Khảo sát tập đoàn cà chua, phát hiện gen chí chậm và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





NGUYỄN THỊ VÂN






KHẢO SÁT TẬP ðOÀN CÀ CHUA, PHÁT HIỆN GEN
CHÍN CHẬM VÀ KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số : 60 42 80

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
tốt nghiệp này là khách quan, trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo
vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn tốt
nghiệp này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã
ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012

Tác giả


Nguyễn Thị Vân
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii
LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi
ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng
như những người thân trong gia ñình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn,
người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình

thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Tống
Văn Hải và toàn thể cán bộ, nhân viên bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ
sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, ðH Nông nghiệp Hà Nội ñã rất
nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực
hiện ñề tài tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trường ðH nông nghiệp Hà Nội ñã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết
ñể có thể thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình,
anh em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành
luận văn này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012
Tác giả


Nguyễn Thị Vân
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích, yêu cầu 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 ðặc ñiểm giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cà chua 4
2.2 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của cây cà chua 5
2.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây cà chua 5
2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu cà chua chín chậm 7
2.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng
bệnh virus xoăn vàng lá 15
2.6 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trong nước 22
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25
3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26
3.3 Phương pháp xử lý số liệu 34
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
4.1 Khảo sát ñánh giá các mẫu giống trong vụ ñông xuân (2012) 35
4.1.1 Các giai ñoạn sinh trưởng 35
4.1.2 Một số ñặc ñiểm hình thái và cấu trúc cây 37
4.1.3 Cấu trúc chùm hoa và ñặc ñiểm nở hoa 41
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv

4.1.4 ðánh giá tình hình nhiễm bệnh một số bệnh hại chính trên
ñồng ruộng 43
4.1.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 46
4.1.6 ðặc ñiểm hình thái quả 49
4.1.7 ðặc ñiểm chất lượng quả 52
4.2 Kết quả PCR phát hiện gen chín chậm rin 55
4.3 ðánh giá ñặc tính chín chậm của quả 56
4.4 Kết quả PCR phát hiện gen kháng virus xoăn vàng lá 58
4.4.1 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-1 58

4.4.2 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-2 59
4.4.3 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-3 59
4.5 ðề xuất một số mẫu giống cà chua triển vọng 60
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
5.1 Kết luận 63
5.2 Kiến nghị 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
PHỤ LỤC 69

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- PCR: Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi trùng hợp DNA
- TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus
- ACC : 1-aminocylopropane-1-carbonxylic acid.
- Cnr : Colorless non-ripening.
- ETB : Ethidium bromide.
- DNA : Deoxyribonucleotide acid.
- dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
- EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic
- FAO : Food and Agriculture Organization.
- Gr : Green ripe.
- rin : ripening inhibitor.
- Nor : non-ripening.
- Nr : Never ripen.
- PG : enzyme polygalacturonase.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3.1 Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 25
4.1 Các giai ñoạn sinh trưởng của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 35
4.2 Một số ñặc ñiểm cấu trúc cây của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 38
4.3 Cấu trúc chùm hoa và ñặc ñiểm hoa của các mẫu giống vụ ñông
xuân 2012 42
4.4 Thống kê sơ bộ tình hình nhiễm một số loại sâu bệnh hại của các
giống cà chua 45
4.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống
vụ ñông xuân 2012 47
4.6 Một số ñặc ñiểm hình thái quả của các mẫu giống vụ ñông xuân
2012 50
4.7 Một số ñặc ñiểm về chất lượng quả vụ ñông xuân 2012 53
4.8 ðánh giá ñặc tính chín chậm quả các giống cà chua mang gen rin 57
4.9 Một số giống cà chua có triển vọng 62

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

2.1 Sơ ñồ tổng hợp Ethylen theo Chalves & Mello-Farias, 2006 8

2.2 Sơ ñồ phương pháp tạo cà chua chín chậm dựa vào sinh tổng hợp
Ethylen 10

2.3 Sơ ñồ thể hiện cơ chế ñiều hòa, tác ñộng của ethylen 11

2.4 Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua 12

2.5 Bản ñồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua 14

2.6 Bản ñồ gen của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể số 1 của cà chua 15

2.7 Gen Ty-1 nằm trên NST số 6 18

2.8 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11 18

2.9 Gen Ty-3 nằm trên NST số 6 20

2.10 Gen Ty-4 nằm trên trên NST số 3 20

2.11 Bản ñồ khoảng cách cM giữa các marker gen Ty-5 trên nhiễm sắc
thể 4 21

4.2 Ảnh ñiện di sản phẩm chạy PCR phát hiện gen chín chậm rin 56

4.3. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-1 với cặp mồi JB-1 58

4.4 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-2 bằng cặp mồi
T0302F/TY-2R1 59

4.5 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Ty-3 60



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1

1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Cây cà chua (Licopersicum esculentum Mill) thuộc họ cà (Solanaceae)
có nguồn gốc từ Châu Mỹ là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, ñược
trồng với diện tích lớn nhất trong các cây rau. Quả cà chua có nhiều giá trị
dinh dưỡng cao, ñặc biệt là trong quả chín có nhiều loại vitamin và khoáng
chất rất có lợi cho sức khỏe con người. Ngoài ra cây cà chua còn ñược nhiều
phòng thí nghiệm sử dụng làm cây mô hình cho các nghiên cứu di truyền, tế
bào và chọn giống ở thực vật bậc cao. Hiện nay ở các nước châu Âu, ngoài
giá trị dinh dưỡng, quả cà chua ñược dùng như một nguồn dược liệu làm chất
chống oxy hóa ở người.
Sản xuất cà chua ở miền Bắc nước ta khá thuận lợi ñặc biệt là vụ ñông
xuân nên loại rau này ñược trồng chủ yếu từ tháng 10 ñến tháng 4 năm sau
(chiếm 70% sản lượng thu hoạch). Vụ ñông xuân là thời kỳ có nhiều yếu tố
môi trường như nhiệt ñộ, ẩm ñộ, ánh sáng , rất thuận lợi cho cà chua sinh
trưởng, phát triển và ít bị sâu bệnh phá hại nên năng suất và chất lượng khá
cao. Tuy nhiên do thu hoạch tập trung nên giá tương ñối thấp ảnh hưởng ñến
thu nhập của người sản xuất. Trong khi ñó, từ tháng 6 ñến tháng 9 do thời tiết
nóng bức nên nhu cầu cà chua ăn tươi, làm nước giải khát hay phục vụ chế

biến và công nghiệp ñồ hộp rất cao, giá cà chua lúc này có lúc tăng gấp 2 – 3
lần thời ñiểm chính vụ. Vì thế, ñã có nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ cà
chua như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới và dùng các giống
chống chịu nóng, úng và sâu bệnh. Tuy nhiên do ñiều kiện thời tiết không
thuận lợi nên hầu hết các giống cà chua mới chọn tạo của ta hiện nay chưa
thích ứng tốt và ñem lại hiệu quả kinh tế khi trồng trái vụ.
Hiện nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ nhiều nước trên thế
giới như Mỹ, Pháp và Nhật ñã tạo ñược nhiều giống cà chua có tính chín
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

chậm hoặc không chín. Những giống cà chua có ñặc tính này quả dù ñạt kích
thước và tích luỹ ñủ chất khô nhưng không chín trên cây do mất khả năng
sinh tổng hợp ethylene - là hoocmon tín hiệu giúp hoạt hoá nhiều enzyme xúc
tiến cho quá trình làm quả chín. Tính chín chậm hoặc không chín ñược xác
ñịnh là do một số gen quy ñịnh như: gen ức chế quá trình chín của quả, ký
hiệu là rin (ripening inhibitor) nằm trên nhiễm sắc thể 5 (Vrebalov và cộng
sự, 2002), gen nor (non-ripening) và gen Nr (Never-ripening) quy ñịnh tính
không chín… Hiện nay người ta ñã tìm thấy một số chỉ thị phân tử DNA ñể
phát hiện và chọn lọc các gen gây nên tính chín chậm này. Quả cà chua chín
chậm có thời gian sử dụng lâu hơn, ñộ cứng cao hơn cà chua thông thường do
ñó ít bị thối dập trong khi vận chuyển, kéo dài ñược thời gian bảo quản cũng
như thời gian sử dụng mà vẫn ñảm bảo chất lượng. Chính vì thế, chọn tạo
giống cà chua có ñặc tính chín chậm là một giải pháp ưu việt nhằm rải vụ
trong nhà mà không cần trồng trái vụ trên ñồng ruộng.
Mặt khác một trở ngại gây ảnh hưởng lớn ñến nền sản xuất cà ở miền
bắc cũng như nhiều nơi trên thế giới gặp phải là sự phá hại nặng của virus,
ñặc biệt ở vụ sớm, muộn và trái vụ. Cho ñến nay, biện pháp sử dụng giống
cà chua kháng virus ñược coi là hướng hiệu quả nhất ñể phòng chống bệnh.

Chính vì vậy, chọn tạo giống cà chua có khả năng kháng virus là rất cần
thiết. Hiện nay, ñã có 5 gen kháng virus ñược phát hiện là Ty-1, Ty-2, Ty-3,
Ty-4 và Ty-5. Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR phát hiện gen Ty-1
(marker JB-1), Ty-2 (T0302) và Ty-3 (P6-25) cũng ñã ñược phát triển và sử
dụng rộng rãi (Pena và cộng sự, 2010). ðiều này có ý nghĩa rất quan trọng
trong việc phát hiện các gen kháng virus và chọn tạo các giống cà chua có
tính kháng bệnh.
Trong quá trình giao lưu và hợp tác, bộ môn Sinh học phân tử và công
nghệ sinh học ứng dụng ñã thu thập ñược một tập ñoàn các mẫu giống cà chua
ña dạng, phong phú, có chứa các gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

ðể sử dụng chúng trong việc tạo ra giống có ñặc tính chín chậm và kháng
virus xoăn vàng lá thì cần thiết phải khảo, sát ñánh giá ñặc ñiểm nông sinh
học, năng suất, chất lượng, khả năng mang gen kháng virus và gen chín chậm.
ðể ñáp ứng ñược yêu cầu trên dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phan
Hữu Tôn chúng tôi ñã tiến hành ñề tài: “Khảo sát tập ñoàn cà chua, phát
hiện gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử
DNA”.
1.2. Mục ñích, yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
- ðánh giá ñược các ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất, chất lượng,
ñặc tính chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá trên ñồng ruộng của các mẫu
giống cà chua thu thập.
- Phát hiện gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá trong tập ñoàn
cà chua bằng chỉ thị phân tử DNA.
- Tuyển chọn ñược một số dòng giống tốt.
1.2.2. Yêu cầu

- Khảo sát các ñặc ñiểm sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng
quả của các giống cà chua nhập nội.
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA ñể phát hiện gen chín chậm, gen
kháng virus xoăn vàng lá trong tập ñoàn giống cà chua nhập nội.
- Tìm ra một số giống cà chua có triển vọng thích ứng với ñiều kiện thời
tiết khí hậu Việt Nam làm nguồn vật liệu tạo giống mới.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. ðặc ñiểm giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cà chua
Cà chua là nguồn cung cấp vitamin A và C rất quan trọng, là loại rau ăn
quả ñược sử dụng ở nhiều phương thức khác nhau. Trong quả cà chua chín có
nhiều dinh dưỡng như: ñường, vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan
trọng như Ca, Fe, P, K, Mg… (Tạ Thu Cúc, 2006) [4]. Edward C. Tigchelaar
(1989) ñã phân tích quả cà chua chín và xác ñịnh thành phần hóa học gồm: 94 -
95% nước, 5 - 6% chất khô.
Theo Võ Văn Chi (1997), về mặt y học cà chua có vị ngọt
tính
mát, giải
nhiệt chống hại huyết, kháng khuẩn, lọc máu, nhuận tràng, giúp
tiêu
hoá tốt
tinh bột Nước ép cà chua kích thích gan, tốt cho dạ dày (Nguyễn Thị
Hồng Thuý, 2009) [10]. Một nghiên cứu của Mỹ cho thấy, lycopen trong quả
cà chua giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Ngoài ra lycopen ñược ñược

chứng minh là có thể ngăn ngừa bện ung thư tiện liệt tuyến (Trương Văn
Nghiệp, 2006) [8].
Bên cạnh giá trị dinh dưỡng lớn cây cà chua còn là một loại cây rau ăn
quả có giá trị kinh tế cao, chính vì vậy cà chua ngày càng chiếm vị trí quan
trọng trong cơ cấu cây trồng trên thế giới và không ngừng ñược mở rộng diện
tích gieo trồng. Sản suất cà chua ở ñồng bằng sông Hồng cho thu nhập bình
quân 42,0 ñến 68,4 triệu ñồng/ha/vụ với mức lãi thuần 15 ñến 26 triệu
ñồng/ha, cao gấp nhiều lần so với trồng lúa [8]. Ở ðài Loan hàng năm xuất
khẩu cà chua tươi với tổng giá trị là 925.000 USD và 40.800 USD cà chua
chế biến, mỗi hecta có thể ñem lại thu nhập cho nông dân từ 4.000-5.000
USD. Ở. Mỹ hàng năm tổng giá trị xuất khẩu cà chua rất cao, chỉ tính riêng
kim ngạch xuất khẩu năm 1997 ñạt hơn 4 lần so với lúa nước và 20 lần so với
lúa mì [4].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5

2.2. Một số ñặc ñiểm nông sinh học của cây cà chua
Cà chua là cây trồng hàng năm, dạng thân bụi, phân nhánh mạnh, có lớp
lông dày bao phủ, trên thân có nhiều ñốt và có khả năng ra rễ bất ñịnh. Chiều
cao và số nhánh rất khác nhau phụ thuộc vào giống và ñiều kiện trồng trọt.
Rễ cà chua thuộc hệ rễ chùm, trên ñồng ruộng rễ cà chua có thể phát triển
rộng tới 1,3 m và sâu tới 1 m. Với khối lượng rễ lớn như vậy, cà chua ñược
xếp vào nhóm cây chịu hạn.
Lá cà chua ña số thuộc dạng lá kép, các lá chét có răng cưa, có nhiều
dạng khác nhau: dạng chân chim, lá khoai tây, lá ớt tuỳ thuộc vào giống mà
lá cà chua có màu sắc và kích thước khác nhau.
Hoa cà chua ñược mọc thành chùm. Có ba dạng chùm hoa là ñơn giản,
trung gian và phức tạp. Số lượng hoa / chùm, số chùm hoa/cây rất khác nhau
ở các giống.

Quả cà chua thuộc loại quả mọng, có 2, 3 ñến nhiều ngăn hạt. Hình dạng
và màu sắc quả phụ thuộc vào từng giống. Khối lượng quả dao ñộng rất lớn
tuỳ theo ñặc ñiểm của giống, từ 3 ñến 200g thậm chí 500g.
2.3. Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây cà chua
2.3.1. Nhiệt ñộ
Cây cà chua ưa thích khí hậu ấm áp, khả năng thích nghi cao nên nó
ñược trồng ở khắp mọi nơi trên thế giới. Cà chua chịu ñược nhiệt ñộ cao
nhưng rất mẫn cảm với rét. Cây có thể sinh trưởng ñược trong phạm vi nhiệt
ñộ từ 15
o
C – 35
o
C, thích hợp là 22
o
C - 24
o
C [10].
Tỷ lệ ñậu quả ñạt tối ưu ở nhiệt 18 - 20
o
C, nhiệt ñộ cao vào 2 ñến 3
ngày sau khi nở hoa gây cản trở quá trình thụ tinh, auxin không ñược hình
thành làm cho hoa rụng. Quả cà chua phát triển thuận lợi ở nhiệt ñộ thấp,
nhiệt ñộ trên 35
o
C ngăn cản sự phát triển của quả và làm giảm kích thước quả
rõ rệt [10].
Quá trình sinh tổng hợp caroten rất mẫn cảm với nhiệt ñộ, do ñó ảnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

hưởng lớn ñến màu sắc quả. Sự hình thành lycopen và caroten diễn ra rễ dàng
ở 24-28
o
C làm cho quả có màu ñỏ hoặc da cam ñậm. Nhiệt ñộ cao trong quá
trình phát triển quả cũng làm giảm sự hình thành pectin nên quả nhanh mềm
hơn [10].
2.3.2. Ánh sáng
Theo nhiều tác giả cho rằng tất cả các giống cà chua trồng trọt ñều thông
qua giai ñoạn ánh sáng, với chế ñộ chiếu sáng 11- 13h. Avakian nghiên cứu 25
giống trong nhà kính và 50 giống trên ñồng ruộng ñã ñi ñến kết luận: Không có
giống nào ñiển hình cho ngày ngắn hoặc ngày dài. Kết quả nghiên cứu trên ñã
khẳng ñịnh cà chua không phản ứng với ánh sáng (Avakian, 1952) [15].
Cà chua là cây ưa ánh sáng mạnh, nếu thiếu ánh sáng cây yếu ớt, lá
nhỏ, mỏng, lóng vươn dài, cây vống, ra hoa muộn, tỷ lệ ñậu quả thấp và chất
lượng kém [15]. Trong ñiều kiện ngày ngắn nếu không bón ñạm thì chỉ cho
quả ít, trong ñiều kiện ngày dài mà không bón ñạm thì cây không ra hoa và
không ñậu quả [10].
2.3.3. Nước và ñộ ẩm
Cà chua có yêu cầu về nước ở các giai ñoạn sinh trưởng rất khác nhau, xu
hướng ban ñầu cần ít về sau cần nhiều. Ra hoa và hình thành quả là các thời
kỳ cây cà chua cần nhiều nước nhất. Thời kỳ này không ñủ nước sẽ làm cho
hoa rụng, ít hoa, ít quả, quả khô.
Cà chua sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở ñộ ẩm ñất 70-80%, ẩm ñộ
không khí là 45-55%. ðộ ẩm không khí trên 90% dễ làm cho hạt phấn bị trương
nứt, hoa cà chua không thụ phấn ñược và sẽ rụng. ðộ ẩm thấp làm giảm năng suất
quả nhưng phần nào làm tăng phẩm chất quả vì hàm lượng ñường và hàm lượng
chất khô trong quả tăng lên. ðộ ẩm thấp cũng làm rút ngắn thời gian chín của quả
(Tạ Thu Cúc, 1983). Khi ñộ ẩm ñất quá cao, nước dư thừa cây sinh trưởng mạnh,
thân lá mềm yếu, giảm khả năng chống chịu, giảm chất lượng và phẩm chất quả,

khả năng bảo quản và vận chuyển kém [15].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

2.3.4. ðất và dinh dưỡng
Cà chua là cây trồng thích nghi rộng, không kén ñất nên có thể trồng ở
nhiều loại ñất khác nhau (Bộ Nông Nghiệp và PTNT, 2001) [2]. ðất phù hợp
với cây cà chua là ñất thịt nhẹ, ñất cát pha, tơi xốp, tưới tiêu dễ dàng.
Theo Figueira (1972) cho rằng, cây cà chua ñược trồng trong các ñiều
kiện sinh thái khác nhau, nền ñất khác nhau nhưng lượng các chất N, P, K mà
cây lấy ñi theo xu hướng chung là K >N>P [3]. Theo Becseev, ñể tạo 1 tấn
quả cà chua cần 3,8 kg N, 0,6 kg P
2
O
5
và K
2
O (Kiều Thị Thư, 1998) [11].
Ngoài những nguyên tố khoáng cần thiết là ñạm, lân và kali thì với cây cà
chua các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng ñối với sự phát triển của cây,
ñặc biệt góp phần cải tiến chất lượng quả. Cà chua phản ứng tốt ñối với các
nguyên tố vi lượng B, Mn, Zn, Mo [15]. Khi thiếu các yếu tố vi lượng cây sinh
trưởng chậm, dễ nhiễm bệnh, rụng hoa, quả non làm giảm năng suất [10].
2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu cà chua chín chậm
2.4.1. Ethylene và cơ chế chín của quả
Ethylene là một phytohormon quan trọng trong cây, nó ñiều chỉnh
nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Ethylene ñược tổng hợp
trong tất cả các tế bào và các mô nhưng nhiều nhất là các mô già và ñặc biệt
là trong quả ñang chín.

Theo nghiên cứu của Barry và cộng sự (2005) [16]. Sơ ñồ con ñường
tổng hợp ethylene gồm 2 bước chính: tổng hợp SAM và oxi hóa ACC.
Nguyên liệu ñầu tiên là acid amin methionine, methionine ñược hoạt hóa bằng
ATP ñể hình thành nên SAM (S-adenosyl ethionine). Sau ñó SAM phân hủy
tạo ra ethylene, acid fomic và CO2.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8



Hình 2.1. Sơ ñồ tổng hợp Ethylen theo Chalves & Mello-Farias, 2006
2.4.1.1. Các phương pháp tạo giống cà chua chín chậm thông qua ñiều khiển
tổng hợp ethylen
Hiện nay trên thế giới ñã sử dụng một số phương pháp ñể ñiều khiển quá
trình chín chậm bằng công nghệ biến ñổi gene, ñiều khiển sự tổng hợp
ethylene. Lượng ethylene tạo ra có thể ñược ñiều khiển bằng cách “ñóng”
hoặc làm giảm sự tạo ethylene trong quả bằng một số cách sau:
1. Ức chế sự biểu hiện của gen ACC (1-aminocyclopropane-1-
carbonxylic acid) synthase. ACC synthase là enzyme chịu trách nhiệm chuyển
hóa S-adenosymethiomine (SAM) thành ACC từ bước thứ 2 tới bước cuối
cùng trong quá trình sinh tổng hợp ethylene. Sự biểu hiện của enzyme bị cản
trở khi một antisense hoặc một ñoạn của bản sao gene synthase ñược chuyển
vào trong genome của thực vật (Brady et al, 1985 ) [18].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9

2. Chuyển gen ACC diaminase. Gene mã hóa cho enzyme này nhận ñược từ

một vi khuẩn ñất (Pseudomonas chlororaphis) không gây bệnh. Vi khuẩn này có
khả năng chuyển hóa ACC thành một phân tử khác, nhờ vậy làm giảm lượng
ACC có thể nhận ñược ñể tạo ethylen ( Klee et al, 2002) [30].
3. Chuyển gen SAM hydrolase. Phương pháp này làm giảm tiền chất của
ethylen. Ở ñây SAM ñược chuyển hóa thành homoserine. Gene mã hóa cho
enzym này ñược phân lập từ thể thực khuẩn E. coli T3 [30].
4. Ức chế biểu hiện của gen ACC oxidase - enzyme xúc tác cho sự oxi
hóa ACC thành ethylene.Thông qua công nghệ antisense, giảm sự ñiều khiển
gene ACC oxidase dẫn ñến ức chế sự hình thành ethylen, do ñó làm làm chậm
sự chín của quả [30].
5. ðiều khiển việc nhận ethylen: Khi ethylen có tín hiệu bắt ñầu cho việc
chín quả, việc làm chậm quá trình chín có thể ñạt ñược bằng cách biến ñổi
thụ thể của ethylen. Gen ETR1 là một ví dụ, nó mã hóa cho protein liên kết
ethylen. Gen này ñược biến ñổi thì mất khả năng phản ứng với ethylen
(Wilkinson et al., 1995) [38].
6. Ức chế hoạt tính của polygalacturonase: enzym polygalacturonase
(PG) chịu trách nhiệm cho việc phân giải pectin, chất duy trì ñộ cứng thành tế
bào thực vật. ðể tạo ra quả chín chậm bằng phương pháp này, người ta ñã
chuyển gene antisense hoặc một ñoạn bản sao của gene PG vào trong genome
của thực vật dẫn ñến sự ức chế tạo ra enzym PG (Redenbaugh & Kramer
1994) [37].





Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

Hình 2.2. Sơ ñồ phương pháp tạo cà chua chín chậm dựa vào sinh tổng
hợp Ethylen [12]

2.4.1.2. Nghiên cứu các thụ thể tiếp nhận ethylen (Ethylene Receptor)
Nghiên cứu trên cây Arabidopsis người ta ñã phát hiện và nhân dòng
ñược 5 gen mã hóa cho các receptor liên quan ñến việc cảm ứng sinh ra
ethylene trong quá trình chín gồm có CTR1 (constitutive-tripe-respone)
(Kieber et al., 1993), EIN2 (ethylene-insensitive) (Alonso et al., 1999), EIN3
(Chao et al., 1997), ERF1 (ethylene-response-factor) (Solano et al., 1998) và
ETR1 (Chang et al., 1993) mã hóa cho các loại recetor có tên tương ứng.
Dựa vào ñặc ñiểm cấu trúc protein, gia ñình receptor ETR1 liên quan ñến
cảm ứng ethylene ở Arabidopsis ñược chia thành 2 gia ñình nhỏ (subfamily):
Subfamily I gồm ETR1, ERS1 có cấu trúc protein tương ñồng cao với enzyme
histidine kinase; subfamilyII gồm ETR2, EIN4, ERS2 có khả năng hoạt ñộng
như enzyme serine kinase (Klee et al, 2007 ) [31].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11
Theo các nghiên cứu của Bleecker & Kende (2000), Giovannoni (2004)
và Stepanova and Alonso (2005) ñã chỉ ra cơ chế ñiều hòa của ethylene như
sau: Khi Ethylene gắn vào vùng cảm ứng của receptor (gồm 1 hệ thống các
receptor thuộc gia ñình ETR) sẽ cảm ứng cho phản ứng xảy ra giữa vùng
histidine kinase với vùng ñiều hòa của receptor CTR1 (Raf-like kinase) tạo
thành phức hợp receptor. Phức hợp receptor CTR1 tác ñộng lên protein màng
EIN2 (là một kênh protein vận chuyển nguyên tố khoáng). ðầu C của EIN2 là
tín hiệu dương cảm ứng với yếu tố sao mã EIN3 nằm trong nhân. Yếu tố sao
mã này hoạt ñộng sẽ cảm ứng sao mã cho gen ERF1 sinh ra yếu tố phản ứng
với ethylene.

Hình 2.3. Sơ ñồ thể hiện cơ chế ñiều hòa, tác ñộng của ethylen
(Bleecker và Kende, 2000) [17]
Các nghiên cứu trên cà chua cho thấy có ít nhất 6 loại receptor:
LeETR1, LeETR2 (Zhou et al., 1996; Lashbrook et al., 1998), NR (LeETR3)
(Wilkinson et al., 1995; Payton et al., 1996), LeERT4, LeETR5 (Tieman and
Klee, 1999) [38], và LeETR6 (Ciardi and Klee, 2000) [19]. Sự biểu hiện của
các receptor này phụ thuộc vào từng giai ñoạn sinh trưởng, phát triển, phụ
thuộc vào sự tác ñộng từ môi trường [36].
+ LeETR1 và leETR2: Biểu hiện ở tất cả các loại mô ñã bước sang giai
ñoạn phát triển.
+ NR: Có liên quan ñến giai ñoạn trước hạt phấn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12
+ NR và LeETR4: Liên quan ñến giai ñoạn trước chín, già hóa,sự rụng
(Payton et al,1996), sự xâm nhiễm của nguồn bệnh [19].
+ LeETR5: Biểu hiện trong quả, hoa khi có sự xâm nhiễm của nguồn
bệnh [38].

Hình 2.4. Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua
(Tieman và Klee, 1999) [38]

2.4.2. Các dạng ñột biến liên quan ñến sự chín ở cà chua
Khi quả cà chua chín có sự biến ñổi hóa sinh rất mạnh mẽ và nhanh
chóng gắn liền với những thay ñổi về màu sắc, ñộ mềm và hương vị. Theo
nghiên cứu của nhiều tác giả thì các dạng ñột biến liên quan ñến sự chín ở cà
chua có thể chia thành 2 dạng chính: các ñột biến liên quan ñến sự tổng hợp
tăng cường của ethylene trong quá trình chín và các ñột biến liên quan ñến
khả năng phục hồi biểu hiện của các gen liên quan ñến sự chín của ethylene
(sự cảm ứng của ethylene tới các gen biểu hiện khi chín) (Adams-Phillips et

al., 2004a; Giovannoni, 2004) [12].
ðại diện cho nhóm thứ nhất gồm có các ñột biến: rin (ripening inhibitor),
non-ripening (nor) và ñột biến liên quan ñến sự biến ñổi màu của quả chín. ðặc
ñiểm của các dạng ñột biến này là ethylene không ñược tổng hợp khi chín nhưng
luôn ñược duy trì ở mức cơ bản (baseline). Khi xử lý với ethylene có thể phục
hồi ñược biểu hiện của một số gen nhưng quả không chín. ðiều này có thể giải
thích là do các locus ñột biến này ñiều hòa biểu hiện của các yếu tố trong quá
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13
trình quả chín mà ñộc lập với ethylene và các yếu tố ñó có thể ức chế sự chín
hoàn toàn của quả [12].
ðại diện cho nhóm thứ hai là các ñột biến liên quan ñến các thụ cảm tiếp
nhận ethylen như Nr. Với dạng ñột biến này, ethylene vẫn tăng trong khi chín
nhưng sự biểu hiện của các gen liên quan ñến sự chín bị giảm. Chúng sẽ
không chín ngay cả khi xử lý với ethylen (Lanahan và cộng sự, 1994) [32].
* Dạng ñột biến rin (ripening inhibitor)
Theo nghiên cứu của Picton và cộng sự năm 1993 ñã thực hiện nhân dòng
các cDNA liên kết với dạng ñột biến này phát hiện ñược 1 loạt các ERT:
ERT1, ERT10 và ERT15 là các cDNA có phản ứng sinh mARN trong quá
trình chín của dạng ñột biến này. Khi xử lí dạng ñột biến này với ethylene thì
1 phần các gen này ñược sao mã, chứng tỏ dạng ñột biến này vẫn có khả năng
phản ứng với ethylene ngoại sinh (Lincoln & Fischer, 1987) [33].
Ở thực vật, mỗi loài ñều có hộp gene chứa các gene mã hóa cho các yếu tố
sao mã, ñiều khiển quá trình ra hoa và chín của quả ñược gọi là MADS-box
transcription factor. Ví dụ như ở Arabidosis, hộp gen MADS-box có 47 gen
(Rebekah et al, 2002) [36]. Trong khi ñó ở cà chua, theo nghiên cứu của
Vrebalov và cộng sự năm 2002 [29] ñã phát hiện ra rằng gene rin là một gen
nằm trong hộp gen này. Cũng theo nghiên cứu này gene rin nằm trên nhiễm
sắc thể số 5 và sự biểu hiện của rin là do tác ñộng của 2 locus kiểm soát sự

chín và ñiều khiển sự phát triển của ñài hoa. Từ ñó thiết kế ñược các cặp mồi
phát hiện các gene này dựa vào phương pháp PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14


Hình 2.5. Bản ñồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua [20]
* Dạng ñột biến Never ripe (Nr):
Dạng ñột biến này ñược phát hiện từ rất sớm bởi Rick & Butler,1956.
ðây là một dạng ñột biến bán trội xảy ra tại 1trong các receptor cảm ứng với
ethylene [38]. Dạng ñột biến Nr này ñã ñược sử dụng trong nhiều nghiên cứu
về vai trò của ethylene trong các giai ñoạn phát triển khác nhau như: (Aloni
et al., 1998) [13] nghiên cứu biểu hiện của gene; khả năng kháng stress [19].
Quả cà chua ñột biến không chín hoàn toàn ngay cả khi xử lí bởi ethylene
ngoại sinh.
* Dạng ñột biến: Never-ripe-2 (Nr-2) và Green ripe (Gr)
Các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng dạng ñột biến Nr-2 có trình tự gen mã hóa
không tương ñồng với ñột biến Nr. ðột biến Nr-2 ñược chỉ ra là do gen Nr-2,
nằm trên vùng cánh dài của NST số 1 (Giovannoni và cộng sự năm 2005) [21].
Nghiên cứu sự di truyền của 2 dạng ñột biến Gr và Nr-2 cho thấy ñây là 2
dạng ñột biến trội. Khi lập bản ñồ di truyền của 2 dạng ñột biến cho thấy gen
qui ñịnh dạng ñột biến này nằm trên 1 vùng 2cM giữa 2 chỉ thị TG260 và
TG245 trên cánh dài của NST số 1 [16].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

15


Hình 2.6. Bản ñồ gene của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể

số 1 của cà chua [16]
2.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng bệnh
virus xoăn vàng lá
Nhìn chung, các nghiên cứu tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá
ñi theo các hướng chủ yếu: (1) tạo giống kháng vector bọ phấn; (2) tạo giống
kháng virus xoăn vàng lá nhờ những nguồn kháng tự nhiên từ cà chua dại và
(3) tạo giống kháng bệnh nhờ nguồn kháng từ virus thông qua công nghệ
RNAi. Trong ñó, tạo giống mang tính kháng tự nhiên ñược cho là hiệu quả
nhất ñể phòng chống bệnh (Pena và cộng sự, 2010) [34].
2.5.1. Nguyên nhân gây bệnh virus xoăn vàng lá
Bệnh xoăn vàng lá cà chua lần ñầu tiên ñược xác ñịnh tại Israel vào năm
1930 và hiện nay ñã ñược xác ñịnh do một nhóm các loài begomovirus khác
nhau thuộc họ geminivirus gây ra, ñược lan truyền bởi vector bọ phấn trắng
(Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Hà Viết Cường, 2008) [5].
Mặc dù nhóm geminivirus này bao gồm các loài riêng biệt, nhưng chúng vẫn
ñược gọi chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus
(Vidavski, 2007) [39].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

16
TYLCVD cho ñến nay ñược biết có liên quan tới ít nhất 11 loài và hơn
25 chủng monopartite begomoviruses (Fauquet và cộng sự, 2008) [20]. Bệnh
virus xoăn lá cà chua (Tomato leaf curl virus disease - ToLCVD) có những
triệu chứng khác rất nhỏ với TYLCVD, nó ñược chú ý sau này do ñược gây ra
bởi các loài begomovirus bộ gen kép (bipartite begomovirus) và bởi sự khác
biệt trong chuỗi DNA [4], [34]. Các loài begomovirus bộ gen kép (bipartite
genome) gồm hai phân tử DNA sợi vòng ñơn: DNA-A (2,6-2,8 kb) và DNA-
B (2,5-2,8 kb) (Gronenborn, 2007) [23], các loài có bộ gen ñơn tương ñương
phân tử DNA-A.
Ở Việt Nam ñã phát hiện có 3 loài begomovirus gây ra bệnh xoăn

vàng ngọn cà chua là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV); Tomato
yellow leaf curlKanchanaburi (TYLCKaV) vàTomato yellow leaf curl
Vietnam virus (TYLCVNV) [23].
2.5.2. Nghiên cứu về các nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá
Loài cà chua trồng (Solanum lycopersicum) cực kỳ mẫn cảm với virus
xoăn vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV). Tuy nhiên, mức ñộ
kháng cao với TYLCV ñã ñược tìm thấy trong các loài cà chua dại S.
pimpinellifolium, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites, và S.
cheesmaniae. Một vài accession của và S. pimpinellifolium cũng biểu hiện
mức ñộ chống chịu tốt với TYLCV (Ji và cộng sự, 2007a) [24]. Trong các
loài cà chua dại biểu hiện tính kháng với TYLCV, S. chilense, S.
habrochaites, và S. peruvianum cung cấp khả năng kháng tốt và ñã ñược sử
dụng rộng rãi trong chương trình tạo giống ñể phát triển các giống cà chua
thương mại kháng TYLCV [24], [34].
Tiếp ñó, các dòng giống với khả năng kháng cao như TY172, TY197…
ñã ñược phát triển tại Trung tâm Volcani ở Israel từ loài S. Peruvianum [24].
Tính kháng trong TY172 ñược ñiều khiển bởi một QLT (Quantitative Trait
Locus)lớn và bốn QLT nhỏ, QLT lớn ñược ñặt tên là Ty-5, nằm trên nhiễm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

17
sắc thể số 4 (Anbinder và cộng sự, 2009) [14]. Các accession LA372, LA452,
LA462, LA1274, LA1333, LA1373, và CMV sel INRA (PI126926 ×
PI128648-6), cũng như S. peruvianumvar. humifusum LA385 ñã ñược phát
hiện là có khả năng kháng cao với TYLCV. Các gen từ S. peruvianum ñã
nhanh chóng ñược ñưa vào các giống lai thương mại tên tuổi và cung cấp khả
năng kháng tốt với TYLCV [24].
S. chilense là nguồn gen kháng rất quan trọng trong nhiều chương trình
tạo giống trên thế giới. Năm 1991, Zakay và cộng sự ñã báo cáo khả năng
kháng cao với TYLCV trong các cá thể LA1969 [25]. Năm 1994, Zamir và

cộng sự [35] ñã lập bản ñồ gen Ty-1 trên nhiễm sắc thể số 6 và hai gen bổ
sung trên nhiễm sắc thể số 3 và 7 [25]. Hiện ñã tìm ra ở S. chilense các
accession LA1932, LA1938, LA1959, LA1960, LA1961, LA1963, LA1968,
LA1969, LA2747, LA2774, và LA2779 có khả năng kháng ToMoV ở Florida
và ñã ñược sử dụng ñể bắt ñầu một chương trình tạo giống kháng bằng
phương pháp lai khác loài. Các ñánh giá tại trung tâm rau thế giới (The World
Vegetable Center -AVRDC) cũng cho thấy LA1932 kháng tốt tại tất cả 8 ñịa
ñiểm thử nghiệm tại ðông Nam Á (Green và Shanmugasundaram, 2007) [22],
gợi ý rằng LA1932 có thể là một nguồn gen kháng tốt cho Việt Nam và cần
ñược nghiên cứu thêm.
Năm 1982, Hassan và cộng sự ñã ñánh giá các accessionLA0386,
LA1252, LA1295, LA1352, LA1393, LA1624, và LA1691 thuộc loài S.
habrochaitesvà thấy rằng chúng có khả năng kháng cao với TYLCV, tính
kháng từ các accession này là trội [25].
Tại Ấn ðộ, S. habrochaites f. glabratum B6013 ñã ñược chứng minh có
hai gen lấn át (epistatic genes) kiểm soát tính kháng Tomato leaf curl virus
(ToLCV). Sau ñó, các nhà nghiên cứu ở ñây ñã phát triển dòng giống H24 từ
accession này. "H24" ñã ñược chứng minh mang gen kháng Ty-2. "H24" tạo
ra tính chịu bệnh rõ ràng với một số chủng (strains) TYLCV/ToLCV nhưng