phân tích đồng thời các dạng dimethyldiselenite, selenomethioline, selenit and selenat trong mẫu thủy hải sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Hoàng Thị Dung


PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC DẠNG DIMETHYLDISELENITE,
SELENOMETHIOLINE, SELENIT AND SELENAT
TRONG MẪU THỦY- HẢI SẢN




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC









Hà Nội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Hoàng Thị Dung


PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC DẠNG DIMETHYLDISELENITE,
SELENOMETHIOLINE, SELENIT AND SELENAT
TRONG MẪU THỦY- HẢI SẢN



Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Tạ Thị Thảo




Hà Nội - 2013

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo
đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS. Phạm Hồng Chuyên đã tận tình giúp
đỡ, động viên, chỉ bảo, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong
thời gian tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân tích-
ĐHKHTN ĐHQG Hà Nội đã dạy dỗ, trang bị kiến thức, trong quá trình học tập
và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn gia đình và các bạn học viên, sinh viên
bộ môn Hóa Phân tích đã giúp tôi trong thời gian làm luận văn.
Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2013
Học viên



Hoàng Thị Dung







MỤC LỤC

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Trạng thái tự nhiên và tính chất phân tích của selen 2
1.1.1. Các dạng tồn tại của selen và sự chuyển hóa của Selen trong môi trƣờng
và thực phẩm 2
1.1.2. Tác động của selen đối với sức khỏe con ngƣời 5
1.2. Xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp phổ nguyên tử 6
1.3. Các phƣơng pháp phân tích dạng 11
1.3.1. Phƣơng pháp phân tích trắc quang 11
1.3.2. Nhóm phƣơng pháp phân tích điện hóa. 12
1.3.3. Các phƣơng pháp ghép nối 13
1.3.4. Phƣơng pháp phân tích kết hợp với sử dụng chemometric 15
1.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu phân tích có chứa selen 23
1.4.1. Xử lý mẫu phân tích dạng 23
1.4.2. Bảo quản mẫu để phân tích dạng selen 26
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 27
2.1. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu 27
2.1.2. Nguyên tắc phƣơng pháp xác định dạng Selen bằng HVG-AAS 27
2.1.3. Nội dung nghiên cứu 28
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 28
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 28
2.2.2. Hoá chất 29

2.2.3. Các phần mềm tính toán và xử lí số liệu phân tích 30
2.3. Tiến hành thí nghiệm 30
2.3.1. Quy trình phân tích 30
2.3.2. Thuật toán và câu lệnh tính toán phƣơng trình hồi quy đa biến 32

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Chuẩn hóa lại các điều kiện xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng
pháp HVG-AAS 36
3.1.1. Điều kiện đo phổ AAS xác định Se(IV) 36
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất khử đối với quá trình khử các dạng
selen thành selennua 37
3.1.3. Hiệu suất khử các dạng selen phụ thuộc vào môi trƣờng 38
3.2. Chuẩn hóa lại mô hình hồi quy đa biến 38
3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn đa biến 38
3.2.2. Đánh giá tính phù hợp của phƣơng trình hồi qui thông qua mẫu tự tạo 40
3.2.3. Xác định nồng độ các dạng selen trong mẫu tự tạo theo mô hình PCR. 40
3.3. Nghiên cứu sự chuyển dạng và mất chất phân tích khi bảo quản mẫu 41
3.3.1. Ảnh hƣởng của pH và vật liệu bình chứa 41
3.3.2. Ảnh hƣởng của oxi 44
3.3.3. Ảnh hƣởng của ion Fe
3+
và cách loại trừ 47
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng các yếu tố đi kèm trong nền mẫu thực phẩm 50
3.4.1. Ảnh hƣởng của chất béo stearin và cách loại trừ. 50
3.4.2. Ảnh hƣởng của protein abumin đến tín hiệu đo 52
3.4.3. Loại trừ ảnh hƣởng chất béo bằng cột SPE 54
3.5. Phân tích mẫu thực tế 59
3.5.1. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết 59
3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng thời gian rung siêu âm 60
3.5.3. Ảnh hƣởng của số lần chiết lặp 61
3.5.4. Hiệu suất thu hồi 61
3.5.5. Lấy mẫu thủy-hải sản và xử lí sơ bộ mẫu 62

3.5.6. Phân tích mẫu thực 63
KẾT LUẬN 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Một số dạng tồn tại của selen đã đƣợc tìm thấy 2
Bảng 3.1: Tóm tắt các điều kiện tối ƣu xác định Se(IV) bằng phƣơng pháp HVG-
AAS 36
Bảng 3.2: Hiệu suất khử các dạng Se bằng NaBH
4
trong môi trƣờng HCl 6M 37
Bảng 3.3: Hiệu suất khử(%) các dạng Se bằng NaBH
4
trong các môi trƣờng phản
ứng 38
Bảng 3.4: Ma trận nồng độ 40 dung dịch chuẩn 39
Bảng 3.5: Hệ số của các PC tính theo hàm SVD 39
Bảng 3.6: Ma trận nồng độ các mẫu kiểm chứng phƣơng pháp 40
Bảng 3.7: Kết quả tính nồng độ các chất trong mẫu tƣ tạo theo phƣơng pháp PCR
41
Bảng 3.8: Sự ảnh hƣởng của pH đến sự chuyển dạng của Selen 42
Bảng 3.9: Sự hấp thụ các dạng Se của vật liệu teflon 44
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của oxi có trong dung dịch đến sự chuyển dạng Se 45
Bảng 3.11: Sự chuyển dạng Se khi không có oxi 46
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của ion Fe
3+
đến quá trình chuyển dạng Se 48
Bảng 3.13: Khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe
3+
bằng EDTA 49
Bảng 3.15: Kết quả xác định hàm lƣợng và hiệu suất thu hồi các dạng Se khi có mặt

protein 52
Bảng 3.16: Nồng độ các dạng Selen khi đi qua cột chiết pha rắn C
18
54
Bảng 3.17: Ảnh hƣởng của tốc độ nạp mẫu tới quá trình phân tích dạng Selen 55
Bảng 3.18: Ảnh hƣởng của tốc độ dung môi rửa giải đến quá trình phân tích dạng
Selen 56
Bảng 3.19: Ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi rửa giải trong quá trình phân tích dạng Selen
58
Bảng 3.20: Hiệu suất thu hồi của dung môi chiết (methanol:H
2
O 9:1) 62
Bảng 3.21: Kết quả phân tích mẫu thực 64
Bảng 3.22: Hàm lƣợng tổng 4 dạng Se và Selen tổng ở khu vực Pháp Vân- Thanh
Trì- Hà Nội 64

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Các dạng tồn tại của selen trong môi trƣờng nƣớc theo pH 4
Hình 1.2: Sơ đồ các bƣớc tiến hành của phƣơng pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) . 17
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hƣởng của pH tới quá trình chuyển dạng của
Selen 43
Hình 3.2: Sự chuyển dạng Se khi có mặt của oxi 45
Hình 3.3: Sự chuyển dạng Se khi không có oxi 46
Hình 3.4: Sự chuyển hóa các dạng Se khi có mặt ion Fe
3+
48
Hình 3.5: Đánh giá khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe
3+
bởi EDTA 50

Hình 3.6: Hiệu suất thu hồi các dạng Se và tổng dạng Se khi có mặt Stearin 52
Hình 3.7: Hiệu suất thu hồi các dạng Se trong dung dịch có chứa protein 53
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ nạp mẫu tới quá trình phân tích dạng
Selen 55
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ dung môi rửa giải đến quá trình phân
tích dạng selen 57
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi rửa giải đến quá trình phân
tích dạng selen 58
Hình 3.11: Ảnh hƣởng tỉ lệ Methanol/H
2
O đến khả năng chiết các dạng Se 59
Hình 3.12: Ảnh hƣởng của thời gian rung siêu âm đến khả năng chiết dạng selen 60
Hình 3.13: Ảnh hƣởng của số lần chiết lặp đến khả năng chiết dạng Selen 61
Hình 3.14: Khu vực Pháp Vân – Thanh Trì – Hà Nội (Nguồn Googlemap). 62


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ILS
:
Bình phƣơng tối thiểu nghịch đảo (inverse least squares)
PCR
:
Hồi qui cấu tử chính (Principal component regression)
PC
:
Cấu tử chính (Principal component)
HVG - AAS
:
Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hidrua

hoá
AES
:
Phƣơng pháp phổ phát xạ
HTNT
:
Hấp thụ nguyên tử
GF-AAS
:
Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa
HPLC
:
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
MS
:
Phƣơng pháp phổ khối lƣợng
CCS
:
Các cộng sự
1
MỞ ĐẦU

Selen là một nguyên tố vi dƣỡng rất thiết yếu đối với sức khỏe con ngƣời,
chúng thƣờng có trong các thực phẩm nhƣ ngũ cốc, tỏi, tôm, cá… selen bổ sung
dinh dƣỡng cho con ngƣời và có vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản, tham
gia quá trình trao đổi chất trong nội tiết tố, tổng hợp DNA. Ngoài ra, selen thể là
độc tố môi trƣờng, khoảng nồng độ Se đƣợc phép có mặt trong cơ thể ngƣời mà
không gây độc hại là rất hẹp và tùy thuộc vào dạng tồn tại của Se. Lƣợng Se nên
đƣa vào cơ thể ngƣời hàng ngày khoảng 50-200µg/ngày [65].Trong cơ thể ngƣời,
Se có thể tham gia vào các quá trình sinh hóa, cần thiết cho chức năng tế bào, tạo

thành trung tâm hoạt hóa một số enzym [68]. Nếu sử dụng quá liều lƣợng giới
hạn, Se có thể gây độc cho ngƣời…
Selen tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau nhƣng chủ yếu là hai dạng
chính selen vô cơ (selenat, selenite…) và selen hữu cơ (selenocysteine,
selenomethionine…) [71], mỗi dạng hợp chất có vai trò riêng, thƣờng thì selen ở
dạng hữu cơ có ích hơn ở dạng vô cơ. Chính vì vậy, xác định hàm lƣợng các dạng
selen hữu cơ, vô cơ sẽ góp phần vào đánh giá chất lƣợng thực phẩm tốt hơn.
Hiện nay, số lƣợng công trình nghiên cứu xác định các dạng selen còn hạn
chế và chủ yếu tập trung ở các nghiên cứu trên hệ kết hợp sắc kí lỏng hiệu năng
cao (HPLC) kết nối với bộ phận phát hiện nhƣ AAS, AES, AFS, MS, Các hệ
đo này cho phép tách và định lƣợng đồng thời các dạng selen một cách hiệu quả
trên nhiều đối tƣợng, đặc biệt là đối tƣợng sinh học. Nhƣng chi phí cho quá trình
phân tích khá lớn do đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên không phải phòng thí
nghiệm nào cũng có thể trang bị đƣợc. Vấn đề đặt ra trong thực tế thí nghiệm
Việt Nam hiện nay là cần nghiên cứu một phƣơng pháp có thể sử dụng các thiết
bị phổ biến hơn, giá thành hợp lý mà vẫn đảm bảo độ chọn lọc, độ chính xác và
tin cậy cao để định dạng selen. Xuất phát từ những lý do đó, chúng tôi đã chọn đề
tài luận văn “Phân tích đồng thời các dạng Dimethyldiselenite, Selenomethioline,
Selenit and Selenat trong mẫu thủy- hải sản”.
2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Trạng thái tự nhiên và tính chất phân tích của selen
1.1.1. Các dạng tồn tại của selen và sự chuyển hóa của Selen trong môi trường và
thực phẩm
Selen ít phổ biến trong tự nhiên, có nguồn gốc từ việc phun núi lửa, có
trong sunphua kim loại nhƣ đồng, niken, sắt, chì và trong các khoáng vật hiếm
nhƣ Cu
2
Se, PbSe và As

2
Se. Selen là nguyên tố chiếm thứ 17 trên vỏ trái đất về
khối lƣợng. Hàm lƣợng của selen trên bề mặt trái đất là không đồng đều [1].
Sự có mặt của selen trong sinh học và môi trƣờng rất đa dạng. Ví dụ, selen
trong đất đá khoảng từ 0,1 ppm (các khu vực thiếu Se của New Zealand) đến
1200 ppm (một vùng ở Ireland). Khoảng nồng độ rộng cũng đƣợc tìm thấy trong
trong các loại nƣớc không chứa muối, chiếm từ khoảng 0,1 µg/l đến 9 mg/l [1].
Selen trong nƣớc biển khoảng 0,05-0,5 µg/l. Selen trong thực vật chiếm khoảng
0,1 mg/kg khô và trong động vật khoảng 0,1-vài mg/kg ƣớt [68].
Các dạng tồn tại chủ yếu của Selen đƣợc liệt kê trong bảng 1.1:
Bảng 1.1: Một số dạng tồn tại của selen đã đƣợc tìm thấy
Selenous acid, selenite
H
2
SeO
3
, SeO
3
2-

Selenic acid, selenate
H
2
SeO
4
,SeO
4
2-

Selenocyanate

SeCN
-
Methylseleninic acid anion
MeSe(O)O
-
Methylselenenic acid anion
MeSeO
-
Dimethylselenide
Me
2
Se
Dimethyldiselenide
Me
2
Se
2

Methylselenol
MeSeH
Trimethylselenonium cation
Me
3
Se
+

Selenocysteine
H
3
N

+
–CH(COO−)–CH
2
–SeH
Selenocystine
H
3
N
+
–CH(COO-)–CH
2
–Se–Se–
CH
2
CH(COO−)–NH
3
+

3
Selenomethionine
H
3
N
+
–CH(COO−)–CH
2
–CH
2
–Se–Me
Se-methylselenocysteine

H
3
N
+
–CH(COO−)–CH
2
–Se–Me
γ-glutamyl-Se-
methylselenocysteine
H
3
N
+
–CH(COO−)–CH
2
–CH
2
–CO–NH–
CH(COO−)CH
2
–SeMe
Selenocystathionine
H
3
H
+
–CH(COO−)–CH
2
–CH
2

–Se–CH
2
–
CH(COO−)–NH
3
+

Selenohomocysteine
H
3
N
+
–CH(COO−)–CH
2
–CH
2
–SeH
Se-adenosylselenohomocysteine
NH
2
CH(COOH)CH
2
CH
2

SeCH
2
C
4
H

5
O
3
C
5
H
4
–NH
2

Trong tự nhiên, selen tồn tại chủ yếu ở ba trạng thái ôxy hóa: Se
+4
, Se
+6
,
Se
-2
.Selen vô cơ tồn tại chủ yếu trong đất và nƣớc [1,15], tuy nhiên chúng cũng
đƣợc tìm thấy trong các cơ thể sống (động, thực vật và vi sinh vật) [68,15].
Mặt khác, các dạng selen hữu cơ nhƣ dimetyl selenua (CH
3
)
2
Se, dimetyl
diselenua (CH
3
)
2
Se
2

và dimetylselenon (CH
3
)
2
SeO
2
đƣợc tạo ra từ nƣớc thải, bùn,
đất đá và cũng đƣợc tìm thấy trong một số nƣớc tự nhiên và trong các cơ thể
sống.Trong cơ thể sống, selen chủ yếu tồn tại ở dạng aminoaxit, nhƣ selencytin,
selencystein, selenmethionin, selenglutathion, và các selen protein [68,63,47].
Trong đất, các dạng Se vô cơ chính đƣợc tìm thấy là Se(IV) và Se(VI),
Độc tính của selen trong đất phụ thuộc vào mức độ oxi hóa. Se(IV) bị hấp phụ
mạnh trên mặt đất, còn Se(VI) bị hấp phụ yếu, hoặc dễ dàng bị rửa trôi trên bề
mặt.
Selenmethionin có rất nhiều trong các loại cây trồng nhƣ ngũ cốc, đậu
nành….Mặc dù cây cối không hấp thụ selen nhƣng chúng tích trữ một lƣợng lớn
Selen từ đất. Ở vùng Brassica, thực vật có thể tích lũy 1000 mg Se/kg trong tế
bào của lá. Tại Nonaccumulators, các loại ngũ cốc, cỏ cây không tích lũy nhiều
hơn 50mg Se/kg [58]. Hàm lƣợng selen trong cỏ tƣơi thay đổi từ 1mg/ kg đến
4mg/kg. Cỏ ngừ từ 3mg/ kg đến 4mg/kg, cỏ nục 1,4 mg/kg, cỏ thu 1,2 mg/kg [2].
Các động vật không xƣơng sống dƣới nƣớc, động vật có vú, bò sát là
những động vật đầu tiên xác định đƣợc chứa các dạng Selen có trong tế bào [69].
4
Tiếp theo đó, đã phát hiện ra thủy-hải sản có chứa hàm lƣợng lớn selen [68,76]¸
các dạng selen đƣợc tìm thấy dƣới dạng selen vô cơ nhƣ selenit, selenat và selen
hữu cơ nhƣ selenmethionin, selencystein, selencystin, selenprotein, selenua,
selenomethionin, methylselenocystein, selenocystein [65,68,44,74,76]. Selen tập
trung nhiều nhất ở da và gan cá, đặc biệt là cá ngừ. Vì thế mỡ cá và dầu gan cá có
hàm lƣợng selen lớn. Các loài động vật khác có hàm lƣợng selen ít và không ổn
định. Hàm lƣợng selen trong một số loài cá lên đến 370 ppm [66].

Trong nƣớc, các dạng tồn tại của selen phụ thuộc vào pH biểu diễn tại
(hình 1.1), trong khoảng pH thấp từ 0- 3,8 thì tồn tại các dạng H
2
Se, H
2
SeO
3
0
,
HSeO
4
1-
; các dạng SeO
4
2-
, HSe
-
nằm trong vùng tuyến tính rất rộng pH từ 2,5- 14;
dạng HSeO
3
1-
tồn tại chủ yếu trong khoảng pH từ 2,5-7, nếu môi trƣờng có từ
trung tính đến bazơ thì selen tồn tại ở dạng SeO
3
2-
. Quan sát hình 1.1 ta thấy đƣợc
Selenate chiếm phần lớn trong môi trƣờng nƣớc tự nhiên

Hình 1.1: Các dạng tồn tại của selen trong môi trƣờng nƣớc theo pH
Căn cứ vào giản đồ, trong khoảng pH thấp từ 0- 3,8 thì tồn tại các dạng

H
2
Se, H
2
SeO
3
0
, HSeO
4
1-
; các dạng SeO
4
2-
, HSe
-
nằm trong vùng tuyến tính rất
rộng pH từ 2,5- 14; dạng HSeO
3
1-
tồn tại chủ yếu trong khoảng pH từ 2,5-7, nếu
môi trƣờng có từ trung tính đến bazơ thì selen tồn tại ở dạng SeO
3
2-
. Thấy đƣợc
5
rằng selenate chiếm phần lớn trong môi trƣờng nƣớc tự nhiên. Hàm lƣợng selen
cho phép trong nƣớc là 50 mg/ml [59].
1.1.2. Tác động của selen đối với sức khỏe con người
Ở ngƣời, selen là chất dinh dƣỡng vi lƣợng. Selen với chức năng tham gia
tạo các enzym chống ôxy hoá nhƣcác glutathion peroxyđaza (GSHPx) và một vài

dạng nhất định của thioredoxyn reductaza. Selen tham gia xúc tác trong phản ứng
chuyển hóa thứ cấp, ức chế các gốc tự do sinh ra từ quá trình perôxyt hóa lipit và
cũng ức chế khả năng gây độc của các kim loại nặng: Hg, Pb, As, Cd và Sn
[68,15,37].
Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều tác dụng của selen đối với con
ngƣời: Những ngƣời tiêu thụ 54-90µg selen hàng ngày sẽ giảm nguy cơ mắc hen
(suyễn) xuống một nửa so với những ngƣời tiêu thụ 23-30µg. Selen có tác dụng
làm ức chế các khối u gây ung thƣ tiền liệt tuyến, tăng cƣờng khả năng chống
phóng xạ và tia tử ngoại. Ngƣỡng có lợi của selen trong khoảng 50-200µg/ngày
cho mỗi ngƣời [62,56]. Theo khuyến cáo, lƣợng selen nam giới nên dùng hằng
ngày là 80µg và nữ giới là 55µg [56]. Nguồn dinh dƣỡng selen đến từ các loại
quả hạch, củ họ hành, tỏi, ngũ cốc, thịt, cá và trứng. Ngoài ra còn nhiều dạng
thực phẩm khác cung cấp nhiều selen nhƣ các loại hải sản [1,15] .
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) tính toán, hàm lƣợng selen trong máu ngƣời
trung bình phải đạt trên 0,15 µg/ml thì mới đủ lƣợng cần thiết cho cơ thể. Những
kết quả nghiên cứu của WHO khẳng định nguyên tố selen có vai trò sinh học rất
lớn đối với sức khoẻ con ngƣời. Điều tra dịch tễ học tại Mỹ và Bắc Âu cho thấy
sự liên hệ giữa thiếu hụt selen và sự gia tăng mắc bệnh tim mạch, huyết áp cao,
não, dẫn đến tử vong đối với con ngƣời. Thiếu hụt selen có thể dẫn tới các bệnh
có liên quan tới chức năng tim mạch đƣợc gọi là bệnh Keshan. Sự thiếu hụt selen
cũng đóng góp (cùng với thiếu hụt iot) vào bệnh Kashin-Beck, là loại bệnh tạo ra
sự teo dần, thoái hoá và chết hoại của các mô chất sụn. Nếu thiếu hụt selen có thể
sinh ra các triệu chứng của giảm hoạt động tuyến giáp, bao gồm sự mệt mỏi,
bƣớu cổ, chứng ngu độn và xảy thai [1].
6
Bên cạnh những tác dụng có lợi thì selen cũng là một độc độc tố khi ở
nồng độ cao. Selen nguyên tố và phần lớn các selenua kim loại có độc tính tƣơng
đối thấp do chúng có hiệu lực sinh học thấp. Ngƣợc lại, các selenat và selenit lại
cực độc hại. Các hợp chất hữu cơ chứa selen nhƣ dimetyl selenua, dimetyl
diselenua, selenmethionin, selencystein, selencystin và metylselencystein, tất cả

các chất này đều có hiệu lực sinh học cao và độc hại khi ở liều lƣợng lớn [1].
Chính vì những ƣu điểm của selen và ranh giới giữa tác dụng tích cực và tiêu cực
của selen có liên quan chặt chẽ tới sức khoẻ con ngƣời, cho nên việc nghiên cứu
thiết.
1.2. Xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp phổ nguyên tử
Để xác định tổng hàm lƣợng các dạng Selen chúng ta có thể dùng dùng
các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: Phƣơng pháp quang phổ phát xạ nguyên
tử(AES), phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, phƣơng pháp trắc quang,
phƣơng pháp điện hóa Tuy nhiên, phƣơng pháp tiêu chuẩn hiện nay xác định
tổng hàm lƣợng selen trong dung dịch nƣớc là phƣơng pháp đo phổ hấp thụ
nguyên tử, sử dụng kỹ thuật hidrua hóa theo TCVN [3].
- Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử (AES) xác định selen dựa
trên ba vạch phổ đặc trƣng 196,1 nm; 204 nm; 206,3 nm. Khi sử dụng nguồn
năng lƣợng là ngọn lửa đèn khí, hồ quang điện hoặc tia lửa điện, độ nhạy của
phép xác định đạt tới µg/ml, phân tích nhanh, có độ chính xác bảo đảm và độ
nhạy khá cao.
Phƣơng pháp quang phổ phát xạ nguyên tử AES sử dụng kỹ kĩ thuật tạo
hợp chất hidrua đƣợc ứng dụng rộng rãi khi phân tích các hợp chất dễ tạo hợp
chất hidrua nhƣ As, Se, Hg….hoạt động dựa trên việc sử dụng các chất khử mạnh
trong môi trƣờng axit để khử các chất phân tích về dạng hidrua dễ bay hơi, sau đó
hơi hidrua đƣợc dẫn vào buồng nguyên tử hóa để sinh phổ phát xạ.
Khi sử dụng kĩ thuật này đối với máy AES phân tích selen đạt đƣợc giới
hạn phát hiện 3µg/ml [19]. Mặc dù giới hạn này là khá nhỏ nhƣng để hạ thấp hơn
giới hạn phát hiện thì quá trình làm giàu trƣớc là cần thiết. Thomson và cộng sự
7
làm giàu bằng phản ứng đồng kết tủa với lantan hidroxit khi đó giới hạn phát hiện
là 0,06µg/ml. Wang sử dụng kĩ thuật bay hơi cho giới hạn phát hiện là 0,5µg/ml.
[27,50,16].
Tuy nhiên, phƣơng pháp quang phổ chỉ cho chúng ta biết tổng hàm lƣợng
của Se trong mẫu, mà không chỉ ra đƣợc các dạng selen tồn tại ở trong mẫu

- Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS có rất nhiều ƣu điểm so
với các phƣơng pháp phân tích khác cho độ nhạy và có một số điểm mạnh khác
nhƣ: khả năng phân tích đƣợc gần 60 nguyên tố hoá học, ngoài các nguyên tố kim
loại còn có thể phân tích đƣợc một số á kim (lƣu huỳnh, clo…) và một số chất
hữu cơ; lƣợng mẫu tiêu tốn ít; thời gian tiến hành phân tích nhanh, đơn giản…
Ngày nay trong phân tích hiện đại, phƣơng pháp HTNT đƣợc sử dụng rất có hiệu
quả đối với nhiều lĩnh vực nhƣ y học, dƣợc học, sinh học, phân tích môi trƣờng,
phân tích địa chất, … đặc biệt phân tích lƣợng vết các nguyên tố kim loại.
Khi phân tích mẫu thực tế, trong mẫu có rất nhiều nguyên tố ảnh hƣởng
với Selen là nguyên tố rất dễ tạo hợp chất hidrua nên để tránh ảnh hƣởng của nền
mẫu ngƣời ta kết hợp kỹ thuật hidrua hóa.
Trên thế giới: Năm 1955 ông Walsh đã giới thiệu phƣơng pháp HTNT,
sau đó kĩ thuật phân tích này đã đƣợc sử dụng rất phổ biến ở các phòng thí
nghiệm trên toàn thế giới. Tuy nhiên ban đầu việc xác định nguyên tử bằng
HTNT còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc mù hoá (sol khí hoá) dung dịch mẫu
nhất là đối với các nguyên tố As, Se, Sb, Te… Mặt khác bƣớc sóng hấp thụ của
các nguyên tố này lại nằm xa vùng tử ngoại (nhỏ hơn 230nm), tại đó sự hấp thụ
nền là lớn khi sử dụng ngọn lửa thông thƣờng. Việc sử dụng ngọn lửa hydro –
argon cho nhiệt độ thấp hơn giảm bớt đƣợc sự hấp thụ nền tới 15%, nhƣng ngọn
lửa này có đặc điểm hoá hơi mẫu kém, gây ra sai số do sự hấp thụ nền và sự hoà
tan muối không hoàn toàn. Sự phát triển kĩ thuật nguyên tử hoá cho HTNT nhƣ
nguyên tử hoá bằng lò graphit thì tránh đƣợc các khó khăn của HTNT bằng ngọn
lửa. Tuy vậy, việc sử dụng thiết bị này gặp một số vấn đề khác nhƣ: Tại bƣớc
sóng ngắn sự khuếch tán hạt (nhƣ hạt cacbon) gây ra sự nhiễu nền lớn, bên cạnh
8
đó đối với nguyên tố dễ bay hơi nhƣ As, Se có thể bị mất trong quá trình nguyên
tử hoá nên phép đo kém ổn định.
Năm 1969, Holak đã sử dụng kĩ thuật tạo hidrua kết hợp với HTNT. Ông
dùng hỗn hợp kim loại và axit (kẽm và axit clohydric) đểthực hiện phản ứng khử,
kẽm và axit HCl đƣợc đựng trong một ống nghiệm có nitơ lỏng, trƣớc tiên ống

nghiệm đƣợc làm nóng lên rồi dẫn dung dịch có chứa As đi qua, khi As sinh ra
đƣợc dẫn vào ngọn lửa không khí–axetylen trong môi trƣờng nitơ. Bằng phƣơng
pháp này khắc phục đƣợc đáng kể nhƣợc điểm của sự mù hoá, nâng cao đƣợc độ
nhậy. Chất khử dùng cho phản ứng tạo hidrua là hidro mới sinh:
Zn + 2HCl => ZnCl
2
+ H
.
2H
∙
+ E
m+
=> EH
n
+ H
2
E là nguyên tố phân tích, m, n có thể giống hoặc khác nhau. Một số tác giả
dùng nhôm hoặc magiê thay thế cho kẽm. Cũng có thể sử dụng clorua thiếc (II)
hoặc KI làm chất khử và về sau ngƣời ta sử dụng natri tetrahydro borat (NaBH
4
)
có nhiều thuận tiện hơn. Khí hidrua đƣợc đẩy ra khỏi dung dịch chuyển đến
buồng nguyên tử hoá nhờ dòng khí mang là khí trơ (Argon, Nitơ hoặc Heli).
Thiết bị HG–AAS có thể dùng bộ nguyên tử hoá lò graphit hoặc bộ nguyên
tử hoá ngọn lửa. Hệ nguyên tử hoá bằng ngọn lửa, để nguyên tử hoá hợp chất
hidrua khí đƣợc dẫn vào ống thạch anh hình chữ T. Ban đầu ngƣời ta dùng ngọn
lửa Ar-H
2
để đốt nóng ống thạch anh, Holak dùng ngọn lửa C
2

H
2
– không khí có
nhiều ƣu điểm hơn và đƣợc sử dụng nhiều hơn. Cũng có thể đốt nóng ống thạch
anh bằng lò điện và sự phân huỷ AsH
3
xảy ra trong môi trƣờng khí trơ (Ar hoặc
Ne, H
2
). Groulden và Brookband đã sử dụng loại thiết bị này. Ƣu điểm của việc
đốt nóng ống thạch anh bằng lò điện là có thể điều khiển để đạt đƣợc nhiệt độ tối
ƣu nhất, nhiệt độ phân bố cho ống thạch anh đều hơn, độ nhiễu nền thấp hơn [39].
Bằng kĩ thuật hidrua hoá độ nhậy của phƣơng pháp tăng lên rất nhiều so
với kĩ thuật mù hoá dung dịch thông thƣờng. Dùng nguồn năng lƣợng là ngọn lửa
và không khí thì độ nhạy phép xác định là 1µg/ml theo vạch 196nm, còn khi dùng
ngọn lửa axetilen–không khí thì độ nhạy là 0,25µg/ml. Kĩ thuật nguyên tử hoá
9
không ngọn lửa xác định Se trong máu và serum, giới hạn phát hiện là 0,8µg/ml,
còn khi nối với cột Cellex làm giàu thì giới hạn phát hiện tƣơng ứng là 2,1 và 2,4
ng/ml.
Trên thế giới, rất nhiều nhà nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp để xác định
hàm lƣợng selen đạt đƣợc giới hạn phát hiện thấp nhƣ: Denise Bohrer và CCS
xác định hàm lƣợng Se trong thịt gà bằng phƣơng pháp HG-AAS và GF-AAS,
đâu tiên thịt gà đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 65
o
C trong 24h, chất béo đƣợc loại bỏ
bằng hỗn hợp axit HNO
3
và HClO
4

. Sau khi phá mẫu, selen đƣợc đo bằng phƣơng
pháp HG-AAS và GF-AAS trong môi trƣờng HCl 4-6 M. Kết quả cho thấy phần
lớn lƣợng chất béo trong thịt gà đã đƣợc chiết ra. Phƣơng pháp HG-AAS và GF-
AAS cho độ lệch chuẩn lần lƣợt là 0,8% và 6,5%, giới hạn phát hiện tƣơng ứng
của 2 phƣơng pháp này là 0,6 µg/l và 1 µg/l [18]. William R. Mindak và CCS sử
dụng phƣơng pháp HG-AAS xác định Se trong thức ăn với giới hạn định lƣợng
0,02 mg/kg [53]. Norooz Maleki và CCS định lƣợng Se trong nƣớc và trong đất
bằng phƣơng pháp HG-AAS sử dụng chất NaBH
4
và axit tartaric để chuyển Selen
(IV) về Selen (VI) thu đƣợc độ lệch chuẩn tƣơng đối của Selen là 1,93% và giới
hạn phát hiện là 10,6 ng/ml [58]. Ondrej Hegedus và CCS đã xác định hàm lƣợng
Selen trong rau bằng phƣơng pháp Hg – AAS, dùng bƣớc sóng 196,0 nm, cƣờng
độ dòng của đèn là 10mA, chất khử là NaBH
4
0,6% /NaOH 0,5%, thu đƣợc kết
quả là 0,001-0,034 mg/kg trong mẫu rau tƣơi, với giới hạn phát hiện là 0,49 µg/l.
Rau nhiều đƣờng và tinh bột thì chứa ít selen, khoai tây và cà rốt chứa nhiều
Selen (0,034 mg/kg và 0,02 mg/kg) [34]. Magda A.Akl đã xác định đƣợc Selen
trong một số mẫu thức ăn nhƣ: sữa trâu tƣơi là 0,053 µg/g; sữa bột là 0,071 µg/g;
thịt bò hun khói là 0,47 µg/g; cá hồi là 0,81µg/g [48]. Hisatake Narataki xác định
Selen trong nƣớc sông đạt giới hạn phát hiện là 0,04 µg/ml [57].
Miller HJ xác định selen có trong thực phẩm bằng cách lẫy 3 gam mẫu đem
vô cơ hóa bằng hỗn hợp HNO
3
-HClO
4
-H
2
SO

4
, dùng NaBH
4
để hidrua hóa mẫu
giới hạn phát hiện của selen là 25ng [36] .William R.Mindak và Scott P.Dolan đã
xác định tổng hàm lƣợng selen trong các mẫu thức ăn nhƣ: thịt bò, gấu, bánh mỳ,
10
ngũ cốc, trứng, sữa, hoa quả, nƣớc chanh, lạc. Nồng độ giới hạn phát hiện của
selen là 0,09 ng/ml, giới hạn định lƣợng là 0,02 mg/kg [53]. Kỹ thuật FI- HVG-
AAS cũng đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng selen có trong mẫu thực phẩm. Mẫu
thực phẩm (sữa bò, thịt bò, thịt gà, cơ cá, cá đóng hộp, trứng, gạo, bột mì và mì
ống). Các mẫu này đƣợc xay và trộn đều, sau đó đông khô, rồi hòa tan trong dung
dịch HNO
3
nung nóng ở 90
o
C trong 2h, sau đó thêm tiếp HNO
3
và HClO
4
dung
dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc sóng λ= 296 nm thu đƣợc hàm lƣợng Selen trong
các mẫu thực phẩm là nhƣ sau: bột mỳ 0,01770 mg/l; gạo 0,01713 mg/l; sữa
0,01699 mg/l; thịt bò 0,01694 mg/l; trứng 0,01580 mg/l với % RSD là 4% cho
bột mì, gạo và thịt bò, 3% đối với thịt gà và trứng, 2% đối với bột mỳ, sữa, thịt
bò. Phƣơng pháp này cho hiệu suất thu hồi là 96% [17].
Gần đây, ở Việt Nam, phƣơng pháp HVG-AAS để xác định hàm lƣợng các
dạng Selen có trong mẫu máu và nƣớc tiểu bằng cách sử dụng HNO
3
, H

2
SO
4
,
thêm HClO
4
, để phá mẫu, định mức dung dịch mẫu sau đó đem đo độ hấp thụ
quang bằng HVG-AAS và xác định hiệu suất thu hồi thì nồng độ Selen trong mẫu
máu và nƣớc tiểu là 0,41 ng/ml. Tác giả [5] cũng xác định tổng hàm lƣợng selen
trong mẫu thực phẩm bằng cách cho mẫu thực phẩm (ngao, tôm ) đã sấy khô,
nghiền mịn, thêm 15,0 – 20,0 ml dung dịch axit HNO
3
đặc 65%, ngâm khoảng
2h, đem đun trên bếp cách cát đến cạn, thêm vài giọt H
2
O
2
đun tiếp đến hết khói
nâu. Lấy ra để nguội, thêm 12,0ml dung dịch axit HCl đặc 37%, sóc trộn đều
dung dịch, đem đun trên bếp cách thủy trong 40 phút, lấy ra để nguội chuyển vào
bình định mức 25 ml, thêm nƣớc cất đến vạch mức đem đo độ hấp thụ quang kết
quả hàm lƣợng selen trong mẫu thực phẩm là mẫu tôm là 25,00 µg/g, mẫu ngao là
100,69 µg/g. Phƣơng pháp này đƣợc dùng sử dụng rãi để xác định hàm lƣợng các
kim loại khác nhƣ As, Sb
Qua phân tích các công trình đã công bố, chúng tôi thấy rằng selen tồn tại
trong mẫu ở những dạng hợp chất hóa trị khác nhau. Nhƣng hầu hết cần chuyển
những dạng này về dạng khí H
2
Se để nguyên tử hóa. Trƣớc hết cần vô cơ hóa
chúng về Se(VI) và DMDSe bằng các phƣơng pháp xử lý mẫu khác nhau sau đó

11
khử Se(VI) về Se(IV), DMDSe về SeMt bằng các hợp chất thích hợp. Chất khử
thƣờng đƣợc dùng là HCl, hỗn hợp KBr/HCl, KI đun nóng, còn với phản ứng
hidrua hóa thì dùng chất khử là NaBH
4
trong môi trƣờng NaOH. Trong luận văn
này, chúng tôi sẽ sử dụng phƣơng pháp HVG-AAS có thể xác định đƣợc các dạng
selen trong các mẫu thực phẩm khác nhau.
1.3. Các phƣơng pháp phân tích dạng
1.3.1. Phương pháp phân tích trắc quang
Phƣơng pháp trắc quang để xác định Se(IV) dựa trên phản ứng tạo màu
của Se(IV) với các o-diamin thơm. Thuốc thử hay đƣợc sử dụng nhất là
3,3’diaminobenzidin. Trong môi trƣờng axit, thuốc thử này đƣợc tạo với selen
phức piazoseol có màu vàng. Đo độ hấp thụ quang của phức màu trong pha nƣớc
ở 490nm (hay sau khi chiết bằng toluen ở 420nm). Khoảng tuân theo định luật
Lamber - Beer là 0,25 µg/ml đến 2,5 µg/ml [2,12,75].
Cũng có thể xác định dạng Selen bằng phản ứng tao phức của
Se(IV) với 2,3-diaminonaphtalen ở pH=1, sau đó phức đƣợc chiết vào dung môi
cyclohexan và đo huỳnh quang ở 520 nm sau khi kích thích ở 380 nm (ở các dung
dịch mà nồng độ Selen là quá nhỏ thì selen đƣợc làm giàu bằng phản ứng tạo
phức với amino pyrolidin dithiocacbamat ở pH=4,2 và sau đó đƣợc giải chiết
bằng HNO
3
) [2,12,75]. Phƣơng pháp cho phép xác định selen đến nồng cỡ nm. S.
Forbes và CCS đã sử dụng phƣơng pháp ghi đo quang phân tử hợp chất phức màu
của selen với 2,3-diaminonaphtalen để xác định hàm lƣợng Se trong đất và cây
trồng [32]. Phƣơng pháp trắc quang đã xác định selen trong cây trinh nữ bằng
cách chuyển các dạng selen về Se(VI) sau đó sử dụng thuốc thử triôxyazobenzen
để tạo phức với Se(VI) hấp thụ mật độ quang của phức tại bƣớc sóng λ= 610 nm
[11].

Phƣơng pháp trắc quang cho độ tin cậy cao, thực hiện rất nhanh, thuận lợi,
trang thiết bị đơn giản và tự động hóa, tuy nhiên bên cạnh đó còn một số mặt hạn
chế ở phƣơng pháp này là độ chính xác không cao, không loại đƣợc ảnh hƣởng
của nền mẫu nên không thể dùng phƣơng pháp này phân tích hàm lƣợng selen
12
trong các mẫu hải sản đƣợc vì trong mẫu hải sản hàm lƣợng nền mẫu ảnh hƣởng
là rất lớn, do đó phải xử lý tách bỏ ảnh hƣởng của nền mẫu.
1.3.2. Nhóm phương pháp phân tích điện hóa.
Phƣơng pháp cực phổ nói chung cho độ nhạy chỉ đạt cỡ 10
-4
-10
-5
M. Cƣờng
độ dòng phụ thuộc thế điện phân trong dung dịch và thế điện cực. Ngƣời ta tiến
hành điện phân và đo cƣờng độ dòng với một dãy dung dịch chuẩn biết trƣớc
nồng độ. Dựa vào đồ thị xác định đƣợc nồng độ chất phân tích khi biết cƣờng độ
dòng. Giá trị nửa thế sóng cho biết thành phần định tính, chiều cao sóng cho biết
thành phần định lƣợng của chất phân tích. Trên thế giới, đã có một số công trình
xác định Se
4+
bằng phƣơng pháp cực phổ dòng một chiều, tuy nhiên giới hạn phát
hiện không cao (10
-5
M). Năm 1986 G.E. Batley sử dụng phƣơng pháp cực phổ
xung vi phân xác định selen trong nƣớc thải. Tác giả dùng nền HCl pH = 2, píc ở
–0,6V (so với điện cực Ag/AgCl) đƣợc dùng để định lƣợng. Nƣớc thải đƣợc loại
bỏ tạp chất thô bằng cách dội qua cột C
18
sep-pak sau đó dùng nhựa chelex 100
để loại bỏ lƣợng vết các kim loại. Khoảng nồng độ tuyến tính của phƣơng pháp là

2-100g/l [20]. Đặc biệt các phƣơng pháp von - ampe hoà tan, nhờ làm giàu chất
phân tích lên bề mặt điện cực bằng phản ứng khử hay oxi hóa kết tủa chất sau đó
hoà tan sản phẩm kết tủa và ghi tín hiệu hoà tan mà các phƣơng pháp điện hóa
hoà tan có độ nhạy cao, công trình của Wang. J và Jianmin. L sử dụng CSV trên
nền 0,1M H
2
SO
4
+ 10 g/l Rh
3+
, điện phân làm giàu ở –0,2V, phƣơng pháp dựa
trên phản ứng tích luỹ và sau đó khử lớp Rh
2
Se
3
trên HMDE, giới hạn phát hiện
của phƣơng pháp là 0,5g/l khi thời gian điện phân là 3 phút [73]. Britta Lange
và CCS xác định Se bằng CSV xúc tác với sự có mặt của Rh(III), sử dụng nền là:
HCl 0.3M+ 75 ppb Rh(III) và điện phân ở thế −0,2V, cho giới hạn phát hiện 2,4
pM với thời gian điện phân 50s [43]. Bằng phƣơng pháp von ampe hòa tan,
Rugayah Mohamed và CCS đã xác định đồng thời hai dạng Se(IV) và DMDSe
trong pha nƣớc (nền HCl 0,05M, Edep= +0,1V, tdep= 90s) thu đƣợc giới hạn phát
hiện cao hơn nhiều (Se(IV) là 0,646 ppb và DMDSe là 17,836 ppb) [54].
13
Ở Việt Nam, phƣơng pháp von ampe hòa tan áp dụng để xác định các dạng
Selen trong mẫu hải sản, trong nền HCl 0,06M+LiClO
4
0,2M+CH
2
Cl

2
/C
2
H
5
OH
(1/1), pic ở -0,3V, xác định hàm lƣợng các dạng Se(IV), Se-Cyst, DMDSe trong
mẫu cá khoai lần lƣợt là 0,143 g/g; 0,596 g/g; 0,042 g/g. Trong mẫu tôm sú,
chứa 0,166g/g Se (IV); 6,269 g/g Se-Cyst; 0,028 g/g DMDSe [5].
Phƣơng pháp điện hóa cho giới hạn phát hiện cỡ thấp ng/l, trang thiết bị
đơn giản dễ phân tích tự động và dễ ghép nối làm detecto cho các phƣơng pháp
khác. Tuy nhiên, phƣơng pháp này chỉ xác định đƣợc các dạng selen có hoạt tính
điện hóa.
1.3.3. Các phương pháp ghép nối
1.3.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp kỹ thuật hidrua hóa ghép nối quang
phổ
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp kỹ thuật hidrua hóa ghép
nối quang phổ dựa trên nguyên tắc: Dùng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để
tách các dạng selen ra khỏi mẫu, sau đó dùng các chất khử natri bohydrua để đƣa
các dạng selen về dạng hidrua (H
2
Se), tiếp theo dẫn luồng khí này vào buồng
nguyên tử hóa và đo phổ hấp thụ của selen từ đó sẽ xác định đƣợc hàm lƣợng các
dạng selen.
Phƣơng pháp này đƣợc xem là phƣơng pháp rất tốt, nhƣng khó tách rời
cách dạng selen nhƣng chi phí phân tích cao, trang thiết bị đòi hỏi phải ghép nối
phức tạp. Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứu xác định dạng selen theo hƣớng này
trƣớc khi thiết bị HPLC-ICP-MS phát triển.
Amit Chatterjee và CCS đã xác định dạng SeMt bằng HPLC-HG-AAS cho
giới hạn phát hiện 1,08 ng/ml và đã ứng dụng tốt vào phân tích SeMt trong nƣớc

tiểu của ngƣời [24]. Carmen Cámara và CCS đã sử dụng phƣơng pháp HPLC-
HG-AAS để xác định các dạng crom và selen (Se(IV), Se(VI)) trong dung dịch
[21]. Ildikó Ipolyi và CCS đã xác định các dạng asen và selen (Se(IV)+Se(VI))
bằng phƣơng pháp HPLC-HG-AFS đạt đƣợc giới hạn phát hiện lần lƣợt là 1,0;
0,5; 1,0; 0,3 và 0,7 ng/l đối với Se(IV), As(III), DMA, MMA và As(V) [40].
14
Trong một công trình khác, nhóm các tác giả này công bố, bằng phƣơng pháp
HPLC-HG-AFS đã xác định Se(IV) và các axit selenamino thu đƣợc giới hạn
phát hiện Se-Cyst, SeMt, SeEt và Se(IV) lần lƣợt là 18, 70, 96, và 16 ng/l [40].
Pilar Viñas và CCS cũng sử dụng phƣơng pháp LC-HG-AFS xác định các dạng
selen (Se(IV), Se(VI), SeCyst, SeMt)[72]. Phƣơng pháp pháp HPLC-UV-HG-
AFS đƣợc dùng để xác định các selen vô cơ và các axit selenoamino acid trong
mẫu máu và nƣớc tiểu cho giới hạn phát hiện của SeCys, SeMt, SeEt, Se(IV),
Se(VI) tƣơng ứng là 0,31 ; 0,43 ; 0,7; 0,44 và 0,32 ng/l [38].
1.3.3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao-plasma cao tần cảm ứng- phổ khối (HPLC-
ICP-MS)
Nguyên tắc xác định của phƣơng pháp này là: trƣớc tiên dùng sắc ký lỏng
để tách riêng rẽ các dạng selen, sau đó dùng nguồn ICP để sinh phổ khối của các
dạng Selen , từ đó dựa vào tín hiệu đo phổ để xác định hàm lƣợng của từng dạng
selen.
Trên thế giới, phƣơng pháp HPLC-ICP-MS đƣợc sử dụng rộng rãi ở các
phòng thí nghiệm hiện đại. Tác giả [74] đã tìm thấy các dạng As(III), As(V),
MMA, DMA, AsB trong cả hai mẫu cá, đồng thời tìm thấy hai dạng Se(IV),
Se(VI) trong mẫu cá kiếm (swordfish). Các tác giả đã xác định các dạng selen:
TMSe, SeMt, H
2
SeO
3
, H
2

SeO
4
bằng HPLC-ICP-MS cho giới hạn phát hiện thấp
hơn lần lƣợt là 0,08; 0,34; 0,18 và 0,07 µg Se/l [45]. Cũng bằng phƣơng pháp
này, Maїté Bueno và CCS đã xác định các dạng selen vô cơ (Se(IV), Se(VI)) và
hữu cơ (Se-Cyst) trong nƣớc tự nhiên ở hàm lƣợng cỡ 10 ng Se/l [22]. Gottfried
Kölbl so sánh các phƣơng pháp HPLC-FAAS, HPLC-GFAAS với HPLC-ICP-
MS khi xác định các hợp chất Se trong môi trƣờng nƣớc và kết quả cho thấy
phƣơng pháp HPLC-ICP-MS cho giới hạn phát hiện thấp nhất (0,1 ng/l) so với
HPLC-FAAS và HPLC-GFAAS lần lƣợt là 10 ng/l và 1 ng/l, đồng thời phƣơng
pháp HPLC-ICP-MS còn cho khoảng nồng độ tuyến tính rộng nhất (10 µg đến 10
mg Se/l) [41]. L.Orero và CCS đã xác định đồng thời các dạng As (As(III),
As(V), DMA, MMA) và Se (Se(IV), Se(VI)) trong trầm tích bằng phƣơng pháp
15
HPLC-ICP-MS với giới hạn phát hiện nằm trong khoảng 2÷40 ng/g [61]. X.C Le
và CCS đã xác định đƣợc 13 dạng As và Se bằng phƣơng pháp HPLC-ICP-MS và
đã áp dụng thành công vào việc xác định dạng AsB và Se-Cyst trong cá ngừ đóng
hộp cũng nhƣ xác định đƣợc 6 dạng asen đƣờng trong trầm tích [44] . Cũng bằng
phƣơng pháp HPLC-ICP-MS, các tác giả đã phân lập các dạng Se trong nƣớc tiểu
(TMSe, Se(IV), Se(VI), SeMet, SeEt), SeEt) [25], trong tỏi [52] và hành xanh
[67]. Laura Hinojosa Reyes và CCS đã sử dụng phƣơng pháp IC-ICP-MS đểxác
định đồng thời 5 dạng As (As(III), As(V), MMA, DMA, AsB) và ba dạng Se
(SeMet, Se(IV), Se(VI)) trong mô cá, đạt đƣợc giới hạn phát hiện khoảng 0,1µg/l
(đối với các dạng asen) và 0,7µg/l (đối với các dạng selen) [65].
Có thể nói, phƣơng pháp HPLC-ICP-MS hiện nay là một phƣơng pháp
hiệu quả nhất đang đƣợc sử dụng phổ biến ở phòng thí nghiệm hiện đại để nghiên
cứu xác định các dạng vết selen và nhiều nguyên tố khác, phƣơng pháp này có ƣu
thế sử dụng lƣợng mẫu nhỏ phù hợp với việc phân tích vết và siêu vết nhƣng chi
phí đắt nên ở Việt Nam chƣa đƣợc đầu tƣ trang thiết bị này.
1.3.4. Phương pháp phân tích kết hợp với sử dụng chemometric

1.3.4.1. Cơ sở phương pháp toán
Chemometrics đƣợc định nghĩa là việc ứng dụng các phƣơng pháp toán
học, thống kê, đồ họa,… để qui hoạch thực nghiệm, tối ƣu hoá các thông tin hoá
học trích ra từ tập số liệu phân tích và đƣa ra tối đa những thông tin hữu ích từ
tập số liệu ban đầu [14,33].
Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ 70, cho tới nay chemometric đã xác
lập đƣợc một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học, đặc biệt là trong
hoá học phân tích hiện đại. Một mảng lớn trong chemometric phát triển nhanh
gắn liền với toán học và tin học là hồi qui đa biến–kỹ thuật đa biến đƣợc dùng
rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài toán xác định
đồng thời nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách loại trƣớc.
Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy dung dịch chuẩn có mặt tất cả các cấu tử
cần xác định với nồng độ biết trƣớc trong hỗn hợp (các biến độc lập x), đo tín
16
hiệu phân tích của các dung dịch này dƣới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc y
và thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến
độc lập x (nồng độ các chất trong hỗn hợp). Dựa trên mô hình này có thể tìm
đƣợc nồng độ của các cấu tử trong cùng dung dịch định phân khi có tín hiệu phân
tích của dung dịch đó [14].
Nếu các cấu tử có mặt trong hỗn hợp cho tín hiệu đo có tính chất cộng tính
thì có thể sử dụng phƣơng pháp hồi qui đa biến tuyến tính thông thƣờng (multiple
linear regression- MLR) nhƣ phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu thông thƣờng
hoặc hiệu quả hơn nhƣ bình phƣơng tối thiểu từng phần, phƣơng pháp hồi qui cấu
tử chính,….Nhƣng nếu trong hỗn hợp, các cấu tử có sự tƣơng tác lẫn nhau làm
mất tính chất cộng tính ở tín hiệu đo thì phải sử dụng mô hình hồi qui đa biến phi
tuyến tính mà phổ biến là các phƣơng pháp kết hợp với mạng nơron nhân tạo
[51,39].
Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phƣơng pháp
hồi qui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phƣơng pháp hồi qui đa biến
tuyến tính sử dụng phổ toàn phần nhƣ phƣơng pháp CLS, PLS, và phƣơng pháp

sử dụng dữ liệu phổ riêng phần nhƣ ILS. Trong luận văn này, tín hiệu của các
dung dịch chứa các dạng Se đƣợc đo ở 5 điểm rời rạc nên chúng tôi chọn sử dụng
phƣơng pháp hồi qui cấu tử chính PCR vì phƣơng pháp này về lí thuyết có thể sử
dụng cho cả hai trƣờng hợp của hàm phụ thuộc [14,51,69].
1.3.4.2. Phương pháp hồi qui cấu tử chính (Principal component regression - PCR)
Hồi qui đa biến, trong trƣờng hợp các biến có tƣơng quan, là vấn đề gây
nhiều khó khăn khi giải các bài toán phức tạp trong một số ngành nhƣ: vật lý, hóa
học, các ngành khoa học tự động và thiết kế công trình,
Để giải quyết bày toán này, các nhà khoa học thƣờng sử dụng phƣơng
pháp hồi qui cấu tử chính (PCR). PCR là phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu
nghịch đảo trên tập dữ liệu mới thu đƣợc trong phép chiếu tập dữ liệu lên các
vectơ đơn vị của không gian mới (PC – principal components) [14,42,51,69]
PCR bao gồm các bƣớc tiến hành nhƣ sau: