Khảo sát các điều kiện ban đầu để xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan thủy tiên tím(dendrobium amabile) sạch virus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BAN ĐẦU ĐỂ XÂY
DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN
THỦY TIÊN TÍM (DENDROBIUM AMABILE)
SẠCH VIRUS
SVTH: TRẦN THỊ LỆ THỦY
MSSV: 60604409
CBHD: ThS.NGUYỄN XUÂN DŨNG
KS.NGUYỄN PHÚC TRƯỜNG
TT CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP.HCM
TP HỒ CHÍ MINH 1/2011
iii
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ, động viên của gia đình, thầy cô, các anh hướng dẫn. Xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất đến:
Thạc sĩ Nguyễn Xuân Dũng – Phó trưởng phòng Công nghệ Sinh học Thực vật,
Trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM – đã đồng ý cho tôi thực hiện đề tài này tại
phòng thực vật trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM, anh đã rất tận tình giúp đỡ,
góp ý và động viên tôi trong quá trình làm việc.
Kỹ sư Nguyễn Phúc Trường – nhân viên phòng CNSH Thực vật, Trung tâm
công nghệ sinh học Tp.HCM – đã hướng dẫn tận tình giúp tôi quen dần với môi trường
làm việc ở đây và luôn theo sát chỉ bảo tôi.
Các anh chị kỹ thuật viên của trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể
sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.
Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM
cùng các thầy cô của trường đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập.
Bố mẹ và em tôi luôn sát cánh, động viên tinh thần, giúp đỡ về mặt tái chính để

tôi có thể an tâm thực hiện tốt luận văn.
Các bạn lớp HC06BSH trường Đại học Bách Khoa đã cùng học tập, trao đổi,
góp ý giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
iv
TÓM TẮT
Sử dụng phương pháp RT – PCR thanh lọc được nguồn mẫu sạch, làm nguyên
liệu ban đầu cho kỹ thuật nhân giống in vitro cây lan Thủy tiên tím. Đoạn thân mang
chồi bên được khử trùng bằng dung dịch Canxi Hypochloride ở các nồng độ khác nhau
và sử dụng các biện pháp bổ sung kháng sinh trong quá trình khử trùng và cô lập mẫu
có kích thước nhỏ để hạn chế sự nhiễm do vi khuẩn nội sinh trong mẫu cấy. Sau đó,
khảo sát sự ảnh hưởng của các loại chất điều hòa sinh trưởng BA (0, 2, 2.5 và 3 mg/l)
riêng lẻ và BA (2.5, 3, 4 mg/l) kết hợp với NAA 0.5 mg/l lên khả năng tăng trưởng của
chồi bên. Cuối cùng, sử dụng kỹ thuật RT – PCR để kiểm tra tình trạng sạch virus đối
với những chồi lan in vitro vừa tái sinh sau 8 tuần nuôi cấy.
Kết quả đã chọn lọc được mẫu cây lan Thủy tiên tím sạch virus từ bộ sưu tập để
sử dụng làm nguyên liệu ban đầu cho quy trình nhân giống in vitro. Xác đinh được
nồng độ Ca(OCl)
2
17%, thời gian khử trùng 30 phút kết hợp ngâm kháng sinh
Streptomycin trong 20 phút có khả năng khử trùng tốt nhất và tỷ lệ mẫu chết ít nhất.
Tiếp theo, thành công trong việc tăng trưởng chồi bên trên môi trường MS bổ sung BA
3 hay 4 mg/l kết hợp NAA 0.5 mg/l. Sau 8 tuần các chồi tái sinh được kiểm tra lại
bằng phương pháp RT – PCR khẳng định hoàn toàn sạch virus.
v
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC v
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix
Chương 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Yêu cầu đề tài 2
1.3. Nội dung thực hiện 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về giống lan Dendrobium 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2 Phân bố 3
2.1.3 Đặc điểm hình thái 3
2.1.4 Đặc điểm sinh thái 4
2.2. Sơ lược về lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) 5
2.2.1 Đặc điểm hình thái 5
2.2.2 Đặc điểm sinh thái 6
2.2.3 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự phát triển của thủy tiên tím 6
2.3. Giới thiệu tổng quan về virus 7
2.3.1 Cách gọi tên virus 7
2.3.2 Thành phần cấu tạo 8
2.3.3 Phương thức sinh sản và lan truyền 9
2.4. Sơ lược về virus thực vật 9
2.5. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan 10
2.5.1 Cymbidium mosaic virus (CyMV) 10
2.5.2 Odontoglossum ringspot virus (ORSV) 12
2.6. Sơ lược về phương pháp RT-PCR 15
2.7. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô 16
vi
2.7.1 Vài nét về kỹ thuật nuôi cấy mô 16
2.7.2 Các giai đoạn của nhân giống in vitro 17
2.7.3 Những thuận lợi và khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro 17
2.7.4 Một số phương pháp nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 18

2.7.5 Sơ lược về những kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro trên giống Dendrobium 20
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Vật liệu 23
3.1. 1. Mẫu thí nghiệm 23
3.1. 2. Địa điểm và thời gian thực hiện 23
3.1. 3. Thiết bị dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm 23
3.1. 4. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 23
3.2. Phương pháp 24
3.2. 1 Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus bằng phương pháp RT – PCR 24
3.2. 2 Khử trùng mẫu tạo nguồn mẫu ban đầu cho nhân giống in vitro 26
3.2. 3 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tăng trưởng chồi bên lấy từ đoạn thân
Thủy tiên tím 27
3.2. 4 Kiểm tra sự nhiễm virus của mẫu sau khi nuôi cấy 27
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1. Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus bằng phương pháp RT – PCR 28
4.2. Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu 29
4.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA lên sự tăng trưởng chồi bên cô lập từ
thân lan Thủy tiên tím. 32
4.4. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tăng trưởng chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên
tím. 34
4.5. Kiểm tra sự nhiễm virus của mẫu sau khi nuôi cấy 36
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
5.1. Kết luận 37
5.2. Đề nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
PHỤ LỤC 2
vii
CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4 – D 2,4 – Dichlorophenoxyaxetic acid
BA Benzyladenine

BAP Benzylaminopurine
cDNA Complementary Deoxynucleotide Acid
CĐHST Chất điều hòa sinh trưởng
cs cộng sự
Strep Kháng sinh Streptomycin
CyMV Cymbidium Mosaic Virus
DAI Days After Inoculation
NAA Naphthalene acetic acid
ORSV Odotoglossum Ringspot Virus
PCR Polymerase Chain Reaction
PLB Protocorm-like body
RNA Ribose Nucleotide Acid
RT Reverse Transcription
TAE Tris-acetate-EDTA
TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1: Các thành phần phản ứng multiplex RT – PCR 25
Bảng 3. 2: Chu kỳ nhiệt của phản ứng multiplex RT - PCR 25
Bảng 3. 3: Các nồng độ Ca(OCl)
2
không kết hợp kháng sinh 26
Bảng 3. 4: Các nồng độ Ca(OCl)
2
kết hợp kháng sinh 27
Bảng 4. 1: Tỉ lệ sống vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy chồi bên từ cây lan Thủy tiên tím. 29
Bảng 4. 2: Tỉ lệ sống vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy chồi bên cô lập từ cây lan Thủy
tiên tím. 30
Bảng 4. 3: Tỉ lệ sống vô trùng của chồi bên cô lập từ thân Thủy tiên tím với các nồng
độ Ca(OCl)

2
có kháng sinh sau 7 ngày nuôi cấy 31
Bảng 4. 4: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi
trường MS bổ sung BA 33
Bảng 4. 5: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi
trường MS bổ sung BA và NAA sau 2 tuần nuôi cấy 34
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1: Cây lan Thủy tiên tím nở hoa. 6
Hình 2. 2: Hình dạng của virus CyMV (Navalinskiene và cs, 2005) 10
Hình 2. 3: Sơ đồ miêu tả bộ gen của CyMV (Ajjikuttira và cs, 2003) 11
Hình 2. 4: Triệu chứng của CmMV trên lá và hoa 12
Hình 2. 5: Hình dạng của ORSV (Navalinskiene và cs, 2005) 13
Hình 2. 6: Cấu trúc bộ gen của ORSV (Ajjikuttira và cs, 2003) 13
Hình 2. 7: Triệu chứng của ORSV gây ra 14
Hình 4. 1: Kết quả phát hiện virus trên các mẫu lan Thủy tiên tím bằng phương pháp
RT – PCR. 28
Hình 4. 2: Quá trình cô lập chồi có kích thước nhỏ lấy từ đoạn thân Thủy tiên tím 30
Hình 4. 3: Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng chồi bên cây lan Thủy tiên tím bằng
Ca(OCl)
2
kết hợp kháng sinh . 32
Hình 4. 4: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi
trường MS bổ sung BA 33
Hình 4. 5: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi
trường MS bổ sung BA và NAA sau 2 tuần nuôi cấy 35
Hình 4. 6: Kết quả phát hiện virus trên các mẫu chồi tăng trưởng của cây lan Thủy
tiên tím sau 8 tuần nuôi cấy. 36
Chương 1: Mở đầu
1

Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) là một trong những giống lan rừng đặc
hữu của Việt Nam (Trần Hợp,1998). Đây là giống lan rừng có dáng hoa rất đặc biệt,
hoa to, đẹp, màu sắc nhã nhặn, có mùi thơm dễ chịu lại rất lâu tàn. Tuy nhiên, hiện nay
đang được liệt vào danh sách những giống lan quý hiếm, mức độ đe dọa bậc R. Vì vậy
vấn đề bảo tồn nguồn gen giống lan này là vấn đề đang được quan tâm.
Thông thường có 2 cách để bảo tồn nguồn gen lan là lưu trữ thông qua nhân
giống In vivo và In vitro. Phương pháp nhân giống In vivo thường không đạt hiệu quả
cao trên lan do đặc điểm sinh thái đặc biệt, chịu sự chi phối của các yếu tố tự nhiên,
gây khó khăn cho vấn đề quản lý và chăm sóc bộ sưu tập. Trái lại, việc nhân giống In
vitro phát huy được nhiều ưu điểm như không phụ thuộc vào các yếu tố tự nhiên, dễ
dàng kiểm soát, chăm sóc và sử dụng được cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau.
Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên thì phương pháp In vitro vẫn có nhược điểm
là không loại trừ được bệnh virus, một trong những loại bệnh gây hại nghiêm trọng
trên hoa lan nói chung.
Để giải quyết những vấn đề trên, đề tài: “ Khảo sát các điều kiện ban đầu để xây
dựng quy trình nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) sạch
bệnh virus được thực hiện nhằm mục đích phục vụ cho việc bảo tồn nguồn gen và
cung cấp cây giống chất lượng cao của giống lan này cho sản xuất.
Chương 1: Mở đầu
2
1.2. Yêu cầu đề tài
Khảo sát và đưa ra được một số điều kiện cần thiết cho việc xây dựng quy trình
nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) sạch bệnh
(Cymbidium mosaic virus, Odotoglossum ringspot virus).
1.3. Nội dung thực hiện
Bao gồm 4 nội dung chính:
Kiểm tra, thanh lọc để tạo nguồn mẫu lan sạch virus bằng kỹ thuật RT-PCR.
Khảo sát loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp cho việc

khử trùng mẫu cấy.
Khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc tăng trưởng và phát
triển chồi từ mẫu cấy vô trùng.
Kiểm tra sự sạch bệnh (virus) của các chồi tạo thành từ kỹ thuật RT – PCR.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về giống lan Dendrobium
2.1.1 Phân loại
Cây lan Thủy tiên tím là loài lan thuộc:
Giới: Plantae (Thực vật)
Lớp: Monocotyledon (Đơn tử diệp)
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Họ phụ: Epidendroideae
Tông: Dendrobieae
Giống: Dendrobium
Tên khoa học: Dendeobium amabile.
2.1.2 Phân bố
Dendrobium còn được gọi là Hoàng Lan hay Đăng Lan, là một trong những
giống phong lan lớn, chiếm vị trí thứ hai trong họ phong lan, gồm có 16000 loài
phân bố trải dài từ Australia, xuyên qua Thái Bình Dương, Phillippines, Ấn Độ đến
Nhật Bản, nhưng tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á (Parvin và cs, 2009).
Dendrobium có hai dạng chính: dạng đứng (Dendrobium Phalaenopsis) sinh
trưởng trong điều kiện khí hậu nóng, chịu ẩm tốt, rất siêng ra hoa và dạng thòng
(Dendrobium Nobile) sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ thích hợp với các vùng
đồi núi cao.
Ở Việt Nam Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt
bởi thân, lá và hoa, dạng đứng thích hợp với khí hậu TPHCM, trong khi đó, dạng
thòng thích hợp với khí hậu Đà Lạt (Lâm Đồng…). (Dương Công Kiên, 2006).

2.1.3 Đặc điểm hình thái
Dendrobium thuộc nhóm đa thân (hay còn gọi là nhóm hợp trục), mọc bụi,
giả hành thường rất dài, lá mọc xen kẽ nhau ôm lấy giả hành, lá có bẹ thuôn dài ôm
Chương 2: Tổng quan tài liệu
4
lấy thân. Hình dạng lá rất đa dạng, từ hình xoan đến hình kim, dạng lá mềm mại,
mọng nước, nạc, dai, có màu xanh đậm hay nhạt tùy vị trí sống của cây (Dương
Công Kiên, 2006).
Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ giúp cho Dendrobium thích hợp với
nhiều điều kiện sống khác nhau. Rễ mập hay mảnh mai, thân rễ dài hay ngắn, bò đi
xa hay chụm lại thành búi dài. Rễ vừa có nhiệm vụ giúp cây bám chắc chắn vào giá
thể vừa có vòi hút ẩm từ không khí và hút chất dinh dưỡng từ xác thực vật khác
(Dương Công Kiên, 2006).
Hoa Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các
mắt ngủ giữa lá và thân ở vị trí gần ngọn. Hoa mọc thành chùm đơn hoặc kép hoặc
từng hoa một. Mặt khác, số lượng phát hoa trên cây nhiều và cấu trúc hoa của
giống Dendrobium phong phú và hấp dẫn về màu sắc và cấu tạo (Dương Công
Kiên, 2006).
Quả dạng nang, khi quả chín hoặc vỏ nang bị mục thì hạt mới phát tán ra
ngoài. Một quả chứa từ 10.000 – 100.000 hạt, có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa
phân hóa. Cho nên nhân giống bằng phương pháp gieo hạt in vivo rất khó khăn,
không như các loại thực vật khác (Dương Công Kiên, 2006).
2.1.4 Đặc điểm sinh thái
Giống Dendrobium có hoa lâu tàn, trung bình từ 1 đến 2 tháng. Một số loài
hoa nở quanh năm. Ở một số khác thuộc giống Dendrobium cây trút hết lá trước
khi ra hoa. Các phát hoa không những mọc trên giả hành mới mà cũng có thể mọc
lên từ các giả hành củ đã ra hoa trước đó.
Nguồn khai thác Dendrobium ở Việt Nam chủ yếu là từ rừng. Rừng Việt
Nam có nhiều loại Dendrobium đẹp, trữ lượng cao. Do trên thân Dendrobium có
nhiều mắt ngủ nên có thể nhân giống bằng phương pháp chiết tách, phương pháp

này thao tác đơn giản nhưng cây con tạo ra dễ bị nhiễm bệnh và nhân giống số
lượng ít. Đối với phương pháp gieo hạt, vì hạt lan nhỏ, không có chất dinh dưỡng
dự trữ nên hạt khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên nếu không cộng sinh với nấm
Chương 2: Tổng quan tài liệu
5
tương thích. Hạt chín sau 12 – 18 tháng và phát tán nhờ gió, nhờ nấm cộng sinh
tương thích trong điều kiện thích hợp hạt sẽ nảy mầm.
2.2. Sơ lược về lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile)
Thủy tiên tím có tên khoa học là Dendrobium amabile, hay còn gọi là
Hoàng Thảo duyên dáng (Trần Hợp, 1998), Thủy tiên hường (Phạm Hoàng Hộ,
1970), là loài lan đặc hữu của Việt Nam, phân bố chủ yếu ở khu vực Miền Trung
bao gồm các tỉnh như Thanh Hóa ,Quảng Bình, Quảng Trị, Huế, Tuyên Quang,
Hòa Bình,Yên Bái, Thái Nguyên, Cao Bằng…
2.2.1 Đặc điểm hình thái
a) Rễ : Là loài có lối sống phụ bì, bám lơ lững trên vỏ cây, lại là loài đa
thân nên rễ rất dài, mập mạp và chắc chắn để giúp cây bám chặt vào giá thể, giữ
thăng bằng cho cây. Cây có hệ rễ khí sinh, có một lớp mô hút ẩm dày bao quanh
gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ có màu xám bạc (Sách đỏ
Việt Nam, 1996).
b) Thân : Cấu tạo đa thân, mọc thành cụm. Thân có 7 – 8 rãnh dọc, dày
1.2 – 1.5 cm, mọc cao từ 70 đến 90 cm, mang lá tập trung về phía ngọn, lá xếp cách
đối ôm lấy thân. Ở mỗi nách lá có một chồi ngủ, có từ 4 – 7 chồi trên một thân, tùy
vào chiều cao của cây (Sách đỏ Việt Nam, 1996).
c) Lá : Lá thuôn rộng đầu hơi nhọn, dài 11 - 12 cm, rộng 4 – 7 cm, lá dày,
màu xanh đậm tùy vào vị trí mọc của lá, mặt dưới có màu bạc hơn (Sách đỏ Việt
Nam, 1996).
d) Hoa : Phát hoa dài 25 – 45 cm, ngang khoảng 3 – 6 cm. Hoa lớn có màu
tím nhạt, cánh hoa hình bầu dục, đầu tròn, mép có răng nhỏ, dài 3 – 3.2 cm, rộng 2
cm. Cánh môi gần tròn, có 3 thùy không rõ rệt, dài 2.5 – 2.7 cm, rộng 2.4 – 2.6 cm,
viền ngoài màu trắng, ở giữa là một đốm lớn màu da cam, bề mặt có phủ lông. Hoa

nở vào cuối mùa xuân và có mùi thơm (Sách đỏ Việt Nam, 1996).
Chương 2: Tổng quan tài liệu
6
Hình 2. 1: Cây lan Thủy tiên tím nở hoa.
2.2.2 Đặc điểm sinh thái
Đây là loài thuộc giống Dendrobium ra hoa nhưng không rụng lá. Hoa
thường nở vào tháng 5 hoặc tháng 6. Phát hoa lên ở gần đỉnh của thân còn lá. Tái
sinh lan Thủy tiên tím bằng hạt và bằng chồi (Sách đỏ Việt Nam, 1996 - trang
325). Nếu tái sinh bằng hạt trong điều kiện tự nhiên phải công sinh với nấm tương
thích, hoặc gieo hạt không có nấm cộng sinh trong điều kiện vô trùng trong phòng
thí nghiệm .
2.2.3 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự phát triển của thủy tiên tím
a) Ánh sáng
Là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và khả năng ra hoa của cây. Thủy tiên
tím là loài lan ưa sáng, có thể sinh trưởng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay
ánh sáng khuếch tán khoảng 70%. Ánh sáng yếu cường độ quang hợp giảm khi đó
cây sẽ thiếu dinh dưỡng, mảnh khảnh, lá mỏng, hoa nhỏ hoặc không có hoa, trái
lại, ánh sáng quá cao lại gây bỏng lá và cây sẽ bị cháy.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
7
b) Nhiệt độ
Thuộc loài thích hợp với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trưởng của cây từ 27 – 32
o
C (ban ngày) và từ 16 -18
o
C (ban đêm).
Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm cho phép từ 6 – 9
o
C đối với những cây

trưởng thành. Nếu nhiệt độ quá thấp hay quá cao thì sự đồng hóa glucose giảm
xuống cây sẽ bị chết rất nhanh ( ).
c) Độ ẩm
Ẩm độ thích hợp đối với lan Thủy tiên tím khoảng 50 – 70%. Độ ẩm được
tạo ra bởi lượng mưa và nhiệt độ. Ẩm độ trong không khí tác động đến khả năng
hấp thụ nước, chất khoáng và khả năng sống của cây. Nếu ẩm độ quá cao lá cây
không thoát hơi nước được, cây bị stress nước tế bào khẩu đóng lại cường độ
quang hợp giảm. Nếu ẩm độ quá thấp vào mùa khô, không khí khô ráo sự thoát hơi
nước xảy ra mạnh làm cho lá trở nên khô héo, cây nhanh chết
().
d) Độ thông thoáng
Độ thông thoáng cũng chính là lượng không khí luân lưu, lưu lượng CO
2
trong không khí. Trên mặt lá, lượng CO
2
liên tục giảm do bị cây hấp thụ vì vậy độ
thông thoáng là yếu tố cần thiết tái lập lượng CO
2
xung quanh lá. Thiếu thông
thoáng làm tăng ẩm độ khi nhiệt độ cao. Càng thiếu thông thoáng càng dễ gia tăng
bệnh cho cây. Ngược lại, sự thông thoáng quá lớn, gia tăng sự bốc hơi làm giảm độ
ẩm của môi trường, làm tăng sự bốc hơi trên mặt lá, cây trở nên kém phát triển
().
e) Giá thể
Giá thể dùng để trồng lan phải xốp, thoáng khí, không giữ nước quá lâu. Có
thể sử dụng một loại giá thể hoặc dùng kết hợp nhiều loại với nhau: vỏ cây khô, đá
núi lửa, xơ dừa hoặc đá bọt (Dương Công Kiên, 2006).
2.3. Giới thiệu tổng quan về virus
2.3.1 Cách gọi tên virus
Chương 2: Tổng quan tài liệu

8
Tên virus = tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + virus
Ví dụ: Odontoglossum Ringspot Virus: virus này gây hại trên cây lan thuộc
chi Odontoglossum, lá cây bị bệnh có các vết bệnh đốm vòng.
Tobaco Mosaic Virus: virus gây hại trên cây thuốc lá, đặc điểm bênh
là gây khảm lá.
2.3.2 Thành phần cấu tạo
Virus là các thể nội kí sinh bắt buộc, không có cấu tạo tế bào. Cấu tạo virus
chỉ gồm hai phần căn bản: phần vỏ capsid và phần lõi.
a) Phần lõi: Bộ máy di truyền của virus có thể là DNA mạch kép, mạch
đơn; RNA mạch kép, mạch đơn. Bộ gen của virus thường là một phân tử
nucleotide acid dạng vòng tròn hay thẳng. Virus nhỏ nhất có khoảng 4 gen, virus
lớn nhất có khoảng vài trăm gen (Phạm Thành Hổ, 2003).
b) Vỏ protein (capsid): Bao bọc bộ gen là vỏ capsid có dạng hình que,
hình ống xoắn, hình đa diện hay phức tạp. Chúng không có hệ sinh tổng hợp
protein riêng (không có ribisome); không có hệ thống biến dưỡng riêng, do đó
chúng chỉ biểu hiện các gen và sinh sản bên trong một tế bào sống khác. Nhờ sự
trao đổi chất của tế bào chủ để tạo ra nhiều bản sao các protein của các cấu phần
khác (capsid, cổ, bao đuôi…).
Chức năng của capsid: Bảo vệ nucleic acid của virus tránh sự tác động của
các enzyme. Đồng thời, các tác dụng nhận biết là lắp khớp vào điểm nhận trên bề
mặt tế bào chủ trong giai đoạn xâm nhập.
c) Màng bao (envelop): Nhiều virus còn có lớp vỏ glycoprotein bao bọc
bên ngoài capsid. Lớp vỏ này bắt nguồn từ màng của tế bào chủ, nhưng ngoài
phospholipid và protein của tế bào chủ, chúng còn có thêm protein và glycoprotein
nguồn gốc virus. Cho nên còn được gọi là lớp màng “lai tạo” (Nguyễn Bá Tiếp,
2007).
Chương 2: Tổng quan tài liệu
9
2.3.3 Phương thức sinh sản và lan truyền

Virus không có khung sườn tế bào nên di chuyển bằng sự khuếch tán.
Chúng không tăng trưởng về khối lượng và kích thước nhưng chúng lại tăng trưởng
theo cấp số nhân về số lượng khi đã xâm nhiễm vào tế bào chủ. Và một đặc điểm
quan trọng khác biệt với các sinh vật khác nữa đó là virus không bị tác động bởi
các thuốc kháng sinh ở mức độ tế bào (Phạm Thành Hổ, 2003).
Điểm nổi bật của virus đó là tạo ra hàng trăm hàng ngàn virion trong mỗi
thế hệ. Các virus nhận biết tế bào chủ theo nguyên tắc “ống khóa và chìa khóa”.
Protein vỏ của virion lấp vừa điểm nhận trên bề mặt tế bào chủ. Khi xâm nhập vào
bên trong tế bào chủ, với gen mã hóa cho enzyme sao chép trên bộ gen của mình,
chúng sử dụng chất dinh dưỡng, ribosome và các nguồn khác của tế bào chủ để tạo
ra nhiều bản sao của bộ gen và các protein của các cấu phần khác (capsid, cổ và
bao đuôi…). Chúng sẽ tự đông lắp ráp khi các thành phần được sao chép đầy đủ
tạo ra số lượng lớn virion làm vỡ tế bào chủ và thoát ra ngoài. Mỗi cá thể virus lại
tiếp tục quá trình nhận biết – xâm nhiễm – sao chép – tự ráp – phóng thích của
mình.
2.4. Sơ lược về virus thực vật
Phần lớn các virus thực vật là virus RNA, chứa RNA mạch đơn, sợi dương
và nhiều dạng có capsid hình que như virus đốm thuốc lá. Vỏ capsid được tạo nên
bởi một số lớn tổ hợp các phần tử protein gọi là hạt capsomere xếp thành hình
xoắn. Các virus DNA thuộc loại hiếm, chỉ gồm 2 nhóm: Cauliflower mosaic virus
có bộ gen DNA mạch kép nằm trong vỏ đa diện và Geminivirus có đặc điểm là vỏ
capsid dính thành đôi, mỗi cái chứa một phân tử DNA mạch đơn vòng tròn với
khoảng 2500 nucleotide. Các viroid là nhóm tác nhân gây bệnh cho thực vật có
kích thước nhỏ và cấu trúc đơn giản như virus. Chúng là những RNA đơn, trần,
nhỏ bé, không được bao bọc bởi lớp vỏ protein, không gắn vào bộ gen tế bào chủ
và sao chép không qua trung gian DNA mà nhờ trực tiếp enzyme sao chép RNA.
RNA của viroid bằng cách nào đó ngăn trở trao đổi chất của tế bào và làm ngưng
tăng trưởng của cả thực vật, gây tác hại rất đáng kể trong khi triệu chứng biểu hiện
không rõ ràng (Phạm Thành Hổ, 2003).
Chương 2: Tổng quan tài liệu

10
2.5. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan
Bệnh virus trên lan được biết đến sớm nhất vào những năm 1960. Có ít nhất
25 loại virus gây bệnh đã được đề cập, trong đó Cymbidium mosaic virus và
Odontoglossum ringspot virus là 2 loại phổ biến nhất. Cả hai loại đều gây ảnh
hưởng trên nhiều giống lan nhưng Cymbidium mosaic virus phổ biến hơn (Zettler
và cs, 1990; Flynn, 1996). Hai loài virus này gây ảnh hưởng lớn đến giá trị kinh tế
của phong lan (Robert và cs, 2006).
2.5.1 Cymbidium mosaic virus (CyMV)
Là virus thuộc nhóm IV ssRNA (+), giống Potexvirus, họ Flexividae hay còn
gọi là virus khảm vàng, được mô tả đầu tiên bởi Jensen. Phần tử virus có dạng sợi,
không màng bao, dài 480nm, rộng 13nm (Navalinskiene và cs, 2005) (hình 2.2).
Bộ gen chứa RNA mạch đơn, sợi dương, có chiều dài 6227 nucleotide
không tính đuôi polyA ở đầu tận cùng 3’(Wong và cs, 1997). Có mũ chụp ở đầu 5’
và đuôi polyA ở đầu 3’. Tổ chức bộ gen được bảo tồn cao và bao gồm 3 vùng:
RdRp (RNA-dependent RNA polymerase-RNA polymerase phụ thuộc RNA), TGB
(triple gene block- nhóm gen ức chế bộ ba) và CP (coat protein-protein vỏ). Tương
tự như các virus khác trong nhóm Potexvirus, bộ gen của CyMV có 5 khung đọc
Hình 2. 2: Hình dạng của virus
CyMV (Navalinskiene và cs, 2005).
Chương 2: Tổng quan tài liệu
11
mở (OREs 1-5) mã hóa cho ba loại protein khác nhau: RdRp (RNA-deppendent
RNA polymerase – trọng lượng phân tử 160Kda),TBG (triple gene block – trọng
lượng phân tử 26 Kda/13 Kda/ 10 Kda) và CP (protein vỏ - trọng lượng phân tử 24
Kda) (Wong và cs,1997).
Hình 2. 3: Sơ đồ miêu tả bộ gen của CyMV (Ajjikuttira và cs, 2003)
CyMV gây ra hiện tượng vàng lá thể khảm đi kèm sự hóa đen và chết của
những vùng lá dọc theo gân lá (Moran và Knoxfield, 1999). Cây bị nhiễm virus có
các đốm và vệt mô chết kéo dài, hóa màu nâu đến đen, rải rác trên cả hai mặt của

các lá già (University of Illinois, 1990). Triệu chứng trên hoa thường ít biểu hiện,
tuy nhiên, ở những cây nhiễm virus nặng, hoa sẽ bị biến dạng, có kích thước nhỏ
và số lượng hoa ít, màu sắc hoa loang lỗ đậm nhạt, có những đường loang lổ của
các vết hoại tử trong vài ngày sau khi nở (Ajjikuttira và cs, 2003). Tuy nhiên, các
triệu chứng trên hoa thường chỉ biểu hiện sau khoảng 2 tuần và đặc biệt dễ dàng
nhận thấy trên hoa Cattleya trắng (Marais, 2002). Các triệu chứng này nhanh chóng
biểu hiện làm lá và hoa lão hóa nhanh đến khô héo.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
12
a) Vết hoại tử trên lá Cymbidium; b) c) Khảm màu ở hoa Vanda và
hoa Phalaenopsis (American Orchid Society)
2.5.2 Odontoglossum ringspot virus (ORSV)
Là một thành viên của nhóm tobamo virus (TOV). Phần tử virus có dạng
hình que, dài 290-300nm (Navalinskiene và cs, 2005). Vật chất di truyền là RNA,
mạch đơn, sợi dương bao gồm 6618 nucleotide chứa 5 khung đọc mở (ORFs 1-5),
mã hóa cho các loại protein có trọng lượng phân tử tương ứng: 126 Kda, 181 Kda,
34 Kda và 52 Kda (Ryu và Park, 1995).
Hình 2. 4: Triệu chứng của CmMV trên lá
và hoa
a)
c)
b)
Chương 2: Tổng quan tài liệu
13
Hình 2. 5: Hình dạng của ORSV (Navalinskiene và cs, 2005)
Bộ gen của ORSV bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA-deppendent RNA
polymerase – RNA polymerase phụ thuộc RNA), MP (movement protein – protein
vận động) và CP (coat protein – protein vỏ). Đây là một trong những virus có RNA
dài nhất trong nhóm tobamovirus chứa 6609nucleotide.
Hình 2. 6: Cấu trúc bộ gen của ORSV (Ajjikuttira và cs, 2003)

ORSV là virus gây bệnh đốm vòng vàng, được biết đến lần đầu tiên trên lá
lan Odontoglossum grande Lindl. Tuy nhiên, nó được biết phổ biến hơn với triệu
chứng vàng lá dạng hình thoi đặc trưng trên lá lan Cymbidium. Các đốm hình thoi
này cũng đi kèm với các vệt vàng ở Cymbidium (Moran và Knoxfield, 1999). Triệu
chứng vòng đơn hoặc các vòng tròn đồng tâm xuất hiện trên cả lá già lẫn lá non.
Những vòng này có màu sắc từ vàng nâu đến tía và đen, bao xung quang vùng
Chương 2: Tổng quan tài liệu
14
trung tâm có màu xanh sáng hoặc màu vàng. Những vòng hình tròn, hình thoi, đơn
hoặc đồng tâm này có thể chồng lên nhau tạo thành từng mảng, từng phần trên lá
và chính là nguyên nhân gây chết của chồi non và toàn bộ cây. Trên hoa, ORSV
tạo ra sự khảm màu (đậm, nhạt) (Marais, 2000; McMillian và cs, 2005). Tuy nhiên,
không nên nhầm lẫn sự khảm màu với các vệt màu trắng trên cây Cattleya có hoa
màu xanh nhạt pha đỏ do biến dị di truyền gây ra. Sự khảm màu này trước đây chỉ
có ở Cattleya nhưng hiện nay đã thấy xuất hiện ở nhiều giống lan khác nữa.
a) Biểu hiện biến màu của hoa Cattleya; b) Triệu chứng
đốm vòng trên lá lan Hồ điệp.
Triệu chứng biểu hiện có hai mức độ khác nhau do hai chủng virus riêng
biệt gây ra, đó là chủng nhẹ và chủng nặng. Các cây bị chủng nhẹ ít bị đốm trên
hoa hơn, hoa không bị biến dạng và lá có triệu chứng nhẹ hơn so với chủng nặng
(Universiy of Illinois, 1990).
Nói chung, virus gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các
triệu chứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại
virus. Các triệu chứng nổi bất nhất là lá vàng (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử)
cũng như sự cằn cỗi của cây. Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp
với nhau hoặc hoàn toàn không biểu hiện do điều kiện nuôi trồng ngăn cản sự phát
Hình 2. 7: Triệu chứng của ORSV gây ra
a)
b)
Chương 2: Tổng quan tài liệu

15
triển triệu chứng. Các cây trong điều kiện stress thường có xu hướng biểu hiện
triệu chứng nghiệm trong khi bị nhiễm virus (Marais, 2002).
Sự khác nhau giữa các biểu hiện bệnh còn phụ thuộc vào giống cây kí chủ,
dòng virus và các điều kiện môi trường như cường độ ánh sáng, nhiệt độ, dinh
dưỡng… Bên cạnh đó, các triệu chứng bệnh đốm vòng cũng tương tự như bệnh
đốm do một số loại nấm gây ra. Sự mất cân bằng dinh dưỡng, ngộ độc muối, cường
độ sáng cao, côn trùng hay do sự rối loạn di truyền biểu hiện triệu chứng như bệnh
virus (Flynn, 1996). Do đó, bệnh virus không chỉ khó phát hiện khi mới chớm bị,
mà khi bị nặng và đã biểu hiện ra bên ngoài cũng rất dễ nhầm lẫn.
2.6. Sơ lược về phương pháp RT-PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) là phương pháp tạo dòng in vitro, không có sự hiện diện
của tế bào, là phương pháp khuếch đại một trình tự DNA bằng cách thực hiện một
chuỗi nhiều chu kì nhiệt. Tuy nhiên, enzyme Taq polymerase không hoạt động trên
phân tử RNA. Do đó, khuếch đại RNA phải sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR
(Reverse transcriptase – PCR).
Nguyên tắc của RT-PCR là RNA được chuyển thành cDNA nhờ enzyme
phiên mã ngược. Sau đó, cDNA được khuếch đại bằng Taq polymerase. Hiện nay,
enzyme phiên mã ngược có nguồn gốc từ AMV (Avian Myeloblastosis Virus) và
phổ biến hơn là từ MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (Hồ Huỳnh Thùy
Dương, 2000).
Để enzyme phiên mã ngược tổng hợp được cDNA từ khuôn RNA mạch đơn
cần phải có mồi đặc hiệu bám trên sợi khuôn RNA. Mồi được sử dụng trong giai
đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ được phiên mã ngược thành
cDNA (hình 2.8) và mồi này có thể là mồi xuôi hay mồi ngược của giai đoạn PCR
tùy chiều 5’ đến 3’ của RNA bắt cặp được với mồi nào (Phạm Hùng Vân, 2009).
Ngoài ra, cũng có thể sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên (random hexamer)
gồm 6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên để phiên mã ngược toàn bộ RNA có trong
mẫu thành cDNA (hình 2.9). Tuy nhiên, mồi ngẫu nhiên này chỉ có hiệu quả khi

Chương 2: Tổng quan tài liệu
16
phiên mã ngược các đoạn DNA dài dưới 600 base, còn những đoạn dài hơn phải
dùng mồi đặc hiệu mới đạt hiệu quả cao.
Có thể nói kỹ thuật RT-PCR là phương pháp nhạy nhất để phát hiện RNA
(Dharmaraj MS., 2008). Đây là phương pháp nghiên cứu các RNA tồn tại với hàm
lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern
blot…
Có hai kiểu thực hiện RT – PCR: RT – PCR hai bước và RT – PCR một
bước.
Trong RT – PCR hai bước, giai đoạn RT tổng hợp cDNA được thực hiện
trước sau đó, cDNA được khuếch đại ở giai đoạn PCR trong một tube khác có chứa
PCR mix và mồi đặc hiệu. Nhược điểm của RT – PCR hai giai đoạn là nguy cơ
ngoại nhiễm cao do mở nắp tube PCR mix để cho sản phẩm cDNA vào sau giai
đoạn RT. Để hạn chế tình trạng này, có thể cho thêm dUTP và UNG vào phản ứng
PCR (Phạm Hùng Vân, 2009).
Trong RT – PCR một bước, cả hai giai đoạn RT và PCR được thực hiện cùng
một phản ứng. Để thực hiện RT – PCR một bước, trong tube phản ứng phải có đủ các
thành phần hóa học cần thiết cho cả hai giai đoạn. RT – PCR một bước thường được
sử dụng hơn RT – PCR hai bước vì nó tiện lợi và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm.
Toàn bộ cDNA tạo ra được tham gia phản ứng PCR sau đó và không nhất thiết phải có
mồi riêng cho giai đoạn RT vì nó sử dụng chính mồi của giai đoạn PCR. Tuy nhiên,
trong RT – PCR một bước không thể ứng dụng kỹ thuật cho dUTP và enzyme UNG
vào dung dịch phản ứng vì UNG sẽ cắt bỏ toàn bộ cDNA tổng hợp được trong giai
đoạn RT.
2.7. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô
2.7.1 Vài nét về kỹ thuật nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô là một thuật ngữ chung được dùng chỉ một dãy quy trình để
duy trì, nuôi tế bào (callus, tế bào, protoplasts) và cơ quan thực vật (thân, rễ, phôi)
trong điều kiện vô trùng. Phương pháp nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng vào

nhiều mục đích khác nhau:
Chương 2: Tổng quan tài liệu
17
- Tạo quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện
tích thí nghiệm nhỏ, các điều kiện hóa lý được kiểm soát.
- Tạo được những cây con từ các loại mô như lóng thân, phiến lá, hạt
phấn, phát hoa…, mà nhân giống in vivo không thực hiện được.
- Tạo nguồn gen giống cây trồng sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus thông
qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
- Cải tiến giống, lai vô tính hay tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen.
2.7.2 Các giai đoạn của nhân giống in vitro
Thành công của việc vi nhân giống phụ thuộc vào việc phân định rõ các
bước phát triển khác nhau của mẫu cấy vào trong những pha phát triển thích hợp,
mỗi giai đoạn được nuôi cấy trên những môi trường khác nhau và ở những điều
kiện nuôi cấy khác nhau. Nhưng nhìn chung chia thành các giai đoạn như sau:
Giai đoạn 1: Tạo thể nhân giống in vitroi.
Giai đoạn 2: Nhân giống in vitro.
Giai đoạn 3: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro.
Giai đoạn 4: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm (Dương Công kiên,
2006).
2.7.3 Những thuận lợi và khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro
Những thuận lợi của kỹ thuật nhân giống in vitro so với các phương pháp
nhân giống vô tính khác:
(1) Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.
(2) In vitro có thể cảm ứng trẻ hóa của mô nên có thể tạo được một số
loài thực vật mà nhân giống in vivo không thể thực hiện.
(3) Sự tăng trưởng của cây nhân giống in vitro thường mạnh hơn những
cây được nhân giống in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa và
sạch bệnh.
(4) Nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên chọn

lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.