xác định giai đoạn hình thành và khảo sát sự biệt hóa của nguyên bào sụn trên giá thể pla

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






LÊ MINH DUY







Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VÀ KHẢO SÁT
SỰ BIỆT HÓA CỦA NGUYÊN BÀO SỤN
TRÊN GIÁ THỂ PLA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Cán bộ hướng dẫn : TS. Trần Lê Bảo hà





ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





LÊ MINH DUY




ĐỀ CƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
LUẬN VĂN THẠC SĨ





Tên đề tài: Xác định giai đoạn hình thành và khảo sát sự biệt hóa của nguyên bào
sụn trên giá thể PLA
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 62420201
Chƣơng trình: Phương thức 2




Xác nhận của cán bộ hướng dẫn
(Ký tên và ghi rõ họ tên)





TS. Trần Lê Bảo Hà





Tp. HCM, tháng 1 năm 2015
1

1. Giới thiệu tổng quát
Tế bào bào gốc trưởng thành hoặc tế bào gốc sinh dưỡng đều có những tiềm năng đầy
hướng hẹn trong sự tái tạo mô cơ thể. Hiện nay, việc nghiên cứu sinh học cơ bản và ứng
dụng trị liệu của tế bào gốc trung mô đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Tế
bào gốc trưởng thành (Adult stem cell, ASC) đã được phân lập và nghiên cứu từ nhiều
nguồn mô khác nhau trong cơ thể như tủy xương, dây cuống rốn, não, biểu mô, tủy răng
và gần đây nhát là mô mỡ. Mặc dù tế bào gốc trưởng thành còn hạn chế trong khả năng
biệt hóa thành các mô cơ quan khác nhau nhưng chúng vẫn đảm nhiệm vai trò duy trì tính

nội cân bằng mô trong cơ thể bằng cách phục hồi các tế bào bị mất do tuổi tác hoặc bị tổn
thương. Điều đó cho thấy chức năng tái tạo mô đầy triển vọng của các loại tế bào gốc
này. Một trong số các ASC được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất đó là tế bào gốc trung
mô (Mesenchymal stem cell, MSC) và nồi bật là tế bào gốc mô mỡ. Tế bào gốc mô mỡ
(Adipose tissue-derived stem cell, ADSC) không những có chung các đặc điểm của tế
bào gốc trung mô tủy xương mà còn mang các ưu điểm nổi bật khác tiêu biểu như việc
thu nhận dễ dàng hơn khi không cần quá trình phẫu thuật phức tạp. Hơn thế nữa, tế bào
gốc mô mỡ còn có tiềm năng biệt hóa thành các tế bào trung mô như tế bào mỡ, tế bào
xương, cơ xương và tế bào sụn, cũng như các tế bào không phải trung mô như tế bào gan,
tế bào nội tiết tuyến tụy, tế bào thần kinh, tế bào cơ tim và tế bào nội mô mạch máu [8]
Hiện nay, ứng dụng của tế bào bào gốc mô mỡ ngày càng phát triển đặc biệt trong lĩnh
vực công nghệ tái tạo mô. Công nghệ này nghiên cứu và sử dụng các vật liệu sinh học để
tạo ra các mô mới có đặc điểm chức năng tương tự trong cơ thể nằm thay thế các mô cơ
quan bị mất hoặc tổn thương. Một ví dụ tiêu biểu trong lĩnh vực này đó là công nghệ tái
tạo mô sụn. Mô sụn khớp khi trưởng thành không có khả năng tự sửa chữa một cách hiệu
quả khi bị tổn thương hoặc bị lão hóa. Việc sử dụng các tế bào gốc mô mỡ đã được kích
hoạt biệt hóa sụn nhằm thay thế các mô sụn đã mất cho các bệnh nhân thoái hóa sụn khớp
đang được ứng dụng rộng rãi ở các bệnh viện và đã gặt hái được các thành công nhất
định. Bên cạnh việc ứng dụng điều trị bệnh về sụn khớp, công nghệ tái tạo mô sụn còn
mở ra một hướng đi mới đầy hứa hẹn cho lĩnh vực phẫu thuật thẩm mỹ như nâng mũi và
2

tái tạo khuôn mặt [7]. Với đặc điểm sống mũi không cao và chóp mũi tẹt ở hầu hết các
phụ nữ châu Á, nhu cầu chỉnh sửa nâng mũi ngày càng lớn kéo theo các công nghệ phẫu
thuật ngày cang phát triên. Cho đến nay có ba phương pháp nâng mũi được sử dụng phổ
biến là nâng mũi bằng silicon, chất làm dầy và sụn. Trong đó, phương pháp nâng mũi
bằng sụn được ưa chuộng nhất do sỡ hữu các ưu điểm nổi bật so với hai phương pháp còn
lại như ít biến chứng, khối sụn sẽ dần đồng nhất với cơ thể và tồn tại vĩnh viễn mà không
cần tái phẫu thuật. Nâng mũi bằng sụn là phương pháp đặt thêm một miếng sụn dưới da,
dọc theo sống mũi để kéo dài, làm thẳng hoặc tạo hình thẩm mỹ phù hợp cho chiếc mũi.

Miếng sụn có thể là sụn nhân tạo hay sụn tự thân. Trong đó, sụn tự thân được thu nhận
thông thương từ sụn sườn, sụn vành hoặc sụn vách ngăn của chính người cần phẫu thuật.
Hiện nay, các bác sĩ phẫu thuật đã phát triển thêm bước bọc một miếng sụn ở chóp mũi.
Miếng sụn nhỏ này được lấy từ sụn vành tai với đường mổ khoảng 1 – 2 cm. Việc này
giúp cho sống mũi nhân tạo không bị tụ, đầu mũi không bị biến chứng. Tuy nhiên,
phương pháp nâng mũi bằng sụn hiện nay đòi hỏi phải phẫu thuật lấy sụn từ nhiều vị trí
trên cơ thể nhưng vẫn không đảm bảo được lượng sụn cần thiết để nâng sống mũi. Việc
sử dụng sụn nhân tạo là các giá thể 3D rỗng có cấu trúc tương tự sụn có thể gây biến
chứng và cần tái phẫu thuật sau một thời gian nhất định. Vì vậy, công nghệ tạo mô sụn từ
tế bào gốc mô mỡ của chính bệnh nhân là giải pháp đầy triển vọng cho vấn đề này.
Để có thể thu nhận mô sụn với kích thước mong muốn tạo thẩm mỹ cho sống mũi, quá
trình biệt hóa sụn cần được diễn ra trên một giá thể phù hợp. Một giá thể lý tưởng trong
tái tạo mô phải bao gồm ít nhất ba đặc điểm: tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào bám
dính và phát triển, dễ dàng được gia công thành cách hình dạng cụ thể và có đủ độ bền để
duy trì hình dạng đó. Giá thể polylactic acid (PLA) được xem là một trong các giá thể
được ứng dụng thành công nhất trong công nghệ tái tạo mô sụn do mô sụn được biệt hóa
trên giá thể PLA có cấu trúc tương tự như mô sụn tự nhiên. PLA với cấu trúc phân tử
(C
3
H
4
O
2
)
n
là một polyester nhiệt dẻo có khả năng phân hủy sinh học. Ngày nay, các thiết
bị hiện đại giúp gia công các sợi PLA thành các giá thể có hình dạng chính xác với sống
mũi người từ đó miếng sụn được tạo ra đạt kích thước lý tưởng cho phẫu thuật nâng mũi.
3

Với các ưu điểm của giá thể PLA, nhiều công trình nghiên cứu đã thực hiện quá trình
biệt hóa tế bào gốc mô mỡ trên giá thể này và khảo sát sự biệt hóa hình thành nên mô
sụn. Tuy nhiên, phương pháp biệt hóa tế bào gốc mô mỡ ngay trên giá thể PLA không
kiểm soát được tỷ lệ biệt hóa sụn cũng như không đảm bảo được chất lượng miếng mô
sụn được tạo ra. Trong đề tài này sẽ đưa ra một hướng giải quyết đó là sử dụng nguyên
bào sụn, một giai đoạn trung gian trong quá trình biệt hóa sụn và có tỷ lệ hình thành sụn
cao hơn, để nuôi cấy biệt hóa trên giá thể PLA. Điều này đỏi hỏi phải xác định giai đoạn
hình thành nguyên bào sụn và khảo sát sự tăng trưởng biệt hóa của nguyên bào sụn này
trên giá thể PLA. Kết quả của đề tài được ứng dụng trong việc tối ưu khả năng biệt hóa
sụn từ tế bào gốc mô mỡ có sử dụng giá thể PLA, từ đó đảm bảo chất lượng của miếng
sụn trong phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi hoặc tái tạo khuôn mặt. Bên cạnh đó, phương
pháp sử dụng nguyên bào sụn để biệt hóa thành tế bào sụn với hiệu suất biệt hóa cao hơn
sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh về sụn khớp.
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:
Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều các đề tài nghiên cứu thức hiện quá trình biệt
hóa sụn từ tế bào gốc trung mô hay tế bào gốc mô mỡ in vitro và cả in vivo. Một số đề tài
còn khảo sát sự biệt hóa sụn của tế bào gốc mô mỡ trên các loại giá thế có thành phần
khác nhau. Tuy nhiên, đối với giai đoạn nguyên bào sụn thì chưa có một đề tài nghiên
cứu nào xác dịnh thời gian biệt hóa thành nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ cũng như
các marker bề mặt đặc trưng cho giai đoạn này. Do đó, việc khảo sát sự biệt hóa của
nguyên bào sụn trên giá thể cũng chưa được nghiên cứu.
Gần đây, việc trị bệnh thoái hóa khớp bằng tế bào gốc mô mỡ tự thân đã được ứng dụng
ở các bệnh viện lớn trong nước ta. Trong năm 2012, bệnh viện Đại học Y dược đã áp
dụng cho hơn 20 trường hợp, tất cả điều cho kết quả tốt, bệnh nhân phục hồi chức năng
khớp gối đạt 80-90% so với bình thường. Nhiều bệnh viện lớn trong nước đã sử dụng kỹ
thuật phân tách tế bào gốc mô mỡ tự thân mà đã được nghiên cứu, thực hiện tại nhiều
nước trên thế giới trong việc điều trị thoái hóa khớp gối. Hiện nay, nước ta cũng có
những nghiên cứu lâm sàng điều trị thoái hóa khớp gối bằng cách sử dụng tế bào gốc mỡ
4

tự thân. Điều này cho thấy ứng dụng quá trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ ngày
trong trị liệu ở nước ta càng phổ biến và được quan tâm nghiên cứu. Đối với phẫu thuật
thẩm mỹ đặc biệt là trong phẫu thuật nâng mũi, nước ta đã áp dụng thành công các công
nghệ và phương pháp tiên tiến chuyển giao từ nước ngoài và thu được lợi nhuận to lớn.
Tuy nhiên các phương pháp phẫu thuật nâng mũi hiện vẫn còn những hạn chế nhất định.
Nội dung đề tài này phần nào đưa ra một hướng đi mới, một phương pháp mới hoàn thiện
hơn trong phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi nói riêng và công nghệ tái tạo mô sụn nói chung.
2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài bao gồm hai mục tiêu chính:
- Xác định giai đoạn nguyên bào sụn trong quá trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ.
- Khảo sát sự tăng trưởng của nguyên bào sụn trên giá thể PLA.
3. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng là mẫu mô mỡ bụng của người trưởng thành.
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ
Trong quá trình biệt hóa từ tế bào gốc trung mô thành tế bào sụn trải qua các giai đọan
cơ bản như: (1) Tế bào gốc trung mô; (2) tế bào tiền sụn; (3) Nguyên bào sụn; (4) tế bào
sụn chưa trương phồng; (5) tế bào sụn trương phồng. Ở mỗi giai đoạn biệt hóa đều được
đặc trưng bởi một số gen mõa hóa cho chất nền ngoại bào sụn. Do đó, để xác định được
giai đoạn hình thành nguyên bào sụn, phương pháp RT-PCR là công cụ đắc lực để phát
hiện sự bắt đầu biểu hiện của các gen đặc trưng cho từng giai đoạn. Khi tế bào đi vào giai
đoạn nguyên bào sụn sẽ kích hoạt biểu hiện các gen Collagen IIa1 (Col2a1), aggrecan
(Acan) và COMP (Cartilage oligomeric matrix protein). Khi tế bào bước sang giai đoạn
tế bào bào sẽ bắt đầu kích hoạt biểu hiện gen Collagen Xa1 (Col10a1) [6]. Như vậy có
thể sử dụng thông tin này để xác định khoảng thời gian nguyên bào sụn hình thành bằng
cách thu hẹp dần dần các mốc thời gian kiểm tra sự biển hiện các gen đặc trưng trên
5

đồng thời kết hợp với khảo sát hiệu suất biệt hóa bằng phương pháp nhuộm đặc trưng
chất nền tế bào sụn (Toluidine Blue).

Giai đoạn
biệt hóa
Các marker
chất nền
Các marker
điều hòa
Hình dạng
tế bào
Các nhân tố
tăng trƣờng và
biệt hóa
Tế bào trung mô
tạo sụn
Col1a1
Sox9, Runx2

Shh, TGF-β
Tiền nguyên bào sụn
Col2a1, Acan,
Crtl
Sox9, Sox5,
Sox6

TGF-β, Wnt-3A,
Wnt7A
FGF-2,4,8,10
BMP-2,4,7
Nguyên bào sụn
Col2a1, Acan,
Crtl1, Comp,

Crtm
Sox9, Sox5,
Sox6

IGF-1
FGF-2/FGFR2
BMP-2,4,7,14
Tiền tế bào sụn
Col2a1,
Acan,Crtl1,
Comp, Crtm
Pthr1, Ihh

FGF-18, FGFR-3
BMP-2,7
Tế bào sụn
Col10a1
Runx2, Runx3

VEGF
FGF-2, FGF-R1
Wnt14/β-catenin
Các giai đoạn của quá trình biệt hóa sụn và các gen biểu hiện đặc trưng [6]
4.1.1. Biệt hóa nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ bằng nuôi cấy vón cục
Không giống với quá trình biệt hóa mỡ và biệt hóa xương, các yếu tố vật lý của vi môi
trường tạo sụn đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình biệt hóa của tế bào gốc
trung mô thành sụn. Theo một số công trình nghiên cứu, các tương tác không gian ba
chiều, sự tiếp xúc bề mặt của các tế bào gốc trung mô là điều cần thiết cho sự biệt hóa
sụn. Khi các tế bào gốc dược nuôi cấy theo phương pháp tếbào đơn sẽ không có kết quả
biệt hóa thành sụn cho dù được nuôi trong môi trường có bổ sung nhân tố biệt hóa sụn.

Chỉ khi được biệt hóa trong vi môi trường ba chiều phù hợp, các tế bào sẽ biểu hiện
proteoglycan, collagen isoform và chất nền sụn hình thành [1]. Vì thế, các phương pháp
nuôi cấy phổ biến được sử dụng trong quá trình biệt hóa sụn in vitro nhằm thiết lập môi
trường giúp các tế bào gốc có thể tương tác với nhau như: nuôi cấy micromass,
6

nuôi cấy trong gel alginate và nuôi cấy vón cục. Nuôi cấy vón cục là phương pháp được
sử dụng trong đề tài này.
Sau khi thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ từ tế bào mỡ, các tế bào ADSC được
nuôi cấy vón cục để biệt hóa thành nguyên bào sụn. Ở các mốc thời gian sau khi bắt đầu
kích hoạt biệt hóa 1, 2, 3 và 4 tuần sẽ thực hiện RT-PCR cho các gen Aggrecan, COMP,
Col2a1, Col10a1 và nhuộm Toluidine blue để xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn.
4.1.1. Biệt hóa nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ bằng nuôi cấy tế bào đơn
Phương pháp nuôi cấy vón cục có một hạn chế đó là các tế bào biệt hóa không đồng đều
do các tế bào bên ngoài tiếp xúc với môi trường biệt hóa nhiều hơn là các tế bào nằm bên
trong lõi của cục vón. Một số nghiên cứu đã công bố, khi các tế bào gốc mô mỡ được
kích hoạt biệt hóa trong điều kiện nuôi cấy tế bào đơn, những tế bào này vẫn diễn ra quá
trình biệt hóa sụn cho dù không có sự tương tác giữa tế bào với tế bào. Điều này cho thấy
mặc dù điều kiện vi môi trường 3D giúp các tế bào tương tác với nhau thúc đẩy sự biệt
hóa sụn hơn nuôi cấy tế bào đơn nhưng điều kiện này không phải là bắt buộc của quá
trỉnh biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ. Vì thế cần thử nghiệm song song hai phương
pháp biệt hóa sụn là nuôi cấy vón cục và nuôi cấy bám dính để có thể lựa chọn nguyên
bào sụn được tạo ra từ phương pháp nào là tốt nhất [9].
Sau khi thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ từ tế bào mỡ, các tế bào ADSC được
nuôi cấy tế bào đơn biệt hóa thành nguyên bào sụn. Ở các mốc thời gian sau khi bắt đầu
kích hoạt biệt hóa 1, 2, 3 và 4 tuần sẽ thực hiện RT-PCR cho các gen Aggrecan, COMP,
Col2a1, Col10a1 và nhuộm Toluidine blue để xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn.
4.2. Tiếp tục biệt hóa sụn từ nguyên bào sụn trên giá thể PLA
Nguyên bào sụn được đưa lên giá thể PLA và tiếp tục được nuôi cấy trong môi trường
biệt hóa sụn trong vòng 2 tuần. Sau đó sẽ tiến hành các thử nghiệm RT-PCR cho gen

Col2a1 và Col10a1, nhuộm tế bào bằng Toluidine Blue, chụp SEM (Scanning electron
microscope) và flow cytometry cho marker CD10/14/26/151 để xác định tế bào sụn đã
được hình thành [5]
7

4.3. Sơ đồ nội dung nghiên cứu











5. Phƣơng pháp nghiên cứu
Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:
- Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ
- Nuôi cấy bám dính, nuôi cấy vón cục
- Biệt hóa sụn trên giá thể 3D
- Nhuộm Toluidine, RT-PCR, chụp SEM, flow cytometry.
5.1. Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ [1]
Môi trường tách chiết:
• HBSS
• Betadine iodine
• Collagenase type I
• PBS

Tế bào gốc mô mỡ
ADSC
Xác định giai đoạn
nguyên bào sụn
Khảo sát sự tăng trưởng
nguyên bào sụn trên
giá thể PLA
Nuôi cấy vón cục
Nuôi cấy bám dính
Cấy nguyên bào sụn
lên giá thể PLA
RT-PCR
Nhuộm Toluidine Blue
RT-PCR
Nhuộm Toluidine Blue
Chụp SEM
Flow cytometry
8

Môi trường nuôi cấy và cấy chuyển:
• DMEM
• 10% FBS
• 1% Penicillin 100 U/mL + Streptomycin 100 µg/mL
• Trypsin/EDTA
• Gentamycin
• PBSA
• IMDM
Cách thực hiện:
• Mô mỡ được cắt nhỏ và rửa bằng HBSS, betadine.
• Bổ sung collagenase, đặt trong bể ổn nhiệt 37

o
C trong 60p.
• Ly tâm thu cặn. Huyền phù tế bào bằng PBS rồi tiếp tục ly tâm.
• Huyền phù cằn với môi trường nuôi cấy. Ủ ở 37
o
C, 5% CO
2
.
• Thay môi trường 2 lần 1 tuần.
• Khi tế bào phát triển 70 – 80% diện tích bình nuôi thì cấy chuyển.
5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy vón cục [2]
Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp ly tâm với tốc độ hợp lý sẽ làm các tế bào tụ lại với
nhau nhằm tạo điệu kiện môi trường tương tác giữa tế bào với tề bào. Sự tương tác này
tương tự như cấu trúc mô sụn tự nhiên, giúp thúc đẩy sự biệt hóa sụn của tế bào gốc.
Môi trường biệt hóa sụn:
 DMEM HG (Dulbecco‟s Modified Eagles Medium – High glucose)
 Dexamethasone 100 nM
 Penicillin/Streptomycin (100 μg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin)
 ITS + (bovine insulin, transferrin, selenous acid, linoleic acid, BSA)
 L-Ascorbic acid 2-phosphate 50mg/mL
 FBS 10% + TGF-β1 10 ng/ml


9

Cách thực hiện:
 Thu nhận 2 x 10
5
tế bào ADSC cho vào falcon 15 ml
 Bổ sung 1 ml môi trường biệt hóa sụn

 Ly tâm 500g trong 5 phút. Đổ bỏ dịch nổi.
 Bổ sung 500 μl môi trường biệt hóa sụn. Ủ với nhiệt độ 37
o
C và 5% CO
2

 Thay môi trường 3 ngày một lần
5.3. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn
 Thu nhận 2 x 10
5
tế bào ADSC cho vào đĩa bốn giếng.
 Bổ sung 400 μl môi trường biệt hóa sụn. Ủ với nhiệt độ 37
o
C và 5% CO
2

 Thay môi trường 3 ngày một lần
5.4. Phƣơng pháp nuôi cấy trên giá thể 3D
 Thu nhận 2 x 10
6
nguyên bào sụn cấy vào giá thể ở đĩa petri
 Ủ ở 37
o
C trong 2 giờ để tế bào bám dính vào giá thể
 Bổ sung môi trường biệt hóa sụn sao cho giá thể ngậm hết trong môi trường
 Ủ với nhiệt độ 37
o
C và 5% CO
2

 Thay môi trường 3 ngày một lần
5.5. Các phƣơng pháp xác định nguyên bào sụn và tế bào sụn
5.5.1. RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)
Nguyên tắc: Phương pháp RT-PCR là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và
phương pháp PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lượng rất
thấp có trong mẫu
Cách thực hiện:
• Tách chiết RNA
• Tạo cDNA
• Chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Aggrecan, COMP, Col2a1, Col10a1, GADPH.
• Chạy điện di gel agarose 1%
10

Gen
Mồi xuôi
Mồi ngƣợc
Amplicon
Aggrecan
5‟-CCTCTGGACAACCAGGTGTT-3‟
5‟-AAACCAGGTCAGGGACTCCT-3‟
174 bp
COMP
5‟-AGGACAACTGCGTGACTGTG-3‟
5‟-GTGTCC TTTTGGTCGTCGTT-3‟
221 bp
Col2a1
5‟-ACCCCAATCCAGCAAACGTT-3‟
5‟-ATCTGGACGTTGGCAGTGTTG-3‟
399 bp
Col10a1

5‟-AGGTGCCAAAGGGGAACAAG-3‟
5‟-AATCCTGGAATGCCTGGTGG-3‟
429 bp
GADPH
5‟-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3‟
5‟-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3‟
238 bp

5.5.2. Nhuộm mô tế bào bằng Toluidine Blue
Nguyên tắc: Toluidine Blue là một thiazine biến sắc cơ bản và có ái lực cao với các
thành phần mô có tính acid. Do đó, Toluidine blue sẽ liên kết với các proteoglycan mang
điện tích âm có trong chất nền sụn. Sau khi rửa đi tuốc nhuộm, mẫu sụn sẽ bắt màu xanh
dương đặc trưng.
Cách thực hiện:
Chuẩn bị đóng khung mẫu vón cục:
 Đưa mẫu vón cục vào 20 ml paraformaldehyde, ủ với nhiệt độ phòng trong 4 giờ.
 Dehydrate mẫu bằng các dung dịch EtOH
 Rửa bằng xylene
 Bổ sung paraffin ủ với nhiệt độ 60
o
C trong 60 phút
 Chuyển vào khung để qua điêm
 Cắt lát mỏng 10 μm chuyển lên lame
Nhuộm Toluidine Blue
 Rehydrate mẫu với dung dịch EtOH. Rửa với nước cất
 Bổ sung dung dịch Toluidine Blue, ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Rửa với nước cất
 Dehydrate mẫu với dung dịch EtOH
 Rửa sạch mẫu bằng xylene
 Quan sát trện kinh hiển vi
11

5.5.3. Flow cytometry
Nguyên tắc: Flow cytometry là một kĩ thuật có độ nhạy cao dùng để xác định các
marker bề mặt của tế bào. Kĩ thuật này sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh
quang gồm một kháng thể kháng marker bề mặt có gắn màu huỳnh quang. Sau đó, các
tế bào sẽ được di chuyển theo dòng chất lỏng xuyên qua một chùm tia sáng. Khi tế bào
có nhuộm huỳnh quang bị va đập bởi ánh sáng tập trung thì chúng phát ra những tín hiệu
khác nhau. Tín hiệu này được cảm nhận bằng máy dò, chuyển đến máy tính xử lý và
được xuất ra thông tin kết quả.
Cách thực hiện:
 Thu nhận 10
6
tế bào bằng trypsin/EDTA 0.25
 Huyền phù tế bào trong 1 ml Facs Flow và nhuộm với 10 μl kháng thể kháng
CD10/14/26/151 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
 Làm lạnh mẫu trong 15 phút ở 4
0
C.
 Tiến hành đánh giá marker tế bào bằng máy FACS Calibur sử dụng phần mềm
Cell Quest Pro.
5.5.4. Chụp SEM (Scanning electron microscope)
Nguyên tắc: SEM là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao
của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử electron hẹp quét lên trên bề
mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích
các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu. Ưu điểm chính của
phương pháp này là có thể phân tích bề mặt mẫu mà không cần phá hủy mẫu thử.
Cách thực hiện:
 Mẫu được cắt lát mỏng và cố định trong dung dịch 2.5% glutaraldehyde
 Rửa 3 lần với 0.2 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4).
 Cố định mẫu với 1% osmium tetraoxide và rửa bằng dung dịch cồn và amyl acetate

 Sấy khô
 Mẫu được bọc vàng và quan sát bằng thiết bị SEM.
12

6. Dự kiến kết quả
Giai đoạn hình thành nguyên bào sụn bắt đầu sau 7 ngày đến 14 ngày sau khi kích thích
biệt hóa tế bào gốc trung mô thành sụn.
Sau 2 tuần biệt hóa sụn trên giá thể 3D, tế bào sụn được hình thành số lượng nhiều.
7. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: Phòng thí nghiệm nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc
Thời gian: Từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 8 năm 2015
STT
Nội dung, công việc chủ yếu
Kết quả dự kiến
Thời gian
thực hiện
1
Xác định giai đoạn hình thành
nguyên bào sụn từ tế bào
ADSC bằng nuôi cấy vón cục
Xác định thành công
giai đoạn hình thành
nguyên bào sụn
Tháng 1 – 3/2015
2
Xác định giai đoạn hình thành
nguyên bào sụn từ tế bào
ADSC bằng nuôi cấy TB đơn
Xác định thành công
giai đoạn hình thành

nguyên bào sụn
Tháng 3 – 5/2015
3
Khảo sát sự tăng trưởng của
nguyên bào sụn trên giá thể
Đánh giá được khả
năng biệt hóa thành sụn
của nguyên bao sụn
Tháng 5 – 7/2015
4
Phân tích, tổng kết các kết quả
và viết báo cáo.
Hoàn thành đề tài.
Tháng 8/2015




13

8. Tài liệu tham khảo
8.1. Tài liệu Tiếng Việt
[1] Phan Kim Ngọc (2010), “Công nghệ tế bào gốc”, NXB Giáo dục Việt Nam.
8.2. Tài liệu Tiếng Anh
[2] Bradley T. Estes, Brian O. Diekman, Jeffrey M. Gimble (2010), “Isolation of adipose
derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype”, Nat Protoc, 5(7),
1294–1311.
[3] Francesco Carfì Pavia (2012), “Poly Lactic Acid Based Scaffolds for Vascular Tissue
Engineering”, Chemical engineering transactions,27.
[4] Gary S. Firestein,Ralph C. Budd,Sherine E (2012), „Cartilage and Chodrocytes”,

Kelley's Textbook of Rheumatology volume 1, NXB Elsevier Health Sciences, 33.
[5] Hamada T, Sakai T, Hiraiwa H (2013), “Surface markers and gene expression
to characterize the differentiation of monolayer expanded human articular chondrocytes”,
Nagoya J Med Sci, 75(1-2):101-11.
[6] Hanna Taipaleenmäki (2010), “Factors regulating chondrogenic differentiation”,
University of Turku.
[7] Liliana S. Moreira- Teixeira (2011), “Cartilage Tissue Engineering”, Cartilage and
Bone Development and Its Disorders, 21, 102–115.
[8] Samira Yarak (2010), “Human adipose-derived stem cells: current challenges and
clinical perspectives”, An Bras Dermatol, 85(5):647-56.
[9] Stephane Boeuf, Wiltrud Richter (2010), “Chondrogenesis of mesenchymal stem
cells: role of tissue source and inducing factors”, Stem Cell Research & Therapy,1: 31.