Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin liên quan đến khả năng kháng mọt ở ngô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN THỊ HỢP





THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC GEN CYSTATIN LIÊN QUAN
ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở NGÔ





LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN THỊ HỢP



THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC GEN CYSTATIN LIÊN QUAN
ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở NGÔ


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2014

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ
Khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên;
Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn


Nguyễn Thi Hợp

ii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh,
ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống - Đại học
Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những
góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng
Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp
và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Hợp

iii
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
1. Lí do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. NGÔ (ZEA MAY L.) 3
1.2. MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais 9
1.3. PROTEINASE VÀ CYSTATIN 12
1.3.1. Proteinase và các loại proteinase 12
1.3.2. Proteinase inhibitor 14
1.4. CHUYỂN GEN THỰC VẬT 17
1.4.1. Phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 17

20
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 23
2.1.1. Vật liệu 23
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 24
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 25
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Phân lập gen 25

iv
2.2.2. Phản ứng lai ghép gen Cystatin2 (Cys2) với vector pENTR
TM
/D-TOPO
®
31
2.2.3. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen Cys2 bằng
kỹ thuật Gateway 33
2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 35
2.2.4.1. Phƣơng pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens 35
2.2.4.2. Phƣơng pháp tái sinh cây thuốc lá 35
2.2.4.3. Phƣơng pháp tách DNA từ cây thuốc lá 36
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. PHÂN LẬP GEN CYSTATIN2 TỪ GIỐNG NGÔ CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG MỌT SL 38
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN Cys2 43
3.3. TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN
pPhaso-Cys2 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
PHỤ LỤC 58

v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT
Chữ viết tắt
Nghĩa tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
1
BAP
6- benzyl amino purine

2
bp
Base pair
Cặp bazơ
3
cDNA
Complementary DNA

4
cs

Cộng sự
5
DEPC
Diethyl pyrocarbonate

6
DNA
Deoxyribose nucleic acid

7
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate

8
EDTA
Ethylene diamine tetraacetic
acid

9
E. coli
Escherichia coli

10
GM
Germination medium
Môi trƣờng nảy mầm của

hạt
11
IPTG
Isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside

12
kb
kilo base

13
kDa
kilo Dalton

14
LB
Luria Bertani

15
MS

Môi trƣờng nuôi cấy mô
cơ bản theo Murashige
và Skoog
16
mRNA
messenger ribonucleic acid

17
OD

Optical density


vi
18
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng
hợp
19
RM
Rooting medium
Môi trƣờng ra rễ
20
RNA
Ribonucleic acid

21
SDS
Sodium dodecyl sulfate

22
TAE
Tris – acetate- EDTA

23
X-gal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-
D-galacto-pyranoside

24
Taq
Thermus aquaticus

25
v/p
Vòng/phút
















vii
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1: Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012 7
Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô của Việt Nam từ 2007 - 2013 9
Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 24
Bảng 2.2: Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 26

Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng PCR nhân gen Cys2 26
Bảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen Cys2 27
Bảng 2.5: Thành phần gắn gen Cystatin vào vector tách dòng pBT 27
Bảng 2.6: Thành phần của phản ứng colony - PCR 30
Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR 30
Bảng 2.8: Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 30
Bảng 2.9: Thành phần phản ứng ghép nối gen Cys2 với vector
pENTR
TM
/D-TOPO
®
32
Bảng 2.10: Thành phần phản ứng LR 34
Bảng 2.11: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 36
Bảng 2.12: Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2 t
37
Bảng 3.1: Cys2
38130 42
Bảng 3.2: Sự sai khác giữa trình tự amino acid của giống SL và trình tự
có mã số D38130 43
Bảng 3.3: Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen Cys2 49







viii
DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1: Mọt ngô Sitophilus zeamais 10
Hình 2.1: Ảnh của giống ngô SL 23
Hình 2.2: Sơ đồ minh họa phản ứng LR giữa pENTR- Cys2 33
Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hóa gen Cys2 38
Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen Cys2 39
Hình 3.3: Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2 40
Hình 3.4: Cystatin 2 của
giống ngô SL và D38130 41
Hình 3.5: Hình ảnh t Cys2
38130 42
Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR t p p
plasmid pENTR-Cys2 44
Hình 3.7: Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-Cys2 45
Hình 3.8: A.tumefaciens 46
Hình 3.9: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR t h
trong chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58 47
Hình 3.10: 48
Hình 3.11: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá; 49
Hình 3.12: Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 từ thuốc lá 50





1
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cây ngô là một trong những cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế
nông nghiệp thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Trên thế giới, ngô đƣợc xếp thứ 3 về

diện tích, thứ 2 về sản lƣợng và thứ nhất về năng suất. Trong hạt ngô chứa khá
đầy đủ các chất dinh dƣỡng cho ngƣời và gia súc. Ngô là cây lƣơng thực nuôi
sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới, tất cả các nƣớc trồng ngô nói chung đều
sử dụng ngô làm nguồn dinh dƣỡng với các mức độ và cách chế biến khác nhau.
Toàn thế giới sử dụng 21% sản lƣợng ngô làm lƣơng thực cho con ngƣời, đặc
biệt các nƣớc ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng 85% sản lƣợng ngô làm
lƣơng thực. Ở Việt Nam, ngô là loại cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa.
Ngô đƣợc trồng khắp nơi, từ đồng bằng đến trung du và khá nhiều ở miền
núi. Có nhiều loại ngô, thƣờng đƣợc xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất
và công dụng nhƣ ngô , ngô đƣờng và ngô rau.
Ở nƣớc ta hiện nay, ngô là một trong những cây trồng đang đƣợc coi
trọng để phát triển cả diện tích cũng nhƣ năng suất và chất lƣợng. Tuy nhiên,
do điều kiện khí hậu, thời tiết nƣớc ta rất phức tạp, vấn đề bảo quản ngô sau
thu hoạch chƣa đƣợc chú trọng, tạo điều kiện cho loài mọt hại ngô có cơ hội
phát triển dẫn đến chất lƣợng của hạt ngô giảm. Vấn đề đặt ra là cần tạo
giống ngô mới có khả năng kháng mọt cao, chất lƣợng . Có nhiều công
trình nghiên cứu đến khả năng kháng mọt của ngô, là kết quả nghiên cứu
thành phần sâu mọt hại ngô bảo quản, đặc điểm sinh thái học của loài mọt
ngô, đánh giá giống ngô nhiệt đới kháng mọt Sitophilus zeamais [40], đánh
giá giống ngô kháng mọt [42], nghiên cứu đánh giá cải thiện giống ngô lai với
mức độ kháng khác nhau với mọt ngô [46], đánh giá biểu hiện của một gen
cystatin lúa mạch trong ngô tăng cƣờng sức đề kháng [23]. Các nghiên cứu
đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt của cây ngô do nhiều gen quyết định,
trong đó có gen Cystatin. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo

2
giống ngô theo hƣớng nâng cao khả năng kháng mọt, chúng tôi đã tiến hành
đề tài nghiên cứu “Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin
liên quan đến khả năng kháng mọt ở ngô”.
2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chính gen cystatin liên quan
đến khả năng kháng mọt giống ngô địa phƣơng Sơn La.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin ở .
- Thiết kế vector mang cấu trúc gen cystatin.
- vector chuyển gen gen cystatin vào cây thuốc lá
sự có mặt của gen cystatin bằng
phản ứng PCR.












3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGÔ (ZEA MAY L.)
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., do nhà thực vật học Thụy Điển
Linnaeus đặt tên theo hệ thống tên kép Hy Lạp- La Tinh: Zea- từ Hy Lạp để chỉ
cây ngũ cốc và mays là từ ―Maya‖- tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất
xứ của cây ngô [12], là một loại cây lƣơng thực thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo
(Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales). Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khảo cổ
học, tế bào học, di truyền học…cho thấy cây ngô có nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngô

lan truyền sang Châu Âu và phần còn lại của thế giới sau khi có sự tiếp xúc của
ngƣời Châu Âu với Châu Mỹ. Ở Việt Nam ngô đƣợc trồng vào thế kỷ thứ XVII.
Ngô có rễ tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Tuy nhiên, ngô có bộ rễ
phát triển rất mạnh, nên có khả năng hút nƣớc rất khỏe, hơn nhiều loài cây trồng
khác. rễ của cây ngô hoàn chỉnh chia thành 3 nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân
kiềng. Rễ mầm mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nƣớc,
. Rễ đốt mọc vòng quanh các đốt thấp của thân. Rễ chân kiềng mọc
quanh các đốt thấp sát mặt đất. Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất,
chúng cũng tham gia hút nƣớc và . Số lƣợng rễ, số lông rễ và độ dài
rễ khác nhau ở mỗi giống.
Thân ngô đặc, đƣờng kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô trƣởng
thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Thân ngô
ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận chuyển chất hữu
cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận
của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lìa. Theo hình thái và vị trí trên thân, lá ngô
đƣợc chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của lá phụ
thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá ngô thƣờng
biến động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều khí khổng. Trung

4
bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm
2
lá có từ 500 - 900 khí
khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn
hán. Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao
đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng…
Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực (bông
cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau. Hoa
đực nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách

nhiều nhƣng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Số bắp
trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi,
nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn. Lớp alơrôn
nằm dƣới vỏ hạt. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa 70 - 78% khối lƣợng hạt
với giá trị dinh dƣỡng khá cao so với các loại hạt ngũ cốc khác. Phôi ngô
: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dƣới lá
mầm, rễ mầm và chồi mầm.
Quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây ngô đƣợc chia thành hai giai
đoạn: giai đoạn sinh dƣỡng và giai đoạn sinh thực. Giai đoạn sinh dƣỡng đƣợc
tính từ khi gieo đến trỗ cờ. Giai đoạn sinh thực đƣợc tính từ trỗ cờ đến chín hoàn
toàn. Căn cứ vào đặc điểm quá trình sinh trƣởng phát triển có thể chia ra các giai
đoạn sinh trƣởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt nảy mầm và mọc;
giai đoạn từ mọc đến 3 lá; giai đoạn từ 3 lá đến 7 lá; giai đoạn từ 7 lá đến trổ cờ;
giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn từ thụ phấn đến chín [9].
Đặc điểm hóa sinh hạt ngô
Thành phần hydratcacbon ở ngô chủ yếu là tinh bột (60 - 70%), lipid chủ
yếu là acid béo, protein, hàm lƣợng đƣờng khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng 1 -
2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối lƣợng của phôi [9].
Tỷ lệ protein trong hạt ngô 8 - 12%. Protein chính của ngô là zein,
một loại prolamin, gần nhƣ không có lysine và tryptophan. Protein của ngô đƣợc
chia thành 3 loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo và protein dự

5
trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lƣợng protein cũng nhƣ
các thành phần amino acid bị thay đổi bởi những tác động của các yếu tố di
truyền (giống) và môi trƣờng, kỹ thuật canh tác.
Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có
nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ). Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu
tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP. Riêng ngô vàng chứa nhiều

carotene (tiền vitamin A) [8].
Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung
trong mầm ngô. Trong chất béo của ngô có 50
panmitic và 3% là stearic. Hàm lƣợng lipid là một chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [7].
Đặc điểm di truyền học của cây ngô
Chi Zea có một loài duy nhất zeamays nhƣng có rất nhiều giống, hàng
ngàn giống đƣợc phân chia thành nhiều loài phụ khác nhau dựa vào đặc điểm
cấu trúc hạt. Ngô gồm có chín loài phụ nhƣ sau: Ngô răng ngựa ( Zea mays
var.indentata Sturt.), ngô đá (Zea mays var.indurata Sturt.), ngô nổ (Zea mays
var.everta Sturt.), ngô bột (Zea mays var.amylacea Sturt.), ngô đƣờng (Zea
mays var.saccharata Sturt.), ngô bọc (Zea mays var.tunicata Sturt.), ngô nếp
(Zea mays var.ceratina Kulesh.), ngô đƣờng bột (Zea mays var.amylacea
saccharata Sturt.), ngô bán răng ngựa (Zea mays var.semiindentata Kulesh.).
Ngô có 10 nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc
thể là 1.500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có cái mà ngƣời ta gọi là "bƣớu
nhiễm sắc thể": các vùng tạp sắc lặp đi lặp lại cao với vết màu sẫm. Mỗi bƣớu
riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô. Barbara
McClintock đã sử dụng các bƣớu này để chứng minh thuyết transposon của bà
về các "gen thay đổi đột ngột", và với công trình này bà đã đoạt giải Nobel năm
1983 trong lĩnh vực sinh lý học và y học. Ngô vẫn còn là sinh vật mẫu quan
trọng cho di truyền học và sinh học phát triển ngày nay [61].

6
Tại Hoa Kỳ có một kho trung tâm các đột biến ở ngô, The Maize Genetics
Cooperation — Stock Center, do Cục Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông
nghiệp Hoa Kỳ (USDA) thành lập và nằm tại Khoa các khoa học cây trồng
của Đại học Illinois tại Urbana-Champaign. Tổng cộng bộ sƣu tập có gần 80.000
mẫu. Bộ sƣu tập này bao gồm vài trăm gen đã đặt tên, cộng với các tổ hợp gen
bổ sung và các biến thể có thể di truyền khác. Ở đây có khoảng 1000 sai lệch

nhiễm sắc thể (chẳng hạn các hoán vị hay nghịch đảo) và các nguồn với số
nhiễm sắc thể bất thƣờng (nhƣ các dạng tứ bội). Dữ liệu di truyền miêu tả các
nguồn đột biến ở ngô cũng nhƣ vô số các dữ liệu khác về di truyền học của ngô
có thể truy cập tại MaizeGDB (Maize Genetics and Genomics Database: Cơ sở
dữ liệu di truyền học và bộ gen ngô).
Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa
Kỳ và Bộ Năng lƣợng Hoa Kỳ (DOE) đã thành lập một côngxoocxiom để xác
định trình tự chuỗi bộ gencủa ngô. Dữ liệu về chuối AND trong kết quả đã đƣợc
đƣa ngay vào Ngân hàng gen, kho chứa công cộng của các dữ liệu chuỗi gen.
Việc thiết lập trình tự chuỗi cho bộ gen ngô là khá khó khăn do kích thƣớc lớn
và các sắp xếp phức tạp. Bộ gen ngô có 50000–60000 gen nằm rải rác trong 2,5
tỷ bazơ – các phân tử tạo ra ADN – mỗi gen lại có 10 nhiễm sắc thể. (Để so
sánh, bộ gen ngƣời chứa khoảng 2,9 tỷ bazơ và 26.000 gen.) [61].
Giá trị kinh tế của cây ngô
Ngô là loại cây lƣơng thực chính đƣợc trồng rộng rãi trên toàn thế giới.
70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp cho gia súc là ngô; ngô còn là
thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho đại gia súc đặc biệt là bò sữa. Gần đây cây
ngô còn là cây thực phẩm; ngƣời ta dùng bắp ngô bao t làm rau cao cấp vì nó
sạch và có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao; ngô nếp, ngô đƣờng (ngô ngọt) đƣợc dùng
làm quả ăn tƣơi (luộc, nƣớng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Ngoài
việc cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời và vật nuôi, nhiều nƣớc đang tiến hành
sử dụng ngô để chế biến ethanol- năng lƣợng sạch cho tƣơng lai [8], [12].
Chính vì tầm quan trọng của nó trong nền kinh tế nhƣ vậy, cho nên cây
ngô đã đƣợc toàn thế giới gieo trồng và hình thành 4 vùng sinh thái cây ngô

7
chính là: vùng ôn đới, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới cao và vùng nhiệt đới
thấp. Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp; cây ngô đã đƣợc đƣa
vào sản xuất cách đây 300 năm.
Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là

cây màu quan trọng nhất đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Cây ngô
không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói
giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [1].
Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam
* Tình hình trên thế giới
Năm 1961, diện tích ngô toàn thế giới đạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4
tạ/ha, sản lƣợng 205 triệu tấn, đến năm 2009, diện tích trồng ngô thế giới đạt
khoảng 159,5 triệu ha, năng suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lƣợng 817,1 triệu tấn.
Sản lƣợng ngô thế giới năm 2013 đạt khoảng 963 triệu tấn, tăng 10% so với năm
2012. Trong đó Hoa Kỳ, Trung Quốc, Brazil là những nƣớc đứng đầu về diện
tích và sản lƣợng (Hoa kỳ đạt khoảng 340 triệu tấn, Trung Quốc đạt khoảng 214
triệu tấn, Brazil đạt 77,8 triệu tấn) đƣợc thể hiện ở trong ng 1.1 [54], [60].
Bảng 1.1. Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Năng suất
(tạ/ha)
1961
105,56
205,03
19,42
1962
103,50
204,88
19,80
2005
148,16

713,68
48,17
2006
146,96
706,84
48,10
2007
158,53
789,88
49,82
2008
162,87
830,34
50,98
2009
158,85
820,00
51,62
2010
164,31
851,17
51,80
2011
172,05
888,01
51,61
2012
177,38
872,07
49,16

(Nguồn: FAOSTAT 2012)

8
Trên thế giới, Mỹ là nƣớc có diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô lớn nhất
thế giới. Kết quả trên có đƣợc, trƣớc hết là nhờ sự đầu tƣ cho nghành nông
nghiệp, không ngừng cải thiện các kỹ thuật canh tác, đồng thời ứng dụng công
nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống đã góp phần đƣa năng suất và sản lƣợng
ngô của nƣớc này cao hơn các nƣớc khác. Các giống cây trồng chuyển gen đƣợc
tạo ra nhờ công nghệ sinh học đã đƣợc trồng phổ biến, đem lại lợi nhuận nông
nghiệp cao, trong đó nƣớc Mỹ tập trung vào các cây mũi nhọn là bông, đậu
tƣơng và ngô.
Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai nƣớc có diện tích trồng ngô lớn nhất
và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác. Mỹ và Trung Quốc, cùng với Ấn
Độ là những nƣớc xuất khẩu ngô lớn, các nƣớc nhập khẩu ngô chính là Nhật
Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[8].
* Tình hình tại Việt Nam
Trƣớc đây sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, phân tán, mặt khác do kĩ
thuật canh tác kém và chất lƣợng giống kém dẫn đến năng suất rất thấp. Từ đầu
những năm 1990 đến nay, khi tiến hành mở rộng diện tích trồng kết hợp với các
giống ngô lai cùng với việc cải thiện các kĩ thuật canh tác nhằm đáp ứng yêu cầu
của giống mới đã tạo ra những bƣớc tiến nhảy vọt trong ngành sản xuất ngô.
Tình hình sản xuất ngô đƣợc thể hiện ở bảng 1.1 dƣới đây.
Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô của Việt Nam từ 2007 - 2013
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Năng suất (tạ/ha)
Sản lƣợng
(1000 tấn)
2007

1,096
39,3
4303,20
2008
1,140
40,11
4573,10
2009
1,089
40,1
4371,70
2010
1,126
41,08
4625,7
2011
1,121
43,13
4835,6
2012
1,156
43,02
4973,6
2013
1,172
44,31
5193,5
(Nguồn Tổng cục Thống kê, 2014)

9

Từ năm 2007 tới nay, năng suất và sản lƣợng ngô của Việt Nam đã có
những bƣớc nhảy vọt. Tốc độ tăng trƣởng diện tích, năng suất và sản lƣợng ngô
của Việt Nam cao hơn nhiều lần, lợi nhuận trồng ngô lai cao hơn hẳn so với các
loại cây trồng khác. Năm 2007, diện tích trồng ngô của cả nƣớc (trong đó diện
tích trồng ngô lai chiếm ƣu thế) đạt trên 1 triệu ha, tổng sản lƣợng gần 4 triệu
tấn. Năm 2008, diện tích trồng ngô tăng lên 1,4 triệu ha, tổng sản lƣợng lên tới
hơn 4,5 triệu tấn. Năm 2013 là năm tạo dấu ấn ấn tƣợng của ngô Việt Nam, đạt
mức sản lƣợng cao nhất từ trƣớc đến nay với 5,19 triệu tấn và năng suất 44,31
tạ/ha [55]. Có đƣợc thành tựu này là do việc tạo ra các giống ngô lai mới, đồng
thời mở rộng diện tích trồng ngô lai trong sản xuất, kết hợp các biện pháp kĩ
thuật canh tác hiện đại.
Những vùng trồng ngô lớn ở Việt Nam là khu vực Đông Nam Bộ, Tây
Nguyên, trung du miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và duyên hải miền
Trung [1]. Trong đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô
địa phƣơng. Năng suất của các giống ngô địa phƣơng thƣờng thấp, tuy nhiên các
giống ngô địa phƣơng vẫn tiếp tục đƣợc quan tâm nghiên cứu vì các ƣu điểm
nhƣ khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại
đất khác nhau.
1.2. MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais
Mọt ngô có tên khoa học là Sitophyllus zeamais Motsch, thuộc bộ
Coleoptera, họ Curculionidae. Mọt ngô là loại đa thực, chúng có thể ăn đƣợc
hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật
khác. Thức ăn thích hợp nhất với nó là ngô hạt. Mọt này có phổ biến ở hầu hết
khắp các nƣớc trên thế giới, nhất là ở châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) và
Bắc Mỹ. Ở nƣớc ta trong các kho lƣơng thực, nhất là kho bảo quản ngô, gạo
thƣờng gặp loài mọt này. Mọt có thể đẻ trứng ở ngoài đồng và cả trong kho. Nó
thuộc loại phá hoại nghiêm trọng [38], [53].

10

Hình 1.1: Mọt ngô Sitophilus zeamais
Mọt gây hại trên bắp và hạt ngô ngay giai đoạn ngô chín sáp ngoài đồng,
chúng theo ngô vào kho và gây hại liên tục trong suốt quá trình bảo quản. Trong
kho mọt hoạt động nhanh nhẹn, hay bay bò và có tính giả chết, chúng thích bò
lên các vị trí cao trong đống hạt. Khi gặp điều kiện độ nhiệt cao, mọt thƣờng tập
trung vào kẽ kho, mép bao… để ẩn nấp.
Đặc điểm hình thái của mọt ngô
Giai đoạn trƣởng thành mọt ngô rất giống mọt gạo, vì thế trong phân loại
trƣớc đây, có nhiều ý kiến khác nhau. Có ngƣời cho rằng mọt ngô và mọt gạo là
cùng loài nhƣng khác tên, nhiều ngƣời khác cho rằng mọt ngô và mọt gạo là 2
loài độc lập với nhau [35]. Cho đến nay, mọt ngô đƣợc xem nhƣ một loài riêng
biệt, rất gần với mọt gạo. Về hình dạng ngoài, mọt ngô rất giống mọt gạo,
nhƣng kích thƣớc cơ thể lớn hơn (3,5- 5mm). Cánh trƣớc trơn bóng và các
điểm màu đỏ tròn cánh khá rõ. Các lỗ chấm trên tấm lƣng ngực trƣớc thô và
dày ở phía trƣớc. Do đó việc phân biệt chủ yếu dựa vào dạng cơ quan sinh dục
đực (penis) ở mọt gạo có hình bán nguyệt, còn ở mọt ngô là hình 3 góc. Bề mặt
phía trên của penis ở mọt gạo đơn giản, không có lông dài, còn ở mọt ngô thì có
2 lông dài. Đầu máng đẻ trứng của con cái mọt gạo có hình chữ Y, còn của mọt
ngô là hình móc nhọn.

11
Các lỗ chấm ở ngực trƣớc khá trơn và không có vùng lỗ chấm lộn xộn ở
giữa. Chấm lõm trên đầu rất rõ ràng. Đoạn trƣớc trán rất bằng dẹt, phần gốc vòi
có 3 chiếc máng, dọc theo viền mép ngực trƣớc còn có một dảy chấm lõm. Chấm
lõm trên mảnh lƣng ngực trƣớc hình tròn, ở khu giữa chấm lõm rất dày, chấm lõm
ở 2 cạnh gần nhƣ hỗn hợp lại. Cánh cứng có 2 vệt chấm màu trắng đỏ, một ở bên
vai, một ở gần đoạn cuối. Chấm lõm ở mặt bụng thân mình dày hơn. Cánh sau
phát triển và có thể bay đƣợc. Cánh màu nâu đen bóng. Các điểm vá màu vàng đỏ
hình bán nguyệt rất rõ. Trên mặt ngoài của gai giao cấu (Aedeagus) con đực có

các rãnh chạy dọc; các con cái đầu nhánh rẽ hình chữ Y hóa cứng mạnh nên nhọn.
Giai đoạn trứng có đặc điểm: dài 0,5-0,7mm, rộng 0,25- 0,3mm, hình bầu
dục hơi dài màu trắng sữa. Giai đoạn sâu non: Khi đã lớn dài 3-3,2 mm, rất mập,
lƣng cong lại nhƣ hình bán nguyệt, mặt bụng tƣơng đối bằng. Toàn thân màu
sữa đến màu nâu nhạt. Giai đoạn nhộng: dài 3-4 mm, hình bầu dục, cân đối 2
đầu, lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu.
Cũng nhƣ mọt gạo, mọt ngô có thể bay đƣợc, nó còn bay mạnh hơn mọt
gạo cho nên mọt ngô đã gây hại ngay từ ngoài đồng. Trên các ruộng ngô ở
Tây Nguyên, mọt ngô thƣờng xuất hiện và phát triển vào thời kỳ chuẩn bị thu
hoạch [6], [27].
Đặc điểm về chu kì sống
Khả năng sinh trƣởng và phát triển của mọt ngô trong ngô hạt là lớn nhất,
sau đó mới đến thóc và các ngũ cốc khác. Kết quả nghiên cứu ở Nhật Bản xác
nhận mọt ngô chịu lạnh tốt hơn mọt gạo [27].
Toàn bộ thời gian phát triển cho vòng đời của S. zeamais trung bình 36
ngày. Thời gian phát triển này là gần giống nhƣ S. oryzae và nhanh hơn so với S.
granarius khoảng 7 ngày trong điều kiện tƣơng tự. Hầu hết trứng đƣợc lắng
đọng trong nội nhũ. Tốc độ sinh sản tối đa 6,7/
, thời gian phát triển và số lƣợng các thế hệ con cháu sản xuất là tối
ƣu ở 30ºC và 75% [53], [59].

12
Khi đẻ trứng, mọt dùng i đẻ trứng vào
những lỗ này, sau đó tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại. Sâu non nở ra
ăn hại ngay trong hạt và lớn lên. Khi ăn hạt, nó thƣờng ăn phôi trƣớc, sau đó
mới đến nội nhũ và các bộ phận khác làm hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng, nhìn
bề ngoài dễ lẫn với hạt còn nguyên vẹn. Khi đẫy sức, sâu non đục những lỗ nhỏ
lộ rõ trên mặt hạt để vũ hoá bay ra ngoài. Tùy theo điều kiện mà mọt đẻ ít hay
nhiều, nhiều nhất mỗi con cái có thể đẻ đƣợc 384 trứng [52].
Thức ăn có ảnh hƣởng rất lớn đến đời sống của mọt, trong cùng một điều

kiện độ nhiệt và độ ẩm nhƣ nhau, nuôi mọt ngô bằng thức ăn khác nhau đã thu
đƣợc kết quả nhƣ sau: Khi nuôi bằng ngô hạt, thời gian vòng đời của mọt là 34
ngày; khi thay bằng loại thức ăn khác là gạo, thời gian vòng đời sẽ là 47 ngày;
thóc là 53 ngày.
Ở nhiệt độ 0ºC, mọt có thể sống đƣợc 37 ngày, ở -5ºC mọt chết sau 23 ngày, còn
ở -10ºC tất cả các giai đoạn phát triển của mọt chết sau 13 ngày. Ở 55ºC, mọt
chết sau 6 giờ, ở 60ºC chết sau 2 giờ. Trong điều kiện độ nhiệt 25ºC mọt có thể
sống không có thức ăn 18 - 26 ngày [33], [52].
1.3. PROTEINASE VÀ CYSTATIN
1.3.1. Proteinase và các loại proteinase
Quá trình phân giải protein có sự tham gia của các loại enzyme thủy phân
protein, trong đó có proteinase. Proteinase là một nhóm các enzyme phá vỡ các
phân tử chuỗi dài của các protein thành các đoạn ngắn hơn (peptide) và cuối
cùng là thành phần các amino acid. Proteinase có liên quan đến quá trình tiêu
hóa, hoạt hóa tiền enzyme, giải phóng các peptide hoạt động sinh lí, hoạt hóa bổ
sung và các quá trình viêm.
Ngƣời ta phân loại proteinase làm bốn nhóm dựa vào gốc amino acid thiết
yếu ở vị trí trung tâm hoạt động, sự thay đổi hoạt động ở pH tối ƣu, sự tƣơng
đồng của trình tự amino acid và sự tƣơng đồng về các chất ức chế. Bốn nhóm

13
proteinae bao gồm: serin-, cysteine-, aspartic- và metallo-proteinase. Trong bốn
nhóm này, một lƣợng lớn chất ức chế của serine- và cysteine- proteinase đã
đƣợc nghiên cứu nhiều [43].
Trong động vật có xƣơng sống, các proteinases cysteine đƣợc tham gia
vào hệ thống phân hủy protein lysosome .Trong động vật không có xƣơng sống
nhƣ giun tròn, proteinases cysteine là một trong các enzym tiêu hóa [41].
Trong động vật chân đốt nhƣ tôm hùm, đóng vai trò tiêu hóa, nhƣng cũng có
liên quan trong hệ thống thần kinh [21]. Trong côn trùng, chúng đƣợc sử dụng
trong quá trình tiêu hóa nhƣng đƣợc tìm thấy trong nhiều mô khác [41]. Các

nghiên cứu về sự phụ thuộc độ pH của hoạt động proteinase cysteine trong
chiết xuất dầu thô của ấu trùng côn trùng đã chỉ ra rằng, chúng hoạt động chủ
yếu trong phạm vi pH kiềm [22], đó là độ pH cho các hoạt động của
proteinases cysteine [19], [43].
Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận cùng
trong chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động. Vùng amino tận (hay
còn gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của
enzyme mà còn giúp các protein mới đƣợc tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo
vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh. Về phƣơng diện proregion,
các enzyme giống Cathepsin L và giống Cathepsin B là các phân họ của papain.
Chúng hình thành nên 2 nhóm enzyme khác biệt: vùng proregion của Cathepsin
L (với xấp xỉ 60 gốc amino acid) ngắn hơn proregion của Cathepsin B (với xấp
xỉ 100 gốc amino acid). Vị trí hoạt động của Cathepsin B khác so với các
Cathepsin khác ở chỗ nó có vùng móc, vùng này có chức năng nhất định trong
hoạt tính exopeptidase của protein này. Ngƣời ta đã quan sát đƣợc hai vùng khác
biệt trong cấu trúc không gian ba chiều của các thành viên thuộc họ papain.
Vùng amino tận cùng có cấu trúc xoắn anpha trong khi vùng cacboxyl tận có
chứa chủ yếu cấu trúc gấp nếp beta. Vị trí hoạt động có chứa gốc Cys 25 và His
159, chúng đƣợc bổ sung nhờ Asn 175 liên kết với His 159 và Gln 19. Các nhà

14
khoa học cũng đã tìm ra các hoạt tính khác biệt của các enzyme họ papain bao
gồm endopeptidase, aminopeptidase, carboxylpeptidase. Cũng có sự khác biệt
trong hoạt động phân giải protein của các Cathepsin ở các pI và pH tối ƣu khác
nhau nhƣ: Cathepsin B (pI= 4,5-5,5, pH=6), Cathepsin H (pI= 6,0-7,1, pH=6,8),
Cathepsin L (pI= 5,5-6,1, pH=5,5) [19], [43].
1.3.2. Proteinase inhibitor
Các chất ức chế proteinase (PI) thực vật nói chung là protein nhỏ mà chủ yếu
đ trữ, chẳng hạn nhƣ các loại củ và hạt, nhƣng
cũng đã đƣợc tìm thấy trong các bộ phận trên không của cây, thƣờng gây ra

để đáp ứng với chấn thƣơng hoặc tấn công của côn trùng hoặc các mầm bệnh.
Các hoạt động của proteinases cysteine đƣợc kiểm soát bởi protein ức chế
tự nhiên nhƣ α
2
-macroglobulin và cystatins. Cystatin là một thuật ngữ đề cập
đến các loại protein có khả năng ức chế đặc hiệu hoạt động của papain và các
enzyme phân hủy cysteine nhƣ Cathepsin B, H, và L, ficin và Bromelain. Sự tồn
tại của chúng trong cơ thể vi sinh vật, động vật, và các loài thực vật rất phổ biến
[10]. Các nghiên cứu gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa cystatin với
hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây
bệnh. Protein này có mối quan hệ về mặt cấu trúc và chức năng với chất ức chế
của cysteine proteinase, nó đƣợc mô tả lần đầu tiên ở lòng trắng trứng gà và sau
đó đƣợc gọi là cystatin lòng trắng trứng gà [19].
Các cystatin kìm hãm hoạt động của cysteine protenase có liên hệ với
nhau về mặt tiến hóa, hình thành nên siêu họ cystatin. Các thành viên của siêu
họ này đƣợc phân chia thành ba nhóm có mối liên hệ chặt chẽ với nhau, sự phân
loại đó dựa trên sự tƣơng đồng của trình tự bậc một, khối lƣợng phân tử, số
lƣợng liên kết disulfide và sự định vị của chúng trong tế bào.
Cystatin họ 1, đƣợc biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc các
nhóm carbohydrate, nó có trọng lƣợng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100 gốc
amino acid.

15
Cystatin họ 2, là protein có 2 liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu
carbon cuối cùng và đƣợc glycosyl hóa, có trọng lƣợng phân tử khoảng 13-24
kDa với 115 amino acid.
Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tƣơng,
nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết các phức hợp phân tử
cystatin có trọng lƣợng phân tử cao (60-120 kDa) với khoảng 355 gốc amino
acid có chứa các liên kết disulfide. Các kininogen giữ vai trò quan trọng trong

quá trình đông máu.
Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật
và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [33], gồm hầu hết các
chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu
hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là
chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Nó có mối liên hệ về
mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà. Oryzacystatin cũng
đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt của liên kết disulfide, chuỗi
pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly (gốc thứ 57 - 61) và
khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino acid. Trình tự amino
acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó có vùng trình tự Phe-
Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ
oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II.
Gen cystatin đƣợc phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là
OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102 amino
acid [18]. Ở cây đậu xanh, gen cystatin đƣợc Kang và cs phân lập, đọc trình tự
từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích
thƣớc 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88 amino acid
[56]. Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tƣơng khá lớn, có
kích thƣớc 5863bp trên đó có 4 exon và 3 intron đƣợc Misaka phân lập năm
2000 [54]. Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập đƣợc đoạn gen cystatin