nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (glycine max (l.) merrill)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN





LÒ THANH SƠN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN
GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ
CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)






LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015





BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN





LÒ THANH SƠN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN
GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ
CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21


LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Chu Hoàng Mậu
2. PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh






THÁI NGUYÊN - 2015

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của
GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS. TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các kết quả trình
bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa
học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.
Thái Nguyên, tháng 01 năm 2015
TÁC GIẢ

Lò Thanh Sơn




i
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Chu Hoàng Mậu, PGS.TS.
Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi
nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Lê Văn Sơn, TS.
Phạm Bích Ngọc, TS. Lâm Đại Nhân, TS. Nguyễn Trung Nam, TS. Nguyễn Thị
Thuý Hường - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện
các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Bộ môn
Di truyền&Sinh học hiện đại trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận
án; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong các buổi seminar khoa học, báo
cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập
thể cán bộ Phòng Công nghệ ADN và ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực
vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp,
các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm -
Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá
học này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, chân thành
cảm ơn các đồng nghiệp là thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh Hoá - Trường Đại học

Tây Bắc đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên,
quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, tháng 01 năm 2015
TÁC GIẢ


Lò Thanh Sơn
ii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

i
Lời cảm ơn

ii
Mục lục

iii
Danh mục những chữ viết tắt trong luận án

iv
Danh mục bảng trong luận án

v
Danh mục hình trong luận án

vi

MỞ ĐẦU

1
1. Đặt vấn đề

1
2. Mục tiêu nghiên cứu

2
3. Nội dung nghiên cứu

3
4. Những đóng góp mới của luận án

3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5
1.1. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI
VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN

5
1.1.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương

5
1.1.2. Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương

7
1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT

12
1.2.1. Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ

12
1.2.2. Expansin và cơ chế kéo dài rễ

14
1.3. CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG
NHỜ A.TUMEFACIENS

25
1.3.1. Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương thông qua
A.tumefaciens

25
1.3.2. Cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương bằng chuyển gen liên quan
đến bộ rễ

33
iii
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

38
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

38
2.1.1. Vật liệu thực vật

38
2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector

39
2.1.3. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu

39
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

39
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

39
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu

40
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.
40
2.3.1. Phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ

40
2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen

42
2.3.3. Phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1
.
44
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens

46
2.3.5. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen

51
2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu

53
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

54
3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG NGHIÊN CỨU

54
3.1.1. Sự kéo dài rễ chính của đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo

54
3.1.2. Thể tích bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo

54
3.1.3. Khối lượng khô của bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo

57
3.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG
ĐẬU TƯƠNG

59
3.2.1. Đặc điểm của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ một số giống đậu
tương

59
3.2.2. Sự đa dạng của trình tự vùng mã hoá gen EXP1 ở một số loài thực vật

67
3.3. PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN GmEXP1

69
3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1

70
3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển
gen GmEXP1

72
3.4. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ

76
3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá nhờ
A.tumefaciens

76
3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế
hệ T
0


78
3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển
GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T

1

.
85
3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1

95
3.5.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ
A.tumefaciens

95
3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T
0


97
Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

100

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

109

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

112

PHỤ LỤC

128

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

ABA Abscisic Acid
AS Acetylseringone
bp base pairs Cặp bazơ nitơ
cs Cộng sự
CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy
Ct Threshold of Cycle Chu kỳ ngưỡng
DAB 3,3'-Diaminobenzidine
tetrahydrochloride

DRE Dehydration Responsive Element Yếu tố điều hoà phản ứng với
sự mất nước
DREBs Dehydration Responsive Element
Binding protein
Protein gắn với DRE
DREB
factor
Dehydration Responsive Element
Binding - factor
Yếu tố gắn với DRE
DPBB Double Psi Beta-Barrel structure Vùng cấu trúc DPBB
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay

Xét nghiệm ELISA
EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện
ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EXP Expansin Protein expansin
EXP1 Expansin 1 Gen expansin 1
FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương thế giới
GFP Green Fluorescene Protein Protein phát xạ lưu huỳnh
GM Germination Medium Môi trường tái sinh
GmEXP1 Glycine max expansin1 gene Gen expansin 1 ở đậu tương
GUS β-Glucuronidase
iv
HRP Horse Radish Peroxidase
IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside
LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản
nuôi cấy vi khuẩn
MCS Multi Cloning Site Vùng cắt gắn đa vị
MS Murashige và Skoog, 1962 Tên gọi đặt cho môi trường
dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô
OD Optical Density Mật độ quang
PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
P5CR l-Δ
1
-Pyrroline-5-Carboxylate
Reductase

P5CS l-Δ
1
-Pyrroline-5-Carboxylate
Synthetase

RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ
rpm Revolution Per Minute Số vòng/phút
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase
Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp -
phiên mã ngược
SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi
SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi
T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào
thực vật
Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u
TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine
UTR UnTranslated Region Vùng không dịch mã
WT Wild Type Kiểu dại
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-
galacto-pyranoside

DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN
Trang
Bảng 2.1. Thống kê một số giống đậu tương địa phương sử dụng làm vật liệu
nghiên cứu

38
Bảng 2.2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

39
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix

42
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng

43
Bảng 2.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn

43
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI

44
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI

45
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII

46
Bảng 2.9. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá

48
Bảng 2.10. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84

50
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR

52
Bảng 2.12. Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR

52
Bảng 3.1. Chiều dài rễ chính của các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9
ngày hạn

55

Bảng 3.2. Thể tích bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7 và 9 ngày
hạn

55
Bảng 3.3. Khối lượng khô của bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5,
7, 9 ngày hạn

56
Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide trên gen EXP1 của đậu tương SL1
và DT84

67
Bảng 3.5. Thống kê một số trình tự gen EXP1 để phân tích đa dạng di truyền

68
Bảng 3.6. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N.
tabacum

78
Bảng 3.7. Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen
GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T
0


83
v
Bảng 3.8. Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen
GmEXP1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T
1
so với cây T

0
26

87
Bảng 3.9. Kết quả xác định sự khác biệt về mức độ biểu hiện phiên mã ở hai
dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T
1
bằng t-Test

88
Bảng 3.10. Khối lượng chất khô của bộ rễ các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9
ngày hạn

91
Bảng 3.11. Thể tích bộ rễ thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn

93
Bảng 3.12. Chiều dài rễ chính của các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn

94
Bảng 3.13. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84

97
DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc protein expansin suy diễn

20
Hình 1.2. Mô hình cấu trúc 3D protein α-expansin1 của đậu tương

20
Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào thực vật

21
Hình 1.4. Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin

24
Hình 1.5. Sơ đồ các phương pháp phân tích cây chuyển gen

29
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

41
Hình 2.2. Sơ đồ phát triển vector chuyển gen mang gen GmEXP1

45
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm

49
Hình 3.1. Mối quan hệ giữa các giống đậu tương nghiên cứu dựa trên dữ liệu
về sự phát triển bộ rễ trong điều kiện gây hạn nhân tạo

56
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1; colony-PCR
chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp và sản phẩm cắt plasmid tái tổ
hợp bằng BamHI

60
Hình 3.3. So sánh trình tự gen GmEXP1_cDNA của Ngân hàng gen quốc tế
(AF516879) và của bảy giống đậu tương nghiên cứu

63
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự DNA và cDNA của gen GmEXP1 phân lập
từ giống SL1

65
Hình 3.5. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide
đoạn mã hoá của gen EXP1 ở một số loài thực vật

69
Hình 3.6. Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng
NcoI/NotI và sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ
hợp pRTRA7/3_GmEXP1

70
Hình 3.7. Sơ đồ sản phẩm cắt plasmid bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen
GmEXP1 và hình ảnh điện di sản phẩm DNA đích đã tinh sạch từ vector
pCB301 cắt bởi HindIII

72
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR bằng mồi
SoyEXP1F_NcoI/SoyEXP1R_NotI chọn dòng vi khuẩn E.coli và
A.tumefaciens mang vector chuyển gen

74
vi
Hình 3.9. Sơ đồ kiểm tra gen GmEXP1 trên vector chuyển gen bằng NotI

75
Hình 3.10. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá

chuyển gen

77
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen
GmEXP1 trong các cây thuốc lá chuyển gen

78
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen
GmEXP1 trong các cây thuốc lá chuyển gen

79
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của các cặp mồi chuẩn bị cho
phản ứng Real-time RT-PCR trên các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T
0


81
Hình 3.14. Đồ thị ngưỡng nhiệt, và đồ thị phân tích nhiệt độ nóng chảy của hai
gen GmEXP1 và actin ở các mẫu thuốc lá chuyển gen T
0
trong phản ứng Real-
time RT-PCR

82
Hình 3.15. Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T
0


84
Hình 3.16. Hạt thuốc lá gieo trên môi trường MS không kháng sinh và có

kháng sinh chọn lọc kanamycin

85
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ gen GmEXP1 ở các dòng
thuốc lá chuyển gen thế hệ T
1


86
Hình 3.18. Biểu đồ so sánh tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá
chuyển gen thế hệ T
1
so với mẫu cây chuyển gen T
0
26

88
Hình 3.19. Kết quả lai Western các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T
1


89
Hình 3.20. Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuốc lá và so sánh hình
thái rễ cây có tưới nước và cây không tưới nước ở giai đoạn 5 ngày gây hạn

90
Hình 3.21. Hình ảnh minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây đậu tương
chuyển gen

96

Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển
GmEXP1 trong các cây đậu tương chuyển gen

98
Hình 3.23. Kết quả lai Western trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T
0


99


1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều
quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Hạt đậu tương có giá trị
dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Hạt có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa
nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin ) và các
vitamin (B1, B2, C, D, E, K ) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Hạt đậu
tương được sử dụng trực tiếp làm thực phẩm cho con người, làm thức ăn cho gia
súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và là mặt hàng xuất khẩu có giá
trị cao trên thế giới. Đậu tương là cây trồng cải tạo đất. Thân lá để lại trong đất
nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả
năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên đất.
Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở
các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông
nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ Ngoài những tác động trực tiếp
lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản suất nông
nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên

khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng,
trong đó có đậu tương. Theo thống kê của FAO, năng suất đậu tương trên thế giới
giảm khoảng 11,13% trong ba năm trở lại đây. Cây đậu tương có thời gian sinh
trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây
trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Khô hạn có ảnh
hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn của cây đậu tương.
Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% năng suất hạt đậu tương
so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa. Chính vì vậy chọn tạo giống
đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết và mang tính thời sự trên thế
giới cũng như ở Việt Nam.

2
Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và sự
phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm
bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Thực vật có bộ rễ
phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới những lớp đất sâu sẽ có
cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện khô hạn. Đồng thời, sự điều
chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những cơ chế tích luỹ chất khô, tăng
cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp và trao đổi ion cũng giúp
thực vật dễ dàng lấy được lượng nước ít ỏi trong đất. Mặt khác, trong điều kiện hạn,
thực vật còn có một loạt các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu
với điều kiện hạn như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước,
tăng cường tích nước tế bào… Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật
dưới điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát
triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên được xem là biện pháp hữu
hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương.
Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem là
giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay. Hướng tiếp
cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã được quan tâm với
việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và

ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công nghệ gen được coi là biện pháp
có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao.
Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc
điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu
tương (Glycine max (L.) Merrill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 liên
quan đến sự kéo dài rễ bằng kỹ thuật chuyển gen.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự
nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu
tương địa phương.

3
(ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự
kéo dài rễ ở cây đậu tương.
(iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu hiện
sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen.
(iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến sự
phát triển kéo dài rễ.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua
các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân nhóm các
giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ.
(2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế cặp
mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen này từ cây đậu tương.
(3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1
liên quan đến sự kéo dài rễ.
(4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài

rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển
trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T
0
và T
1.
Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ
của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế hệ T
1
trên phương diện chiều
dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ.
(5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến sự
kéo dài rễ vào cây đậu tương.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập,
tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen GmEXP1 liên
quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương Việt Nam.
Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được mức
độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu
tương chuyển gen mang gen GmEXP1.

4
Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp
cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển bộ rễ bằng
kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmEXP1
phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật
chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định
thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen

GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với
cây đối chứng.
Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu kỹ
thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong
nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư liệu
có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.
Về mặt thực tiễn
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so với
cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật
chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và những cây trồng
khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn.
Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự phát
triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết quả bước
đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng
chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống
cây trồng chịu hạn ở Việt Nam.


5
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI
TÁC ĐỘNG CỦA HẠN
1.1.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương
1.1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill (2n = 40) thuộc họ Đậu
(Fabaceae). Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc giống phụ G.Soja, chi
Glycine. Hiện nay, đậu tương trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống
địa phương và các giống nhập nội [3], [8].

Đậu tương là loại cây trồng thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá,
hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ bên, trên có nhiều
nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm của không
khí. Thân tròn, mang 8 - 14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân Đậu
tương là cây tự thụ phấn, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có màu trắng hay tím. Thời
kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và
thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Quả
đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi
chín có màu vàng hay xám đen. Hạt đậu tương có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài,
tròn dẹt; vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen [2], [3].
Cây đậu tương là cây trồng ngắn ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều
vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông
nghiệp để khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới. Trong suốt thời gian sinh
trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn. Yêu cầu về độ ẩm
đồng ruộng trung bình là 50 - 60%, giai đoạn ra hoa, hình thành quả phải đạt 70 -
80% nên đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng có nhu cầu về nước cao [2], [14].
Đối với ngành trồng trọt, đậu tương có khả năng tích luỹ đạm của không khí
để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt sần ở bộ rễ và
sinh khối thân, cành lá. Các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hoá

6
học và tăng độ phì nhiêu cho đất. Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu tương có tác
dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh,
chống nạn ô nhiễm do lạm dụng phân bón hoá học và thuốc trừ sâu [2], [5].
1.1.1.2. Tác động của hạn đối với cây đậu tương
Đậu tương tuy là cây trồng cạn nhưng cần nhiều nước cho quá trình sinh
trưởng và phát triển để có thể cho năng suất cao. Nhu cầu về nước tăng theo thời
gian sinh trưởng của cây cùng với sự tăng trưởng mạnh của thân, lá. Quá trình sinh
trưởng của cây phụ thuộc vào cường độ quang hợp, hiệu suất quang hợp, tổng diện
tích lá và thế năng quang hợp (thời gian lá xanh). Tổng sản phẩm quang hợp của cây

nếu bị thiếu nước sẽ giảm do tỷ lệ CO
2
hấp thụ trên một đơn vị diện tích lá giảm và
diện tích quang hợp giảm do sự phát triển của lá kém và chóng tàn [84]. Thiếu nước
trầm trọng ảnh hưởng tới sự hình thành diệp lục dị hình, giảm sự vận chuyển điện tử
trong quang phosphoryl hoá, ảnh hưởng hoạt tính các enzyme khác tham gia vào
quá trình đồng hoá carbon. Từ đó dẫn tới giảm hiệu quả quang hợp và sự tích luỹ
chất khô của cây [57], [84]. Nước rất cần cho sự phát triển bình thường của cây đậu
tương cả giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và giai đoạn sinh trưởng sinh thực.
Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ sử dụng nước ở pha nảy mầm và
cây con thấp do tán còn nhỏ. Nhu cầu nước tăng dần khi cây đạt 3 - 5 lá kép, tăng
nhanh khi bắt đầu bước vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực.
Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, cây rất nhạy cảm với tình trạng thiếu
nước. Phần lớn biến động về năng suất là do biến động về lượng nước cho cây trong
thời kỳ ra hoa đậu quả. Ở giai đoạn ra hoa, đậu quả nếu thiếu nước, hoa và quả non
bị rụng nhiều. Giai đoạn quả phát triển và hạt vào mẩy cần nhiều nước nhất, thiếu
nước ở giai đoạn này sẽ dẫn đến giảm kích thước hạt, năng suất giảm đáng kể. Nếu
thiếu nước xảy ra trước giai đoạn hạt phát triển, sau đó đủ nước thì quang hợp có
thể phục hồi, sinh trưởng có thể trở lại bình thường và hạt có thể phát triển tới kích
thước bình thường [5]. Theo Manavalan và cs (2009), năng suất của đậu tương giảm
từ 32 đến 44% nếu gây hạn ở giai đoạn làm hạt [84].

7
Khả năng cố định đạm ở các loài cây họ Đậu thường rất nhạy cảm đối với tình
trạng nước ở trong đất. Mất quá nhiều nước, cây đậu tương không chỉ giảm khả
năng cố định CO
2
, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định đạm cũng bị ảnh
hưởng nghiêm trọng, làm giảm sinh tổng hợp protein [101]. Quá trình cố định đạm
giảm một phần do lượng sản phẩm quang hợp chuyển về rễ giảm, một phần do ảnh

hưởng trực tiếp của thế nước ở trong nốt sần. Theo Huang và cs (1975), hoạt động
cố định đạm giảm khi thế nước giảm và ngừng lại khi trọng lượng nốt sần giảm
dưới 80% so với khi đủ nước [58].
Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định đạm trong điều kiện hạn đã được xác
định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O
2
giảm, nguồn carbon tới các nốt
sần giảm, hoạt tính của enzyme tổng hợp sucrose giảm, hàm lượng ure và amino acid
tự do tăng. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và nốt sần đã được xác
định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của nitrogenase giảm 70% trong
4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình quang hợp giảm khoảng 5%
[69]. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt
sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuếch tán oxy. Tình
trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá của cây đậu tương và
hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần [111].
1.1.2. Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương
1.1.2.1. Đặc điểm kiến trúc bộ rễ liên quan đến sự hấp thu nước
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy
nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu
tương, sự thích nghi với các điều kiện khô hạn chủ yếu thông qua việc phát triển rễ
trụ để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu. Hệ thống rễ phát triển
giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao, giàu dinh dưỡng [59].
Đậu tương là thực vật hai lá mầm có hệ rễ cọc phát triển gồm một rễ cái và
nhiều rễ bên. Rễ cái phát triển dài ăn xuyên vào lòng đất từ 30 - 50 cm. Rễ bên phát
sinh quanh cổ rễ, lan toả theo bề ngang xung quanh gốc, hút nước và khoáng trên
tầng đất mặt chừng 15 - 25 cm. Bộ rễ của đậu tương phát triển rất khoẻ theo từng
giai đoạn và cho thu hoạch thì rễ mới ngừng phát triển [5].

8
Sinh khối, mật độ, chiều dài và chiều sâu của rễ là các đặc điểm chính giúp

cho việc chống chịu hạn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng dưới tác động thiếu
nước của môi trường [46], [90], [111], [130]. Khả năng thu nhận nước của cây phụ
thuộc chủ yếu vào bộ rễ. Trong điều kiện khô hạn, những cây chịu hạn tốt thường
có bộ rễ khoẻ, dài, mập, có sức đâm xuyên sâu sẽ hút được nước ở những lớp đất
sâu hoặc rễ lan rộng với số lượng lớn. Khi ở giai đoạn cây non, thực vật thường
chịu tác hại mạnh của hạn vì bộ rễ chưa phát triển đầy đủ và còn yếu [13]. Các chỉ
tiêu về sự phát triển bộ rễ như chiều dài, thể tích rễ, khả năng đâm xuyên qua các
lớp đất sâu được Songsri và cs (2008) sử dụng để đánh giá và chọn lọc dòng lạc
có khả năng chống chịu hạn trong điều kiện khô hạn tự nhiên [114].
Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng đâm sâu của rễ đậu
tương là tỷ số kéo dài rễ trụ. Do rễ trụ được hình thành đầu tiên ở đậu tương nên
việc xác định các giống đậu tương có đặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác
định khả năng đâm sâu của rễ. Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tương có tỷ số
kéo dài rễ trụ cao cho thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu tốt hơn
nhiều so với các giống còn lại [46], [67], [117]. Một số nghiên cứu khác thực hiện
đối với hệ thống rễ bên của cây đậu tương cho thấy trong điều kiện hạn, số lượng rễ
bên trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ
không thay đổi [21], [53], [117].
Hạn chế về nước trong quá trình sinh trưởng thường làm tăng sinh khối của rễ,
từ đó làm tăng tỷ lệ rễ/thân. Nghiên cứu cho thấy ở cây đậu tương không được tưới
nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới nước. Ngoài ra, các
nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ giữa nhiều tính trạng rễ
như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ bên ở các giống chịu
hạn Những tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh
giá và nhận dạng các giống đậu tương có đặc tính chịu hạn [21], [46], [48], [119].
Ở cây đậu tương, khi khô hạn xảy ra trong pha sớm hay muộn của giai đoạn
sinh trưởng sinh thực làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, đặc biệt là hệ thống rễ ở
các lớp đất sâu. Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi khô hạn xảy
ra ở cuối giai đoạn sinh thực [55]. Một nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi

9
bị xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa sẽ cho năng suất hạt cao hơn những cây đậu
tương bị xử lý hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa. Điều này được giải thích là do chúng
đã phát triển bộ rễ đầy đủ để thích ứng với điều kiện hạn trước khi nở hoa [53]. Có
thể thấy rằng, cây đậu tương phát triển tốt bộ rễ ở những giai đoạn sớm của quá trình
sinh trưởng sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các điều kiện hạn.
Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Uga thực hiện chuyển gen DRO1 (Deeper
rooting 1) xác định tính trạng đâm xuyên sâu vào đất theo phương thẳng đứng của bộ
rễ từ giống lúa Kinandang patong chịu được khô cằn vào lúa trồng IR64. Kết quả trồng
thực nghiệm trong điều kiện khô hạn nghiêm trọng cho thấy, giống IR64 bị thiệt hại
hoàn toàn trong khi dòng IR64 chuyển gen chỉ giảm năng suất khoảng 30% [126].
Vai trò bộ rễ của thực vật nói chung và của cây đậu tương nói riêng được đánh
giá cao trong nhiều nghiên cứu cải thiện khả năng chịu hạn. Khi tổng quan về cơ
chế sinh lý và phân tử của đặc tính chịu hạn ở đậu tương, Manavalan và cs (2009)
cho rằng, việc xác định đầy đủ cơ chế của những đặc tính và tính trạng liên quan
đến khả năng chịu hạn, trong đó những đặc điểm liên quan đến bộ rễ là rất cần thiết
trong xây dựng chiến lược cải thiện khả năng chịu hạn của loại cây trồng này [84].
Năm 2013, Ha và cs dựa trên các chỉ tiêu về chiều dài rễ chính, thể tích bộ rễ và số
lượng rễ bên để đánh giá đặc tính chịu hạn và tiềm năng di truyền của giống đậu
tương mới DT2008 (giống lai chịu hạn tốt của Việt Nam) khi so sánh với giống đậu
tương William 82 [50]. Thu và cs (2014) cũng sử dụng tiêu chí phát triển kéo dài rễ
làm một trong những căn cứ quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng chịu
hạn của 13 giống đậu tương Việt Nam nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu về tiềm năng
các giống cho sản xuất đậu tương và kỹ thuật di truyền [119].
1.1.2.2. Khả năng hút nước của bộ rễ và một số đặc tính sinh lý liên quan
Khả năng hút nước của rễ trước hết phụ thuộc vào áp suất thẩm thấu của tế
bào lông hút. Áp suất thẩm thấu của tế bào lệ thuộc vào đặc điểm keo hoá chất
nguyên sinh thông qua một số quá trình sinh lý như: hô hấp rễ, tích luỹ chất khô, sự
trao đổi ion của rễ, hoạt động của các kênh vận chuyển tích cực trên màng tế bào
lông hút Khả năng hút nước của bộ rễ còn liên quan đến một số quá trình sinh lý

10

của cơ thể như cường độ thoát hơi nước qua lá, quá trình tổng hợp và tích luỹ chất
khô của cây Ngoài ra, sự hút nước của rễ còn phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh
như nhiệt độ, thành phần và nồng độ muối khoáng, độ ẩm môi trường [116].
Nước có thể bay hơi vào khí quyển qua tất cả các bộ phận của cây, nhưng quan
trọng và chủ yếu nhất là sự bay hơi nước qua bề mặt lá. Cường độ thoát hơi nước chủ
yếu phụ thuộc vào mức độ đóng mở lỗ khí. Thoát hơi nước là động lực phía trên đảm
bảo cho sự hút nước hút khoáng và dinh dưỡng, vận chuyển từ rễ lên các bộ phận
phía trên của cây. Sự thoát hơi nước qua khí khổng tạo ra sự chênh lệch áp suất nước
giữa tán và rễ cây (sự chênh lệch thế nước) [123].
Sự tăng trưởng của tế bào phụ thuộc vào những yếu tố sinh hoá ảnh hưởng tới
sự co giãn của thành tế bào và những yếu tố lý học kiểm tra sự phân tán của nước đi
vào tế bào. Thân cây sinh trưởng ban đêm mạnh hơn ban ngày, nhưng rễ sinh
trưởng ban ngày mạnh hơn, bởi vì rễ ít tiếp xúc với những bất lợi xảy ra ban ngày.
Ban ngày, rễ giữ sức căng cao hơn lá. Như vậy, ban ngày sự phát triển của lá do
thiếu nước giảm, những sản phẩm quang hợp được chuyển về rễ. Ban đêm, khí
khổng đóng dẫn đến sức căng tăng, tế bào phát triển mạnh hơn và trở thành cơ quan
chứa nhiều carbonhydrate hơn rễ và như vậy rễ sinh trưởng kém hơn. Song song với
quá trình tăng trưởng của tế bào, hoạt động tích luỹ chất khô cho cơ thể thực vật
tăng lên và áp lực hút nước mỗi tế bào và cả cơ thể nhờ đó cũng tăng lên [5].
Khả năng hấp thụ tích cực của nước từ đất vào lòng mạch lệ thuộc vào số
lượng và hoạt động của các kênh vận chuyển tích cực trên biểu bì vùng lông hút.
Cây có bộ rễ phát triển tốt, diện tích vùng lông hút lớn với nhiều kênh trên màng thì
khả năng hút nước càng cao [116], [123].
Guttikonda và cs (2014) nghiên cứu biểu hiện gen AtDREB1D phân lập từ
Arabidopsis trên cây đậu tương chuyển gen cho thấy, trong điều kiện bình thường
cây chuyển gen và không chuyển gen không có sự khác biệt đáng kể. Trong điều
kiện dần mất nước, cây đậu tương chuyển gen AtDREB1D duy trì được hàm lượng

nước cao hơn trong cây vì các dòng biến đổi gen có thể sử dụng nước chậm hơn,
nhờ vậy cây chậm héo và có tỷ lệ sống sót cao hơn 17 - 24% so với cây không
chuyển gen [49].

11

1.1.2.3. Đặc điểm nốt sần liên quan đến sự phát triển bộ rễ đậu tương trong điều
kiện hạn
Đối với thực vật thuộc họ Đậu, ngay từ giai đoạn cây mọc được vài tuần đã bắt
đầu từ rễ cái trước rồi đến rễ bên xuất hiện nốt sần, trong có chứa nhiều vi khuẩn
Rhizobium japonicum sống cộng sinh. Vi khuẩn Rhizobium có trong đất, xâm nhập
vào rễ cây qua lông hút, có nhiệm vụ tổng hợp đạm hữu cơ từ nitơ không khí. Thời
gian đầu, số lượng các nốt sần xuất hiện rất ít, sau đó ngày càng gia tăng theo đà tăng
trưởng của cây. Đến khi cây bắt đầu ra hoa và hình thành quả thì nốt sần rễ ngừng
phát triển [106], [139]. Số lượng nốt sần hình thành trong rễ đậu tương được Lim và
cs (2011) xác định là do ảnh hưởng của hai gen GmRIC1 và GmRIC2. Sản phẩm
biểu hiện của các gen trên là rhizobia trong tế bào lông hút thúc đẩy quá trình khởi
sinh hình thành và phát triển lan rộng của nốt sần [80].
Nghiên cứu của Xu và cs (2004) cho thấy, tình trạng thiếu nước nghiêm trọng
gây hạn chế về tỷ lệ cố định đạm của nốt sần rễ đậu. Sự cố định đạm của nốt sần có
liên quan đến một số quá trình sinh lý trong đó có tỷ lệ đồng hoá carbon trong quá
trình quang hợp. Tuy nhiên, trong điều kiện khô hạn ở mức độ cho phép, thực vật
thuộc họ Đậu vẫn duy trì được khả năng cố định đạm từ nitơ không khí. Nhờ đó tăng
cường quá trình tích luỹ chất khô cho bộ rễ, tăng áp suất thẩm thấu cho tế bào và cơ
thể. Đặc tính này là một ưu thế ở những thực vật thuộc họ Đậu góp phần tạo sinh khối
cho cây giúp cây khoẻ mạnh vượt qua những điều kiện bất lợi phi sinh học của môi
trường [57], [139].
Nghiên cứu của Ladrera và cs (2007) về khả năng cố định đạm ở nốt sần rễ đậu
tương cho thấy, hầu hết các giống đậu tương đều tích luỹ đạm mạnh mẽ trong điều
kiện được cung cấp nước đầy đủ. Sự cố định đạm rất nhạy cảm với độ khô của đất và

tỷ lệ đồng hoá carbon. Trong giai đoạn đầu gây hạn nhân tạo, quá trình cố định đạm ở
giống đậu tương Biloxi chịu hạn kém sớm bị đình trệ trong khi ở giống đậu tương
Jackson chịu hạn tốt, hoạt động cố định đạm vẫn diễn ra bình thường. Quá trình tích
luỹ đạm và carbon thực hiện trước khi hạn hán xảy ra quyết định lớn đến khả năng
chống chịu hạn ở các giống đậu tương [70].
Khả năng tích luỹ đạm và carbon trước và trong khi xảy ra khô hạn được sử
dụng làm căn cứ chọn tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn. Hàm lượng

12

ure ở cuống lá được xem là một trong những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu
tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn trong điều kiện khô hạn. Bằng cách sàng lọc
số lượng lớn các dòng đậu tương dựa vào hàm lượng ure cuống lá, Sinclair và cs
(2007) đã chọn được 8 dòng đậu tương có khả năng cố định đạm tốt. Trồng thử
nghiệm để đánh giá khả năng chịu hạn trong điều kiện nhà kính và khô hạn tự nhiên
cho thấy, các dòng cố định đạm tốt đều có khả năng chịu hạn và cho năng suất cao
hơn các giống đối chứng. Giống đậu tương Jackson chịu hạn và có khả năng cố định
đạm cao, đã được dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có
năng suất cao ở các điều kiện hạn [112].
Nghiên cứu của Serraj và cs (2003) cho thấy, trong giai đoạn đầu của khô hạn,
sự cố định đạm của nốt sần rễ đậu phụ thuộc vào khả năng đồng hoá carbon, làm
tăng cường khả năng hình thành và tích luỹ chất khô cho các tế bào bộ rễ, trong đó
có một số loại amino acid ưa nước (như serine, tyrosine) dẫn đến hiệu quả tăng
cường khả hấp thụ nước cho bộ rễ và thay đổi kích thước bộ rễ [109].
Hiểu biết về các cơ chế sinh lý và quá trình điều hoà di truyền của sự thích
nghi của bộ rễ dưới điều kiện hạn, xác định các gen đặc hiệu liên quan đến sự phát
triển bộ rễ mở ra triển vọng sử dụng cho việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây
trồng bằng kỹ thuật chuyển gen.
1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT
1.2.1. Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ

Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn về mặt sinh lý, hoá sinh và cấu trúc tế bào đã
phát hiện hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức độ khác nhau, trong các
giai đoạn phát triển khác nhau của cây đậu tương. Điều này chứng tỏ tính chịu hạn
của thực vật do nhiều gen quy định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác
nhau. Cho đến nay các nhà khoa học vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự
quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến đặc tính
chịu hạn của cây đậu tương [13]. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương có liên quan
chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của chất nguyên sinh, đặc điểm của quá trình trao
đổi chất, sự biến đổi hình thái sinh lý của cơ thể để thích nghi với điều kiện sinh
thái bất lợi [84]. Khả năng chịu hạn của thực vật thể hiện ở nhiều khía cạnh khác
nhau như: sự phát triển của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, bản chất di truyền của