khả năng ứng dụng của Tilling

KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TILLING TRONG
CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG – VẬT NUÔI
TILLING
Lưu T. Phương Thảo
1. Đặt vấn đề.
2. Tìm hiểu về Tilling
a. Tilling là gì?
b. Các bước cơ bản của Tilling
3. Khả năng ứng dụng của Tilling

NỘI DUNG
Đột biến là một phương pháp quan trọng của ngành chọn giống cây trồng, vật nuôi,
cho tới năm 2007 đã có tới trên 2.700 giống cây trồng đột biến thuộc 175 loài thực
vật đã được chọn tạo và đưa ra sản xuất.
Để nâng cao hiệu quả và thúc đẩy nhanh quá trình chọn tạo giống, với bước tiến
mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đang đưa ngành chọn giống đơn thuần từ
mò mẫm, không định hướng, nặng về định tính đến một kỷ nguyên phát triển mới,
hình thành ngành Công nghệ sinh học Chọn giống đột biến với các phương pháp gây
tạo đột biến có chủ đích TILLING, phương pháp GENOMICS sàng lọc phân tử, định
vị gen đột biến, tìm ra cơ chế biến đổi gen, chuyển và nhân gen đột biến, tạo ra thư
viện các gen đột biến ở từng loại cây trồng để cho cả nhân loại sử dụng, đi sâu vào cơ
chế tác động của gen đột biến, góp phần cải thiện tích cực năng suất, thành phần sinh
hóa và dinh dưỡng, chất lượng của nông sản.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
2. TÌM HiỂU VỀ
PHƯƠNG PHÁP TILLING
a. TILLING là gì ?
TILLING (Targetting Induced Local Lesions In Genomes: đột biến gene có chủ đích) là một phương pháp sinh học
phân tử cho phép xác định hướng của các đột biến ở một gen cụ thể.
Quá trình tiến hóa trong tự nhiên diễn ra một cách chậm chạp thông qua sự hình thành các đột biến, chọn lọc các đột
biến, sau đó các loài động thực vật phản ứng thích nghi và biến đổi. Tilling là kết quả của quá trình tạo giống mà các

nhà nghiên cứu muốn sử dụng để đẩy nhanh quá trình tiến hóa thêm bước nữa.
Tilling đã được giới thiệu vào năm 2000, sử dụng mô hình Arabidopsis thaliana. Tilling từ đó đã được sử dụng như
một phương pháp đảo ngược di truyền trong sinh vật khác như cá ngựa, ngô, lúa mì, gạo, đậu tương, cà chua và rau
diếp
Corn Soybean Broken rice Lettuce Tomato
1. Xử lý đột biến EMS
+ Hạt giống xử lý đột biến EMS ( Mo)
+ Trồng cây EMS ( M1) tự thụ rồi thu hạt.
+ Trồng cây EMS ( M2) tự thụ, rồi thu hạt.
3. Thu hoạch hạt giống của M2 , lưu giữ hạt M2 trong ngân hàng hạt giống. Tách DNA từ các mẫu lá .
4. DNA đã tách được cho lần lượt vào các giếng trên các đĩa giếng PCR
7. Khuếch đại chuỗi nucleic acid đích bằng PCR, mồi được đánh dấu bằng gắn huỳnh quang.
Sản phẩm khuếch đại được ủ và biến tính với một endonuclease như CEL I để cho phép hình thành các heteroduplexes. Do có mutant ở
từng nucleotide > heteropolymorphism xảy ra > hình thành thể mismatch.
5. CEL I nuclease được sử dụng để cắt tại điểm mismatches.
6. Sử dụng DHPLC để phát hiện sự có mặt của heteroduplexes trong giếng.
7. DNA được tách theo từng kích cỡ bằng LI-COR 4300 DNA Analysis System.
8. Xác định các cá thể đột biến. Giải trình tự sản phẩm đột biến của PCR
( Xem các sơ đồ 1, 2 ,3 của trang sau).
b. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING
B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING
Hình 1
Các chất gây đột biến hóa học trong Tilling được áp dụng như ethyl methanesulfonate (EMS- là một tác
nhân hóa học chủ yếu gây nên quá trình chuyển đổi C » T và G » A trên toàn bộ gen) và N-nitroso -N-
methylurea ( NMU ) cho cây trồng và ruồi giấm còn ethylnitrosourea ( ENU ) áp dụng trong cá và động vật
có vú.
Nhóm 1
Nhóm 2
Hạt đã được EMS
(hạt từ cây Mo)

Cây M1
Cây M2
Ngân hàng hạt
giống
DNA
pools
Nhóm 1
Nhóm 2
Nhóm 1
Nhóm 2
B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING
Hình 2: Các bước thu nhận DNA từ cây M2
B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING
Hình 3
3. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP
TILLING
Cà chua (Solanum lycopersicum L.) là một loại rau quả quan trọng với nhiều mục
đích sử dụng khác nhau như sản phẩm tươi sống và chế biến có giá trị dinh dưỡng cao.
Một phần do tính thương mại quan trọng và di truyền tương đối đơn giản của nó
(lưỡng bội, tự tương thích) đã có một khối lượng lớn di truyền phân tử được sản xuất
từ cà chua kết nối gen với tính trạng quan tâm. Tuy nhiên, giống cà chua vẫn bị thách
thức bởi một loạt các vấn đề bao gồm bệnh / kháng sâu bệnh và chống chịu stress
cũng như nhiều mục tiêu khác hướng vào chất lượng trái cây và cấu trúc cây.
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Sử dụng EMS là tác nhân gây đột biến hạt giống Mo.
Từ quần thể M1 tạo ra hai quần thể đột biến. Mỗi cây đột
biến M1 thu hoạch 2 loại trái và hạt giống quả 1 được lưu
giữ trong seeds bank, còn hạt quả 2 đem gieo trồng được
quần thể cây M2, M2 thu nhận được 8225 dòng.Thu nhận

7030 dòng từ quả cây M2 và phần hạt giống còn lại được
lưu trong ngân hàng giống (M3). DNA được chiết xuất từ
10 hạt giống từ ngân hàng M2 và 10 hạt từ cây M3 được
cho vào các đĩa giếng. Các DNA này được cho vào các đĩa
giếng gộp lại 4 × hoặc 8 × , tùy vào phương pháp sàng lọc
đột biến CSCE.
Sau Khuyếch đại PCR với mồi được đánh dấu huỳnh
quang, mẫu được gộp lại với nhau và các mao dẫn chứa đầy
CAP polymer. Bể chứa một đột biến được xác định bằng
cách sử dụng Toán ứng dụng Applied Maths' HDA peak
ana-lyser. Sau khuếch đại PCR với sự có mặt của LC-xanh
+ ™, các giếng được phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản
phẩm.
Hình 4
Phương pháp thực hiện: Xem hình 4
Cà chua có đặc điểm đột biến ở M2:
(A) Cây lùn do thiếu chất diệp lục,
(B) Bụi cây nhỏ,
(D) Cây quá khổ với sự tăng trưởng không xác
định
(C) Màu sắc quả chín
(E) Kích cỡ quả nhỏ
(F)Trái cây màu cam,
(G) Cấu trúc cụm hoa
(H) Trái cây tươi sáng màu vàng
( I) Quả hình trứng
(J) Lá giống lá Pimpenellifolium S (Cần hôi) .
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Hình 5
Ở M2 cho thấy một loạt các kiểu hình đột biến

cho màu sắc trái cây, hình dạng và kích cỡ. Đặc
điểm cấu trúc cây, chẳng hạn như kích thước
cây, phân nhánh, hình dạng lá, chùm hoa và tổ
chức hoa cũng rất khác nhau ( Hình 5)
Một số đột biến ở M2: Xem hình 4
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Sử dụng SNP để sàng lọc đột biến
Hệ thống tiêu chuẩn để phát hiện điểm đột biến
trong các dự án Tilling được dựa trên một loại
enzyme endonuclease, cả CEL1 hoặc ENDO1. Cụ
thể là phân cắt tại các điểm đột biến bằng cách
nhận ra sai lệch trong phân tử DNA đôi. Những
giếng có chứa đoạn đột biến quan tâm được hình
trên gel polyacrylamide bằng cách sử dụng ADN
Li-Cor analyser.
Cùng với SNP người ta thực hiện hai kỹ thuật mới
phát hiện đột biến sàng lọc gọi là Conformation
Sensitive Capillary Electrophoresis (CSCE) and
High Resolution Melt curve analysis (HRM) và đã
được chứng minh là phương pháp nhạy , có số
lượng vật liệu đưa vào cao. Tổng quan về quá trình
sàng lọc CSCE được biểu thị trong hình 4.
Hình 6
Một số đột biến ở M2: Xem hình 6
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Trên màn hình CSCE ta đọc kết quả ( Hình 7):
- (A): Trong giếng không có chứa bất kì đột biến nào, tất
cả các đoạn di chuyển trên mạch dẫn ở cùng 1 tốc độ.
-
(B): Giếng chứa DNA đã được phân lập từ hạt

pimpenellifolium S ( lá giống lá cây cần hôi). Những
đoạn hình thành heteroduplexes di chuyển qua
Polymer CAP khác hơn các sản phẩm khác.
Homoduplexes trong mẫu chạy nhanh hơn
homoduplexes trong các mẫu C, D và E
-
Kết quả xác định thu được từ CSCE:
+ (A) C2_At4g11570 không có đột biến;
+ (B) C2_At4g11570 có đột biến
+ (C) C2_At4g11570 có đột biến;
+ (D) Đột biến Expansin1.
+ (E) Đột biến Expansin1 thứ 2.

Hình 7
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Hình 8: Đọc dữ liệu từ HRM ( A và B) .Cho thấy sự
thay đổi trong huỳnh quang phụ thuộc vào nhiệt độ.
Bảng bên cho thấy sự khác biệt tương đối trong các
đường cong nóng chảy so với một mẫu tham khảo.
Mẫu bắt đầu tan chảy ở nhiệt độ thấp hơn có khả
năng chứa một SNP trong đoạn khuếch đại .
(A)Pha loãng lần lượt. Một sản phẩm PCR ( TG581
RFLP marker (SGN - M84 ) ) đã được khuếch đại từ
S. lycopersicum (màu xám) , S. pimpenellifolium
(màu hồng) hoặc pha loãng S. pimpenellifolium trong
S. lycopersicum với các tỷ lệ sau đây : 1/1 ( ánh sáng
màu xanh) , 1/ 3 ( màu xanh đậm ) , 1/ 7 ( màu xanh
lá cây ) ; 1/9 (màu đỏ) , 1/ 15 ( màu xanh) , 1/ 31
( màu cam) . (B) Các gen PSY thực hiện trên 4x từ
quẩn thể M2. Đường cong nóng chảy màu hồng

tương ứng với giếng có chứa một đột biến trong đoạn
C » T đột biến trong đoạn.
Hình 8
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Những đường cong khác nhau được xác định là nhiệt độ nóng chảy homoduplexes (Hình 8).
Hình 8
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Hình 9
Hình 9: (A) PARSESNP định vị đồ họa của
SNPs xác định. Hộp màu cam thể hiện trình tự
mã hóa ProDH ( Các gen đột biến trong cả M2
và M3). Hình tam giác màu đen đại diện cho vị
trí của các đột biến. Sọc đen đại diện cho các
mảnh vỡ PCR đã được phân tích. (B) ProDH đột
biến được xác định trình tự. G» A và C » T quá
trình chuyển đổi được xác định là đỉnh đường
cong của biểu đồ.
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Hình 10: Tổng quan về màn hình đột biến
cho ProDH trên dân số M2
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
Hình 10
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
a. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua
b. Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO)
Phòng thí nghiệm thuộc trung tâm UCD Genome được tài trợ bởi Bộ nông nghiệp Mỹ - NRI
Genome đã áp dụng phương pháp Tilling trên cây cà chua. Những người tham gia dự án: Junda
Jiang (Tomato breeder and molecular biologist), Allen Van Deynze (co-PI), Roger Chetelat
(co-PI), and Luca Comai (PI).
Tiến hành thí nghiệm và kết quả

Quần thể VFNT-140: xử lý với 140 mM EMS, 9.000 dòng ở giai đoạn M2. Tiến hành một thử nghiệm để
xác định tỷ lệ đột biến trong khoảng 800 cây M2.
Quần thể VFNT-140x2: Mỗi 1 hạt giống M2 từ 9.000 dòng trong quần thể "VFNT - 140" đã được xử lý
140 mM EMS. Từ hạt giống này, thu được 5.000 cá thể từ quả của M2M1 hạt giống M3M2.
Người ta trồng khoảng 12 hạt giống của mỗi dòng cho nảy mầm trong đĩa, và cấy 6 cá thể sống của mỗi
dòng ra ngoài đồng. Sib dự phòng được sử dụng để tăng khả năng có được giống tốt M2s.
Họ đã có khoảng 20.000 cây trồng trong mùa hè năm 2009, và hy vọng sẽ có ít nhất 4.000 dòng đưa vào
sản xuất.
Quần thể A. H1706-100: xử lý với 100 mM EMS. Cây M2 được trồng vào hè năm 2011.
Quần thể H1706-M5: xử lý với 5 mM MNU. Cây M1trồng trong nhà kính vào hè năm 2011.
Quần thể B. H1706-110: xử lý với 110 mM EMS. Hạt giống M2 được thu hoạch vào mùa thu năm 2012.
b. Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO)
Phenotypes in Population A (Heinz 1706, EMS)
(Kiểu hình trong quẩn thể A)
b. Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO)