Khảo sát các điều kiện thích hợp để xác định nitrat, nitrit trong thực phẩm chế biến

1

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA HÓA




Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học



KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ
XÁC ĐỊNH NITRAT, NITRIT TRONG THỰC PHẨM
CHẾ BIẾN



Nguyễn Thị Hoa
Khóa 2008 – 2012



Huế, 5/2012
1


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA HÓA





Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học



KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ
XÁC ĐỊNH NITRAT, NITRIT TRONG THỰC PHẨM
CHẾ BIẾN


Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa
Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Ly



Huế, 5/2012
i

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Văn Ly đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Qua đây, tôi xin cảm ơn các thầy cô trong tổ Hóa Vô Cơ – Phân
Tích, các thầy cô trong khoa Hóa – trường Đại Học Khoa Học Huế,
các bạn Hóa K32 đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Do thời gian làm khóa luận có hạn và lần đầu tiên tiếp xúc với
công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi những sai sót. Vậy kính
mong quý thầy cô và các bạn bè tham khảo, đóng góp ý kiến để tôi
thành công hơn nữa trong các lĩnh vực nghiên cứu sau này.
Xin chân thành cảm ơn.

ii




TÓM TẮT

Xã hội ngày một văn minh, đời sống con người ngày càng phát triển. Do vậy,
đánh giá chất lượng thực phẩm là một trong những vấn đề mà con người luôn quan
tâm.
Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng cao, đã ra đời nhiều phương pháp để
xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên phương pháp trắc
quang là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc kiểm soát chất lượng thực
phẩm nói chung, thực phẩm chế biến nói riêng vì phương pháp này có thể định lượng
nhanh chóng với độ chính xác cao.
Vì vậy, trong bản khóa luận này chúng tôi đã nghiên cứu qui trình xác định

nitrat, nitrit trong các mẫu thực phẩm chế biến bằng phương pháp trắc quang dựa trên
cơ sở phản ứng tạo hợp chất diazo của axit sunfanilic và α-naphthylamin.
Nội dung của phương pháp nghiên cứu gồm:
- Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho phản ứng tạo màu của hợp
chất diazo giữa nitrit, axit sunfanilic và α-naphthylamin.
- Nghiên cứu điều kiện thích hợp để khử nitrat thành nitrit.
- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp.
- Áp dụng qui trình để xác định nitrat, nitrit trong một số mẫu thực phẩm chế
biến trên thị trường.
iii





DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CAC : Ủy ban Tiêu chuẩn hóa Thực phẩm Quốc tế (Codex Alimentarius
Commission)
FAO : Tổ chức Nông Lương của Liên Hợp Quốc (Food and Agriculture
Organization)
WHO : Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)
TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam ( Viet Nam Standards)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – Performance Liquid
Chromatography hoặc High – Pressure Liquid Chromatography)
LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
SA : Acid sunfanilic ( Sulfanilic Acid)
NA : α-naphthylamin ( Alpha Naphthylamine)
Rev : Độ thu hồi (Recovery)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviatin)
UV-Vis : Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (Ultraviolet Visible
Spectrometry)
iv

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn i
Tóm tắt ii
Danh mục các từ viết tắt iii
Mục lục iv
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Phụ gia thực phẩm 2
1.1.1. Vai trò của phụ gia thực phẩm 3
1.1.2. Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người 3
1.2. Ảnh hưởng nitrat, nitrit lên sức khỏe con người 4
1.3. Tính chất của nitrat, nitrit 5
1.3.1. Tính chất của nitrat 5
1.3.2. Tính chất của nitrit 6
1.4. Các phương pháp phân tích nitrat, nitrit 7
1.4.1. Các phương pháp phân tích nitrat 7
1.4.2. Phương pháp phân tích nitrit 9
1.4.3. Các phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit 10
1.5. Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 11
1.5.1. Kỹ thuật vô cơ hóa ướt 11
1.5.2. Kỹ thuật vô cơ hóa khô 12
1.5.3. Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp 12

1.6. Cơ sở của phương pháp trắc quang 13
1.6.1. Định luật Bouguer – Lambert – Beer 13
1.6.2. Phân tích định lượng 14
v

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nội dung nghiên cứu 16
2.1.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phương
pháp 16
2.1.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 17
2.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 19
2.1.4. Xác định độ ẩm trong mẫu thực phẩm chế biến 19
2.1.5. Xây dựng quy trình xử lý mẫu để phân tích nitrat, nitrit trong mẫu thực
phẩm chế biến 20
2.1.6. Thử áp dụng qui trình phân tích trên các đối tượng thực tế 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu 20
2.2.2. Thiết bị và hóa chất 21
2.2.3. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử và dung dịch chuẩn 22
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phương pháp 24
3.1.1. Điều kiện xác định nitrit 24
3.1.2. Điều kiện khử từ nitrat qua nitrit 28
_Toc3256528753.2. Xây dựng đường chuẩn xác định nitrat và nitrit 30
3.2.1. Đường chuẩn xác định nitrit 30
3.2.2. Đường chuẩn xác định nitrat 31
3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 32
3.4. Khảo sát ảnh hưởng nitrat qua nitrit 33
3.5. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 34
3.6. Áp dụng quy trình xử lý mẫu để phân tích nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm chế

biến 37
3.7. Xác định nitrit, nitrat trong mẫu thật……………………………………… 39
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
4.1. Kết luận 40
4.2. Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41
vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng 22
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu diazo vào
nồng độ axit sunfanilic 24
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu diazo vào
nồng độ α-naphthylamin 26
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu diazo theo pH 27
Bảng 3.4. Sự thay đổi độ hấp thụ quang ở pH khác nhau với cột khử Cd-Cu 29
Bảng 3.5. Sự thay đổi độ hấp thụ quang ở pH khác nhau với hỗn hợp huyền phù kẽm
+ dung dịch CdSO
4
30
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrit
và phương trình đường chuẩn xác định nitrit 30
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrat
và phương trình đường chuẩn xác định nitrat 32
Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của nitrit, nitrat 33
Bảng 3.9. Sự thay đổi độ hấp thụ quang khi cố định nồng độ nitrit 33
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu đến độ hấp thụ quang 35
Bảng 3.11. Giá trị độ hấp thụ quang tính sự mất mát nitrit qua quá trình xử lý mẫu 36
Bảng 3.12. Kết quả hàm lượng nitrat, nitrit trong Xúc xích bò ViSan 39

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Dạng đường chuẩn trong phân tích trắc quang 14
Hình 1.2. Dạng đường thêm chuẩn 15
Hình 2.1. Phổ hấp thụ của hợp chất màu diazo 21
Hình 3.1. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu diazo vào nồng
độ SA 25
Hình 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu diazo vào nồng
độ NA 26
Hình 3.3. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo theo pH 27
Hình 3.4. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo theo thời gian 28
Hình 3.5. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrit
31
Hình 3.6. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrat
32
Hình 3.7. Sơ đồ qui trình phân tích nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm chế biến 37





1

MỞ ĐẦU

Trong cuộc sống hiện đại, thực phẩm chế biến là những sản phẩm đi liền với

đời sống hàng ngày của mỗi gia đình vì nó tiết kiệm thời gian và tiền bạc cho thực đơn
bữa ăn gia đình. Nhưng điều đáng lo ngại nhất là chất lượng của thực phẩm chế biến
(hàm lượng chất bảo quản, phụ gia thực phẩm) mà người sản xuất đưa vào với mục
đích giữ gìn và kéo dài thời gian sử dụng của các loại thực phẩm. Một trong số đó là
nitrit, nitrat (muối diêm) là một dạng muối được xếp vào nhóm chất bảo quản có chức
năng ổn định màu, ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây độc.Tuy nhiên nếu dùng
các muối này để chế biến, bảo quản không đúng qui định thì sẽ là mối đe dọa cho sức
khỏe con người. Vì thế, việc xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong thực phẩm chế biến
là rất cần thiết nhằm đảm bảo sự an toàn cho người tiêu dùng.
Trong bản khóa luận này chúng tôi nghiên cứu qui trình xác định nitrat, nitrit
trong các mẫu thực phẩm chế biến dựa trên cơ sở phản ứng tạo hợp chất diazo của
nitrit với axit sunfanilic và α-napthylamin. Phương pháp này có một số ưu điểm như
độ nhạy của phương pháp cao, ít bị ảnh hưởng của các chất cản trở, có thể thực hiện ở
các phòng thí nghiệm trang bị đơn giản.
Hiện nay có nhiều nghiên cứu xác định nitrat, nitrit tuy nhiên chưa có nhiều
nghiên cứu xác định nitrat, nitrit trên thực phẩm chế biến một cách đầy đủ. Vì vậy,
mục tiêu của chúng tôi là nghiên cứu xác định nitrat, nitrit trong các mẫu thực phẩm
chế biến bằng phương pháp trắc quang.Và với bất kỳ phương pháp nào thì việc nghiên
cứu khảo sát các điều kiện thích hợp để phương pháp cho kết quả chính xác nhất vẫn
là nhiệm vụ quan trọng nhất.
2

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Phụ gia thực phẩm [4]
Theo FAO: Phụ gia là chất không dinh dưỡng được thêm vào các sản phẩm với
các ý định khác nhau. Thông thường các chất này có hàm lượng thấp dùng để cải thiện
tính chất cảm quan, cấu trúc, mùi vị cũng như bảo quản sản phẩm.
Theo WHO: Phụ gia là một chất khác hơn là thực phẩm hiện diện trong thực
phẩm là kết quả của một số mặt: sản xuất, chế biến, bao gói, tồn trữ Các chất này

không bao gồm sự nhiễm bẩn.
Theo Ủy ban Tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (Codex Alimentarius
Commisson - CAC): Phụ gia là một chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, không
được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm và cũng không được sử dụng như một
thành phần của thực phẩm. Việc bổ sung chúng vào thực phẩm để giải quyết mục đích
công nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm
cải thiện cấu kết hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó. Phụ gia thực phẩm không
bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất độc bổ sung vào thực phẩm nhằm duy trì hay
cải thiện thành phần dinh dưỡng của thực phẩm.
Theo TCVN: Phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm
hay một thành phần chủ yếu của thực phẩm, có hoặc không có giá trị dinh dưỡng, đảm
bảo an toàn cho sức khỏe, được chủ động cho vào thực phẩm với một lượng nhỏ nhằm
duy trì chất lượng, hình dạng, mùi vị, độ kiềm hoặc axít của thực phẩm, đáp ứng về
yêu cầu công nghệ trong chế biến, đóng gói, vận chuyển và bảo quản thực phẩm.
Như vậy, phụ gia thực phẩm không phải là thực phẩm mà nó được bổ sung một
cách chủ ý, trực tiếp hoặc gián tiếp vào thực phẩm, cải thiện tính chất hoặc đặc tính kỹ
thuật của thực phẩm đó. Phụ gia thực phẩm tồn tại trong thực phẩm như một thành
phần của thực phẩm với một giới hạn tối đa cho phép đã được quy định.
3

1.1.1. Vai trò của phụ gia thực phẩm [16]
- Làm tăng giá trị dinh dưỡng: Bổ sung vitamin, khoáng chất không có hoặc đã
bị mất đi trong khi chế biến. Như thêm iôt vào muối; thêm vitamin A, vitamin D vào
sữa; thêm vitamin B vào bánh mì, bột, gạo vì khi xay phần lớn vỏ cám có nhiều loại
vitamin này đã mất đi.
- Giữ cho thực phẩm an toàn, tươi lâu hơn
Thực phẩm thường bị một số vi khuẩn, nấm độc, mốc, men làm hư hỏng. Chất phụ gia
có thể giúp bảo quản, làm chậm quá trình lên men, ngăn chặn sự phân hủy của thực
phẩm. Như sulfit được cho vào các loại trái cây khô, nitrit và nitrat được cho thêm vào
các loại thịt chế biến như xúc xích, thịt muối, thịt hộp.

- Làm thay đổi bề ngoài của thực phẩm: Nhằm giúp cho thực phẩm hấp dẫn hơn
Ví dụ: Chất nhũ hóa lecithin ở sữa, lòng đỏ trứng, đậu nành làm món ăn có độ ẩm,
không khô cứng. Chất làm bột nở như muối bicarbonat, natri phosphat được dùng khi
làm bánh nướng, bánh mì để làm cho bánh mềm, xốp hơn
- Làm tăng mùi vị và sức hấp dẫn của thực phẩm: Một số chất màu có công
dụng làm cho thực phẩm có vẻ ngoài hấp dẫn hơn hoặc phục hồi màu sắc nguyên thủy
của thực phẩm; duy trì hương vị vitamin dễ bị phân hủy vì ánh sáng; tạo cho thực
phẩm có dáng vẻ đặc trưng, dễ phân biệt.
1.1.2. Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người [2]
Hiện nay, việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khởe
con người vẫn là một vấn đề phức tạp. Vì lợi ích, những nhà kinh doanh cổ vũ mạnh
mẽ việc sử dụng hóa chất và họ thường tài trợ cho các cơ sở nghiên cứu để thực hiện
những công trình nghiên cứu có lợi cho sản xuất. Nói chung các triệu chứng thường
thấy thuộc vào loại phản ứng dị ứng với một số chất phụ gia như: ngứa ngáy, da nổi
đỏ, nhức đầu, đau bụng, chóng mặt, khó thở vv. Một vài thí dụ như:
 Nhóm sulfite: Có thể gây khó thở, những người bị hen suyễn không nên ăn
thực phẩm có chứa sulfite. Sulfite được trộn trong rau quả, quả khô (như nho khô)
hoặc đông lạnh, các loại nước giải khát, trong tôm tép đóng hộp để cho tươi hơn và
cũng tìm thấy trong các loại xốt cà chua
4

 Nhóm nitrit và nitrat (muối diêm): Có khả năng gây ung thư khi chuyển
thành nitrosamin lúc chiên nướng. Các chất này rất hữu hiệu trong việc ngăn cản sự
phát triển và diệt vi khuẩn, đặc biệt là khuẩn clostridium botulinum trong đồ hộp.
Ngoài tác dụng giúp bảo quản tốt, nitrit và nitrat còn tạo cho thịt có màu hồng tươi rất
hấp dẫn. Thịt nguội, jăm - bông, thịt hun khói, xúc xích đều có chứa nitrit và nitrat.
 Bột ngọt (MSG – monosodium glutamate): Có người không hợp với bột ngọt
nên cảm thấy khó chịu trong người, chóng mặt, nhức đầu, khô miệng, nóng ran ở
mặt, Tuy nhiên, các triệu chứng trên chỉ tồn tại trong một khoảng thời gian ngắn.
 Đường hóa học E951 – Aspartame: Người không hợp với chất aspartame

nên có thể bị đau bụng, chóng mặt, nhức đầu
1.2. Ảnh hưởng nitrat, nitrit lên sức khỏe con người
Bản thân nitrat không độc, nhưng sự chuyển hóa của nitrat thành nitrit trong cơ
thể người và động vật là rất nguy hiểm nếu nó tích lũy ở nồng độ cao [11].
Hàm lượng nitrat cao trong cơ thể có thể gây ra các bệnh về hồng cầu, dễ thấy
nhất là bệnh xanh da ở trẻ nhỏ (bệnh Blue baby), người ta gọi đây là hội chứng
methemoglobin và dễ bị đe doạ đến cuộc sống đặc biệt đối với trẻ dưới 6 tháng tuổi, do
dịch axit trong dạ dày trẻ nhỏ không đủ mạnh như của người trưởng thành. Vì vậy, các
loại khuẩn đường ruột dễ dàng chuyển hóa nitrat thành nitrit [11].
Khi NO
3
-
vào cơ thể người, nó tham gia phản ứng khử ở dạ dày và đường ruột do
tác dụng của các men tiêu hoá sinh ra NO
2
-
, nitrit sinh ra phản ứng với Hemoglobin tạo
thành methaemoglobinemia làm mất khả năng vận chuyển oxy của Hemoglobin.
Thông thường Hemoglobin chứa Fe
2+
, ion này có khả năng liên kết với oxy, khi có mặt
NO
2
-
nó sẽ chuyển hoá Fe
2+
thành Fe
3+
làm cho hồng cầu không làm được nhiệm vụ
chuyển tải O

2
, nếu duy trì lâu sẽ dẫn tới tử vong, phản ứng: [11]
2HbFe
2+
(O
2
) + NO
2
-
+ H
2
O → 2HbFe
3+
+ 2OH
-
+ NO
3
-
+ O
2

Nồng độ nitrit cao hơn 100 mg NO
3
-
/L khi vào dạ dày, tại đây pH thấp nitrit được
chuyển thành axit nitrơ có khả năng phản ứng được với amin hoặc amit sinh ra
5

nitrosamine – đây là hợp chất gây ung thư, mối quan hệ này chỉ mới được thử nghiệm
trên động vật và chưa được kiểm chứng trên người [11].

Do đó để hạn chế mối nguy hại do nitrit gây ra, tiêu chuẩn Việt Nam qui định
hàm lượng nitrit, nitrat cho phép hiện diện trong thực phẩm chế biến: Thịt muối,
jambon, xúc xích, lạp xưởng <150 ppm [8].
1.3. Tính chất của nitrat, nitrit
1.3.1. Tính chất của nitrat [6]
1.3.1.1. Tính chất vật lý
Nitrat là muối của axit nitric. Người ta đã biết được nitrat của tất cả các muối
kim loại. Ion NO
3
-
không màu nên các muối nitrat của những cation không màu đều
không màu. Hầu hết các muối nitrat đều dễ tan trong nước. Một vài muối hút ẩm trong
không khí như NaNO
3
và NH
4
NO
3
. Muối nitrat của những kim loại hoá trị hai và hoá
trị ba thường ở dạng hydrat.
1.3.1.2. Tính chất hóa học
Muối nitrat khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt (chúng có thể thăng hoa
trong chân không ở 380 -500
0
C), còn các nitrat của kim loại khác kém bền với nhiệt dễ
phân hủy khi đun nóng.
Độ bền nhiệt của muối nitrat phụ thuộc vào bản chất cation kim loại.
Nitrat của những kim loại hoạt động đứng trước magie ở trong dãy điện hóa,
khi đun nóng bị phân hủy thành nitrit và oxy.
Ví dụ: 2 NaNO

3
= 2 NaNO
2
+ O
2

Nitrat của những kim loại từ Magie đến đồng, khi đun nóng bị phân hủy thành
oxyt, nitơ dioxyt và oxy.
Ví dụ: 2 Pb(NO
3
)
2
= 2 PbO + 4 NO
2
+ O
2

Nitrat của những kim loại kém hoạt động hơn đồng, khi đun nóng bị phân hủy
đến kim loại.
Ví dụ: Hg(NO
3
)
2
= Hg + 2 NO
2
+ O
2

6

Cách phân hủy khác nhau đó của muối nitrat kim loại là do độ bền khác nhau của
muối nitrit và oxyt của của các kim loại quyết định. Chẳng hạn như NaNO
2
và PbO
bền, trong khi Pb(NO
2
)
2
, Hg(NO
2
)
2
và HgO không bền.
Do dễ mất oxi, các muối nitrat khan khi đun nóng là chất oxi hóa mạnh.
Ion NO
3
-
trong môi trường axit có khả năng oxi hóa như axit nitric, trong môi
trường trung tính hầu như không có khả năng oxy hóa, nhưng trong môi trường kiềm
có thể bị Al, Zn khử đến NH
3
.
Ví dụ: NaNO
3
+ 4 Zn + 7 NaOH + 6 H
2
O = 4 Na
2
[Zn(OH)
4

] + NH
3

1.3.2. Tính chất của nitrit [6]
1.3.2.1. Tính chất vật lý
Nitrit là muối của axit nitrơ. Hầu hết muối nitrit dễ tan trong nước, muối ít tan
là AgNO
2
. Cũng như muối nitrat, đa số muối nitrit không có màu.
1.3.2.2. Tính chất hóa học
Nitrit của kim loại kiềm bền với nhiệt, chúng không phân huỷ khi nóng chảy
mà chỉ phân huỷ trên 500
o
C. Nitrit của các kim loại khác kém bền hơn, bị phân huỷ
khi đun nóng, chẳng hạn như AgNO
2
phân huỷ ở 140
o
C, Hg(NO
2
)
2
ở 75
o
C.
Trong môi trường axit, muối nitrit có tính oxy hóa và tính khử như axit nitrơ.
Muối nitrit oxy hóa được axit HI đến I
2
, dung dịch SO
2

đến H
2
SO
4
, ion Fe
2+
đến
Fe
3+
còn bản thân nó chuyển thành NO.
Ví dụ: 2 HI + 2 NO
2
-
+ 2 H
+
= 2 NO + I
2
+ 2 H
2
O
Với các chất oxy hóa mạnh như KMnO
4
, MnO
2
, thì NO
2
-
bị oxy hóa đến NO
3
-

.
Ví dụ: 2 KMnO
4
+ 3 H
2
SO
4
+ 5 HNO
2
= 2 MnSO
4
+ 5 HNO
3
+ K
2
SO
4
+ 3 H
2
O
Muối NaNO
2
được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp hóa học, nhất là trong
công nghiệp sản xuất phẩm nhuộm azo.
7

1.4. Các phương pháp phân tích nitrat, nitrit
1.4.1. Các phương pháp phân tích nitrat
1.4.1.1. Phương pháp khử bằng Zn [13]
Cơ sở của phương pháp: Ion NO

3
-
được khử về NO
2
-
khi cho tác dụng với Zn
kim loại, sau đó NO
2
-
được xác định khi cho tác dụng với axit sunfanilic và α-
naphthylamin.
Phản ứng khử phụ thuộc vào nhiệt độ, vì vậy tất cả các mẫu phải được khử ở
cùng một nhiệt độ.
Các ion ảnh hưởng: Au, Bi, Fe, Pb, Ag,…có thể làm giảm kết quả đo và màu
của một số ion xen lẫn màu của chất hấp thụ.
Khoảng xác định của phương pháp: 20 µg NO
3
-
-

N/L ÷ 1,4 mg NO
3
-
-

N/L.
1.4.1.2. Phương pháp khử bằng Cd [14]
Cơ sở của phương pháp: : Ion NO
3
-

bị khử về NO
2
-
khi cho mẫu chảy qua cột
chứa Cd kim loại, sau đó NO
2
-
được xác định khi cho tác dụng với hỗn hợp thuốc thử
axit sunfanilic và α-naphthylamin tạo hợp chất azo màu đỏ. Đo độ hấp thụ quang ở
bước sóng λ = 540 nm.
Khoảng nồng độ giới hạn: 0,01 ÷ 1,0 mg NO
3
-
-

N/L.
1.4.1.3. Phương pháp đo thế dùng điện cực chọn lọc ion [3]
Cơ sở của phương pháp: Tách ion NO
3
-
ra khỏi mẫu thực vật bằng dung dịch
phèn nhôm kali 1% (với tỷ lệ mẫu/dung dịch = 1/5). Sau đó xác định NO
3
-
trong dung
dịch nhờ điện cực chọn lọc ion.
Nguyên lý của phương pháp là đo thế điện cực chọn lọc ion, mà giá trị thế phụ
thuộc vào nồng độ ion xác định trong dung dịch. Điện cực bạc clorua bão hòa được sử
dụng như điện cực so sánh.
Phương pháp này không áp dụng được nếu lượng Cl

-
trong mẫu phân tích lớn
hơn nồng độ NO
3
-
trên 50 lần.
Độ nhạy phương pháp: 6 mg NO
3
-
- N/L.
8

1.4.1.4. Phương pháp axit Cromotrophic [13]
Cơ sở của phương pháp: Phản ứng kết hợp giữa hai phân tử NO
3
-
với một phân
tử của axit cromotrophic (C
10
H
8
O
8
S
2
) hình thành nên hợp chất màu vàng. Sau đó đem
đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 410 nm.
Nếu lượng clo dư (là chất oxy hóa) và có mặt nitrit cũng tạo nên hợp chất màu
vàng với axit cromotrophic. Tuy nhiên khi thêm muối sunfit có thể loại trừ được ảnh
hưởng từ lượng dư clo (tác nhân oxi hóa) và dùng urê nhằm chuyển hóa NO

2
-
thành N
2

để loại ảnh hưởng của nitrit.
Giới hạn phát hiện: 50 µg NO
3
-
- N/L.
1.4.1.5. Phương pháp Natri salixilat [9]
Cơ sở của phương pháp: Đo mật độ quang dung dịch có màu vàng dạng p –
nitrosalixylat ở bước sóng 420 nm. Đây là hợp chất được tạo thành giữa nitrat và natri
salixilat trong môi trường axit.
O
3
N
COONa
OH
H
+
+ NO
3
-
COONa
OH
(p-nitrosalixylat)

Phương pháp không bị ảnh hưởng bởi nitrit (≤ 2 mg/L), clorua (≤ 200 mg/L),
sắt (≤ 5 mg/L).

1.4.1.6. Phương pháp axit Phenoldisulfonic [13]
Cơ sở của phương pháp: Dựa trên phản ứng giữa nitrat và axit Phenoldisulfonic
hình thành nên hợp chất nitrophenol. Khi kiềm hóa thì dung dịch trở nên màu vàng và
có cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ NO
3
-
trong mẫu.
C
6
H
3
(HSO
3
)
2
OH + 3 HNO
3
= C
6
H
2
(OH)(NO
2
)
3
+ 2 H
2
SO
4
+ H

2
O
C
6
H
2
(OH)(NO
2
)
3
+ NH
3
= C
6
H
2
(NO
2
)
2
ONH
4

Độ hấp thụ đo ở bước sóng λ = 410 nm.
Độ nhạy của phương pháp: 10
-3
mg NO
3
-
- N/L.

9

1.4.1.7. Phương pháp quang phổ UV [13]
Cơ sở của phương pháp: Dựa trên việc đo độ hấp thụ bằng phương pháp quang
phổ UV ở bước sóng λ = 220 nm của ion NO
3
-
.
Các chất hữu cơ hòa tan có thể cũng hấp thụ ở λ = 220 nm và NO
3
-
không hấp
thụ ở bước sóng 275 nm nên ta có thể đo lần thứ hai ở bước sóng λ = 275 nm với mục
đích cho chính xác giá trị nitrit.
Chất rắn lơ lửng được loại bỏ bằng cách lọc mẫu.
Ảnh hưởng của CaCO
3
, Ca(OH)
2
có thể loại bỏ bằng cách axit hóa bằng HCl.
Giới hạn phát hiện: 40 µg NO
3
-
- N/L.
1.4.2. Phương pháp phân tích nitrit
 Phương pháp dùng hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic và α-naphthylamin
Cơ sở của phương pháp: Cho nitrit cần xác định tác dụng với hỗn hợp thuốc thử
axit sunfanilic và α-naphthylamin để hình thành hợp chất diazo màu đỏ. Sau đó đo độ
hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng λ = 540 nm, dựa vào các phương pháp định
lượng (đường chuẩn, thêm chuẩn, ) để xác định nồng độ nitrit trong mẫu.

Phản ứng tạo thành hợp chất màu diazo như sau:

+ 2H
2
O
HO
3
S
N
N
+ NO
2
-
+ 2H
+
HO
3
S
NH
2




+ H
+
NH
2
N=N
HO

3
S
NH
2
+
N
N
HO
3
S
(diazonium)


axit sunfanilic

diazonium


α-naphthylamin
Chất màu diazo

10

Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp trắc quang đo nitrit: [13]
+ pH của môi trường phản ứng: Thường được tiến hành ở pH khoảng 1,7 ÷ 3;
+ Nếu trong mẫu có hợp chất chứa nitrogentriclorua là hợp chất có màu đỏ,
do đó sẽ ảnh hưởng khi đo quang;
+ Ion Cu
2+
làm giảm kết quả đo, do nó là xúc tác cho sự phân hủy muối

diazonium;
+ Một số ion Sb, Fe, Pb, Ag, có trong mẫu sẽ kết tủa, gây cản trở phép đo
quang.
1.4.3. Các phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit
1.4.3.1. Phương pháp dùng axit sunfanilic và α-naphthylamin [7]
Nitrit ở trong mẫu được xác định bằng cách cho tác dụng với hỗn hợp axit
sunfanilic và α-naphthylamin, phản ứng tạo ra hợp chất diazo màu đỏ. Sau đó đo độ
hấp thụ quang ở bước sóng λ = 540 nm.
Tổng nitrat, nitrit trong mẫu được xác định bằng cách cho thêm dung dịch
EDTA và đệm amoni. Sau đó cho chảy qua cột khử Cd-Cu. Ở đây nitrat bị khử về
nitrit, sau đó nitrit được xác định bằng phương pháp quang phổ như trên.
Độ thu hồi của phương pháp: 95 ÷ 105 %.
Giới hạn áp dụng phương pháp: 0,01 ÷ 1,0 mg NO
3
-
- N/L.
1.4.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]
Phương pháp này dựa trên việc tách nitrat, nitrit trên cột tách và được xác định
bằng detectơ UV. Hỗn hợp pha động là octyl amonium orthophotphat 0,01M +
metanol theo tỷ lệ 30% (thể tích/thể tích) ở pH = 7, tốc độ bơm pha động là 0,8
mL/phút, thời gian phân tích cho một mẫu là 10 phút.
Đường chuẩn xác định nitrat, nitrit xây dựng trong khoảng 0,1 ÷ 100 µg/mL có
hệ số tương quan r = 0,999.
Độ thu hồi của phương pháp: 96,6 ÷ 105,7%.
11

1.4.3.3. Xác định nitrat, nitrit trong mẫu sinh học bằng phương pháp quang phổ bơm
mẫu dòng chảy [14]
Phương pháp này được thực hiện trên hệ thống bơm mẫu dòng chảy hai kênh:
+ Kênh thứ nhất chứa dung dịch chất mang gồm EDTA trong dung dịch đệm

amoni. Một cột khử được mắc vào kênh này để khử nitrat thành nitrit khi xác định
tổng nitrat và nitrit.
+ Kênh thứ hai chứa dung dịch thuốc thử axit sunfanilic và α-naphthylamin.
Chất màu diazo tạo thành được nhận ra và đo bằng detectơ UV- VIS tại bước sóng λ =
540 nm.
Giới hạn định lượng được xác định là 5.10
-8
M.
Trường hợp các mẫu sinh học có chứa nhiều protein được loại trừ trước bằng
hỗn hợp NaOH-ZnSO
4
.
1.5. Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm [5]
1.5.1. Kỹ thuật vô cơ hóa ướt
a. Bằng axit đặc mạnh, có tính oxy hóa mạnh:
Dùng axit vô cơ mạnh và đặc (HCl, H
2
SO
4
), axit mạnh đặc có tính oxy hóa mạnh
(HNO
3
, H
2
SO
4
), hỗn hợp hai axit (HNO
3
+ H
2

SO
4
), hay ba axit (HNO
3
+ H
2
SO
4
+
HClO
4
) để phân hủy mẫu trong bình Kendan hay ống nghiệm được đun nóng. Lượng
axit thường gấp 15 - 20 lần lượng mẫu và còn tùy thuộc vào loại mẫu. Thời gian hòa
tan mẫu trong các hệ hở, bình Kendan thường vài giờ đến vài chục giờ, cũng tùy thuộc
vào loại mẫu, cỡ mẫu, bản chất của các chất cần xác định,
Trong quá trình xử lý này các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp chất cơ kim của
mẫu rau quả sẽ bị oxy hóa, đốt cháy các chất hữu cơ, đưa các kim loại về các muối vô
cơ tan trong dung dịch nước, quá trình hóa học chính là:
Mẫu + HNO
3
+ H
2
SO
4
= CO
2
+ H
2
O + Me
n

(SO
4
)
m
+ Me
x
(NO
3
)
y

12

b. Xử lý mẫu trong lò vi sóng:
Trong các hệ lò đơn giản:
 Hệ bình mẫu hở;
 Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao);
Trong các hệ nhiều bình và tự động hoàn toàn:
 Hệ bình mẫu hở có khống chế nhiệt độ;
 Hệ bình mẫu đóng kín (có áp suất cao) có khống chế nhiệt độ và áp suất;
 Xử lý trong lò vi sóng hệ kín (có áp suất) thì chỉ cần 50 - 60 phút.
1.5.2. Kỹ thuật vô cơ hóa khô
Nung để xử lý sơ bộ mẫu có phụ gia và chất bảo vệ là quá trình xử lý mẫu sơ bộ
nhờ tác dụng của nhiệt độ thích hợp, có thêm tương tác hỗ trợ của chất phụ gia, thường
là các chất chảy, axit đặc để phá vỡ cấu trúc dạng tinh thể ban đầu của mẫu phân tích,
để chuyển nó sang một dạng các hợp chất khác dễ hòa tan tiếp bằng axit. Khi có chất
chảy, nhiệt độ nung thường thấp hơn khi không có chất chảy, thời gian ngắn hơn, song
lại triệt để hơn, mà lại không mất chất phân tích. Nhất là các mẫu có cấu trúc bền, chịu
nhiệt hay mẫu hữu cơ thì tác dụng cảu chất bảo vệ là rất quan trọng.
Ví dụ: Tro hoá mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co, Cr,

Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn), dùng chất phụ gia là 8 mL H
2
SO
4
45% và 2 g KNO
3
. Lấy 5 g
mẫu vào chén nung thạch anh, thêm chất phụ gia, trộn đều, sấy khô cẩn thận cho mẫu
khô và thành than đen, sau đó đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 440-450
0
C, rồi sau đó ở
550-530
0
C, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng. Sau đó hòa tan tro thu được
trong 15 mL dung dịch HCl 18%, đun nhẹ cho mẫu tan hết rồi định mức thanh 25 mL
bằng dung dịch HCl 2%.
1.5.3. Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp
Vì là xử lý khô ướt kết hợp là kế tiếp nhau, trước tiên xử lý ướt sơ bộ, sau đó
mới nung, nên tính chất và diễn biến của nó cũng tương tự như trong hai kiểu đã đề
cập ở trên, chỉ có khác là sau khi xử lý mẫu không phải đuổi lượng axit dư quá nhiều
13

như trong xử lý ướt. Sau khi xử lý ướt ta đem nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ
triệt để hơn xử lý ướt. Phương pháp này hạn chế được mất chất phân tích của một số
kim loại khi nung.
Ví dụ: Xử lý mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co,Cr, Cu,
Fe,Mn, Ni, Pb, Zn). Lấy 5 g mẫu vào chén nung, thêm 15 mL HNO
3
65%, 2 mL H
2

SO
4

98% và 5 mL Mg(NO
3
)
2
5%, trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ sấy mẫu trên bếp điện hay trong
tủ sấy cho đến khi khô và thành than đen. Sau đó đem nung ở nhiệt độ 400-450
0
C trong
3 giờ, sau đó nung ở 530
0
C cho mẫu tro hóa đến khi thấy bã không còn đen. Sau đó hòa
tan tro thu được trong 15 mL HCl 1/1, đun nóng cho mẫu hòa tan hoàn toàn, đuổi hết axit
dư đến còn muối ẩm, và định mức thành 25 mL bằng axit HCl 2 %.
1.6. Cơ sở của phương pháp trắc quang [1]
1.6.1. Định luật Bouguer – Lambert – Beer
Khi chiếu một dòng sáng qua dung dịch chất hấp thụ ánh sáng thì chất đó sẽ
hấp thụ chọn lọc một số tia sáng tùy theo màu sắc của chất.
Định luật Lambert – Beer mô tả mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ dung dịch
và độ hấp thụ ánh sáng, được biểu diễn bằng phương trình toán học sau:
A
λ
= ε
λ
.l.C (1.1)
Trong đó:
A
λ

: độ hấp thụ quang của chất tại bước sóng λ
ε
λ
: hệ số hấp thụ của chất tại bước sóng λ
l : chiều dày cuvet đựng mẫu (cm)
C : nồng độ của cấu tử (mol/L)
Điều kiện sử dụng định luật:
+ Chùm tia sáng đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng, trong suốt
+ Chất phân tích phải bền và bền dưới tác dụng của tia UV – VIS
14

1.6.2. Phân tích định lượng
1.6.2.1. Phương pháp đường chuẩn
+ Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác, tăng dần nhất định
C
x1
, C
x2
, C
x3
, C
x4
, của chất chuẩn cần phân tích.
+ Đo độ hấp thụ quang A
x1
, A
x2
, A
x3

,

A
x4
của các dung dịch chuẩn tại bước sóng
λ
max
đã khảo sát.
+ Xây dựng đường chuẩn A = f(C).
+ Chuẩn bị mẫu trong điều kiện tương tự, đo độ hấp thụ quang A
x
.
+ Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ C
x
.









Hình 1.1. Dạng đường chuẩn trong phân tích trắc quang

1.6.2.2. Phương pháp thêm chuẩn
Dùng mẫu phân tích làm nền, thêm vào các mẫu phân tích một lượng xác định
dung dịch chuẩn của chất phân tích có nồng độ tăng dần và thực hiện phản ứng tạo
màu để có dãy mẫu thêm chuẩn. Đo độ hấp thụ của các mẫu thêm chuẩn này, ta có:

15

C
C
x
C
x
+ C
1
C
x
+ C
2
C
x
+ C
n

A
A
x
A
x+1
A
x+2
A
x+n


Vẽ đường thêm chuẩn A – C được dạng đường như sau

Hình 1.2. Dạng đường thêm chuẩn
Bằng phương pháp ngoại suy (đường 1) hoặc phương pháp hình học (đường 2)
ta tính được C
x
của chất cần phân tích trong mẫu.
16

Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu xác định nitrat, nitrit bằng phương pháp trắc quang trên cơ sở phản
ứng giữa nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic và α-naphthylamin để tạo ra hợp
chất diazo màu đỏ. Xây dựng quy trình phân tích, từ đó áp dụng để phân tích một số
mẫu thực phẩm chế biến. Chúng tôi đã nghiên cứu các nội dung sau:
2.1.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho phương pháp
2.1.1.1. Khảo sát điều kiện xác định nitrit
a. Nồng độ và tỷ lệ nồng độ C
α-naphthylamin
/ C
axit sunfanilic

Cố định nồng độ axit sunfanilic ở 2,5.10
-4
M, thay đổi nồng độ α-naphthylamin
từ 0,5.10
-4
– 10,5.10

-4
M và ngược lại. Lập đồ thị độ hấp thụ quang phụ thuộc vào sự
thay đổi đó rồi chọn ra tỷ lệ nồng độ thích hợp nhất.
b. Môi trường pH tối ưu
Tiến hành lên màu dung dịch chuẩn nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic
và α-naphthylamin, sau đó đo độ hấp thụ quang tại môi trường pH khác nhau để chọn
ra được pH thích hợp cho phản ứng tạo màu diazo.
c. Thời gian ổn định màu
Tiến hành lên màu dung dịch chuẩn nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic
và α-naphthylamin, sau đó đo độ hấp thụ quang tại bước sóng hấp thụ cực đại (λ = 540
nm) liên tục trong 35 phút (mỗi lần đo cách 30 giây), để chọn thời gian ổn định màu
thích hợp cho phương pháp.
2.1.1.2. Khảo sát điều kiện khử từ nitrat qua nitrit
a. Chọn phương pháp khử
Thực hiện phản ứng khử nitrat bằng hai phương pháp: Cột khử Cd-Cu và hỗn hợp
huyền phù kẽm + dung dịch CdSO
4
rồi so sánh hiệu suất khử ở hai phương pháp này.