NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN



LÒ THANH SƠN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN
GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ
CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.01.21


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC








THÁI NGUYÊN - 2015

Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện
đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái

Nguyên; Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ
Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.



Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Chu Hoàng Mậu
2. PGS. TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
Họp tại trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
Vào hồi giờ , ngày tháng năm 201



Có thể tìm hiều luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên,
Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia
Việt Nam.
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang
Mau (2014), “Cloning and Designing Vector Carrying GmEXP1
Gene Isolated from Local Soybean Cultivar Sonla, Vietnam”,
International Journal of Bioscience, Biochemistry and
Bioinformatics (IJBBB), 4 (3), pp.191 - 194.

2. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh
Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector và
chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotinana tabacum”, Tạp
chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52.
3. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh
Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen
GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ một số giống đậu
tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị
Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196.
4. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu
Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến
sự kéo dài rễ phân lập từ mRNA của hai mẫu đậu tương địa
phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ
Đại học Thái Nguyên, 118(4), tr.129 - 134.
Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế
Accession number of GmEXP1_cDNA: HG799004, HG799005,
HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010,
LN681352, LN681353.
Accession number of GmEXP1_DNA: LM651915, LM651916.

- 1 -

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều
quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Đậu tương rất có
giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế. Hạt có hàm lượng protein cao, chứa nhiều
amino acid không thay thế và các vitamin cần thiết cho cơ thể người và động
vật. Thân lá để lại trong đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi

khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử
dụng bền vững nguồn tài nguyên đất.
Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu gây khó khăn lớn cho sản xuất nông
nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ và thu hẹp diện tích sản
suất nông nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên
thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với
nhiều loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Cây đậu tương có thời gian sinh
trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu
cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Khô
hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn
của cây đậu tương. Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40%
năng suất hạt đậu tương so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa.
Chính vì vậy chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp
thiết và mang tính thời sự trên thế giới cng như ở Việt Nam.
Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và
sự phát triển mạnh của bộ rễ s giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất
sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật.
Thực vật có bộ rễ phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới
những lớp đất sâu s có cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện
khô hạn. Đồng thời, sự điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những
cơ chế tích luỹ chất khô, tăng cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng
cường hô hấp và trao đổi ion cng giúp thực vật dễ dàng lấy được lượng
nước ít ỏi trong đất. Mặt khác, trong điều kiện hạn, thực vật còn có một loạt
các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn
như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước, tăng cường
tích nước tế bào… Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật dưới

- 2 -

điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát

triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên được xem là biện pháp
hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương.
Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem
là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay.
Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã
được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính,
đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công
nghệ gen được coi là biện pháp có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống
đậu tương có khả năng chịu hạn cao.
Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc
điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu
tương (Glycine max (L.) Merrill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Tạo được dòng cây chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến sự
kéo dài rễ phân lập từ cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về
trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số
giống đậu tương địa phương.
(ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên
quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương.
(iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1
biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen.
(iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên
quan đến sự phát triển kéo dài rễ.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông
qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân
nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ.

(2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế
cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen từ cây đậu tương.

- 3 -

(3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen
GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ.
(4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự
kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens. Phân tích sự biểu hiện
của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T
0
và T
1.
Phân tích, so
sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế
hệ T
1
trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ.
(5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan
đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân
lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen
GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương
Việt Nam.
ng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được
mức độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được
dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1.
Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong
tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển

bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen
GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu
quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây
trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển
gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển
gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng.
Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên
cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương
ở Việt Nam.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong
nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư
liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.

- 4 -

Về mặt thực tiễn
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so
với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng
kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và
những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn.
Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự
phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết
quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải
thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong
thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam.
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được
chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài

liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang);
Chương 3: Kết quả nghiên cứu (46 trang); Chương 4: Thảo luận chung kết
quả nghiên cứu (09 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình
công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ
lục (8 trang). Luận án có 25 bảng, 31 hình và tham khảo 150 tài liệu.


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 18 tài liệu tiếng Việt; 130 tài liệu tiếng Anh và 2 tài
liệu từ internet để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò của
bộ rễ thực vật và của cây đậu tương đối với tác động của hạn; (2) Một số gen
liên quan đến sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương; (3) Chuyển
gen liên quan đến hoạt động của bộ rễ cây đậu tương nhờ A. tumefaciens.
Bộ rễ thực vật giữ vai trò quan trọng, là cơ quan hấp thu nước chủ yếu
cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể. Những cây có bộ rễ
phát triển kéo dài, đâm xuyên sâu và lan toả rộng s có nhiều cơ hội thu nhận
được nước và dinh dưỡng do vậy có thể dễ dàng vượt qua điều kiện khô hạn
(Huck và cs, 1983). Sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương
được quy định bởi nhiều gen liên quan đến các đặc điểm hình thái, sinh
trưởng phát triển, trao đổi chất (Taylor và cs, 1978; Uga và cs, 2013). Cho
đến nay, gen chìa khoá xác định sự phát triển kéo dài rễ chưa được tìm ra. Ở cây

- 5 -

đậu tương, gen EXP1 xác định protein expansin hoạt động chủ yếu ở vùng sinh
trưởng của cả rễ chính và rễ bên được cho là có liên quan đến hoạt động phát triển
kéo dài rễ (McQueen-Mason và cs, 1994; Choi và cs, 2003; Lee và cs, 2003).
Protein expansin là một liên họ bao gồm 4 phân họ là α-expansin (EXPA),
β-expansin (EXPB), expansin-like A (EXLA) và expansin-like B (EXLB) có
tác động kéo giãn, nới lỏng thành tế bào thực vật. Protein expansin được mã

hoá bởi đa họ gen (multi-gene family) được phát hiện ở nhiều thực vật như
lúa, yến mạch, đậu tương, ngô, khoai tây Riêng ở cây đậu tương có tới 75
gen EXP khác nhau nằm trên 18 cặp NST tương đồng, trong đó gen GmEXP1
thuộc NST số 17 có kích thước 1491 bp gồm 3 exon và 2 intron xen k. Trình
tự mã hoá của gen GmEXP1 dài 768 bp xác định protein α-expansin gồm 255
amino acid (Kende và cs, 2004; Zhu và cs, 2014). Protein tương ứng gồm 3
vùng: vùng tín hiệu dẫn đầu; vùng chức năng DPBB xúc tác dạng enzyme
endoglucanase và vùng Pollen allerg bám dính cơ chất (Wu và cs, 2001). Khi
thành tế bào đạt "pH sinh trưởng" = 4,5 - 6,0 và tỷ lệ khối lượng expansin với
thành tế bào đạt 1 : 10.000 thì expansin gây biến đổi cấu trúc mạng lưới thành tế
bào bằng cách len lỏi, bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các thành phần
polysaccharide với nhau (gồm pectin và hemicellulose) và làm lỏng lẻo mạng
lưới polymer. Áp lực sức trương của tế bào làm khoảng cách giữa các vi sợi mở
rộng theo cả chiều ngang và chiều dọc (Cosgrove và cs 2000, 2005).

Hình 1.4. Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin (theo Cosgrove - 2000)
A: Expansin bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ
gãy các liên kết hoá trị giữa các polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng
trượt và đẩy giãn khoảng cách dưới áp lực sức trương của tế bào.
Ngoài ra tác động trực tiếp giãn thành tế bào, expansin còn gây hiệu quả gián
tiếp tạo khoảng trống cho cellulolase tiếp xúc với cơ chất, đẩy nhanh hiệu quả
tăng kích thước tế bào. Một số thực nghiệm chứng minh hoạt động và phân bố
của expansin trong tế bào mô thuộc vùng sinh trưởng của rễ đậu tương cho thấy

- 6 -

vai trò quan trọng của expansin trong việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật
hấp thu được nhiều nước và dinh dưỡng từ các lớp đất sâu (Cosgrove và cs 1998).
Những tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen thực vật nhờ A. tumefaciens mở
ra khả năng tạo cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 cải tiến sự phát triển kéo

dài rễ nhằm cải thiện khả năng chịu hạn. Sự tiến bộ thể hiện ở các khâu: hoàn
thiện quy trình tái sinh; chọn lọc hiệu quả bằng các gen chỉ thị, gen sàng lọc;
ứng dụng thành công và có hiệu quả các kỹ thuật phân tử trong phân tích thể
chuyển gen như PCR, Real-time RT-PCR, Western blot; đánh giá chính xác
sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển Nhờ đó, Việt Nam và Thế
giới đã đạt được những thành tựu chuyển gen ở cây đậu tương rất đáng khích
lệ (Zhang 2010; Li 2013; de Paiva Rolla 2014; Trần Thị Cúc Hoà 2007; Nguyễn
Thị Thuý Hường 2011; Nguyễn Thu Hiền 2014; Lò Thị Mai Thu 2014 ).

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
Sáu giống đậu tương địa phương Sơn La được Trung tâm Nghiên cứu &
Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực & Cây thực phẩm - Viện Khoa học
Nông nghiệp Việt Nam và giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông
nghiệp Việt Nam cung cấp được dùng làm vật liệu đánh giá bộ rễ và nghiên cứu
đặc điểm gen. Hai giống đậu tương địa phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc được sử
dụng làm vật liệu bổ sung trong tách dòng, xác định trình tự nucleotide và phân
tích đa dạng trình tự gen GmEXP1. Giống thuốc lá Nicotinana tabacum K326
do Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá Việt Nam cung cấp.
Các chủng vi khuẩn và các loại vector sử dụng trong đề tài luận án được
cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công
nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens
CV58; vector pBT tách dòng gen, vector pRTRA7/3, vector pCB301.
2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như Bio-
Neer, Fermentas, Invitrogen ; Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 02
năm 2012, thí nghiệm sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ và kiểm tra chức
năng sinh học của gen chuyển được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Sinh
Hoá - trường Đại học Tây Bắc. Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector,

- 7 -

chuyển gen và phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Công trình được hoàn thành tại Bộ môn
Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.1.



Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chia thành 6 nhóm chính: (1)
nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ, (2) nhóm phương
pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp phát
triển vector chuyển gen GmEXP1, (4) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen,
(5) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen và (6) phân tích, xử lý số liệu.
2.3.1. Nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ
Các giống đậu tương, các dòng thuốc lá nghiên cứu được gây hạn trên hệ
thống thí nghiệm gây hạn nhân tạo (thực hiện theo Lê Trần Bình và cộng sự -
1998) sau khi nảy mầm và đạt 3 lá thật. Mỗi giống/dòng đều được bố trí song
song 3 lô thí nghiệm (lặp lại 3 lần) và một lô đối chứng, mỗi lô 10 cây/1 giai

- 8 -

đoạn gây hạn. Khi các cây có 3 - 4 lá thật thì bắt đầu ngừng cung cấp nước để
gây hạn nhân tạo. Xác định các chỉ số liên quan đến sự phát triển bộ rễ qua

từng giai đoạn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày gây hạn ở cả các lô thí
nghiệm và cả lô đối chứng làm căn cứ so sánh và đánh giá sự phát triển bộ rễ.
2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và giải trình tự gen
Phân lập gen GmEXP1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết
kế SoyExp1F_NcoI/Soy Exp1R_NotI và khuôn mẫu từ DNA tổng số tách
chiết ở lá; từ RNA tổng số tách chiết ở rễ mầm qua tổng hợp cDNA.
Tách dòng và giải trình tự gen qua các bước: i) Tinh sạch sản phẩm PCR,
ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ
hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony
PCR; v) Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI; vi) Xác định và
phân tích trình tự nucleotide.
2.3.3. Nhóm phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1
Vector chuyển gen GmEXP1 được phát triển theo hai bước cơ bản: (1)
Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmEXP1; (2) Gắn cấu trúc gen
GmEXP1 vào vector chuyển gen thực vật pCB301. Các kỹ thuật sử dụng để
phát triển vector bao gồm: cắt DNA bằng enzyme giới hạn theo chỉ dẫn về
thành phần, điều kiện phản ứng của bên cung cấp; tinh sạch sản phẩm cắt theo
chỉ dẫn của KIT; kỹ thuật biến nạp vector vào E.coli DH5α bằng sốc nhiệt,
colony PCR, tách plasmid và một số kỹ thuật phân tử khác thực hiện theo
Sambrook và cộng sự đề xuất năm 2001.
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen nhờ A. tumefaciens
Biến nạp pCB301_GmEXP1 vào tế bào A. tumefaciens CV58 bằng xung
điện, chọn lọc bằng colony PCR và nhân dòng vector chuyển gen để tạo chủng
vi khuẩn mang vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 phục vụ biến nạp.
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 vào cây thuốc lá N.
tabacum K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuyển
gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998.
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 vào cây đậu tương
DT84 qua nách lá mầm hạt chín nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Quy trình tạo
cây đậu tương chuyển gen được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Olhoft và

- 9 -

cộng sự - 2006 và tham khảo quy trình tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen
của Nguyễn Thị Thuý Hường - 2011 và Nguyễn Thị Thu Hiền 2014.
2.3.5. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu SoyExp1F_NcoI/Soy Exp1R_NotI. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm
phiên mã gen GmEXP1 bằng RT-PCR. Đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã
của gen chuyển bằng Real-time RT-PCR theo phương pháp R=2
-∆∆Ct
của
Livak - 2001. Kiểm tra sự có mặt của protein expansin ngoại lai bằng Western
blot. Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển bằng cách đặt
cây chuyển gen trong môi trường gây hạn nhân tạo và đánh giá qua so sánh các
chỉ tiêu phát triển bộ rễ (chiều dài rễ chính, thể tích, khối lượng khô bộ rễ).
2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Hiệu suất chuyển gen (%) =
Số cây mang gen chuyển
Tổng số mẫu biến nạp
× 100
Kết quả nghiên cứu về các trình tự gen, amino acid được xử lý bằng phần
mềm BioEdit, DNA Star; Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm
Excel và NTSYS PC2.1 (Chu Hoàng Mậu 2008).

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
NGHIÊN CU
Đánh giá sự phát triển bộ rễ qua các giai đoạn gây hạn nhân tạo để phân

nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển của bộ rễ đồng
thời xây dựng căn cứ lựa chọn giống đậu tương ưu tú về đặc điểm này phục
vụ phân lập gen nhằm cung cấp nguyên liệu cho việc phát triển vector chuyển
gen. Các chỉ tiêu được đánh giá bao gồm: chiều dài rễ chính, thể tích và khối
lượng khô của bộ rễ ở các ngưỡng gây hạn khác nhau của giai đoạn cây đậu
tương non. Các tham số thống kê về các chỉ tiêu như sai số trung bình, phép
kiểm định giả thuyết về so sánh giá trị trung bình mẫu đều được tính toán
với mức ý nghĩa α = 0,05. Số liệu phân tích trình bày ở các bảng 3.1, 3.2, 3.3
của luận án đều cho thấy các chỉ tiêu phát triển bộ rễ ở các giống địa phương
Sơn La đều cao hơn giống đối chứng DT84; trong đó SL1 có các giá trị đánh
giá cao hơn các giống còn lại và thấp nhất là DT84.

- 10 -



Hình 3.1. Mi quan hệ gia cc ging đậu tương nghiên cứu dựa trên d liệu v sự
phát triển bộ rễ trong điu kiện gây hạn nhân tạo

Dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng về bộ rễ đã đánh giá và bằng
chương trình NTSYSpc 2.1, sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các giống
đậu tương nghiên cứu được thiết lập (hình 3.1). Bảy giống đậu tương nghiên
cứu được phân thành ba nhóm: nhánh I chỉ có giống SL1, có bộ rễ phát triển
mạnh nhất; nhóm II gồm có giống SL6, SL4 có bộ rễ phát triển khá; nhóm III
gồm các giống SL2, SL3, SL5 và DT84 là nhóm có bộ rễ phát triển kém nhất,
trong đó giống DT84 có khoảng cách di truyền xa nhất so với giống SL1
(10,47%). SL1 (giống địa phương Phù Yên - Sơn La) là giống có bộ rễ phát
triển tốt nhất trên các phương diện đánh giá dùng làm vật liệu cung cấp gen
GmEXP1; giống DT84 có bộ rễ phát triển kém nhất làm đối tượng tiếp nhận
gen chuyển.

3.2. ĐC ĐIỂM GEN GmEXP1 PHÂN LẬP T MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
3.2.1. Đặc điểm gen GmEXP1 phân lập t cDNA của một s ging đậu tương
3.2.1.1. Tách dòng cDNA và xác định trình tự gen GmEXP1
Cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI được thiết kế dựa trên trình tự
gen GmEXP1 của đậu tương AF516879 đã công bố tại Ngân hàng gen quốc tế
để nhân bản và phân lập gen GmEXP1 từ các mẫu nghiên cứu; đồng thời
mang trình tự chứa điểm cắt giới hạn của enzyme NcoI/NotI phục vụ phát
triển vector. Sản phẩm PCR khuếch đại gen GmEXP1 từ cDNA được kiểm tra
trên gel agarose nhận được một băng DNA kích thước khoảng 0,79kb phù hợp
với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.2-A). Gen GmEXP1
được tách dòng với các bước: gắn vào vector pBT; biến nạp vào E.coli DH5α
bằng sốc nhiệt; colony PCR chọn dòng mang gen đích tái tổ hợp bằng cặp mồi
pUC18_F/pUC18_R (Hình 3.2-B). Trước khi đọc trình tự, plasmid tái tổ hợp
gen GmEXP1 được cắt kiểm tra bằng BamHI cho kết quả dương tính 7/7 mẫu
thử. Việc giải trình tự trên máy tự động được thực hiện lặp lại 3 lần/mẫu.

- 11 -



A
B
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1 và colony-PCR
chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
1 - 6: các giống đậu tương Sơn La; 7: giống DT84; 15 - 28: sản phẩm colony-PCR từ một số
dòng khuẩn lạc bằng cặp mồi pUC18; (+): đối chứng dương PCR từ cDNA_GmEXP1 với
cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; M: thang chuẩn DNA 1kb

Kết quả phân tích cho thấy, gen GmEXP1 phân lập được từ cDNA các
giống đậu tương nghiên cứu có kích thước 768 bp và tương đồng với trình tự

công bố AF516879 từ 99,3 - 99,7%. Như vậy, gen GmEXP1 đã được phân lập
thành công từ cDNA của các giống đậu tương nghiên cứu.
3.2.1.2. So sánh trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen GmEXP1
So sánh trình tự nucleotide của gen GmEXP1 ở giống SL1 và DT84 với
trình tự nucleotide mang mã số AF516879 cho thấy có 5 vị trí sai khác (93,
258, 360, 594 và 722) trong đó chỉ có sai khác ở vị trí 722 dẫn đến thay đổi
amino acid. Mức độ tương đồng về trình tự amino acid suy diễn của protein
expansin1 ở các giống SL và DT84 so với trình tự AF516879 đạt 99,3-99,7%.
Trình tự gen GmEXP1 của đậu tương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc tương đồng
với các giống SL từ 99,4 - 100%; protein suy diễn của giống Bắc Kạn khác
các các giống nghiên cứu 1 amino acid ở vị trí 212 chứng tỏ sự bảo thủ, bền
vững của gen GmEXP1 trong tiến hoá và chọn lọc dù khác khu vực phân bố.
3.2.1.3. Phân tích đặc điểm của gen GmEXP1 phân lập từ DNA tổng số
So sánh trình tự gen GmEXP1 phân lập từ DNA tổng số với trình tự phân
lập từ cDNA cho thấy, GmEXP1 trong hệ gen dài 1491 bp gồm 3 exon và 2
intron xen k. Tổng chiều dài exon là 768 bp mã hoá 255 amino acid.
Trình tự DNA gen GmEXP1 ở hai giống SL1 và DT84 có 7 điểm sai
khác, trong đó gồm 4 sai khác trên intron và 3 sai khác trên exon.
3.2.2. Sự đa dạng trình tự vùng mã hoá gen EXP1 ở thực vật
So sánh trình tự nucleotide vùng mã hoá đoạn gen EXP1 của 9 giống đậu
tương nghiên cứu với 10 loài thực vật khác có mã số đăng ký trên NCBI. Các

- 12 -

giống đậu tương nghiên cứu có độ tương đồng với một số trình tự gen
GmEXP1 trên NCBI dao động từ 83,5 - 99,7%; gần nhất là giống đậu tương
Hàn Quốc (AF516879) và xa nhất là đậu tương Trung Quốc (JF694991).

Hình 3.5. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyn v trình tự nucleotide đoạn mã hoá của
gen EXP1 ở một s loài thực vật
Tỷ lệ tương đồng đoạn mã hoá gen EXP1 của các giống đậu tương nghiên
cứu và các loại thực vật khác dao động trong khoảng 45,1 đến 92,6%, trong
đó, gần nhất là đậu cove XM_007160571 (tương đồng 92,4 - 92,6%); xa nhất
là lê dại KC855735 (tương đồng 45,1 - 45,2%). Các đối tượng thực vật nghiên
cứu phân thành 2 nhóm chính, nhóm I gồm 12 trình tự và nhóm II có 5 trình
tự; khoảng cách di truyền giữa hai nhóm là 49,7%.
3.3. PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN GmEXP1
3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1
Cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 gồm các thành phần: CaMV35S khởi
động phiên mã gen GmEXP1 ở tất cả các mô bào thực vật; trình tự xác định
chuỗi c-myc kháng nguyên phục vụ phản ứng Western blot; và polyA ổn định
cấu trúc mRNA.


A
B
C

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI
và sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
M: thang chuẩn DNA 1kb; SP1: Gen GmEXP1 đã tinh sạch sau khi cắt pBT_GmEXP1 bằng
NcoI/NotI; SP2: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng NcoI/NotI
1-3: các dòng khuẩn lạc; (-): PCR E.coli không biến nạp; (+): PCR gen GmEXP1

- 13 -

Tạo cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1được tiến hành theo các bước: i)
Thu nhận gen đích GmEXP1 từ vector pBT_GmEXP1 bằng cặp enzyme giới

hạn NcoI/NotI (Hình 3.6A); ii) Cắt mở vòng pRTRA7/3 bằng NcoI/NotI (Hình
3.6B); iii) Gắn gen GmEXP1 lên vector pRTRA7/3 đã mở vòng và nhân dòng
trong E.coli DH5α.
Kết quả chọn dòng E.coli mang vector tái tổ hợp bằng colony-PCR (hình
3.6C) cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn kiểm tra đều cho kết quả dương tính.
3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector
chuyển gen GmEXP1
Thu nhận cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1 từ pRTRA7/3 tái tổ hợp
bằng HindIII. Tiếp theo là gắn cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1 vào vector
chuyển gen pCB301 sau khi mở vòng bằng HindIII dưới xúc tác của T4 DNA
ligase. Vector tái tổ hợp pCB301_GmEXP1 được nhân dòng trong E.coli,
chọn lọc bằng colony PCR và cắt kiểm tra cấu trúc bằng NotI (hình 3.9).


Hình 3.9. Sơ đồ kiểm tra gen GmEXP1 trên vector chuyển gen bằng NotI
A: Cấu trúc chứa gen gắn xuôi chiều; B: Cấu trúc chứa gen chuyển gắn ngược chiều;
C: điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng NotI
Kết quả kiểm tra bằng NotI cho phép khẳng định sự thành công trong phát
triển vector chuyển gen GmEXP1. Vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ
hợp được dùng để chuyển gen GmEXP1 vào tế bào thực vật qua lây nhiễm.
3.4. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuc lá nhờ A.
tumefaciens
Tiến hành chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá N.
tabacum K326 nhờ A.tumefaciens với hai lần biến nạp qua các giai đoạn:
đồng nuôi cấy, tái sinh đa chồi, chọn lọc ở các giai đoạn kéo dài chồi, ra rễ, ra
bầu đất và ra nhà lưới (hình 3.10).

C

- 14 -

A
B
C
D
E
F






Hình 3.10. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuc lá chuyển gen
A. Mảnh lá trên môi trường đồng nuôi cấy; B. Tái sinh đa chồi;
C. Chọn lọc ở giai đoạn kéo dài chồi; D: Ra rễ; E: Cây ra bầu trấu cát; F: Cây ra nhà lưới
Kết quả (bảng 3.6) cho thấy, với 60 mảnh lá K326 biến nạp tạo được 175
cây in vitro sống sót trên môi trường MS có kháng sinh kanamycin 50 mg/l và
cefotaxim 400 mg/l; lựa chọn 44 cây chuyển gen (từ lô thí nghiệm) và 15 cây
không chuyển gen (từ lô ĐC1) sinh trưởng tốt đưa ra nhà lưới.
Bảng 3.6. Thng kê s lượng các mẫu chuyển gen vào cây thuc lá N. tabacum
Công
thức
S mẫu
biến nạp
S mẫu sng sót
tạo cụm chồi
S cây sng
sót ra rễ

S cây ra
bầu đất
S cây ra
nhà lưới
TN 1
30
30
88
74
21
TN 2
30
29
87
75
23
ĐC0
*
30
0
0
0
0
ĐC1
*
30
30
103
15
15

Ghi chú: * ĐC0 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung
kháng sinh; * ĐC1 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ
sung kháng sinh.
3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuc lá ở
thế hệ T
0

Xác định sự có mặt của gen GmEXP1 trong hệ gen cây thuốc lá T
0

Thu mẫu lá của 44 cây chuyển gen T
0
, tách DNA và thực hiện PCR với
cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; kết quả kiểm tra sản phẩm PCR
bằng điện di trên gel agarose thu được 32/44 cây có băng DNA kích thước
khoảng 0,79 kb - tương ứng với kích thước gen đích GmEXP1 (hình 3.11).
Hiệu suất chuyển gen giai đoạn này đạt 32/60 = 53,33%.


Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xc định sự có mặt của gen
GmEXP1 trong các cây thuc lá chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 44: các cây thuốc lá chuyển gen; wt: cây đối chứng không
chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen pCB301_GmEXP1

- 15 -

Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển trên các cây
thuốc lá chuyển gen T
0
bằng kỹ thuật RT-PCR

Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xc định hoạt động của gen
GmEXP1 trong các cây thuc lá chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 24 - 36: sản phẩm RT-PCR các cây thuốc lá chuyển gen (+): sản phẩm
PCR vector chuyển gen GmEXP1; wt: sản phẩm RT-PCR cây thuốc lá không chuyển gen
Các cây thuốc lá chuyển gen được tách chiết RNA tổng số, thực hiện tổng
hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) và sau đó tiến
hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra
trên gel agarose 0,8% cho kết quả 3/32 cây dương tính có băng DNA kích thước
khoảng 0,79 kb tương đương với kích thước gen GmEXP1 (hình 3.12).
Đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển trên các cây thuốc lá chuyển gen T
0

bằng Real-time RT-PCR
Để tạo khuôn cho phản ứng Real-time RT-PCR, các mẫu lá cây chuyển
gen được tách và định lượng 500 ng RNA tổng số đưa vào mỗi phản ứng tổng
hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên. Phản ứng Real-time RT-PCR thực hiện
khuếch đại và thu nhận giá trị Ct của 2 sản phẩm cDNA là gen chuyển
GmEXP1 với cặp mồi qExp1-F/qExp1-R và gen tham chiếu Actin với cặp mồi
qActin-F/qActin-R.


A
B
Hình 3.14. Đồ thị ngưỡng nhiệt (A), và biểu đồ phân tích nhiệt độ nóng chảy và đỉnh
chảy (B) của hai gen GmEXP1 và Actin ở các mẫu thuc lá chuyển gen T
0
trong phản
ứng Real-time

- 16 -

Áp dụng phương pháp R=2
-ΔΔCt
của Livak xác định tỷ lệ biểu hiện phiên
mã của gen GmEXP1 khi so sánh với gen tham chiếu Actin qua phản ứng
Real-time RT-PCR, kết quả phản ánh cây 26 và 36 có mức độ biểu hiện gen
chuyển tương đương nhau; cây 30 cao hơn gấp khoảng 2 lần.
Phân tích sự biểu hiện của gen GmEXP1 ở thế hệ T
0
dựa trên sự có mặt
của protein expansin trên cây thuốc lá chuyển gen


Hình 3.15. Hình ảnh lai Western (cơ chất TMB) các cây thuc lá chuyển gen T
0

M: thang chuẩn protein; 26 - 36: mẫu protein các cây thuốc lá chuyển gen; (+): protein
37kDa có chuỗi c-myc đầu C; wt: mẫu protein cây thuốc lá không chuyển gen
Kết quả điện di protein tổng số và lai Western (hình 3.15) đều biểu hiện
băng protein ở vị trí kích thước khoảng 30 kDa tương ứng với kích thước tính
toán của protein ngoại lai expansin bằng phần mềm ExPASy Compute pI/Mw.
Như vậy gen chuyển GmEXP1 từ đậu tương đã chuyển thành công vào cây
thuốc lá T
0
, đã biểu hiện phiên mã cho mRNA và dịch mã cho protein
expansin tương ứng.
3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen
chuyển GmEXP1 trên cây thuc lá ở thế hệ T

1

Chọn lọc cây thuốc lá T
1
mang gen chuyển bằng kháng sinh
Gieo hạt thuốc lá trên môi trường không kháng sinh và có kháng sinh
chọn lọc cho kết quả, hạt thuốc lá T
0
36 mất khả năng nảy mầm; hạt cây đối
chứng không mang cấu trúc gen chuyển nên bị đào thải trên môi trường kháng
sinh kanamycin; một số hạt các cây 26 và 30 nảy mầm được trên môi trường
kháng sinh chọn lọc có thể mang cấu trúc gen chuyển. Các cây chuyển gen T
1

sống sót qua chọn lọc kháng sinh được ưu tiên phát triển phục vụ các thí
nghiệm phân tích gen chuyển GmEXP1.
Đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển trên các dòng cây thuốc lá chuyển
gen T
1
bằng Real-time RT-PCR

- 17 -

Tiến hành thu mẫu lá các cây thuốc lá chuyển gen T
1
(dòng 26, 30); tách
và định lượng RNA tổng số; tổng hợp cDNA và kiểm tra bằng PCR để chuẩn
bị khuôn cho phản ứng real-time.

Hình 3.18. Biểu đồ so sánh tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuc lá chuyển

gen thế hệ T
1
so với mẫu cây chuyển gen T
0
26
Phản ứng Real-time RT-PCR thực hiện với hai cặp mồi xác định gen
chuyển GmEXP1 và gen tham chiếu Actin ở các cây thuộc hai dòng chuyển
gen T
1
26 và T
1
30 thu được các giá trị ngưỡng nhiệt Ct. Phân tích kết quả về
mức độ biểu hiện gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen T
1
bằng t-Test
(với α=0,001) cho thấy, hai dòng T
1
26 và T
1
30 có mức độ biểu hiện phiên mã
là như nhau, đồng đều và ổn định với mức độ tin cậy 99,9%.
Các cây T
1
26-4, T
1
30-3, T
1
30-4 có mức độ biểu hiện gen chuyển cao hơn
cây T
0

26 từ 1,32 đến 1,79 lần. Nguyên nhân của sự biến động trong biểu hiện
phiên mã của gen chuyển GmEXP1 ở mỗi cá thể có thể xuất phát từ sự tương
tác của các nhân tố bên trong tế bào như: hiệu quả vị trí của gen chuyển trong
bộ NST cây đích; sự thay đổi số lượng copy qua sinh sản hữu tính; hiệu quả
biểu hiện gen đích có sự thay đổi trong hệ thống biểu hiện mới ở thế hệ sau.
Phân tích protein ngoại lai trên các dòng cây thuốc lá chuyển gen T
1

bằng western blot
Protein tổng số từ lá các cây thuốc lá T
1
dương tính với RT-PCR được
điện di biến tính trên SDS-Page; được chuyển lên màng lai nitrocellulose;
bloking bằng sữa tách béo 5% trong PBS; lai kháng thể 1; lai kháng thể 2 và
hiện màu với cơ chất DAB. Kết quả trên màng lai cho thấy các cây thuốc lá
chuyển gen được kiểm tra đều có protein kích thước khoảng 30 kDa tương
ứng với kích thước protein cây đối chứng dương T
0
.

- 18 -

Như vậy có thể nói, gen ngoại lai GmEXP1 phân lập từ giống đậu tương
SL1 đã được chuyển thành công vào cây thuốc lá, di truyền và biểu hiện ổn
định đến mức độ dịch mã qua hai thế hệ T
0
và T
1
.

Hình 3.19. Kết quả lai Western (cơ chất DAB) cc đòng thuc lá chuyển gen thế hệ T
1

1 - 4: Các cây chuyển gen dòng số 26; 5 - 8: Các cây chuyển gen dòng số 30; wt: Cây thuốc
lá không chuyển gen làm đối chứng âm; (+): Protein cây chuyển gen T
0
26 làm đối chứng
dương; M: thang chuẩn protein 10 - 180 kDa
Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên
cây thuốc lá ở thế hệ T
1
Sự biểu hiện chức năng sinh học của gen GmEXP1 được đánh giá qua các
đặc điểm phát triển bộ rễ cây T
1
trong điều kiện hạn so với đối chứng. Kết quả
so sánh về thể tích, khối lượng khô bộ rễ và chiều dài rễ chính được trình bày
trong các bảng 3.10, 3.11 và 3.12 của luận án.

Hình 3.20. Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuc lá (A) và so sánh hình thái
rễ có tưới nước và cây không tưới nước (B) ở giai đoạn 5 ngày gây hạn
WT: Cây thuốc lá đối chứng không chuyển gen; 26, 30: Các dòng thuốc lá chuyển gen
Kết quả phân tích cho thấy, thể tích bộ rễ cây chuyển gen so với đối
chứng tăng mạnh trong khoảng 7 ngày đầu gây hạn (29,82 - 41,15%) và sau
đó giảm dần do mất nhiều nước; khối lượng khô bộ rễ cây chuyển gen tăng từ
30,64 đến 39,69% so với cây đối chứng không chuyển gen.
Chiều dài rễ chính qua các giai đoạn gây hạn ở cây không chuyển gen chỉ
tăng từ 1,59 đến 9,82% so với đối chứng trong khi các cây chuyển gen tăng từ
4,85 đến 22,27%. So với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện
hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T

1
có chiều dài rễ chính tăng từ 31,07 đến
41,23% chứng tỏ mối liên quan giữa gen chuyển GmEXP1 đối với sự thay đổi
chiều dài rễ chính cây thuốc lá chuyển gen.

- 19 -

3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1
3.5.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ A.
tumefaciens
Hạt đậu tương được khử trùng bằng khí Clo, nảy mầm 4-5 ngày trên GM
và thu nhận nách lá mầm làm vật liệu nhận gen. Biến nạp cấy trúc gen
GmEXP1 thông qua lây nhiễm của vi khuẩn A.tumefaciens vào nách lá mầm
kết hợp gây tổn thương bằng vật nhọn. Quá trình biến nạp, tái sinh tạo cây đậu
tương chuyển gen được minh hoạ ở hình 3.21.

A
B
C
D
E
F






Hình 3.21. Hình ảnh minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen
A: Mẫu biến nạp trên CCM; B: Cảm ứng tạo chồi SIM lần 1; C: Cảm ứng tạo chồi SIM lần 2;

D: Chọn lọc kéo dài chồi SEM; E: Tạo rễ RM; F: Cây ra giá thể.
Qua hai lần biến nạp với 380 mảnh lá mầm (Bảng 3.13) thu được 103 mẫu
tạo chồi, 34 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh chọn lọc SEM,
21 chồi ra rễ khoẻ mạnh và thu được 9 cây T
0
phát triển trên giá thể. Lô ĐC1
tạo được 3 cây khoẻ mạnh trên giá thể làm đối chứng.

Bảng 3.13. Thng kê s lượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84
Lô thí
nghiệm
S mẫu thí
nghiệm
S mẫu tạo
chồi
S chồi
kéo dài
S chồi
ra rễ
S cây sng
trên giá thể
TN1
180
50
16
9
4
TN2
200
53

18
12
5
ĐC0
*
30
0
0
0
0
ĐC1
*
30
11
8
6
3
Ghi chú: * ĐC0 lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh;
* ĐC1 lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh

3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T
0

3.5.2.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển GmEXP1 trong hệ gen đậu tương
Tách chiết DNA tổng số từ lá của 9 cây đậu tương chuyển gen và PCR
với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để xác định sự có mặt của gen
chuyển GmEXP1. Sản phẩm điện di trên gel agarose (hình 3.22) cho thấy cây
số 4 và 7 xuất hiện hai băng DNA kích thước khoảng 0,79 (tương ứng kích
thước gen chuyển) và 1,51 kb (tương ứng với kích thước của gen nội tại).

- 20 -


Hình 3.22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xc định sự có mặt của gen chuyển
GmEXP1 trong cc cây đậu tương chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 9: sản phẩm PCR các cây chuyển gen; (+): sản phẩm PCR vector chuyển
gen GmEXP1; (-): sản phẩm PCR DNA cây đậu tương không chuyển gen.
Điều đó chỉ ra rằng, hệ gen của cây đậu tương chuyển gen số 4 và số 7 (ký
hiệu là cây DT
0
4 và cây DT
0
7) có mặt của gen ngoại lai GmEXP1. Hiệu suất
chuyển gen GmEXP1 ở giai đoạn đánh giá này đạt 2/380 = 0,53%.
3.5.2.2. Phân tích biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 dựa trên sự có mặt
của protein expansin ngoại lai trên cây đậu tương chuyển gen
Điện di protein tổng số từ lá hai cây đậu tương DT
0
4 và DT
0
7 và thực hiện lai
hai loại kháng thể sau khi chuyển lên màng lai nitrocellulose. Kết quả hiện màu
với cơ chất DAB (hình 3.23) cho thấy, cây DT
0
4 xuất hiện băng màu ở vị trí
khoảng 30 kDa tương đương kích thước protein expansin ở đối chứng dương.

Hình 3.23. Kết quả lai Western (cơ chất DAB) các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T
0

M: thang chuẩn protein 10-180 kDa; DT
0
4, DT
0
7: mẫu cây chuyển gen số 4 và 7; (-): mẫu
cây đậu tương không chuyển gen; (+): protein cây thuốc lá chuyển gen
Kết quả cho thấy, cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 đã biểu hiện đến mức
độ dịch mã cho protein expansin ngoại lai.
Như vậy có thể thấy, vector chuyển gen pCB301_GmEXP1 đã thiết kế
không chỉ phù hợp với cây thuốc lá mô hình mà còn có khả năng chuyển được
gen đích GmEXP1 vào cây đậu tương. Cây đậu tương chuyển gen biểu hiện
được protein expansin ngoại lai chính là kết quả khẳng định sự thành công của
quy trình chuyển gen GmEXP1 vào cây đậu tương.

- 21 -

Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU


Chọn tạo ging cây trồng chịu hạn mang tính thời sự
- Biến đổi khí hậu toàn cầu, mưa không đồng đều, khô hạn kéo dài gây
hoang hoá, thu hẹp diện tích canh tác nông nghiệp, giảm năng suất và chất
lượng sản phẩm nông nghiệp.
- Xây dựng bộ giống cây trồng ổn định về năng suất, phẩm chất thích ứng
với điều kiện hiện tại là vấn đề mang tính chiến lược trong phát triển kinh tế
nông nghiệp của nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam.
- Khoa học sinh học nghiên cứu cơ sở phân tử đặc tính di truyền, sinh lý,
hoá sinh có thể tìm được lời giải cho vấn đề mang tính thời sự nói trên.
Một s phương pháp đã được ứng dụng và triển vọng ứng dụng công
nghệ gen trong cải thiện đặc tính chịu hạn cây đậu tương ở Việt Nam

- Đậu tương là cây trồng quan trọng và chiến lược của nhiều quốc gia
nhưng thuộc nhóm chịu hạn kém, đòi hỏi áp dụng những tiến bộ khoa học
nhằm cải thiện đặc tính này.
- Chọn tạo giống đậu tương chống chịu tốt với điều kiện khô hạn đã được
tiến hành từ lâu với các biện như pháp lai giống truyền thống, gây tạo đột biến
thực nghiệm đã thu được những thành quả nhất định như: DT2008 (Viện Di
truyền Nông nghiệp); các giống ML48, ML61 (Chu Hoàng Mậu 2001)
- Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen và A.tumefaciens đã được thực
hiện thành công từ 1988 (Hinchee) và ngày càng có nhiều thành tựu về cây đậu
tương chuyển gen; ở Việt Nam cng có một số tác giả thực hiện chuyển gen và
tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen chống chịu sâu hại; chống chịu
hạn; sản xuất vaccin thực vật; kháng bệnh do virus đã minh chứng tiềm năng
của kỹ thuật này trong chọn tạo giống đậu tương cải thiện khả năng chịu hạn.
Lựa chọn gen đích phù hợp nhằm cải tiến bộ rễ - cải thiện khả năng chịu
hạn ở đậu tương
Gen đích được lựa chọn trong đề tài luận án là GmEXP1 cho hiệu quả cải
tiến bộ rễ dẫn đến làm tăng khả năng chịu hạn ở đậu tương vì các lý do:

- 22 -

- Gen chuyển GmEXP1 được lấy từ giống đậu tương có khả năng chịu hạn
tốt, xác định protein expansin cho hiệu quả giãn thành tế bào vùng sinh trưởng
dẫn đến kéo dài rễ, làm tăng khả năng nhận nước của cây đậu tương từ lớp đất
sâu và vùng ngoại vi trong điều kiện khô hạn, cải thiện khả năng chịu hạn.
- Sử dụng gen GmEXP1 từ giống đậu tương chịu hạn tốt chuyển vào
giống đậu tương chịu hạn kém s tránh được những khó khăn trong biểu hiện
chức năng sinh học của protein ngoại lai trong hệ thống biểu hiện mới vì:
+ Expansin hoạt động độc lập, không nằm trong chuỗi phản ứng trao đổi
chất nên không bị giới hạn về cơ chất cng như sự ức chế của sản phẩm xúc tác.
+ Expansin không phải protein điều hoà nên không gặp trở ngại trong biểu

hiện như sự tương quan về số lượng vị trí tương tác trên DNA; vấn đề ức chế
phản hồi; vấn đề kiểm soát vị trí đích
Thiết kế cấu trúc chứa đoạn gen chuyển và phát triển vector chuyển gen
- Cấu trúc chứa đoạn gen chuyển GmEXP1 phải là cấu trúc biểu hiện độc
lập trong tế bào chủ và phải dễ sàng lọc, đánh giá sự biểu hiện. Promoter 35S,
c-myc và polyA là những thành phần cần thiết cho cấu trúc này.
- Vector pCB301 được dùng để chuyển cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào
thực vật bởi cung cấp đủ các thành phần cần thiết cho chuyển gen như: LB,
RB, OriV, nptII, operon TrfA
Những khó khăn trong chuyển gen đậu tương nhờ A. tumefaciens và giải
pháp khắc phục
- Hiệu suất tạo cây đậu tương chuyển gen phụ thuộc nhiều yếu tố: vi
khuẩn, vector chuyển gen, mô tiếp nhận, khả năng tái sinh của giống đậu
tương nhận gen
- Nách lá mầm hạt chín được sử dụng làm mô tiếp nhận nhờ hệ số tạo chồi
cao và dễ thu nhận nguyên liệu biến nạp với số lượng lớn.
- Khó khăn đặc trưng ở chuyển gen đậu tương như dễ nhiễm khuẩn vệ tinh
do hàm lượng protein trong mô bào cao có thể giải quyết bằng điều chỉnh kháng
sinh; khó khăn về mùa vụ sinh thái có thể lựa chọn giải pháp tính toán thời gian
biến nạp và tái sinh trùng khớp chu kỳ sinh học của mỗi giống hoặc giải pháp sử
dụng buồng sinh trưởng điều khiển chủ động nhiệt độ và ánh sáng.