thiết kế vector mang cấu trúc gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM



NGUYỄN ĐỨC HÀO


THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1
LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ
CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
Glycine max (L.) Merrill




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM



NGUYỄN ĐỨC HÀO


THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1
LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ
CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
Glycine max (L.) Merrill
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu





Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai
công bố trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn




Nguyễn Đức Hào



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thanh Sơn, Trường Đại học Tây
Bắc đã đóng góp những ý kiến quý báu và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong
quá trình tiến hành thí nghiệm để hoàn thành đề tài luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di
truyền&Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm –Đại
học Thái Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật,

Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ
sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Phù Lưu, Tuyên
Quang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành
khoá học.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên
khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.

Tác giả luận văn




Nguyễn Đức Hào


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


iii
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục bảng v
Danh mục hình vi
Các ký hiệu dùng trong luận văn vi

MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả năng chịu hạn 3
1.1.1. Chọn giống đậu tương chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm 4
1.1.2. Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật 5
1.1.3. Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen 6
1.2. Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tương 7
1.2.1. Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương 7
1.2.2. Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tương 10
1.2.3. Vector chuyển gen ở thực vật 11
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Vật liệu và thiết bị 14
2.1.1. Vật liệu 14
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 15
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2.1. Phân lập gen 16
2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


2.3. Phương pháp thiết kế vector 25
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Phân lập gen GmEXP1 bằng kỹ thuật RT-PCR 27
3.1.1. Nhân bản đoạn mã hoá của gen GmEXP1 27
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmEXP1 27
3.1.3. Kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 33
3.1.4. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 34
3.2.2. Kết quả cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3 40

3.2.3. Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1 41
3.2.4. Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng HindIII 42
3.2.5. Kết quả cắt plasmid pCB301 bằng HindIII 43
3.2.6. Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 44
3.2.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen
GmEXP1 45
3.3. Kiểm tra hoạt động của vector mang cấu trúc GmEXP1 trên cây thuốc
lá mô hình 47
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc GmEXP1 vào cây thuốc lá 47
3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen GmEXP1 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 3
Bảng 2.1. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 17
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR 18
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 18
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony – PCR 20
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 20
Bảng 2.6. Thành phần gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng pBT 21
Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 22
Bảng 2.8. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 24
Bảng 3.1. Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương SL1 14
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 15
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1 28
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel đoạn mã hoá của gen GmEXP1 29
Hình 3.3. Ảnh khuẩn lạc 31
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 32
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp 33
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 34
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmEXP1 của giống đậu
tương SL1 và AF516879 36
Hình 3.8. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 giữa giống SL1
và AF516879 37
Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1 38
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng NotI + NcoI 40
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng HindIII 42
Hình 3.12. Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII 43
Hình 3.13. Hình điện di sản phẩm colony- PCR 45
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 47
Hình 3.15. Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá 49
Hình 3.16. Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá 50
Hình 3.17. Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi
CÁC KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN

BAP 6- benzyl amino purine
bp Base pair
DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid
đtg Đồng tác giả
E. coli Escherichia coli
GM Germination medium - Môi trường nảy mầm của hạt
GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen
GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen
HSG Heat Shock Granules
HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt
IBA Indole 3 - butyric acid
IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside
kb Kilo base
LB Luria Bertani
MS Môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Murashige và Skoog
MSI Dung dịch I (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS
MSII Dung dịch II (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS
MSIII Dung dịch III (sắt) dùng để pha môi trường MS
MSIV Dung dịch IV (muối vi lượng) dùng để pha môi trường MS
MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trường MS

NST Nhiễm sắc thể
OD Optical density


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi
RM Rooting medium - Môi trường ra rễ
TAE Tris - Acetate - EDTA
Taq Thermus aquaticus
v/p vòng / phút
X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng thuộc họ Đậu, là
cây trồng ngắn ngày. Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng và có giá trị kinh tế
cao, với tỉ lệ 30% - 56% protein; 12% - 25% lipid; 36% - 40% hydrat cacbon.
Ngoài ra hạt đậu tương còn chứa các loại amino acid không thay thế như:
cystein, lysine, triptophan, leucine, methyonine. Từ hạt đậu tương người ta có
thể chế biến ra khoảng 600 sản phẩm khác nhau bằng các phương pháp cổ
truyền, thủ công hoặc hiện đại. Do nguồn nguyên liệu trong nước chưa đáp
ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp chế biến, cho nên nước ta vẫn phải
nhập đậu tương từ một số quốc gia trên thế giới.
Mặt khác luân canh cây đậu tương với cây ngũ cốc sẽ có tác dụng phá

vỡ sự độc canh của cây lương thực, cắt đứt sự lây lan nguồn bệnh ở đất từ vụ
trước sang vụ sau, giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra. Rễ đậu tương là nơi khu
trú của vi khuẩn cộng sinh tiết enzym nitrogenase có khả năng cố định nitơ tự
do cung cấp cho cây, đồng thời góp phần cải tạo đất.
Do biến đổi khí hậu, hạn hán nắng nóng kéo dài đã tác động xấu đến
sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương. Chính vì vậy nghiên cứu tuyển
chọn giống đậu tương chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu
tương là rất cần thiết. Theo hướng nghiên cứu này, Nguyễn Thị Thuý Hường
và đtg (2009) đã phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính
chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [3]. Năm 2003,
Lee và đtg đã phân lập được gen GmEXP1 mã hoá protein expansin và
protein expansin được xem là một trong số các nhân tố chính làm dãn thành tế
bào thực vật bằng cách làm kéo giãn các liên kết polymer tại vùng sinh trưởng


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
của mô [23]. Phát hiện trên đã cung cấp dữ liệu quan trọng cho hướng nghiên
cứu làm tăng diện tích tiếp xúc của rễ với giá thể để nâng cao hiệu quả lấy
nước của hệ rễ cây đậu tương.
Chính vì vậy ý tưởng nghiên cứu xác định biện pháp làm tăng cường
khả năng hút nước của hệ rễ theo cách tiếp cận tăng áp suất thẩm thấu và diện
tích tiếp xúc của hệ rễ phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hệ rễ phát
triển, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận văn là: “Thiết kế vector
mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ
chuyển gen ở cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 liên quan đến sự
phát triển bộ rễ đậu tương và chuyển vào cây thuốc lá.

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA từ mRNA;
3.2. Nhân gen GmEXP1 từ cDNA, tách dòng và xác định trình tự đoạn mã
hoá của gen GmEXP1 phân lập từ cây đậu tương;
3.3. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 và biến nạp vector
chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
3.4. Chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và kiểm
tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR.




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chọn giống đậu tƣơng theo định hƣớng nâng cao khả năng chịu hạn
Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây
mất nước trong cây. Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra
trong tế bào. Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu
nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá
trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học
dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết. Nói chung hạn hán ảnh hưởng đến
mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu tương thì giai đoạn
tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng hợp protein diễn ra
mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý nghĩa lớn quyết định năng

suất. Trước thực tế trên việc xác định các hướng nghiên cứu tăng cường tính
chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo giống chống chịu được quan tâm.
Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu cũng
như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở Việt
Nam. Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động và có
xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu tương
gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

2007
2008
2009
2010
2011
2012*
2013*
Diện tích
(1000ha)
190,1
192,1
146,2
197,8
173,6
200
230
Năng suất
(tấn/ha)
1,45
1,39

1,46
002
1,46
1,5
1,52
Tổng sản lượng
cả năm (tấn)
275,5
267,6
213,6
296,9
254,2
300
350
Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo [31]


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
1.1.1. Chọn giống đậu tƣơng chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm
Dựa vào nguồn tác động mà người ta phân ra thành đột biến tự nhiên
hay đột biến nhân tạo (Kodym và đtg, 2003) [22], dựa vào tính chất biến đổi
cấu trúc của cơ sở vật chất di truyền mà người ta chia đột biến thành đột biến
gen hay đột biến nhiễm sắc thể. Đột biến tự nhiên phát sinh với tần số thấp,
để khắc phục nhược điểm này người ta đã sử dụng các tác nhân gây đột biến
(tác nhân vật lí, hóa học) nhằm làm tăng tần số lên hàng 100.000 lần để tạo
nguyên liệu cho quá trình chọn lọc (Kodym và đtg, 2003) [22]. Nghiên cứu
cải tiến giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ra đời từ
những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng chỉ 30 năm gần đây mới phát triển mạnh

và có hiệu quả trong lĩnh vực tăng năng suất và phẩm chất giống cây trồng,
góp phần không nhỏ vào đời sống con người. Đối với cây đậu tương tại Việt
Nam, Trần Đình Long và đtg (1995) [4]. Tạo giống đột biến M103, ra từ
giống đậu tương V70 bằng cách sử dụng phương pháp xử lý đột biến điểm
bằng ethilenimin nồng độ 0,01%. Sau đó, giống này đã được chọn thuần lại,
khảo nghiệm và công nhận là giống quốc gia, trồng được cả 3 vụ trong năm
nhưng thích hợp nhất là vụ hè. Sau 7 năm khảo nghiệm liên tục (1998-2004)
tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, các tác giả Viện Di truyền nông nghiệp đã
sản xuất thành công giống đậu tương chịu hạn mới – DT96 có khả năng chịu
hạn tốt và năng suất cao. Hiện nay giống đậu tương này đang được trồng phổ
biến ở nhiều vùng canh tác và được Bộ NN&PTNN công nhận chính thức là
giống quốc gia vào tháng 7/2004. Chu Hoàng Mậu (2001) [6] đã sử dụng tia
gamma, hóa chất NMU, EI với các liều lượng khác nhau đã tạo được các đột
biến về hình thái, sinh lý cũng như đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể, từ 60
dòng đột biến đậu tương đánh giá và chọn lọc qua 5 thế hệ đã thu được 4
dòng đậu tương với những đặc tính nông sinh học ưu việt như chín sớm (dòng
ML59, ML 61), có khả năng chịu hạn (dòng ML48, ML61).


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
1.1.2. Chọn dòng đậu tƣơng chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật
Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn
năng của tế bào. Mỗi một tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang đầy đủ
thông tin di truyền để phát triển thành một cơ thể hoàn thiện. Cơ sở thứ hai là
môt hoặc quần thể tế bào muôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào
không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể
thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi.
Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay đổi đó ở mức độ cơ

thể. Thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu
nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành
một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi di truyền do ảnh hưởng
của các yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng.
Tế bào nuôi cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn vì thế có thể chọn được
các cá thể đột biến nhanh hơn và hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn
giống thông thường khác áp dụng trên cây nguyên vẹn. Kỹ thuật nuôi cấy mô
và tế bào còn cho phép làm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn được
những cá thể mang tính trạng mong muốn (Nguyễn Đức Thành, 2000) [8].
Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma bao gồm
nuôi cấy mô sẹo, nuôi cất tế bào huyền phù và nuôi cấy tế bào trần. Hạn
chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt
để do kích thước khối mô lớn và không đồng nhất. Để đạt được hiệu quả
cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thức nhỏ và đều nhau, kích
thước thường dùng các khối mô sẹo có đường kính 1- 3nm để xử lý và
chọn dòng chống chịu (Lê Trần Bình và đtg, 1998) [1]; Đinh Thị Phòng,
2001 [7]; Dix và đtg, 1986 [17].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
Người ta đã sử dụng các phương thức chọn dòng tế bào như chọn trực
tiếp, chọn gián tiếp và chọn tổng thể. Hướng nghiên cứu chọn dòng tế bào
chống chịu ở thực vật đã thu được nhiều thành tựu, trong đó đã có sự thành
công tạo ra dòng cây chịu hạn, chịu lạnh, chịu nóng.
1.1.3. Chọn dòng đậu tƣơng chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen
Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu và
thành công trên nhiều đối tượng giống cây trồng như: chuyển gen thông qua
Agrobacterium tumefacins (A. tumefaciens), chuyển gen trực tiếp bằng hóa

chất, xung điện, súng bắn gen, chuyển gen bằng vi tiêm, chuyển gen qua ống
phấn, chuyển gen bằng ủ dung dịch hạt khô với dung dịch DNA …. Nhưng
hai phương pháp chuyển gen thành công nhất là chuyển gen trực tiếp bằng
súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Những nghiên cứu về đậu tương chuyển gen trên thế giới chủ yếu tập
trung vào các nhóm tính trạng, như tính kháng thuốc diệt cỏ, tính kháng
sâu bệnh, tính chịu hạn hay việc tạo ra các giống đậu tương có hàm lượng
các amino acid chứa lưu huỳnh cao, cải thiện chất lượng protein của đậu
tương (Zeng P và đtg, 2004) [16]. Với rất nhiều nghiên cứu này cùng
những kết quả đã đạt được, đậu tương trở thành một trong những cây trồng
biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất. Vào năm 1997, cây đậu
tương kháng thuốc diệt cỏ glufosinate và gen tăng hàm lượng axit oleic lần
đầu tiên được thương mại hóa. Trong số diện tích đậu tương chuyển gen thì
75% được trồng ở Bắc Mỹ. Riêng ở Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc
diệt cỏ chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương. Còn ở châu Á, đậu tương
kháng thuốc diệt cỏ chiếm 6% tổng sản phẩm cây trồng biến đổi gen. Năm
2004, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu ha chiếm
60% diện tích cây trồng biến đổi gen.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Ở Việt Nam, ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trên cây đậu tương mới chỉ
tập trung nghiên cứu quy trình chuyển gen đối với một số giống đậu tương
trong nước và nhập khẩu (Trần Thị Cúc Hòa (2007) [2], tạo cây chuyển gen
mang cấu trúc gen P5CS của Nguyễn Thị Thuý Hường năm 2009 [3], …
1.2. Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tƣơng
1.2.1. Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh

học, việc ứng dung kỹ thuật di truyền nhằm nâng cao khả năng chống chịu
vớ các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh đã và đang thu được các kết quả
khả quan của cây trồng. Việc sử dụng các gen liên quan đến chống chịu đã
được thiết kế chuyển vào hệ thống thực vật, cải thiện mức độ chống chịu
các điều kiện bất lợi của một số giống cây trồng. Gần đây các nghiên cứu
đã phát hiện rằng sự tác động của tác nhân bất lợi có liên quan đến sự biểu
hiện của một số gen đó là: nhóm gen mã hóa protein chức năng liên quan
trong trao đổi các chất thẩm thấu, các protein bảo vệ,… Nhóm nhân tố điều
hòa sự phiên mã (transcription factors) và nhóm nhân tố tín hiệu
(singnaling factors). Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa
phosphoryl hóa các protein. Một số protein kinase đã được mô tả như nhân
tố truyền tín hiệu (singnal transduction factor) liên quan đến phản ứng
thẩm thấu ở thực vật. Trong đó, SnRK2 (SNF1 – related protein kinase 2)
là protein liên quan đến các phản ứng thích nghi với điều kện bất lợi của
môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA (Umezawa và đtg, 2004
[29]; Hiroaki Fujii và đtg, 2009) [20]. Một số nghiên cứu cũng đã chứng
minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến phản ứng điều kiện
khô hạn của cây trồng (Umezawa và đtg, 2004) [29].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Protein chịu nóng (Hsp) chịu nóng, muối và nhiệt độ cao, tích tụ
nước, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào (Vierling và đtg,
1992 [30], Thomashow 1998) [28]. Hsp có 5 loại: Hsp100, Hsp90, Hsp70,
Hsp 60 và sHsp. sHsp không chỉ được nhấn mạnh trong phản ứng với độ
nóng mà còn với nước, muối, quá trình oxi hóa và nhiệt độ thấp (Sabehat
và đtg, 1998 [26], Hamilton và đtg, 2001) [18]. sHsp và Hsp đóng vai trò
thấp (Sabehat và đtg, 1998 [26], Hamilton và đtg, 2001) [18]. sHsp và Hsp

đóng vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chống chịu trong điều
kiện bất lợi của môi trường.
Khi cây trồng gặp các điều kện ngoại cảnh bất lợi như: nóng, lạnh, phèn,
mặn, hạn, … làm cho tế bào bị mất nước. LEA (Late embryogenesis abundant
protein) là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối
của quá trình hình thành phôi, nó là một trong những nhóm protein quan trọng
liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào, nhóm gen mã hóa loại protein
LEA còn đóng vai tròn quan trọng trong hạt. Khi hiện tượng mất nước xảy ra,
gen LEA phiên mã một lượng lớn mRNA và protein LEA được tổng hợp.
Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá trình mất nước sinh lý khi hạt
chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất
lợi gây ra (Trần Thị Phương Liên [5], close T.J, 1997 [10], Procel và đtg,
2005) [27]. Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi axit absisic
(ABA) và mức độ mất nước của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào. Nhiều
gen LEA đã được nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng. LEA được chia
thành các nhóm sau: nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn gọi là dehydrin) ( Close
T.J.1997) [10], nhóm 3- D7; nhóm 4- D113; nhóm 5-D29; nhóm 6-D95 (Trần
Thị Phương Liên và đtg, 1999 [5], Close T.J, 1997 [10]). Khi điều kiện mất
nước xảy ra, protein LEA được tổng hợp với số lượng lớn, trong đó dehydrin
có thể chiếm tới 1% tổng số protein hòa tan của hạt (Close T.J, 1997) [10].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và đtg của trường Đại học Tự
nhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương từ
mRNA với kích thước 2148 bp. Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng
hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên [3].
Năm 1998, Ji Hoon Ahn và đtg phát hiện gen Sb-HRGP3 dài 1.353 bp ở

đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh trong
mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ. Ở rễ thứ
cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính. Rất có thể, sự biểu hiện
của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [9].
Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng
chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko
Watanabe và đtg (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế
liên quan đến rễ và chồi. Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các
tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với
các cơ chế kháng hạn. Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan
trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên
quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương. Nghiên cứu phân lập và
đọc trình tự gen chaperonin từ giống đậu tương chịu lạnh Bonminori - Nhật
Bản với kích thước phân tử 1,6 kb của Nông Văn Hải và đtg (1997) [25], của
Trần Thị Phương Liên và đtg (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống
đậu tương địa phương chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotid mã hoá
cho 533 axit amin [5]. Nguyễn Thu Hiền và đtg (2005) phân lập gen dehydrin
với kích thước 751 bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương
vàng Mường Khương và Cao Bằng 4. Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg đã phân


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây đậu tương Việt Nam (2011) [3].
Hạn hán luôn là thử thách lớn đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây
đậu tương, ảnh hưởng lớn tới năng suất sinh học cũng như năng suất kinh tế
của cây đậu tương. Để khắc phục thực trạng trên thì việc nghiên cứu chọn tạo

giống đậu tương theo hướng tăng cường khả năng biểu hiện của gen liên quan
đến tính chịu hạn là biện pháp có tính hiệu quả cao. Đã có nhiều gen liên quan
đến tính chịu hạn đã được phân lập như P5CS, DREB2, DREB5, TCS, CCTδ,
Sb-HRGP3, GmEXP1, GmEXP2… đây sẽ là nguồn nguyên liệu làm cơ sở để
tạo cây chuyển gen nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương.
1.2.2. Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tƣơng
Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu phân lập gen GmEXP1 từ mRNA của
cây đậu tương với kích thước 1089 bp và năm 2011 ông và các cộng sự đã
nghiên cứu biểu hiện của gen GmEXP1 liên quan đến việc kéo dài rễ của cây
đậu tương. Expensin là protein có chức năng mở rộng thành tế bào và đã được
coi là protein chủ yếu có ảnh hưởng đến việc kéo dài tế bào rễ. Nghiên cứu
của Cosgrove et al. (1993, 1996, 1998) [11, 12, 13] đã chỉ ra rằng expensin có
vai trò làm tăng kích thước tế bào thực vật , làm nới lỏng thành tế bào. Ngoài
ra enzyme và các tác nhân khác cũng làm tăng cường mở rộng thành tế bào
[14, 15]. Kéo dài tế bào gây ra bởi môi trường có tính acid và expansin với
vai trò mở rộng thành tế bào đã tìm thấy ở nhiều đối tượng thực vật khác
nhau, như tảo, rêu, dương xỉ, cây hạt trần và cây hạt kín, vì vậy có thể coi
expansin giữ vai trò quan trọng trong việc làm giãn tế bào. Các expensin thực
vật trong họ expansin làm biến đổi thành tế bào có nguồn gốc tiến hoá như
nào vẫn còn là bí ẩn [24]. Nhiều gen đã được phân lập từ hệ gen của một loạt
các loài thực vật và kết quả thu được đã chỉ ra rằng chúng tạo thành một họ


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
gen expansin [3]. Li et al. (2000) [24]. Đã phân loại expansin thành ba họ α-,
β- và γ-expansin, dựa vào mối quan hệ phát sinh loài của chúng. Kết quả
nghiên cứu của Kam et al. (2005) [21] cũng cho thấy hai gen EXP1 và
EXPB2 liên quan đến sự tăng trưởng và phát triển của rễ. Lee et al. (2003)

[23] lần đầu tiên xác định được mối liên quan của expansin với sự kéo dài rễ
của cây đậu tương và cho biết mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh
trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo
dài rễ diễn ra rất nhanh. Phân tử mRNA của gen GmEXP1 có nhiều nhất trong
phần đầu rễ, nơi xảy ra sự kéo giãn tế bào và khan hiếm ở miền trưởng thành -
nơi chấm dứt sự kéo giãn tế bào. Bằng phép lai tại chỗ, tác giả nhận định, sản
phẩm phiên mã của gen GmEXP1 có nhiều trong các tế bào biểu bì và các lớp
tế bào miền sinh trưởng của cả rễ cọc và rễ bên. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của cây
đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của rễ chính và rễ thứ cấp [23].
Protein EXP1 có hai vùng chức năng DPBB và Pollen allerg, số lượng
và trình tự amino acid của mỗi vùng có tính đặc trưng và quyết định mức độ
hoạt động của expansin trong quá trình phát triển của rễ cây đậu tương vẫn
chưa được làm sáng tỏ mặc dù đã được nghiên cứu nhiều. Hướng tiếp cận
nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là
sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các
lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều khiển hoạt động kéo dài và trưởng thành
của cây cũng sẽ được quan tâm.
1.2.3. Vector chuyển gen ở thực vật
Cả A.tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes đề được sử dụng để
chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-
plasmid đã được phát triển. Các vector này không chứa bất kỳ trình tự ung thư


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng bình thường sau khi chuyển
DNA vào nhân của nó. Các vector này không gây ung thư hiện đang sử dụng
có thể chia làm hai loại là Cis và Trans, dựa vào việc có hay không các vùng

T-DNA nằm ở mép các trình tự lặp trực tiếp 25 bp trên cùng đơn vị tái bản
như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán. Trước đây loại plasmid
thường được đề cập đến là vector liên hợp, tuy nhiên gần đây vector nhị thể
lại phổ biến hơn.
Cis vector: là vector có nguồn gốc T-plasmid kiểu dại mà gen onc trên
T-DNA đã được loại bỏ và trong một số trường hợp được thay thế bằng một
đoạn DNA đặc hiệu có vùng tương đồng với vector tạo dòng nhỏ mà chỉ có
thể tái bản ở E. coli. Chiến lược tạo vector này phụ thuộc vào sự liên hợp
trong A.tumefaciens giữa các vùng tương đồng trên T-plasmid đã sửa đổi (hỗ
trợ mang gen vir) và một vector tạo dòng nhỏ ở E.coli (vector trung gian)
mang gen marker chọn lọc sẽ hoạt động chức năng trong các tế bào thực vật
và các trình tự duy nhất cho việc xen DNA ngoại lai vào. Vector trung gian
mang trình tự DNA ngoại lai thường được đưa vào A.tumefaciens bằng sự
tiếp hợp và bằng sự chọn lọc thích hợp sẽ thu được thể nhận tiếp hợp với
DNA ngoại lai đã ổn định trong T-DNA là kết quả của tái tổ hợp tương đồng.
Vector nhị thể: vector Trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các
plasmid có thể tái bản cả ở E.coli và A.tumefaciens, các plasmid này có chứa
các trình tự biên của T-DNA. Các vector này được thiết kế sao cho các trình
tự biên cạnh MCS cho phép xen các DNA ngoại lai vào và các marker cho
phép chọn lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp. Plasmid có thể
được thao tác ở E.coli và được chuyển vào qua sự tiếp hợp với các dòng
Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir nhưng thiếu T-DNA và các
trình tự lặp 25 bp các plasmid như thế thường là các thể đột biến mất đoạn


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
đơn giản của Ti-plasmid otopine kiểu dại hoặc kiểu nopaline. Việc chuyển
DNA ngoại lai trên vector tạo dòng và tế bào thực vật có thể được thực hiện

do hoạt động chức năng của vùng vir.
Vector biến nạp sử dụng Agrobacterium rhizogenes: các vector này
sử dụng đầu tiên khi biến nạp vào các loại thực vật mà sự tái sinh toàn bộ cơ
thể từ các tế bào đơn lẻ là khó khăn. Ở một số loài, sự tái sinh có thể xảy ra từ
sự nuôi cấy rễ gây ra bởi Agrobacterium rhizogenes thông qua sự phát triển
phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan. Cơ chế kiểu hình lông rễ bị ức chế làm
phát sinh hình thái chồi hiện nay còn chưa rõ, thực vật tái sinh từ lông rễ
thường bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ thống rễ bị ăn nghiên, sinh
trưởng cằn cỗi khả năng sinh sản kém.










Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
Nguyên liệu thực vật
Sử dụng hạt của giống đậu tương chịu hạn do Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm cung cấp. Hạt có

dạng hình cầu, màu vàng nhạt, rốn hạt có màu nâu, kích thước rốn là 4 mm
(Hình 2.1).



Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tƣơng SL1

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 do phòng Công nghệ tế
bào thực vật của, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ
gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam cung cấp.
Các vector và chủng vi khuẩn sử dụng
Vector pBT; vector pRTRA7/3; vector pCB301 do phòng Công nghệ
tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen,


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam
cung cấp.
Chủng vi khuẩn E.coli DH5α và Agrobacterium tumefaciens do phòng
Công nghệ tế bào thực vật của viện Công nghệ sinh học cung cấp.


pCB301_Kan
5562 bp
AvaI 5376
AvaI 5331
AvaI 632

BamHI 5325
ClaI 5362
EcoRI 5343
HindIII 5295
HindIII 5355
NcoI 4187
NotI 99
PstI 5341
PstI 5311
PstI 3808
SmaI 5333
SfiI 2290
PvuI 4813
oriV
nptIII
TrfA
RB
Nos promoter
nptIII
Nos terminator
ocd
lacZ
MCS of pBluescript
LB

Plasmid pBT Plasmid pRTRA7/3 Plasmid pCB301

Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2. Hoá chất và thiết bị

Hoá chất
Trizol Reagents Kit (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA; Plasmid
Extraction Kit (của hãng Bioneer, Hàn Quốc); các enzyme hạn chế của hãng
Fermentas (Hàn Quốc).
KCl, Tris HCl, MgCl
2
, MgSO
4
, EDTA, NaOH, CaCl
2
, NaCl, X- gal,
Glycerol, Ethanol 70%, yeast extract, agarose, glucose, nước khử ion.
Các loại kháng sinh: kanamycin, cefotaxim.
Môi trường GM, MS đặc, RM, MS lỏng không đường.
Các chất điều tiết sinh trưởng: BAP, IBA, …
Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosytem, Mỹ), máy điện di
Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini – transllumminatior, Bio-