nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu bombyx mori l

Lu
Nguyn Th Lan 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Lan


NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN
KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA
TẰM DÂU BOMBYX MORI L.



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC







Hà Nội – Năm 2013


Lu

Nguyn Th Lan 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Nguyễn Thị Lan


NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN
KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA
TẰM DÂU BOMBYX MORI L.
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình
2. TS. Đinh Nho Thái



Hà Nội – Năm 2013




Lu
Nguyn Th Lan 3

Lời cảm ơn



















 , 













 ,  ,  , , 
. 








:
PGS.TS. Nguyn Th  Gen
ng vt - Vi Sinh hc ting dn, ch b
trong suc tc t
  ng
vt - Vi Sinh h, ch bi
c tp t
Ti c gi li c
thi hc Khoa hc T - ng
d bt thc.
Cui li cc t 
ng nghing h t thi gian hc t
vic.

H

Nguyn Th Lan




Lu
Nguyn Th Lan 4

MỤC LUC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13
1.1. Một số nét khái quát về tằm dâu 13
1.1.1. Vị trí phân loại 13
1.1.2. Nguồn gốc 13
1.1.3. Một số đặc điểm sinh học 14
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất và khả năng chống chịu nóng ẩm của
tằm dâu 19
1.2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa kinh tế của tằm dâu 21
1.2.1. Ý nghĩa khoa học 21
1.2.2. Ý nghĩa kinh tế 21
1.3. Phương pháp truyền thống đánh giá sức sống, năng suất chất lượng tơ kén
của giống tằm 23
1.4. Một số kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa hình 23
1.4.1. Kỹ thuật PCR 24
1.4.2. Kỹ thuật RAPD 25
1.4.3. Kỹ thuật RFLP 26
1.4.4. Kỹ thuật AFLP 27
1.4.5. Kỹ thuật SSR 29

1.4.6. Kỹ thuật ISSR 30
1.4.7. Phần mềm NTSYSpc 31
1.5. Tình hình nghiên cứu đa hình phân tử tằm dâu trên thế giới và ở Việt Nam . 33
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 33
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 35


Lu
Nguyn Th Lan 5

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39
2.1. Vật liệu 39
2.1.1. Các giống tằm 39
2.1.2. Mồi sử dụng 41
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu 43
2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 43
2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 45
2.2.3. Điện di trên gel Agarose 46
2.2.4. Phương pháp PCR – ISSR 47
2.2.5. Xử lý số liệu 48
2.2.6. Phương pháp thôi gel 49
2.2.7. Tạo plasmid tách dòng 50
2.2.8. Biến nạp sản phẩm vào  50
2.2.9. Chọn lọc và nuôi dòng tế bào có khả năng mang đoạn gen biến nạp 51
2.2.10. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 51
2.2.11. Cắt plasmid bằng enzym giới hạn 52
2.2.12. Tinh sạch plasmid 53
2.2.13. Phương pháp xác định trình tự gen 53
2.2.14. Phương pháp thiết kế mồi 54

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55
3.1. Phân tích đa hình phân tử 55
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 55
3.1.2. Phân tích đa hình phân tử của các giống tằm 57


Lu
Nguyn Th Lan 6

3.1.3. Phân tích quan hệ di truyền giữa các giống tằm 59
3.1.4. Xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm 60
3.2. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt
độ và ẩm độ cao của giống 61
3.2.1. Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ
cao 61
3.2.2. Khuếch đại và dòng hóa phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ
và độ ẩm cao 62
3.2.3. Xác định trình tự liên quan tới khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao 65
3.2.4. So sánh trên ngân hàng gen và bản đồ genome tằm 66
3.2.5. Thiết kế mồi, tối ưu điều kiện khuếch đại phân đoạn liên quan đến khả
năng chịu nóng ẩm cao của tằm 70
3.2.6. So sánh tần số khuếch đại và khảo sát mồi đặc hiệu 73
KẾT LUẬN 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC

Lu
Nguyn Th Lan 7

DANH MỤC BẢNG

STT
Bảng
Chú thích
Trang
1
Bảng 1
u ging t
29
2
Bảng 2
ng t
trin ch th
30
3
Bảng 3
 i ISSR
31
4

Bảng 4
t b  dng c s dng
32
5
Bảng 5

33
6
Bảng 6
 ISSR
37
7
Bảng 7
-ISSR
38
8
Bảng 8
Phn ng gn sn ph
40
9
Bảng 9
Phn ng ct hn ch plasmid  hp
42
10
Bảng 10
N  sch DNA cu
46
11
Bảng 11
S n, t l  s PIC

47
12
Bảng 12
H s ng di truyn ging tm
49
13
Bảng 13
 mt s cp mc thit k
61
14
Bảng 14
n ca phn ng PCR  c hiu
62
15
Bảng 15
t ca phn ng PCR  c hiu
62
16
Bảng 16
n s khui cn 1500bp khi
s dng hai loi mi (%)
63
17
Bảng 17
Tn s sut him
64

Lu
Nguyn Th Lan 8

DANH MỤC HÌNH ẢNH

STT
Hình
Chú thích
Trang
1
Hình 1
Trng tm
5
2
Hình 2
T
6
3
Hình 3
Nhng tm
6
4
Hình 4

7
5
Hình 5
 phn ng ISSR
20

6
Hình 6
Kt qu n di DNA tng s ca mt s ging tm

45
7
Hình 7
n di sn phm PCR
48
8
Hình 8
n di sn phm PCR
48
9
Hình 9
n di sn phm PCR
48
10
Hình 10
n di sn phm PCR
48
11
Hình 11
n di sn phm PCR
49
12
Hình 12
n di sn phm PCR
49
13

Hình 13
 quan h di truyn ging tm
51
14
Hình 14
n di sn phm PCR
52
15
Hình 15


53
16
Hình 16
n di sn pht DNA plasmid
53
17
Hình 17
n di kim tra kt qu bin np
54


Lu
Nguyn Th Lan 9

18
Hình 18
n di kt qu tinh sch Plsamid
55
19

Hình 19
 n 1500bp
56
20
Hình 20
 
gen
57
21
Hình 21
V  Genome tm -
GBrowse (chromosome)
60
22
Hình 22
Vị trí của phân đoạn 1500 trên bản đồ Genome tằm
– Pgmap
60
23
Hình 23
n di sn phm PCR
64
24
Hình 24
n di sn phm PCR
65

Lu
Nguyn Th Lan 10

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
(Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành)
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
AFLP
Amplified Fragment Length
Polymorphism DNA
Đa hình chiều dài các đoạn DNA được
khuyếch đại
Bp
Base pair
Cặp bazo
CTPT

Chỉ thị phân tử
DNA
Deoxyribonucleic acid
Axit đeoxyribonucleic
HSTĐDT

Hệ số tương đồng di truyền
ISSR
Inter simple sequence repeat
Trình tự các đoạn lặp lại đơn giản
Kb
Kilo base
1000 cặp bazơ
LB
Luria-Bertani

OD
Optical Density
Giá trị mật độ quang
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase
PĐ, PDĐH

Phân đoạn, Phân đoạn đa hình
RAPD
Random Amplified
Polymorphism DNA
Đa hình các đoạn DNA được khuếch đại

ngẫu nhiên
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism DNA
Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt
ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn
RNA
Ribonucleic acid
Axit ribonucleic
SSRs
Simple Sequence Repeats
Khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản
TLĐH

Tỷ lệ đa hình
TSPĐ

Tổng số PĐ được nhân lên với mồi đó
TAE

Tris - Acetic acid - Ethylen
Diamin Tetra Acetic





Lu
Nguyn Th Lan 11

MỞ ĐẦU
Trồng dâu nuôi tằm, ươm tơ dệt lụa là một trong những nghề được duy trì và
phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Theo một số tài liệu, nghề trồng dâu nuôi tằm
xuất hiện sớm nhất ở Trung Quốc, sau đó mới được phát triển và lan rộng đến các
vùng khác như Nhật, Nga, Hàn Quốc, Ấn Độ Ở Việt Nam, nghề nuôi tằm được du
nhập vào từ khoảng 1200 năm trước và cho đến nay vẫn được duy trì, phát triển tại
nhiều địa phương. Đây là một trong những nghề có thể giúp để xoá đói giảm nghèo,
nâng cao đời sống cho người lao động ở vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa nên đã
được quan tâm đầu tư. Bên cạnh sản phẩm chính là tơ lụa có nhiều đặc tính quý mà
không một loại sợi nào có thể sánh được thì những giá trị và lợi ích từ tằm ngày
càng được con người phát hiện và sử dụng nhiều hơn. Nhu cầu của thị trường về các
sản phẩm tơ tằm không ngừng tăng lên đòi hỏi ngành dâu tằm phải có các biện pháp
để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm [21], [44].
Tuy nhiên cho đến nay, vấn đề giống tằm năng suất chất lượng tơ kén tốt, có
khả năng chống chịu với nhiệt độ và ẩm độ cao đang rất cấp thiết do việc chọn tạo
giống tằm trong nước chủ yếu vẫn thực hiện theo phương pháp truyền thống, việc
đánh giá giống, lựa chọn bố mẹ trong cặp lai mới chỉ dựa vào kiểu hình và đặc điểm
sinh học nên tốn nhiều thời gian mà kết quả đạt được chưa như mong đợi. Trứng
giống tằm trong nước đang bị cạnh tranh mạnh với loại trứng nhập khẩu chủ yếu từ
Trung Quốc. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm các kỹ thuật hỗ trợ để đánh giá nhanh và
chính xác giống theo các chỉ tiêu kinh tế đang rất được quan tâm.
Trong những năm gần đây, sử dụng chỉ thị phân tử DNA để phân tích di
truyền các giống vật nuôi, cây trồng đã trở thành một hướng nghiên cứu quan trọng
trong lĩnh vực công nghệ sinh học phục vụ đời sống con người. Trong tạo giống,
người ta đã tiến hành chọn lọc dưới sự trợ giúp của chỉ thị phân tử. Các kỹ thuật này
ngày càng trở thành công cụ đắc lực hỗ trợ phương pháp truyền thống trong việc
chọn tạo giống, cho phép các nhà tạo giống nhận dạng chính xác các gen quan tâm
từ bất cứ bộ phận nào của vật nuôi và cây trồng ở giai đoạn sớm mà ít bị ảnh hưởng
bởi điều kiện tự nhiên và thời gian lại rút ngắn nên tiết kiệm kinh phí. Đã có những
giống vật nuôi và cây trồng được chọn tạo bằng phương pháp này .

Lu
Nguyn Th Lan 12

Ở một số nước có ngành dâu tằm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn
Độ, Liên Xô cũ, Hàn Quốc đã có những công trình nghiên cứu về đa dạng di
truyền phân tử giống tằm. Các thông tin di truyền phân tử đã trợ giúp cho công tác
giống để phát triển tập đoàn dòng thuần, tìm hiểu ưu thế lai, xác định các cặp lai ưu
tú [52]. Sử dụng chỉ thị phân tử để phân loại, nhận dạng và chọn lọc giống theo các
tính trạng kinh tế. Bản đồ gen tằm đã được các nhà khoa học Nhật Bản, Trung
Quốc… xây dựng và một số gen liên quan đến năng suất, chất lượng tơ kén đã được
nghiên cứu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu còn hướng vào việc tìm kiếm các chỉ thị
phân tử liên kết với các tính trạng kinh tế của giống để phát triển thành markers
phân tử đánh giá giống. Những công trình này đã góp phần đáng kể cho công tác
tạo giống tằm và có những thành công hơn so với các phương pháp truyền thống.
Ở nước ta, trong thời gian qua hướng nghiên cứu này đang ở giai đoạn khởi
đầu và là vấn đề cấp thiết. Các công bố hiện tập trung vào nghiên cứu đa dạng phân
tử giống tằm Việt Nam, xác định quan hệ di truyền, tìm hiểu ưu thế lai. Việc phát
triển chỉ thị phân tử liên quan đến việc đánh giá giống nhằm nâng cao hiệu quả
chọn tạo giống tằm cao sản và có khả năng chịu nóng ẩm cao đang mang tính thời
sự. Từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm
độ cao của tằm dâu Bombyx mori L.”. Công trình được thực hiện tại phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học.
Mục tiêu:
Tìm kiếm chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm
độ cao của tằm dâu Bombyx mori L.
Nội dung nghiên cứu:
 Nghiên cứu đa hình phân tử của các giống tằm.

 Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu
nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu.





Lu
Nguyn Th Lan 13

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số nét khái quát về tằm dâu
1.1.1. Vị trí phân loại
Ban đầu, tằm dâu có tên là Phalaena mori. Đến năm 1758 Linnaeus xếp loài
tằm này vào bảng hệ thống phân loại với tên khoa học là Bombyx mori L. Hệ thống
phân loại của tằm dâu như sau [12]:
Giới: Aminalia
Ngành: Arthropoda
Phân ngành: Hexapodas
Lớp: Insecta
Bộ: Lepidoptera
Bộ phụ: Heterocera
Họ: Bombycidae
Giống: Bombyx
Loài: mori
1.1.2. Nguồn gốc
Tằm dâu vốn là một trong những loài côn trùng hoang dại , được con ngươ
̀
i
nuôi dưng, khai thác va

̀
thuần hoa
́
tư
̀
rất sơ
́
m . Theo những nghiên cứu phát sinh
chủng loại dựa trên cơ sở sự lai khác loài và so sánh cấu trúc gen đã cho thấy tằm
nhà ngày nay có quan hệ gần gũi với tằm dại (Bombyx mandarina). Nghiên cứu tế
bào học trên những con lai khác loài giữa Bombyx mandarina và Bombyx mori L thì
thấy sự hình thành thể tam trị, điều này chỉ ra rằng có thể 1 nhiễm sắc thể của
Bombyx mandarina đã bị tách làm đôi trong quá trình thuần hoá tằm dại thành tằm
nhà với nhiều đặc tính tốt hơn, quý hơn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con
người về năng suất và chất lượng tơ kén [44].


Lu
Nguyn Th Lan 14

1.1.3. Một số đặc điểm sinh học
Vòng đời của tằm dâu: Tằm dâu là loài côn trùng biến thái hoàn toàn, vòng
đời trải qua 4 giai đoạn phát dục: Trứng, tằm, nhộng, ngài [12]. Vòng đời có thể
biến động dài, ngắn phụ thuộc vào điều kiện sống và kỹ thuật chăm sóc. Thời gian
của một vòn dâu như sau [21]:
Các thời kỳ
Giống lưng hệ (ngày)
Giống đa hệ (ngày)
Trứng
10-11

9-10
Tằm
25-26
20-22
Nhộng (kén)
10-11
9-10
Ngài
5-8
3-6
Tổng số
50-56
41-48

Giai đoạn trứng:
Trứng tằm có hình elip, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng là 1,2-1,3 (Hình
1). Kích thước và trọng lượng trứng thay đổi tuỳ thuộc vào giống tằm, điều kiện
nuôi dưng, điều kiện bảo quản nhộng, ngài và thứ tự ngày đẻ trứng. Trứng tằm độc
hệ lớn nhất, sau đến là trứng lưng hệ, trứng tằm đa hệ là bé nhất. Nhìn chung,
trọng lượng 1000 trứng của một số giống tằm như sau [12]:
- Giống độc hệ châu Âu: 0,75-0,85g.
- Giống lưng hệ Trung Quốc, Nhật Bản: 0,6-0,75g.
- Giống đa hệ Việt Nam, Ấn Độ: 0,4-0,45g.
Trên mặt trứng có nhiều lỗ khí. Màu sắc trứng thay đổi theo giống tằm và thời gian
phát dục. Đối với trứng tằm đa hệ thì sau khi con cái đẻ trứng 8-10 ngày, ở 25°C
trứng sẽ nở thành tằm con. Đối với trứng tằm lưng hệ và độc hệ thì sau khi đẻ
trứng sẽ đi vào trạng thái ngủ nghỉ và bắt buộc trứng phải qua lạnh, đây là đặc tính
di truyền của tằm lưng hệ và độc hệ được hình thành trong điều kiện giá lạnh của

Lu
Nguyn Th Lan 15

vùng ôn đới. Sau 4-5 tháng lạnh của mùa đông thì trạng thái ngủ nghỉ (hay còn
được gọi là hưu miên) bị phá v và trứng được nở ra tằm con. Người ta đã lợi dụng
đặc tính này của trứng tằm để bảo quản trứng lâu dài, đi với nó là các phương pháp
đánh thức ngủ nghỉ bằng các biện pháp nhân tạo [12].


Giai đoạn tằm:
Là giai đoạn sinh trưởng dinh dưng, con tằm ăn lá dâu và lớn lên với tốc độ
nhanh, tằm sắp chín (đủ dinh dưng) lớn gấp 8.000-10.000 lần so với tằm mới nở
[21].
Tằm mới nở có màu nâu đậm hoặc màu đen, toàn thân phủ một lớp lông gai
nhỏ và mịn. Sau lần lột xác thứ nhất, lớp lông gai được trút bỏ, từ tuổi 2 da tằm trở
nên trơn và màu sắc nhạt dần (Hình 2).
Toàn bộ cơ thể tằm có hình trụ thuôn dài, chia làm 3 phần: Đầu, ngực và
bụng. Phần ngực với 3 đốt ngực và 3 đôi chân ngực, phần bụng gồm 10 đốt với 4 đôi
chân bụng và 1 đôi chân đuôi. Dọc 2 bên sườn của các đốt bụng và ngực, mỗi đốt có
một đôi lỗ thở [12].
ng tm



Lu
Nguyn Th Lan 16



Giai đoạn nhộng:

Nhộng tằm dâu thuộc loại nhộng màng. Nhộng có hình bầu dục dài, hơi
thuôn về phía đuôi. Khi mới hoá nhộng có màu trắng, sau chuyển dần sang màu
vàng nhạt, vàng sẫm và nâu xám (Hình 3). Khi nhộng có màu nâu xám là lúc sắp vũ
hoá thành ngài.


Giữa nhộng đực và nhộng cái có sự khác biệt tương đối rõ rệt về hình thái.
Nhộng đực nhỏ hơn nhộng cái, đuôi nhọn và các đốt đuôi sít nhau. Ở giữa mặt bụng
của đốt bụng thứ 9 có một chấm nhỏ. Nhộng cái lớn hơn, đuôi tù, các đốt bụng lớn,
khoảng cách giữa các đốt dài, ở mặt bụng của đốt bụng thứ 8 có một ngấn hình chữ
X [12]. Tằm nhả tơ kết kén xong thì hoá nhộng. Thời gian từ tằm chín - nhộng -
ngài thông thường 9 - 12 ngày. Nhộng già thì hoá thành ngài và cắn vỏ kén chui ra
ngoài [21].
. T

3. Nhng tm




Lu
Nguyn Th Lan 17

Giai đoạn ngài:
Ngài tằm dâu vũ hoá từ nhộng nhưng không có khả năng bay vì đã được
thuần hoá. Toàn bộ cơ thể ngài chia làm 3 phần (Hình 4): Đầu, ngực và bụng. Đầu có
mắt kép và râu đầu, râu đầu ngài tằm có dạng kép lông chim. Ngực có 3 đốt với 3 đôi
chân ngực và 2 đôi cánh. Trừ màng ngăn giữa các đốt còn lại toàn bộ bề mặt cơ thể
ngài và cánh ngài được phủ những phiến vảy [12].
Giai đoạn ngài thường kéo dài khoảng 5 – 7 ngày, ngài đực và ngài cái tìm

nhau để giao phối. Sau khi kết đôi, ngài cái sẽ đẻ khoảng 300 – 700 trứng tuỳ thuộc
vào giống tằm. Ngài là giai đoạn kết thúc một thế hệ tằm dâu.


Hệ tính và tính ngủ
Hai đặc tính này thể hiện rõ sự thích nghi của tằm đối với môi trường.
* Hệ tính (voltinism): Là khái niệm chỉ số thế hệ trải qua trong một năm của
một giống tằm. Hệ tính phụ thuộc vào giống tằm và các điều kiện môi trường như
ánh sáng, độ ẩm, độ thoáng khí… đặc biệt là nhiệt độ [12]. Theo cách phân loại này
người ta chia tằm dâu ra làm 3 loại: Tằm độc hệ, tằm lưng hệ, tằm đa hệ.
+ Giống tằm độc hệ (univoltine): Là những giống tằm chỉ sinh ra một thế hệ
trong một năm. Trứng thường nở vào mùa xuân. Sau khi nuôi tằm kết thúc đời thứ
nhất, sinh ra trứng đời 2 thì trứng này đi vào nghỉ đông đến mùa xuân năm sau mới
. 



Lu
Nguyn Th Lan 18

nở [12]. Giống tằm na
̀
y đư ợc nuôi phô
̉
biến ơ
̉
vu
̀
ng ôn đơ
́

i gia
́
la
̣
nh , ẩm độ thấp :
Châu Âu, Bắc Trung Quốc…cho năng suất ke
́
n cao , trọng lượng bình quân kén từ
1,8-2g, chiều da
̀
i sơ
̣
i tơ trung bình 1000-1500m, tỉ lệ vỏ kén trên 30% [44].
+ Giống lƣỡng hệ (bivoltine): Là những giống tằm trải qua 2 thế hệ trong
một năm. Trứng đời thứ nhất nở vào mùa xuân, sau khi nuôi tằm kết thúc đời thứ
nhất đẻ ra trứng đời 2 thì trứng này không nghỉ đông mà nở bình thường. Sau 10 –
12 ngày trứng nở, tiếp tục nuôi tằm kết thúc đời thứ 2, sinh ra trứng đời thứ 3 thì
trứng này có nghỉ đông và chỉ nở vào mùa xuân năm sau [12]. Thời gian ngủ nghỉ
120 ngày, chiều dài tơ đơn 800 - 1000m, trọng lượng trung bình của kén 1,4 - 1,6g.
Tằm lưng hệ có phạm vi thích ứng, sức sống tốt và khả năng chịu nóng cao hơn
tằm độc hệ nhưng không bằng tằm đa hệ [44].
+ Giống đa hệ (multivoltine): Là những giống tằm sinh ra nhiều hơn 2 thế hệ
trong một năm. Trứng không nghỉ đông, đời này phát triển kế tiếp đời kia liên tục,
một năm có thể trải qua 7- 8 thế hệ. Tằm đa hệ được nuôi chủ yếu ở vùng nhiệt đới
như Việt Nam, Lào, Trung Quốc [12].
Tằm đa hệ cho năng suất ke
́
n thấp , chiều dài tơ đơn ngắn 400 - 500 m, trọng
lượng bình quân của kén 1,0g - 1,2g [44].
* Tính ngủ (Diapause): Trong pha tằm, từ khi nở ra đến lúc nhả tơ kết kén,

tằm trải qua một số lần lột xác. Ở mỗi tuổi tằm, sau khi đã đồng hoá thức ăn và đạt
được sự tăng trưởng tối đa của tuổi đó, lúc này da tằm đã căng hết c và không còn
khả năng lớn thêm về thể tích, tằm mất dần sự thèm ăn, lượng dâu ăn ít dần rồi tiến
đến ngừng ăn, chuẩn bị cho quá trình lột xác gọi là tằm ngủ. Tằm thường trải qua 4
lần ngủ ứng với 5 tuổi. Nhưng cũng có một số giống ngủ 3 lần và một số giống ngủ
5 lần [12]. Tằm chuẩn bị ngủ, da dần căng bóng, ăn ít lá dâu. Tằm ngủ, ngừng ăn, ít
động đậy, đầu ngẩng cao, sau 20-24 giờ tuỳ theo mùa, tằm lột xác chuyển sang tuổi
sau gọi là tằm dậy. Thời gian ngủ ở các tuổi từ 15-30 giờ tuỳ theo giống tằm và điều
kiện sinh thái. Thời gian ngủ tuổi 2 là ngắn nhất sau đó đến tuổi 1, tuổi 3 và tuổi 4
[12].


Lu
Nguyn Th Lan 19

Tằm chín: Ở tuổi 5, khi tằm đạt được sự tăng trưởng tối đa, trọng lượng cơ
thể tằm tăng 9000-10.000 lần so với lúc tằm mới nở. Tằm ngừng ăn dâu và chuẩn bị
cho quá trình nhả tơ kết kén gọi là tằm chín. Thời gian tuổi 5 kéo dài 5-6 ngày đối
với giống đa hệ và 7-9 ngày đối với giống lưng hệ và độc hệ. Biểu hiện của tằm
chín là: Tằm ngừng ăn lá dâu, thải phân mềm, ướt, thân tằm căng bóng (như lúc ngủ
ở các tuổi trước) và trở nên trong suốt, có màu trắng trong đối với giống kén trắng
và màu vàng ươm đối với giống kén vàng. Đầu tằm ngẩng cao, lắc qua lắc lại bên
phải bên trái theo động tác nhả tơ, tằm thường có xu hướng bò tản ra xung quanh để
tìm vị trí nhả tơ [12].
Thức ăn của tằm dâu
Thức ăn chủ yếu của tằm dâu là lá dâu có tên khoa học là Morus alba. Tuy
nhiên chúng cũng có thể ăn lá của bất kỳ cây nào thuộc chi dâu tằm (như Morus
rubra hay Morus negra) [12], [8].
Protein trong lá dâu là nguồn vật chất để con tằm tổng hợp nên sợi tơ, gần
70% protein trong thành phần sợi tơ được tổng hợp trực tiếp từ protein trong lá dâu

[12]. Ngoài ra, trong lá dâu có chứa chất dẫn dụ có thể lôi cuốn tằm, chất vị giác
kích thích hành vi nhai của tằm, chất nuốt trôi giúp tằm nuốt lá dâu. Chất dẫn dụ
này có mùi vị đặc trưng riêng biệt, lôi cuốn tằm đến ăn. Do vậy mà loài côn trùng
này không ăn những lá cây khác [8].
1.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng chịu nóng ẩm của
tằm dâu
 Nhiệt độ
Tằm dâu là loài côn trùng biến nhiệt vì vậy nhiệt độ tác động trực tiếp tới
mọi hoạt động sinh lý của tằm. Tằm có thể phát dục được trong khoảng nhiệt độ 7,5
– 37
0
C. Trong đó nhiệt độ thích hợp nhất cho phát dục của tằm là 20 – 30
0
C. Trong
phạm vi nhiệt độ này, khi nhiệt độ càng tăng thì quá trình sinh trưởng phát dục của
tằm càng tăng [12]. Đảm bảo nhiệt độ thích hợp tương đối cho tằm là biện pháp
quan trọng để có lứa tằm năng suất chất lượng cao [21].


Lu
Nguyn Th Lan 20

Khả năng thích nghi với điều kiện nhiệt độ thay đổi tuỳ thuộc vào giống tằm,
tuổi tằm và điều kiện nuôi dưng. Các giống tằm đa hệ thích hợp với nhiệt độ cao
hơn các giống lưng hệ và độc hệ, giống tằm lai thích hợp với nhiệt độ cao hơn
giống nguyên 1
0
C-2
0
C. Tằm con thích hợp với nhiệt độ cao hơn tằm lớn. Nuôi tằm

ở điều kiện ẩm độ cao, thông gió cần nhiệt độ thấp hơn [12].
 Độ ẩm
Độ ẩm tác động tới sinh trưởng, phát dục của tằm thông qua tác động trực
tiếp và tác động gián tiếp [12].
- Tác động trực tiếp: Ẩm độ ảnh hưởng tới mọi hoạt động sinh lý của tằm
như tiêu hoá, tuần hoàn, trao đổi chất … [12]
- Tác động gián tiếp: Ẩm độ quá cao là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn
phát triển, tăng nguy cơ phát sinh bệnh cho tằm. Ẩm độ quá thấp sẽ làm lá dâu
chóng héo, tằm ăn đói, cơ thể thoát hơi nước nhiều dẫn đến chóng suy nhược là môi
trường thuận lợi cho bệnh vi khuẩn phát triển [21].
 Không khí
Cũng như các động vật khác, tằm cần có không khí trong lành để thực hiện
các chức năng sinh lý. Trong phòng nuôi tằm, ngoài các thành phần khí O
2
và CO
2

còn tồn tại thêm một số loại khí khác như CO, NH
3
, SO
2
… sản sinh ra do quá trình
đốt than tăng nhiệt trong phòng tằm hay do sự lên men của phân tằm Những khí
này không có lợi cho quá trình sinh trưởng phát dục của tằm. Do vậy yêu cầu không
khí trong phòng tằm thường phải đảm bảo: CO
2
≤1,5%; CO ≤0,5%; SO
2
≤0,02%
[12].

 Gió
Gió có tác dụng 2 mặt đối với tằm:
+ Tác dụng tốt: Phát tán hơi nước điều hoà thân nhiệt cho tằm, bài trừ khí
độc ra khỏi phòng tằm, điều hoà nhiệt, ẩm độ trong phòng tằm.


Lu
Nguyn Th Lan 21

+ Tác động xấu: Gió làm lá dâu mau héo ảnh hưởng đến khả năng ăn dâu của
tằm, làm tiêu hao nhiệt lượng trong cơ thể tằm đặc biệt khi nhiệt độ thấp và ẩm độ
thấp. Khi tằm ngủ, gió mạnh sẽ làm tằm không lột xác hoặc lột xác một nửa. Khi
tằm lên né gặp gió mạnh tằm sẽ làm kén phân tầng, làm giảm chất lượng kén. Tốc
độ gió thích hợp với tằm nhỏ là 0,02m/s, với tằm lớn là 0,1-0,3m/s [12].
 Ánh sáng
Mức độ ảnh hưởng của ánh sáng đối với tằm không sâu sắc như nhiệt độ và
ẩm độ. Nhìn chung tằm không thích ánh sáng mạnh và cũng không thích che tối
hoàn toàn. Tằm nhỏ thích ánh sáng hơn tằm lớn [12].
1.2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa kinh tế của tằm dâu
1.2.1. Ý nghĩa khoa học
Tằm dâu là loài côn trùng có mức độ đa dạng di truyền cao, kích thước lớn,
dễ nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm. Từ lâu, tằm đã là một mô hình sinh học
trong nghiên cứu của Lepidopteran và Arthropod. Chu trình sống của tằm tiêu biểu
cho dạng biến thái hoàn toàn với 4 giai đoạn phân biệt. Vòng đời của tằm dâu ngắn,
mỗi giai đoạn đều có các tính trạng đặc trưng riêng, trong số đó nhiều tính trạng dễ
bị đột biến trong điều kiện tự nhiên hoặc xử lý hóa chất [53]. Vì vậy hiện nay tằm
dâu đang trở thành một đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu sinh học phân tử
[44].
1.2.2. Ý nghĩa kinh tế
Ở các nước đang phát triển, như Việt Nam, dâu tằm là một nghề rất quan

trọng, nhất là ở các vùng nông thôn. Trồng dâu nuôi tằm đem lại hiệu quả kinh
tế cao hơn nhiều so với các cây trồng khác vì sản phẩm dâu tằm có giá trị cao, vòng
quay lứa tằm ngắn chỉ có khoảng 20 ngày. Đồng thời, cây dâu có thể trồng được ở
những vùng có điều kiện đất đai xấu và khí hậu khắc nghiệt mà vẫn sinh trưởng
phát triển tốt, cho sản lượng lá dâu cao và thu nhập từ cây dâu để nuôi tằm đem lại
thường cao hơn các cây trồng khác. Ở vùng nhiệt đới, trồng dâu nuôi tằm không chỉ


Lu
Nguyn Th Lan 22

tạo ra thu nhập quanh năm mà nó còn giải quyết nhiều lao động nhàn dỗi tại nông
thôn. Mặt khác, trồng cây dâu còn làm tăng độ che phủ xanh trên các bãi đất trống
(đất hoang), tham gia vào điều hòa tiểu khí hậu môi trường vùng đó [21].
Hiện nay, trong nền sản xuất hàng hoá đang phát triển ở nước ta, trồng dâu
nuôi tằm không tồn tại độc lập mà liên kết với rất nhiều ngành kinh tế khác: Nông
nghiệp, công nghiệp, thương mại …đã đem lại nguồn thu ngân sách nhà nước lớn.
Sợi tơ tằm được tôn vinh là "Nữ hoàng" của ngành dệt may. Mặc dù, sản
lượng sợi tơ sản xuất ra thấp hơn nhiều so với các loại sợi khác như: bông, đay, gai,
sợi tổng hợp nhưng vẫn chiếm vị trí quan trọng trong ngành dệt. Lụa tơ tằm được
nhiều người ưa chuộng. Sợi tơ tằm có những đặc tính nổi trội: độ bóng, độ bền, độ
đàn hồi cao, quần áo chất liệu lụa tơ tằm vừa nhẹ lại vừa bền đẹp, mặc mùa đông thì
ấm áp, mặc mùa hè thì mát mẻ, thoải mái [20]. Ngoài ra, sợi tơ tằm ngày càng
khẳng định được vị thế của mình trên thị trường khi những ứng dụng của nó được
mở rộng trên nhiều lĩnh vực như làm chỉ dù, đồ trang sức.
Nhộng tằm chứa nhiều loại axit amin, trong đó có nhiều loại axit amin không
thay thế như valine, methionine, phenylalanine [20]. Nhộng tằm là một món ăn
ngon, giàu chất đạm, giá trị dinh dưng gấp 2 lần thịt, 4 lần so với trứng, 10 lần so
với sữa…do vậy giúp bồi bổ cơ thể. Trong ngài tằm đực có chứa hoocmon sinh dục
nam là methyltestosteron và có tác dụng ích tinh, bổ thận tráng dương nên là món

ăn tốt cho đàn ông. Bên cạnh đó từ dầu nhộng tách được một loạt các axit amin, có
thể dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm và y dược [20].
Phân tằm khô dùng để làm thuốc, còn gọi là Tám mễ, Vân tàm sa, đông y gọi
là Tàm sa, tên khoa học là Faeces Bombycum hoặc Exerementum Bombycis. Là vị
thuốc được ghi đầu tiên trong sách "Danh y biệt lục". Đông y cho rằng tàm sa có vị
ngọt, cay, tính ôn, không độc, quy vào các kinh can, tỳ, vị và có tác dụng khứ phong
táo thấp, chủ trị chứng phong thấp, thấp chẩn, ngứa, trị thổ tả. Trong dân gian
thường dùng tàm sa làm vị thuốc để chữa trị phong thấp, hóa huyết ứ, chữa đau mắt
đỏ, chân tay tê dại [45].


Lu
Nguyn Th Lan 23

1.3. Phƣơng pháp truyền thống đánh giá sức sống, năng suất chất lƣợng tơ kén
của giống tằm
Bằng phương pháp truyền thống, để đánh giá sức sống, năng suất chất lượng
tơ kén của giống tằm, thường người ta phải nuôi tằm từ 3 đến 5 lứa, theo dõi các chỉ
tiêu ở mỗi lứa bằng cân, đo, đếm. Đồng thời theo dõi, thu thập số liệu ở các lứa về
các chỉ tiêu như năng suất nuôi từng vụ, sức sống, đặc tính sinh trưởng, phát triển
và chất lượng tơ kén. Về sức sống của tằm nhộng, người ta phải đếm số tằm nuôi ở
đầu tuổi 4 và số kén có nhộng sống tương ứng. Về năng suất kén được điều tra bằng
cách cân trọng lượng kén trên ổ hoặc trên vòng trứng. Về chất lượng tơ được xác
định bằng cách đo chiều dài sợi tơ, độ mảnh tơ đơn, hệ số tiêu hao và tính tỷ lệ vỏ
kén bằng cách cân trọng lượng toàn kén của 20 kén đực, 20 kén cái đồng thời cân
trọng lượng vỏ của các kén trên [16]. Theo cách này tốn rất nhiều thời gian và kinh
phí, vì vậy tìm kiếm các chỉ thị phân tử để đánh giá nhanh các chỉ tiêu trên là vấn đề
rất được quan tâm.
1.4. Một số kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa hình
Đa hình phân tử là sự khác biệt về mặt di truyền ở cấp độ phân tử giữa các cá

thể trong quần thể. Nghiên cứu đa hình phân tử dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử
(CTPT), so với các quan sát, nghiên cứu truyền thống - chủ yếu là các chỉ tiêu về
hình thái và một số chỉ tiêu sinh hoá, các CTPT có một số ưu điểm vượt trội:
- CTPT phản ánh mức độ biến động rất cao trong phân tử DNA, chính vì thế
nghiên cứu đa hình phân tử không cần phải gây đột biến.
- CTPT phản ánh trực tiếp kiểu gen, nó không phụ thuộc vào yếu tố môi
trường, mô và giai đoạn phát triển. Do vậy, các kỹ thuật phân tử chỉ cần lượng nhỏ
của bất kỳ loại mô nào, bất kỳ trạng thái, giai đoạn phát triển nào miễn là từ đó có
thể tách được một lượng nhỏ DNA đủ cho phân tích [1], [9].
Dưới đây là một số kỹ thuật phân tử thường được sử dụng trong nghiên cứu
đa hình:


Lu
Nguyn Th Lan 24

1.4.1. Kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục
được hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất enzyme tổng hợp
DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus, cùng với đó là sự thiết kế thành
công các máy chu kỳ nhiệt cho phép nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng
giai đoạn phản ứng. Cho đến nay kỹ thuật PCR được xem như là một trong những
phương pháp nền quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại [13].
 Các thành phần của phản ứng PCR bao gồm [13]:
- Enzyme chịu nhiệt, thường sử dụng là DNA Taq polymerase. Enzyme này có
hoạt tính tối đa ở 72
0
C và bền được với nhiệt độ.
- 4 loại dNTP là: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP).

- DNA chứa các đoạn DNA mục tiêu sẽ được nhân bản trong ống phản ứng.
- Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều
dài khoảng 20 – 30 nucleotide và có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự
của 2 đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản.
- Ion Mg
++
trong muối MgCl
2,
, đệm buffer… ở nồng độ thích hợp.
 Nguyên tắc của PCR: Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ PCR sẽ bao gồm 3
giai đoạn nhiệt độ chính [13], [26]:
- Đầu tiên, nhiệt độ được đưa lên 94
0
C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của
mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị tách (biến tính) thành các mạch
đơn. Giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính.
- Tiếp theo, nhiệt độ sẽ được hạ đến 45
0
C – 65
0
C là nhiệt độ thích hợp để các
đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt
độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp.


Lu
Nguyn Th Lan 25

- Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72
0

C là nhiệt độ cho hoạt tính của enzyme
DNA Taq polymerase nhằm kéo dài các dNTP về phía đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt
cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt đầu cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai
bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA
đích đã nhân bản thành 2
30
đến 2
40
bản sao.
 Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp PCR
- Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, sau 3 giờ có thể khuếch đại được một
trình tự đoạn gen đang quan tâm, thực hiện đơn giản và ít tốn kém, độ tinh sạch của
mẫu không cần cao,…
- Nhược điểm: Phải có mồi đặc hiệu cho đoạn DNA cần khuếch đại, xuất
hiện các băng phụ làm kết quả thiếu chính xác…
 Ứng dụng của kỹ thuật PCR
PCR có phạm vi ứng dụng rất rộng trong công nghệ sinh học hiện đại [13]:
- Trong nghiên cứu genome: Nhân bản phân tử bằng PCR, PCR tái tổ hợp,
kỹ thuật fingerprinting DNase I, multiplex PCR…
- Trong y học: Phát hiện tế bào T/virus gây ung thư máu, phát hiện virus
viêm gan B, phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết, phát hiện vi khuẩn
lao
1.4.2. Kỹ thuật RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) – Là phương pháp phân
tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm
1990 (Welsh và McClelland; William và cs). Phương pháp RAPD thực chất là quá
trình nhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi thiết kế ngẫu
nhiên (khoảng 10 nucleotide). Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên với
DNA khuôn ở vị trí bất kỳ nào mà tại đó có trình tự bổ sung với nó [17]. Các sản

phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di trên gel. Hệ gen của hai loài khác