tích với thụ thể có thể xác
định được cũng như các nồng độ chưa biết của chất phân tích đó cũng có thể xác
định được.