phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp hplc

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






Nguyễn Thị Như Hoa








PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH
HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC









LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Như Hoa





Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp
HPLC

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60 44 29



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Văn Ri








Hà Nội – Năm 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10
1.1 Giới thiệu về kháng sinh
β
-lactam 10

1.1.1 Lịch sử ra đời 10
1.1.2 Phân loại 10
1.1.3 Đánh giá tác dụng 10
1.2 Kháng sinh β-lactam 11
1.2.1 Định nghĩa 11
1.2.2 Cấu trúc và phân loại 11
1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học 15
1.2.4. Tác dụng 15
1.2.5. Điều chế 16
1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 17
1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 19
1.3.1. Phương pháp quang học 19
1.3.2. Phương pháp điện hóa 20
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 20
1.3.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC) 22
1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) 22
CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 25
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 25
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 25
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26
2.2.1. Thiết bị 26
2.2.2. Dụng cụ 26
2.2.3. Hóa chất 26
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS 28
3.1.1. Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ 28
3.1.2. Ch
ọn pha tĩnh 30
3.1.3. Chọn pha động 30

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 32
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính 32
3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 37
3.3. Phân tích mẫu thực tế 38
3.3.1. Phân tích mẫu nước tiểu 38
3.3.2. Phân tích mẫu dược phẩm 49
3.4. Hướng phát triển của đề tài 58
KẾT LUẬN 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin
Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ
Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá và các ion con của beta-lactam
Bảng 3.4 Chương trình chạy gradien tối ưu rửa giải các chất beta-lactam
Bảng 3.5 Thời gian lưu t
r
của các kháng sinh nhóm beta-lactam
Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các beta-lactam
Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các beta-lactam
Bảng 3.8
Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 1
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2
Bảng 3.10

Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu
thêm chuẩn ở nồng độ 5 ppb
Bảng 3.11
Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu
thêm chuẩn ở nồng độ 100 ppb
Bảng 3.12
Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu
thêm chuẩn ở nồng độ 200 ppb
Bảng 3.13 Kết quả thực hiện trên mẫu nước tiểu thực
Bảng 3.14 Thông tin mẫu thuốc phân tích
Bảng 3.15 Bảng tính khối lượng trung bình viên của các mẫu thuốc
Bảng 3.16 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc
Bảng 3.17 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn
ở nồng độ 5ppb
Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn
ở nồng độ 100ppb
Bảng 3.19 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn
ở nồng độ 200ppb
Bảng 3.20 Kết quả phân tích mẫu thuốc thực


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp beta-lactam 100ppb
Hình 3.2 Đường chuẩn AMP
Hình 3.3 Đường chuẩn PEN G
Hình 3.4 Đường chuẩn PEN V
Hình 3.5 Đường chuẩn OXA

Hình 3.6 Đường chuẩn CLOX
Hình 3.7 Đường chuẩn CEP
Hình 3.8 Đường chuẩn CEF
Hình 3.9 Đường chuẩn AMO
Hình 3.10 Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 6h
Hình 3.11 Sắc đồ phân tích mẫu thuốc












DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrile
AMO Amoxicillin
AMP Ampicillin
APCI Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển
CAD Áp suất khí mang trong tứ cực Q
2

CE Thế áp vào tứ cực Q1
CEF Cefaclor
CEP Cephalexin

CLOX Cloxacillin
CUR Khí mang
CXP Thế áp vào giữa tứ cực Q2 và Q3
DP Thế đầu vào áp vào màn chắn
EP Thế áp vào nguồn ion mẹ
ESI Ion hóa phun điện tử
GC – MS: Sắc kí khí khối phổ
GS1 Áp suất khí hai bên đầu phun
GS2 Áp suất của luồng khí nóng
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao
IS Thế ion hóa
LC-MS Sắc kí lỏng khối phổ
LOD Giới hạn phát hiện
LOQ Giới hạn định lượng
MeOH Methanol
OXA Oxacillin
PEN G Penicillin G
PEN V Penicillin V
R% Độ thu hồi
RSD% Độ lệch chuẩn tương đối
SPE Chiết pha rắn
TLC Sắc kí bản mỏng
t
r
Thời gian lưu

MỞ ĐẦU

Các kháng sinh là một trong những nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện
đại. Nhờ thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy

hiểm như dịch hạch, tả, cúm, và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các
loại virus, vi khuẩn. Đối với các nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất
quan trọng vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên
thường xảy ra các dịch bệnh. Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000
kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện. Kể
từ khi penicillin được ALEXANDER FLEMING phát hiện năm 1929 và được
chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 thì trong hơn nửa thế kỷ qua kháng
sinh đã trở thành dược phẩm không thể thiếu được trong việc điều trị
các loại bệnh
do virus, vi khuẩn gây ra và nó có tác dụng hơn hẳn so với các thuốc kháng khuẩn
khác [1, 13].
β -Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người,
thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng
sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không
đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn.
Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do virus không chữa
được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn
đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh
trong máu gây các bệnh về thận, đặc biệt là người cao tuổi. Vì vậy, kiểm soát và
phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao
hiệu quả sử dụng chúng.
Hai phương pháp thường dùng để phân tích các
β
-lactam là sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) và phương pháp điện di mao quản (CE). Phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân
tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector hiện đại như huỳnh quang, MS

trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu

điểm nổi bật của nó về độ nhạy và độ chọn lọc ngày càng được áp dụng nhiều trong
các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Xuất phát từ những lý do đó nên tôi
đã chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh
học bằng phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS.























CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về kháng sinh
β

-lactam [1, 2, 11]
1.1.1 Lịch sử ra đời
Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm
Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là
hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác
dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác.
Giới y học định nghĩa : Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học,
có tác dụ
ng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được
sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên.
1.1.2 Phân loại
Kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các nhóm sau:
- Kháng sinh β-lactam
- Kháng sinh Aminoglycosid
- Kháng sinh Tetracylin
- Cloramphenicol và dẫn xuất
- Kháng sinh Macrolid
- Kháng sinh Lincosamid
- Kháng sinh polypeptide
- Các kháng sinh khác: Rifamycin
1.1.3 Đánh giá tác dụ
ng
- Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh thiên
nhiên, không nguyên chất.
- Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm
kháng sinh bán tổng hợp.

1.2 Kháng sinh β-lactam
1.2.1 Định nghĩa
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin,

cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn
nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic
(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.
1.2.2 Cấu trúc và phân loại
* Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng
thiazolidin, vòng β-Lactam
N
S
CH
3
CH
3
N
H
O
CO
R
COOM
2
3
4
1
56
7

Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R
3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,
5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau.
Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau.







Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Tên kháng sinh R Hoạt tính
Nhóm penicillin
tự nhiên
PenicillinG
(PENG)
Benzathin
CH
2
-
Benzyl
Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn
chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+).
Không kháng β-lactamase
Oxacillin
(OXA)
N

C
-
O
CH
3
6-[(5-methyl-3-
p
heny
l
-1,2-oxazole-4-
carbonyl)amino]
Nhóm penicillin kháng penicilliiase
Cloxacillin
(CLO)
Cl
N
O
C-
CH
3
6-{[3-(2-
chlorophenyl )-5-methyl
-
oxazole-4-carbonyl]amino}
Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ
hẹ
p
như nhóm I. Kháng penicilliiase
,
không tác động vào vòng β –

Lactam được.
Ampicillin
(AMP)
CH-
NH
2
6-([(2R)-2-amino-
2-phenylacetyl]amino)
Nhóm penicillin phổ rộng
Amoxicillin
(AMO)
CH-
NH2
HO
6-{[(2R)-2-amin
o
2-(4-hydroxyphenyl)-
acetyl]amino}
Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram
(+) và (-). Không kháng β-lactamase
và penicilliiase


* Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với
1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R
N
H
O
CO

R1
N
S
R3
R2
COOM
1
2
3
4
5
6
7
8

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-
thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên
gram âm yếu hơn thế hệ sau.

Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin

Kháng sinh R1 R2 R3
Cephalexin
(CEP)
CH-

NH
2

H -CH
3
Cephapirin
SCH
2
-

H -CH
2
-OCOCH
3

I: Tác dụng
mạnh nhất
trên vi khuẩn
gram (+), yếu
nhất trên
gram (-).
Không bền và
dễ bị β-
lactamase phá
hủy
Cephazolin
N
NN
N
CH

2
-

H
NN
CH
3
S-CH
2

Cefaclor
(CEF)
CH-
NH
2

H Cl
II: tác dụng
yếu hơn trên
vi khuẩn
gram (+),
mạnh hơn trên
gram (-) so
với thế hệ I.
Bền với β-
lactamase.
Cefprozil
CH-
NH
2

OH

H -CH=CH-CH
3
Cefixim
S
N
N
NH
2
HOOCCH
2
O

H -CH=CH
2
III: tác dụng
yếu hơn trên
vi khuẩn
gram (+) so
với thế hệ I,
tác dụng
mạnh trên
gram (-). Bền
với β-
lactamase
Ceftazidim
S
N
N

NH
2
HOOCC(CH
3
)
2
O

H
N
+
-CH
2

IV: hoạt phổ
tác dụng như
thế hệ III
nhưng tốt hơn
và kháng
nhiều β-
lactamase hơn
Cefepim
S
N
N
NH
2
CH
3
O

H
N
+
CH
3
-H
2
C






1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học [1]
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu
cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng
thời nhóm –COOH và –NH
2
.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ
thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp
thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pK
a
= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc
phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.

Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
Tên kháng sinh pK
a1
Tên kháng sinh pK
a1

AMP 2,70 PEN G 2,74
AMO 2,80 CLO 2,70
CEP 2,60 OXA 2,72
CEF 2,75
1.2.4. Tác dụng[2, 12]
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị
ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa
enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi
khuẩn bị tiêu diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu
kìm hãm sự tồn tại và phát triển củ
a vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ
rộng.
Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,
theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các
cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi
là kháng methicillin).
Độc tính:
Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị
ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc

phản vệ
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Ch
ống chỉ
định dị ứng với thành phần của thuốc.
Đánh giá tác dụng kháng sinh:
Theo đơn vị tác dụng: 1 IU là tác dụng của 0,6
μ
g penicillin G natri tinh
khiết trên một chủng mẫu tụ cầu. Hoạt lục của 1mg chất này là 1667 IU.
1 IU sẽ ứng với 0.672
μ
g penicillin G kali tinh khiết, với 1mg chất này ứng
với 1585 IU.
1.2.5. Điều chế [ 1]
Sinh tổng hợp:
Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc
Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất dạng
kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho độ thu hồi cao thường gây đột biến bằng
mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muố
n, đồng thời
thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình
sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid
phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình
nên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid →
polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men.

Bán tổng hợp:
Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic
(A6AP).
Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi dào

A6AP, chiết lấy trực tiếp.
Tách phần phenylacetyl ( C
6
H
5
-CH
2
-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng
acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi
trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thụ HCl giải phóng ra trong phản ứng
được penicillin khác.
Tổng hợp hoá học:
Chưa được ứng dụng rộng rãi.
1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Như đã trình bày ở trên ta thấy có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng
các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng
với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi
(virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng
sinh thích hợp. Việc lạm dụng thuốc kháng sinh hiện nay xảy ra phổ biến do cả
bệnh nhân và thầy thuốc cùng tham gia thực hiện để gây nên hiện tượng kháng
thuốc sớm. Điều này đã mang lại những hậu quả xấu, làm cho việc đáp ứng điều trị
kém hiệu quả, người bệnh không được chữa khỏi hoặc để bệnh kéo dài, ảnh hưởng
đến sức khỏe kể cả tính mạng của bệnh nhân. Bệnh nhân, người nhà bệnh nhân và
nhiều người khác trong cộng đồng người dân thường quan niệm rằng thuốc kháng
sinh có thể chữa được mọi thứ bệnh tật. Mỗi khi bị cảm cúm, đau đầu, sổ mũi ,sốt,
ho, viêm họng thông thường…đều đã dùng kháng sinh ngay để chữa trị. Mặc dù
kháng sinh đã được Bộ Y tế quy định là loại thuốc cần phải có đơn kê của thầy
thuốc, không ở trong các nhóm thuốc được bán không cần kê đơn (OTC) nhưng trên
thực tế hiện nay việc mua bán kháng sinh rất dễ dàng.[14]
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu

người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết. Theo R. Gonzales

[4,31], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong
khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không
điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở
nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin.
Theo báo cáo của A.W. McCormick [16] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng
penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus
sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ
thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao. Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một
địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến
khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [21] mỗi năm ở Hoa kỳ có
2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi
trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5
đến 10 tỉ đô-la.
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [7], năm 1997
tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh
nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).
Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch
Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít
trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử
vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết
tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi
Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%
tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng
hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng
huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi
khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của
Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%
Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng

kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các

nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý”
(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm
chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát
triển.
Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm
Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng
cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và
chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.
Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các
thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đ
ang phát triển là thuốc giả mạo,
không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ
bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế
được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.
1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam
1.3.1. Phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương
pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-
lactam, đặc biệt trong dược phẩm.
Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng
tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều
trườ
ng hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy

khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các
β-lactam.
A. Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu
2+
thủy phân và tạo phức với
AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu

được 4.10
-7
M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho
hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,
huyết thanh…
Theo [23], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống
bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của
kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl
2
, KCl 2M. Kết quả tạo ra
phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và
giới hạn phát hiện của AMO là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l
Wei Liu và cộng sự [33], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol-K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích
một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao:
PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết
quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP
trong mẫu là 0.1 mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các

phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chấ
t kháng sinh và
trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc
xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy
phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.3.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng
không phổ biến nhiều. Theo [19], Daniela P. Santos và c
ộng sự sử dụng sensor điện
thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm
axetat 0.1M pH=5.2
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng
dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượ
ng mẫu khác
nhau.

L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [27] sử dụng phương pháp điện di
mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện
di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di
10 kV, nhiệt độ 20
0
C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng
sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích
trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27
mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến
4.15%. Độ thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [18] đã sử dụng phương pháp điện di với detector
điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với gi

ới hạn phát hiện thấp
0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ
lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [17] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh
họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8.
Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện
14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,
cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,
ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới
h
ạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục
đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ
Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -18
0
C). Kết quả cho
thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi
pha loãng.
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [29] sử dụng phương pháp CZE và detector UV
– DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ
thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP,
AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông,

nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l
cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.
1.3.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm
tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng
một lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang b
ị phần phát hiện là một máy

đo quang có thể phân tích định tính và định lượng. Tuy nhiên phương pháp này chỉ
dùng để định tính.
1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất
thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các
chất.
Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh
β
-lactam bằng phương pháp HPLC
Theo [34], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích
penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện
chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2

(4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –
(C
2
H
5
)
3
N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong
sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-
lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C
18
(2.1
mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C =
Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút

A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột
45
0
C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin
có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l
với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý.

Tác giả Titus A.M. Msagati và cộng sự [32] đã sử dụng sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS/MS) xác định hàm lượng các Penicillin trong mô gan, thận và sữa. Các
giới hạn phát hiện (LOD) thu được được là 1 ng/kg đối với penicillin G, penicillin
V trong mô gan, thận và 0,7 µg/L trong sữa. Đối với ampicillin, giới hạn phát hiện
(LOD) là 1,4 µg/kg trong mô gan, thận và 1,7 µg/L trong sữa.
Theo [35], David N.Heller và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký
lỏng khối phổ (LC/MS/MS) để nghiên cứu phương pháp xác định nồng độ các
penicillin trong huyết tương bò, thận và nước tiểu. Phát hiện dựa trên sắc ký lỏng
hai lần khối phổ (LC/MS/MS). Phenethecillin được sử dụng làm chất nội chuẩn.
Mẫu huyết tương được chiết với Acetonitril là phương pháp có giới hạn định lượng
12 ng/ml. Mẫu thận được đồng nhất trong nước và Acetonitril sau đó được làm sạch
trên cột chiết pha rắn C18. Giới hạn định lượng của phương pháp này là 10 ng/ml.
Nước tiể
u được pha loãng, lọc và phân tích trực tiếp. Giới hạn định lượng của
phương pháp phân tích này là 63 ng/ml. Độ chính xác cho mẫu huyết tương là
103% với hệ số biến thiên là 3 %, với mẫu thận là 96% và 11% tương ứng, mẫu
nước tiểu là 98 % và 4 % tương ứng. Những phương pháp này được áp dụng để
phân tích mẫu huyết tương , nước tiểu, thận, mẫu sinh tiết được lấy từ động vật đã
được
định lượng với penicillin.
Trong [25, 24], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2
(250mm*4,6mm, 5μm)’; pha động : ACN –Na
2

S
2
O
3
15,7mM trong đệm photphat
0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời
AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5
μ
g/kg.
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ
dẫn… để phân tích các β-lactam.
Trong [20], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,
OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt độ thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%. Còn trong
[34], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách penịillin V,
PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, độ thu hồi đạt 89-117%.

Khi tách và làm giàu các
β
-lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE
thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C
18
) và trao đổi ion
dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ.
K. Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C
18
và dung môi rửa
giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt độ thu hồi
83-89%. Còn trong [26] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu
AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt độ thu hồi
77,1-95,9%.

Trong [22] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách
AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước
thải cho độ thu hồi 76-100%.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như
thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đố
i với các phương pháp
đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu
và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu
cao trong việc phân tích
β
-lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao.

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề
cấp thiết đang được quan tâm. Trong đó chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu
thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như chúng tôi
đã đề cập trong bản luận v
ăn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng
sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là ampicillin
(AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) và Amoxicillin (AMO), benzylpenicillin
sodium (PEN G), Penicillin V Kali ( PEN V), Oxacillin (OXA), Cloxacillin
(CLOX) là các kháng sinh β-Lactam được sử dụng phổ biến, rộng rãi hiện nay.
Mục tiêu của đề tài là xây dựng và phát triển phương pháp xác định đồng thời
các kháng sinh nhóm β-Lactam trong thuốc và trong nước tiểu bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector khối phổ ( LC-MS/MS).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Tập trung nghiên cứu các vấn đề sau:
1. Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
đảo sử dụng detector khối phổ
- Điều kiện vận hành máy LC-MS/MS
- Chọn pha tĩnh
- Tối ưu hoá pha động: Thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,…
2. Điề
u kiện định lượng
- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ)
- Độ đúng và độ lặp lại của phép đo

3. Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp
- Phân tích mẫu thuốc
- Phân tích mẫu nước tiểu
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
2.2.1. Thiết bị
• Hệ thống sắc ký lỏng HPLC của Shimazu (Nhật Bản) gồm: Bộ phận bơm
dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt, cột sắc ký C
18
của Dionex
(150mm × 2,1mm × 3μm) ghép nối với detector khối phổ MS/MS Triple
Quad 5500 của AB Sciex (Hoa Kì).
• Cân phân tích (độ đọc 0,1mg, 0,01mg).
• Cân kĩ thuật (độ đọc 0,01g).
2.2.2. Dụng cụ
• Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml.
• Bình định mức: 10, 50, 100, 200, 1000 ml.

• Ống li tâm 50ml, 10 ml.
• Vial loại 1,8ml.
• Ống đong, phễu, giấy lọc.
• Pipetman loại 200µl, 1000µl và đầu côn.
• Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45µm, bể siêu âm, tủ lạnh, tủ sấy, và
các dụ
ng cụ thí nghiệm thông dụng khác.
2.2.3. Hóa chất
- Chất chuẩn β – lactam gồm các chất chuẩn: AMP,OXA, CEP, CEF, AMO, PEN
V, PEN G, CLOX do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48A Hai Bà Trưng – Hà Nội) sản
xuất và cung cấp.
- MeOH, ACN tinh khiết cho chạy HPLC Merck (Đức). Các hoá chất khác: Axit
acetic, nước cất hai lần.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 0,01g các chất chuẩn trên cân phân
tích (độ đọc 0,01mg) của từng β – lactam, hoà tan cho vào từng bình định mức 50