Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể bưởi thanh trà (citrus grandis (l ) osbeck) ở thành phố huế

MỞ ĐẦU
Từ lâu, bưởi Thanh trà là một trong số các trái cây đặc sản có giá trị của Thừa
Thiên Huế, nổi tiếng với hương vị thơm ngon đặc biệt của chúng. Tuy nhiên, ngay tại
đây, bưởi Thanh trà được trồng ở các vùng khác nhau cũng có chất lượng khác nhau.
Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu trên đối tượng Thanh trà nhưng chủ yếu
tập trung điều tra về phân bố [1], [2]; đánh giá thực trạng sản xuất [7]; các quá trình
dinh dưỡng khoáng cũng như sử dụng phân bón cho Thanh trà [19], [29], [30];
nghiên cứu các tác nhân gây bệnh [14], [21]; nghiên cứu nhân giống [5] chứ chưa
có những nghiên cứu về mối quan hệ cũng như sự đa dạng về mặt di truyền của quần
thể bưởi Thanh trà.
Bưởi Thanh trà ở Thừa Thiên Huế nói chung và Huế nói riêng là loại trái cây
đặc sản được người tiêu dùng nhiều nơi trong nước ưa chuộng, nhưng hiện nay sản
lượng Thanh trà vẫn còn thấp. Do trồng trọt lâu đời, do các đột biến tự nhiên và các
quá trình lai tạo diễn ra trong một thời gian dài nên độ đồng nhất của giống cũng
giảm đi, có nhiều dạng kiểu hình mới xuất hiện. Nghiên cứu về sự đa dạng di truyền
của quần thể bưởi Thanh trà ở đây là cơ sở để chọn lọc và bảo quản các giống gốc,
tạo tiền đề cho việc nhân giống với số lượng lớn sau này.
Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rất
rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng
giữa các loài với nhau.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu
tính đa dạng di truyền của quần thể bưởi Thanh trà (Citrus grandis (L.)
Osbeck) ở thành phố Huế" làm cơ sở cho việc chọn giống Thanh trà sau này.
1
Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây bưởi và cây bưởi Thanh trà
1.1.1. Cây bưởi
Những ghi nhận lịch sử và phân tích di truyền có thể kết luận chỉ có 3 loài
thực sự trong chi Citrus (thanh yên, quýt và bưởi) và nhiều dạng sinh học dưới loài.
Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm mặc dù được thừa nhận rộng rãi nhưng chúng

rất giống nhau về mặt di truyền, được tạo ra do chọn lọc, nhân giống bằng chiết
ghép hay bằng hạt. Sự khác nhau giữa các dạng này có nguồn gốc từ các đột biến
soma. Hơn nữa, nhiều thế hệ cây lai được tạo ra và được con người chọn lọc từ các
dạng ăn được hay theo các tiêu chí công nghiệp tạo nên sự đa dạng trong chi Citrus
như hiện nay [56].
Bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck), còn có các tên khác là C. maxima (J.
Burm.) Merr. hay C. decumna L., được biết đến như là cây truyền thống của chi
Citrus (Scora, 1975). Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), dưới họ Aurantioidae,
tộc Citreaea, dưới tộc Citrinae. Chi này có thể được chia thành hai dưới chi là
Citrus và Papeda dựa vào đặc điểm lá, hoa, quả [46].
Hệ thống phân loại của chi Citrus được dùng phổ biến nhất là của Swingle
và Tanaka. Swingle (1967) cho rằng chi Citrus có 16 loài, trong khi đó Tanaka
(1977) lại cho rằng có đến 162 loài thuộc chi Citrus. Tuy nhiên Scora (1975) lại cho
rằng chỉ có 3 loài là thanh yên (C. medica), quýt (C. reticulata), và bưởi (C.
grandis; hoặc C. maxima) và Papeda là một nhóm của chi Citrus [46].
Bưởi thuộc cây thân gỗ, cao khoảng 10 m. Lá có phiến to, dày, gân phụ 5-6
cặp, cuống có cánh rộng. Hoa có chùm ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 3,5
cm, tiểu nhụy nhiều, dính nhau. Trái to, gần như tròn. Bộ nhiễm sắc thể 2n=18 [13].
Bưởi là một loài cây ăn quả sống lâu năm, lá thường xanh, thân cây cao, tán
cây có dạng hình tròn tự nhiên, hình dẹt hoặc nón. Cành thường to hơn cam, quýt,
cành lá phát triển mạnh. Các bộ phận lá, cành, quả khi còn non thường phủ một lớp
2
lông tơ mỏng. Nhìn chung, cây có múi có bộ rễ ăn cạn, các rễ lông mọc yếu nên khả
năng hấp thụ các chất dinh dưỡng thấp [6], [27].
Bưởi có thể sinh sản hữu tính bằng hạt hay nhân giống bằng giâm, chiết
cành. Thông thường bưởi được nhân giống bằng hạt và thường ít được chú ý chăm
sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày càng đa dạng so với các loài cây kinh tế khác
trong chi Citrus. Bưởi được xem là cây trồng có khả năng thích nghi rộng với khí
hậu mặc dù điều kiện sống tự nhiên của chúng là ở vùng nhiệt đới ẩm [58].
Các nhà phân loại thực vật nhận thấy hiện nay bưởi hoang dại không còn tồn

tại phổ biến nữa. Nếu có một số loài mọc hoang gần gũi với chi Citrus thì chúng
cũng không có quan hệ trực tiếp về mặt di truyền với những loài đang được trồng.
Bưởi được trồng trên khắp thế giới, ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, những
nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, cây có thể sống sót và có đủ nước để sinh
trưởng, phát triển (Gmitter và cs, 1992). Chất lượng quả bưởi tốt nhất là ở các vùng
cận nhiệt đới. Các vùng trồng Citrus phổ biến nhất là châu Mỹ (Brazil, Mỹ,
Argentina và Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc Phi),
châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản) và Nam Phi. Theo FAO, sản lượng bưởi
và bưởi chùm trên thế giới là 4 triệu tấn, được trồng ở 74 quốc gia với diện tích là
264.000 ha. Mỹ là nước có sản lượng bưởi và bưởi chùm lớn nhất thế giới. Vùng
Đông Nam Á, đặc biệt là Đông Ấn Độ, Bắc Burma và Tây Nam Trung Quốc được
xem là trung tâm phát sinh và đa dạng của chi Citrus và những chi có quan hệ gần
gũi với nó. Tổng sản lượng quả của chi Citrus toàn cầu trong thời gian 2004-2005 là
105,5 triệu tấn [8], [46].
Bưởi là loài cây ăn quả đặc sản của nước ta, được trồng phổ biến từ Bắc đến
Nam, từ đồng bằng, trung du đến miền núi. Ở nước ta từ lâu đã hình thành những
vùng trồng bưởi và những giống bưởi nổi tiếng như bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ),
bưởi đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc Trạch (Hương Khê, Hà
Tĩnh), bưởi Thanh trà (Thừa Thiên Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), bưởi Năm roi,
bưởi Da xanh (Vĩnh Long) [2].
3
Bưởi có nhiều giá trị về mặt y học đồng thời là thực phẩm ăn kiêng tốt cho
nhiều loại bệnh. Bưởi có thể được sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều món ăn
khác nhau như các loại mứt, bánh kẹo, gỏi và nước uống. Về thành phần dinh dưỡng,
trong 100 g phần ăn được của bưởi chứa 90,3 g nước; 0,3 g chất khoáng; 38 kcal; 0,5 g
protein; 0,3 g chất béo; 8,5 g carbohydrate; 37 mg calcium; 0,2 mg sắt; 120 μg
carotene; 0,06 mg vitamin B1; 0,04 mg vitamin B2 và 105 mg vitamin C [36]. Tuy
nhiên, các thành phần dinh dưỡng của bưởi theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ có hơi khác
(Bảng 1.1).
Thành phần chủ yếu của tinh dầu lá bưởi là dipenten, linalola và citrala.

Trong tinh dầu vỏ quả có 26% citrala và ester. Trong vỏ quả bưởi, ngoài tinh dầu
còn chứa pectin naringin (một glucoside), các enzyme peroxydase, amylase, đường
ramnose, vitamin A và C, hesperidin (hesperidin còn gọi là hesperidoside) [17].
Bưởi là trái cây nhiệt đới đa công dụng. Trái bưởi không những ngon, có tác
dụng bổ dưỡng mà lá, hoa, vỏ đều chứa nhiều tinh dầu nên thường được dùng để
xông giải cảm. Vỏ hạt bưởi tươi có tác dụng cầm máu rất tốt, bằng cách lấy hạt vỏ
tươi dịt vào chỗ chảy máu. Hạt bưởi bỏ vỏ ngoài, nướng chín đen, nghiền thành bột
bôi lên chỗ chốc lở có thể lành bệnh rất nhanh [17].
Ngày nay, khoa học còn khám phá thêm những đặc tính trị liệu mới của bưởi.
Trong bưởi chứa nhiều pectin, là chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp hấp thu
cholesterol của thức ăn và muối mật nên làm giảm lượng cholesterol trong máu [17].
Hesperidin và naringin là hai flavonoid chính của cùi bưởi có công dụng giúp
bảo vệ tính đàn hồi của mạch máu, ngừa xơ cứng động mạch, gián tiếp chống cao
huyết áp và tai biến mạch máu não. Lycopene trong bưởi ruột hồng và bưởi ruột đỏ
là một carotenoid đặc biệt có khả năng ức chế hoạt động của các khối u, đặc biệt là
ung thư tuyến tiền liệt. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu thêm về dược
tính quý giá này.
4
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của bưởi
Thành phần Hàm lượng
Nước 89,10 g
Năng lượng 38 kcal
Protein 0,76 g
Lipid tổng số 0,04 g
Tro 0,48 g
Carbohydrate 9,62 g
Chất xơ 1,0 g
Chất khoáng
Calcium 4 mg
Sắt 0,11 mg

Magnesium 6 mg
Phosphorus 17 mg
Potassium 216 mg
Sodium 1 mg
Kẽm 0,08 mg
Đồng 0,048 mg
Mangan 0,017 mg
Vitamin
Vitamin C 61,0 mg
Thiamin 0,034 mg
Riboflavin 0,027 mg
Niacin 0,220 mg
Vitamin B-6 0,036 mg
Vitamin A, IU 8 IU
Cholesterol 0 mg
Thành phần khác
β-Carotene 0 µg
α-Carotene 0 µg
β-Cryptoxanthin 10 µg
Nguồn: United States Department of Agriculture(USDA), 2004
1.1.2. Cây bưởi Thanh trà
Bưởi Thanh trà (Citrus grandis (L.) Osbeck) là loài cây ăn quả đặc sản, có
giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao của Thừa Thiên Huế. Bưởi Thanh trà đã được
trồng ở Huế từ rất lâu. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa khẳng định được cây bưởi
Thanh trà được trồng ở Huế khi nào. Theo thông tin điều tra được từ người dân thì
bưởi Thanh trà được trồng ở đây ít nhất cũng đã gần hai trăm năm. Đây là loại
bưởi thơm ngon, có hương vị và phẩm vị đặc biệt nên được người tiêu dùng rất ưa
5
chuộng, trước đây được trồng để phục vụ riêng cho giới quý tộc trong thời phong
kiến. Ngày nay, đã được trồng khá phổ biến để phục vụ người dân và khách du

lịch [22].
Bưởi Thanh trà thuộc nhóm cây thân gỗ lớn, cao từ 6-8 m, có khi hơn. Lá có
dạng hình trứng ngược, mép lá gợn sóng, đuôi lá chẻ hơi lõm xuống phía ngọn lá.
Hoa bưởi Thanh trà lưỡng tính, có màu trắng và thơm, hoa mọc thành từng chùm
hoặc đơn, có 5 cánh, có khoảng 30 chỉ nhị trên hoa, chỉ nhị màu vàng dính với nhau
từ 3-4 cái, có khi rời (1 cái). Đầu nhụy màu xanh vàng, có chất nhầy bao phủ và có
dạnh hình thang ngược, bầu trên có 8-12 lá noãn hoặc hơn, hoa nở vào tháng 1 và
tháng 2, có khi tháng 6 (trái vụ). Quả dạng hình quả lê, vỏ quả nhẵn, khi chín có
màu vàng sáng, có từ 12-14 múi, tép mọng nước nhưng bóc không dính tay, quả
chín có vị ngọt thanh và chua nhẹ. Hạt đơn phôi có màu trắng, kích thước hạt 1,5×
0,8 cm, nhiều hạt trong một quả, trung bình có 60-85 hạt, có khi đến 100 hạt [22].
Thanh trà là loại cây ăn quả đặc sản của Thừa Thiên Huế và là giống bưởi
ngon so với nhiều giống bưởi khác như: bưởi Năm roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi Đoan
Hùng, Nó có vị ngọt thanh, không đắng. Tuy nhiên, Thanh trà có nhược điểm là
có nhiều hạt, khối lượng quả biến động và độ đồng đều thấp [22].
Thành phần hóa học của bưởi Thanh trà ở Thừa Thiên Huế như sau [18]:
- Nước (%): 88-99
- Tỷ lệ chất khô (%): 12,65-13,23
- Hàm lượng vitamin C (mg/100 g): 40,27-52,70
- Hàm lượng đường tổng số (%): 11,10-11,63
- Hàm lượng chất xơ (%): 0,4
- Hàm lượng acid hữu cơ (%): 0,51-0,60
- Hàm lượng protein (%): 0,67
- Tỷ lệ phần ăn được (%): 55-65
Tổng diện tích trồng Thanh trà ở Thừa Thiên Huế khoảng 622 ha, tập trung chủ
yếu ở các vùng phù sa ven sông, đặc biệt là ven sông Hương như Thủy Biều, Kim
Long, Hương Long (Huế), Hương Hồ, Hương An, Hương Thọ (Hương Trà), Dương
6
Hòa (Hương Thủy), Phú Mậu (Phú Vang) với diện tích 302 ha, chiếm 48,5% tổng
diện tích trồng Thanh trà ở Thừa Thiên Huế. Trên đất phù sa ven sông Bồ như

Hương Vân (Hương Trà), Quảng Thọ, Quảng Phú (Quảng Điền), Phong Sơn, Phong
An (Phong Điền) với diện tích 174 ha, chiếm khoảng 28% tổng diện tích. Ven sông
Ô Lâu như ở Phong Thu, Phong Hòa, thị trấn Phong Điền, Phong Mỹ (Phong Điền)
có diện tích 112 ha, chiếm khoảng 18%. Phần còn lại, Thanh trà được trồng ven
sông Truồi ở Lộc Điền và Lộc Hòa (Phú Lộc) với diện tích khoảng 16,5 ha (2,6%).
Ngoài ra, Thanh trà còn được trồng rải rác ở một số nơi khác như Lộc An, Lộc
Thủy (Phú Lộc) và Hương Hòa (Nam Đông) [2].
Bưởi Thanh trà là loại trái cây cao cấp được người tiêu dùng nhiều nơi trong
nước ưa chuộng, nhưng hiện nay sản lượng vẫn còn thấp. Việc phát triển mở rộng
diện tích trồng bưởi Thanh trà thành vùng sản xuất hàng hóa lớn theo định hướng
của tỉnh còn gặp nhiều khó khăn, tốc độ phát triển hàng năm chậm. Nguyên nhân
của vấn đề này là do các hộ nông dân còn thiếu vốn đầu tư để mở rộng diện tích,
bên cạnh đó do không được đầu tư đúng mức, do ảnh hưởng nặng nề của thiên tai,
dịch hại nên giống bưởi này đã có biểu hiện thoái hóa, năng suất và phẩm chất
giảm sút [7]. Ngoài ra, do trồng trọt lâu đời, do các đột biến tự nhiên và các quá
trình lai tạo diễn ra trong một khoảng thời gian dài nên độ đồng nhất của giống
giảm, có nhiều dạng kiểu hình mới xuất hiện, tạo cho bưởi Thanh trà trồng ở các
vùng khác nhau có những đặc điểm không giống nhau.
1.2. Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền chi Citrus
Trong xu hướng hiện nay, để chọn giống cây trồng hay xác định nguồn gốc
của các loài cây trồng người ta thường sử dụng các chỉ thị phân tử (molecular
marker). Việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết
kiệm thời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái,
không chịu tác động của môi trường. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử là
một công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di truyền của rất nhiều loài.
7
Gần đây, các phân tích phân tử như trình tự các đoạn nucleotide lặp lại ngắn
(microsatellite), các đoạn lặp lại đơn giản (SSR), kết hợp SSR và microsatellite
(ISSR), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP), đa hình các đoạn khuếch

đại ngẫu nhiên (RAPD), đa hình các đoạn khuếch đại với các primer được thiết kế
cho các vùng đặc biệt (SCAR), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… đã được sử
dụng để kiểm tra mối quan hệ họ hàng trong số các nhóm phân loại chi Citrus [56].
1.2.1. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên PCR, bằng cách sử
dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và
nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các
primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản
ứng RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài
các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí
bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa
các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp
nhận diện những chỉ thị phân tử trội. Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu
đa dạng di truyền đã được rất nhiều tác giả quan tâm và thực hiện trên nhiều đối
tượng vi sinh vật, thực vật và động vật [64].
Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rất rộng rãi trên nhiều đối
tượng cây trồng, như dưa leo [15], vải thiều [3], khoai tây [31], dừa [16], lúa cạn [23],
đậu xanh [24]… nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền, chọn lọc các loại cây trồng có
chất lượng tốt, trong đó có các loài thuộc chi Citrus.
Bưởi Năm roi là giống bưởi ngon nổi tiếng của đồng bằng sông Cửu Long và
được trồng nhiều nhất ở huyện Bình Minh, Vĩnh Long. Giống bưởi này được nhân
trồng trong sản xuất chủ yếu bằng phương pháp chiết cành nên đã tạo ra tập đoàn
bưởi có phẩm chất không đồng nhất cũng như có 3 nhóm chính là nhóm hạt to,
nhóm hạt mài và nhóm hoàn toàn không hạt. Võ Công Thành và cs (2005) đã
nghiên cứu tính đa dạng di truyền của bưởi Năm roi bằng cách mỗi nhóm chọn 10
8
cây trong 4 xã khác nhau sau đó phân tích trên 3 loại điện di là protein, enzyme
peroxidase và DNA để đánh giá tính đa dạng di truyền, phục vụ cho công tác chọn
giống sau này. Kết quả phân tích cho thấy cả 3 nhóm bưởi đều rất đa dạng về kiểu
hình (H

o
) và kiểu gen (H
EP
) nhưng sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa
thống kê. Việc nhận dạng bằng 3 loại chỉ thị phân tử dễ dàng đối với nhóm hạt mài,
chưa khác biệt rõ giữa nhóm hạt to và nhóm không hạt [25].
Vũ Thị Nhuận và cs (2005) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của 146 cây
bưởi Năm roi ở xã Mỹ Hòa, Bình Minh, Vĩnh Long bằng phương pháp RAPD. Kết
quả nghiên cứu cho thấy 4 trong 7 primer được chọn để phát hiện các chỉ thị phân
tử cho kết quả tốt ở tất cả các cây trên. Tập đoàn bưởi ở đây được chia làm 6 nhóm,
trong đó có 5 nhóm giống nhau nhiều và 1 nhóm khác hẳn. Khoảng cách di truyền
của tập đoàn này thay đổi từ 0 đến 36%. Trong tổng số 56 chỉ thị RAPD có 8 chỉ thị
hiện diện ở tất cả các cây, 1 chỉ thị có tần số thấp nhất (chỉ có 3 cây) và 3 chỉ thị
hiện diện ở 4 cây. Kết quả nghiên cứu này cho thấy tập đoàn bưởi ở Mỹ Hòa rất đa
dạng về mặt di truyền mặc dù chúng có sự tương đồng cao về mặt hình thái và sinh
trưởng [20].
Để đánh giá nguồn vật liệu di truyền, Nguyen Thanh Nhan và cs (2003) đã
phát triển kỹ thuật RAPD nhằm xác định đặc tính và phát hiện đa hình của các
giống quýt và cam thương mại và truyền thống ở Việt Nam, cũng như đã điều tra
mối quan hệ di truyền ở 37 giống của các loài khác nhau trong chi Citrus. Tác giả
đã sử dụng 150 primer để kiểm tra, trong đó có 15 primer tạo sản phẩm khuếch đại
có độ đa hình cao ở 15 giống quýt và 11 thể lai được chọn lọc. Sử dụng chỉ thị
RAPD trong xác định các loài cam chanh giúp hiểu biết tốt hơn về các biến dị di
truyền, đánh giá biến dị di truyền của chúng so với các loài khác, ứng dụng các
loài cam chanh và các thể lai có liên quan trong nhân giống các cây giống hay
giống gốc [57].
Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã
được Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái và
phân tử. Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, Kiên
9

Giang chia làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh. Sử dụng 4 primer
là A-02, A-04, A-11 và A-13 (Operon Technologies, CA) trong phân tích đa dạng
di truyền bằng kỹ thuật RAPD cho kết quả 49 băng được ghi nhận. Giản đồ phả hệ
cho thấy cây có múi của Gò Quao, Kiên Giang chia thành 4 nhóm: bưởi, cam-quýt,
chanh và hạnh. Kết quả phân tích cho thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm
biến động từ 0-43%. Trong 49 băng có 11 băng xuất hiện ở 100% số cá thể, 26 băng
trên 90%, 4 băng trên 80%, 2 băng trên 70%, 6 băng dưới 70% và có 1 băng là 45%
[11].
Nguyễn Xuân Thụ và cs (2004) đã xây dựng cây phát sinh của một số giống
bưởi trồng ở Việt Nam nhờ vào chỉ thị RAPD. Tác giả đã sử dụng 17 primer
(Operon Technologies, CA) để phân tích 13 giống bưởi trồng của Việt Nam, kết quả
là tất cả các primer đều khuếch đại được DNA của bưởi, trong tổng số 153 băng
được ghi nhận có 124 băng đa hình (81,05%), 29 băng đơn hình (18,95%). Các
băng có kích thước từ 150 bp đến 2450 bp. Tỷ lệ các băng đa hình cao chứng tỏ các
giống bưởi ở Việt Nam có quan hệ di truyền xa nhau. Dựa trên kết quả điện di sản
phẩm PCR-RAPD, tác giả đã tính hệ số đồng dạng di truyền theo công thức của Nei
và Li (1979), theo đó hệ số đồng dạng di truyền giữa các giống bưởi Red Pomelo và
bưởi Thanh trà cao nhất (0,800); hệ số đồng dạng thấp nhất là giữa hai giống bưởi
Phúc Trạch và bưởi Năm roi (0,566). Tính chung thì hệ số đồng dạng di truyền giữa
giống bưởi Phúc Trạch và JoJoRa Flame với các giống khác là thấp nhất. Hệ số
đồng dạng di truyền của hai giống bưởi Red Pomelo và bưởi Thanh trà với các
giống khác là cao nhất. Trên cây phả hệ, bưởi Phúc Trạch nằm tách biệt trên một
nhánh, giống bưởi JoJoRa Flame cũng chiếm vị trí tách biệt trên cây phát sinh, các
giống bưởi thuộc nhóm BC (BC40, BC43, BC39, BC11) và giống bưởi Năm roi tập
hợp trên một nhánh. Các giống bưởi còn lại (Thanh trà, Lá cam, bưởi Diễn, Da xanh
và giống BC15) nằm trên nhánh còn lại của cây phát sinh [28].
Ngày nay, việc sử dụng chỉ thị RAPD để xây dựng bản đồ di truyền, xác định
sự đa dạng di truyền cũng như nguồn gốc của các giống bưởi nói riêng và những
cây thuộc chi Citrus nói chung đã được rất nhiều tác giả trên thế giới quan tâm
10

nghiên cứu (Ellisiario và cs, 1999; Federici và cs, 1998; Hussein và cs, 2004; Hao
và cs, 2004; Yahata và cs, 2005 ) [43], [44], [49], [50], [63].
Bản đồ di truyền dựa trên các chỉ thị RAPD của chi Citrus đã được Cai và cs
thực hiện năm 1994. Sự đa hình của các đoạn DNA khuếch đại được quan sát thấy ở
gần một nữa trong tổng số 140 primer ngẫu nhiên được sử dụng, thể hiện cho 266
locus khác nhau. Việc xác định các nhóm liên kết được thực hiện trên 60 cây của
quần thể BC
1
có nguồn gốc từ lai tự nhiên C. grandis (L.) Osb.×[C. grandis (L.)
Osb.×Poncirus trifoliata (L.) Raf.] (Durham và cs, 1992). Phần lõi của bản đồ liên
kết được xây dựng bao gồm 9 nhóm liên kết chứa 109 chỉ thị RAPD cùng với 51 chỉ
thị AFLP và isozyme từ các công trình nghiên cứu trước đó. Bảy mươi chín chỉ thị
khác không được sắp xếp một cách rõ ràng vì các allele của chúng có liên quan đến
các nhóm liên kết cụ thể và có mối quan hệ đến phần lõi. Phần lõi của bản đồ có
tổng chiều dài là 1,192 cM với khoảng cách trung bình giữa các locus là 7,5 cM và
chiếm khoảng 70-80% của genome [38].
Machado và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự đa hình và
độ tương đồng di truyền cho 39 kiểu gen của quýt Địa Trung Hải. Kết quả khuếch
đại bằng 21 primer ngẫu nhiên thu được 111 băng, trung bình xuất hiện 2,2 chỉ thị
RAPD cho mỗi primer, tương đương với 42% số băng xuất hiện. Các chỉ thị đặc
hiệu kiểu gen cũng được tìm thấy, chủ yếu cho các dạng lai đã biết. Phân tích cây
phả hệ UPGMA cho thấy ít có sự khác nhau về mặt di truyền giữa các mẫu quýt Địa
Trung Hải, trong khi đó sự khác nhau giữa các dạng lai với các loài trong chi Citrus
nhiều hơn. Hai mươi mẫu quýt cho năng suất như nhau, sự đa hình về mặt di truyền
xác định bằng kỹ thuật RAPD cho thấy sự khác nhau giữa các mẫu là khá thấp, như
vậy có thể chúng là một dòng đơn. Với số lượng dạng lai lớn cùng với sự đa hình
giữa các mẫu thấp có thể khẳng định giả thuyết rằng tất cả quýt Địa Trung Hải là
dạng lai của loài quýt phổ biến Citrus reticulata Blanco [55].
Để nghiên cứu sự tương đồng di truyền trên 35 mẫu quýt, bao gồm 10 loài và
7 dạng lai, Filho và cs (1998) đã sử dụng 23 primer (22 primer chứa 10 nucleotide

và 1 primer gồm 8 nucleotide) để thực hiện phản ứng khuếch đại tạo ra 109 băng,
11
trong đó có 45 băng đa hình. Hệ số Jaccard được sử dụng để tính độ tương đồng di
truyền và phân tích UPGMA được sử dụng để xây dựng cây phả hệ. Kết quả phân
tích RAPD cho thấy có những băng đặc trưng cho mẫu và các mẫu phân biệt được
tập hợp thành các nhóm. Sự tương đồng di truyền bên trong nhóm quýt đạt khá cao
(G
J
=0,77) cho thấy các giống quýt được trồng có một nguồn gốc di truyền hẹp. Sự
tương đồng di truyền giữa quýt với các loài Citrus khác như thanh yên (C. medica
L.) và bưởi (C. grandis Osbeck) thấp hơn (thấp nhất G
J
=0,27). Tác giả cho rằng
nhóm các mẫu quýt nghiên cứu thuộc cùng 1 loài (C. reticulata Blanco) với một vài
khác biệt di truyền giữa các cá thể và một lượng lớn các cây lai hơn là một nhóm
loài trong cùng một bậc phân loại [45].
Ba mươi hai mẫu Citrus và Microcitrus cũng đã được kiểm tra bằng phân
tích RAPD. Sự hiện diện của các băng ít gặp trong chi Citrus được tìm thấy trong
các chi gần gũi cho thấy có dấu hiệu của sự di nhập gen, trong khi sự hiện diện của
một vài băng duy nhất cho thấy sự không dung hợp (non-involvement) của các loài
này trong các dạng lai. Hầu hết các loài được mô tả là các dạng lai với độ tương
đồng di truyền cao và ít các băng duy nhất. Ma trận khoảng cách và cây phả hệ
được xây dựng dựa trên hệ số bắt cặp đơn (simple matching coefficient) và phân
tích các nhóm họ hàng. Dữ liệu RFLP và RAPD cho ra kết quả gần giống nhau, các
kết quả này cho thấy C. maxima cùng nhóm với loài không ăn được C. hongheensis
và C. latipes. C. medica cùng nhóm với C. indica và chanh cốm, chanh và các dạng
gần gũi. Quýt không thực sự thuộc về các nhóm trên mà là một loài khác, kết quả
nghiên cứu cũng cho thấy có rất nhiều mẫu đã được định loài sai [45].
Bastianel và cs (2001) đã sử dụng các chỉ thị RAPD để phân tích sự tương
đồng về mặt di truyền của 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) ở Brazil, bao gồm

4 giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck), 4 giống quýt (C. reticulata Blanco, C.
nobilis Loureiro, C. sunki Loureiro và C. deliciosa Tenore), cam chua (C.
aurantium L.), bưởi chùm (C. paradisi Marcf.), bưởi (C. grandis Osbeck), thanh
yên (C. medica L.), chanh cốm (C. latifolia) và 2 dạng lai [C. clementina T.×(C.
tangerina T.×C. paradisi Macf.)]. Sự tương đồng di truyền của 15 giống này được
12
quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giữa các giống quýt thấp
nhất là 0,81. Độ tương đồng thấp hơn thấy ở các loài ít quan hệ là C. medica, C.
grandis và C. latifolia. Bốn giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck) không có sự khác
nhau dựa vào chỉ thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao nhất [36].
Đa dạng di truyền của 38 mẫu bưởi chùm (Citrus paradisi Macf.) và 3 mẫu
bưởi (C. maxima (Burm.) Merr.) đã được Corazza-Nunes và cs (2002) thực hiện
dựa trên kỹ thuật SSR và RAPD. Khoảng 49% trong tổng số 198 chỉ thị RAPD thể
hiện sự đa hình và 4,6 allele/SSR locus đã được xác định. Giá trị hàm lượng thông
tin đa dạng (PIC-polymorphism information content) thay đổi từ 0,093 đến 0,450.
Cây phả hệ UPGMA được xây dựng và hai nhóm bưởi chùm chính cũng đã được
xác định. Mẫu bưởi “do Cabo” và “Siamesa-Filipinas” có mối quan hệ rất gần với
bưởi ở nhóm A. Nhóm B có 3 phân nhóm, chứa hầu hết các mẫu bưởi chùm còn lại.
Các mẫu bưởi chùm chính có sự tương đồng di truyền cao chứng tỏ sự đa dạng về
kiểu hình quan sát được trong nhóm phải có nguồn gốc từ các đột biến soma và
không xác định được bằng các chỉ thị phân tử [41].
De Oliveira và cs (2003) đánh giá quá trình chọn lọc trong quần thể lai
Citrus bằng phân tích RAPD. Sự phân ly của 123 chỉ thị phân tử giữa quýt Cravo
(Citrus reticulata Blanco) và cam Pêra (C. sinensis (L.) Osbeck) được phân tích từ
94 con lai F1. Thành phần di truyền, sự đa dạng, tính dị hợp tử, sự khác nhau trong
cấu trúc nhiễm sắc thể và sự hiện diện của các gen lặn có hại được xác định dựa trên
tỷ lệ phân ly khi quan sát. Một tỷ lệ lớn chỉ thị phân tử có sự sai khác so với tỷ lệ
phân ly 1:1. Nhiều chỉ thị cho kết quả phân ly theo tỷ lệ 3:1 ở cả 2 giống và 1:3 ở
cam Pêra, có lẽ là do quá trình chọn lọc trực tiếp [42].
Cevík và cs (2006) đã xây dựng bản đồ di truyền liên kết của chi Citrus bằng kỹ

thuật RAPD. Tác giả đã chọn ngẫu nhiên 30 cây trong quần thể lai hỗn tạp {C. grandis
(L.) Osb.×[C. paradisi Macf.×Poncirus trifoliata (L.) Raf.]}×{[(C. paradisi Macf.×P.
trifoliata (L.) Raf.)×C. reticulata Blanco]×[(C. paradisi Macf.×P. trifoliata (L.) Raf.)×
C. sinensis (L.) Osb.]} để nghiên cứu. DNA tổng số được tách chiết từ lá sau đó
khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng các primer (10-mer) ngẫu nhiên. Kết quả cho
13
thấy có tất cả 111 chỉ thị phân tử được xác định sau khi được khuếch đại bằng 38
primer, bản đồ di truyền liên kết đã được xây dựng trên các chỉ thị này. Bản đồ sau khi
xây dựng chứa 63 chỉ thị chia làm 9 nhóm, thể hiện cho bộ nhiễm sắc thể đơn bội n=9
của chi Citrus. Tổng chiều dài nhóm liên kết trong thí nghiệm này là 314,8 cM với
khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị phân tử là 5,07 cM [40].
Shaaban và cs (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống
cam địa phương (Citrus aurantium L.) của Ai Cập, 7 giống cam được nghiên cứu là
Succary, Valencia, Balady, Abusoura và 3 cây chưa xác định được đánh số 1, 2 và
3. Tác giả đã đánh giá về các đặc tính sinh lý, hóa sinh của quả cũng như phân tích
đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả nghiên cứu cho thấy cây số 3 có 5
đặc điểm của quả nổi bật là khối lượng quả, thể tích quả, khối lượng vỏ, chiều dài
quả và đường kính quả. Cây này cũng có 3 chỉ tiêu hóa sinh cao hơn các giống khác
là hàm lượng ascorbic acid, tỷ lệ chất rắn hòa tan tổng số (TSS)/acid và tỷ lệ acid vô
cơ trong chất rắn hòa tan tổng số (titratable acidity TSS)/acid. Phân tích RAPD cho
thấy có sự phân biệt rõ dấu DNA (DNA fingerprint) giữa cây số 3 với các giống còn
lại, cây này thuộc về 1 nhóm (cluster A) và những giống còn lại thuộc một nhóm
khác (cluster B) với sự không tương đồng di truyền đạt xấp xỉ 100% giữa 2 nhóm
này. Dựa vào các kết quả nghiên cứu này, tác giả đã xem cây số 3 như là một giống
mới với một số đặc điểm sinh lý, hóa sinh nổi bật [61].
Việc nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật RAPD cũng đã được
nhiều tác giả thực hiện ở nhiều đối tượng thực vật khác, như đu đủ [10], đậu xanh
[12], tảo [9] Để đánh giá tính đa dạng di truyền và thu thập nguồn gen quý của chi
Lilium từ 32 mẫu đại diện cho các giống Lilium bản địa và nhập nội khác nhau,
Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD. Trong số 20

primer RAPD sử dụng, chỉ có 3 primer (chiếm 15%) là các primer cho các băng đa
hình. Ba primer OPA10, P615 và P650 đã tạo ra tổng số 123 băng DNA với trung
bình đạt 0,8; 1,7 và 3,8 băng DNA trên mỗi mẫu nghiên cứu. Mức độ đa hình khác
nhau được thể hiện bởi 3 primer này cũng đã quan sát được ở các nhóm Lilium khác
nhau. Số băng DNA đa hình cao nhất (61 băng) thu được ở các giống Lily thuộc nhóm
Oriental chiếm 49,59%, tiếp sau đó là nhóm L. longiflorum và các con lai của chúng
14
đạt 33,3%, nhóm các loài Lily hoang dại thu thập từ Nhật Bản đạt 8,13%; các giống
Lily thuộc nhóm Asiatic đạt 7,32% và nhóm các loài Lily bản địa của Việt Nam đạt
1,63%. Phân tích RAPD cùng với việc thiết lập cây phân loại di truyền đã cho thấy sự
đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen Lilium đã thu thập [26].
Nguyễn Thị Thanh Bình và cs (2004) đã dùng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu
tính đa hình của 8 giống tằm đang được nuôi tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB,
TML, VC, ĐS1, ĐS2, BM, THT, VYD, trong đó có 4 giống được sử dụng nhiều
trong vài năm gần đây, đó là hai giống địa phương thuộc tập đoàn gốc đa hệ: vàng
chấm (VC) và Đồ Sơn (ĐS) hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình (TTB) và trắng
Mai Lĩnh (TML). Trong tổng số 67 băng nhận được có 26 băng đơn hình (chiếm
38,81%) và 41 băng đa hình (chiếm 66,19%), kích cỡ của các băng từ 100 bp đến
3500 bp. Trong 8 giống tằm nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về
quan hệ di truyền, còn 6 giống đa hệ địa phương có họ hàng khá gần gũi với nhau.
Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, có băng đa hình chỉ
xuất hiện ở một giống mà không xuất hiện ở các giống khác như băng OPO19-1200
bp và OPO19-1000 bp chỉ thấy ở giống TML, băng OPO19-800 bp ở giống TTB và
trong nhóm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM. Với primer OPO16, băng 300 bp quan
sát thấy ở giống TTB, còn băng 400 bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong
nhóm đa hệ. Hiện tượng này còn thấy ở primer OPO13, băng 550 bp ở giống THT,
băng 100 bp xuất hiện trong giống TML, còn băng 1600 bp chỉ thấy ở TTB. Primer
101, riêng giống TTB có băng 100 bp và VC duy nhất mang băng 400 bp trong
nhóm đa hệ. Băng A7-1300 bp, 900 bp và 300 bp không có ở 7 giống khác mà hiện
diện ở TTB. Giống ĐS1 và ĐS2 cho các băng hệt như nhau ở 4 primer nghiên cứu,

primer thứ 5 có 2 băng phân biệt. So sánh tất cả các primer sử dụng, primer OPO16
có tỷ lệ băng đa hình cao nhất 11/12, còn primer 101 có tỷ lệ đa hình thấp nhất 6/15.
Giống TTB có hệ số đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,547 đến 0,703,
thấp nhất trong các giống nghiên cứu, còn ở giống TML chỉ số này cao hơn, biến
đổi từ 0,766 đến 0,906. Các giống trong nhóm đa hệ có hệ số đồng dạng di truyền
thay đổi từ 0,766 đến 0,984. Giống ĐS1 và ĐS2 có hệ số cao nhất 0,984, có khả
năng đây chỉ là một giống nhưng nuôi ở hai địa phương khác nhau [4].
15
Kỹ thuật RAPD đã được Kumari và cs (2006) sử dụng để xác định sự đa
dạng và mối quan hệ gần gũi giữa 11 cây hoa cúc bị gây đột biến từ hai giống hoa
cúc Ajay và Thai Chen Quee. Trong số 40 primer được sàng lọc, 21 primer có sự
khuếch đại, tỷ lệ băng đa hình khác nhau ở các primer, từ 20% (OPR-2) đến 100%
(OPS-2, OPK-3). Hầu hết các primer đều không khuếch đại đối với các mẫu đột
biến màu vàng và cam sáng của giống Thai Chen Queen (trong số 40 primer, có 15
primer khuếch đại đối với cả hai dạng đột biến). Tuy nhiên, primer OPB-11 đã có
sự khuếch đại đối với cả hai dạng đột biến này và có 1 băng đặc hiệu cao (1,9 kb).
Khi so sánh với các mẫu đột biến khác, thấy rằng đây là băng đa hình. Tổng số băng
được khuếch đại bởi 21 primer là 156 cả đối với cây bị đột biến do phóng xạ và cây
bố mẹ, trong đó có 118 băng đa hình. Số băng khuếch đại khác nhau ở các primer,
nhỏ nhất là 3 băng và lớn nhất là 14 băng. Khoảng cách di truyền giữa 13 cây khác
nhau từ 0,43-0,96. Cây phả hệ dựa vào sự phân tích UPGMA có 3 nhóm chính A, B
và C. Nhóm A gồm 4 giống đột biến (Red, Pink Cups, Yellow và Fluted) bắt nguồn
từ cây bố mẹ Ajay; nhóm B gồm cây bố mẹ Thai Chen Queen và 5 giống gồm 7 cây
đột biến (Orange, Small Yellow, Spoon Yellow, Pink và Purple). Hai giống đột biến
vàng và cam sáng của Thai Chen Queen được xếp vào một nhóm hoàn toàn khác
biệt, nhóm C. Điều này chứng tỏ có sự đa dạng di truyền rất cao giữa các cây đột
biến và các cây bố mẹ [53].
Sự đa dạng di truyền và cấu trúc của 4 quần thể tự nhiên thuộc loài
Paramichelia baillonii (Pierre) Hu (họ Ngọc lan) ở Trung Quốc đã được Li và cs
(2007) đánh giá dựa vào kỹ thuật RAPD và các đặc tính hình thái. Theo kết quả phân

tích RAPD, 17 primer được chọn có tổng số băng khuếch đại là 152, trong đó có 63
băng đa hình, chiếm 41,4%. Hệ số Shanon (H
o
) khác nhau ở các quần thể, từ 0,555-
1,121, với giá trị trung bình là 0,955. Sự đa dạng ở cấp độ loài H
sp
=1,217 [54].
Chuối được xem là một loài cây ăn quả có giá trị kinh tế và là một loại thực
phẩm ăn kiêng rất tốt. Jain và cs (2007) đã phân tích mối quan hệ di truyền của 4
giống chuối khác nhau được trồng ở miền Nam Ấn Độ (Grand Naine, Red Banana,
Nendran và Rasthali) bằng kỹ thuật RAPD với 3 primer (OPA-19, OPB-18, OPD-
16
16). Kết quả có 43,47% sản phẩm khuếch đại là băng đơn hình, chung cho tất cả các
kiểu gen, trong khi đó có 30,43% là băng duy nhất, nhưng chỉ có 26,08% thể hiện
mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen này. Trong số các primer đã chọn, primer
OPB-18 tạo ra số lượng băng đa hình cao nhất (4 băng), tiếp theo là primer OPA-19
và primer OPD-16. Các ma trận khác nhau đã được tính toán bằng cách sử dụng chỉ
số SED (Squard Euclidean Distance) để ước đoán sự khác nhau của tất cả các cặp
trong sản phẩm khuếch đại, chương trình được xây dựng bởi phương pháp của
Ward sử dụng thuật toán phương sai nhỏ nhất. Sự phân tích cụm biểu hiện 4 kiểu
gen được xác định bằng chương trình của Grandnaine và Rasthali. Giá trị sai khác
về mặt di truyền là từ 2,82%-3,6%, sự sai khác lớn nhất là 3,6% được phát hiện
giữa hai giống Red Banana và Rasthali, và thấp nhất là ở hai giống Nendran và
Rashali (2,23%) [51].
Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) là một trong những loại rau quả
quan trọng nhất ở Ấn Độ, với sản lượng hàng năm lên đến 4,5 triệu tấn. Archak và
cs (2002) đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa 27 giống cà chua ở Ấn Độ dựa
vào kỹ thuật RAPD, 42 primer được chọn đã khuếch đại tạo ra 174 băng với các
kích thước khác nhau ở 27 giống. Số lượng băng trên primer nhiều nhất là 8 băng,
trung bình là 4,1 băng cho mỗi primer. Số băng đa hình trên mỗi primer là từ 0 đến

7 băng, trung bình là 2,6 băng. Đặc biệt là số băng đa hình tạo ra giữa các giống cao
hơn so với nghiên cứu trước đó giữa các giống cà chua này với những loài hoang
dại thuộc chi Lycopersicon [34].
Upadhyay và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá mối quan hệ
về mặt di truyền và sự đa dạng di truyền giữa các giống dừa Ấn Độ, 8 primer sử
dụng đã phát hiện ra 77 băng đa hình ở 81 cây. Số băng trên mỗi primer khác nhau
từ 7 (OPA 4, OPB 1, OPC 5) đến 15 (OPB 5), trung bình là 9,6 băng trên mỗi
primer. Kích thước của những băng này từ 200 bp đến 2750 bp, kích thước trung
bình là 960 bp. Số băng trung bình đối với các giống dừa cao là 61, trong khi đó
giống dừa lùn là 52. Tỷ lệ băng đa hình giữa các giống dừa cao từ 22% đến 71%,
trung bình là 49%; và đối với các giống dừa lùn là từ 20% đến 44%, trung bình là
17
36%. Số băng được phát hiện bởi mỗi primer phụ thuộc vào trình tự của primer và
phạm vi của sự khác nhau là kiểu gen đặc hiệu. Số lượng băng khác nhau ở các mẫu
khác nhau. Nhìn chung, ở các mẫu dừa cao, số lượng băng được phát hiện nhiều
hơn so với các mẫu dừa lùn. Những kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên
cứu của nhiều tác giả (Ashburner và cs, 1997; Perera và cs, 1999; Upadhyay và cs,
2002) khi nghiên cứu sự khác nhau giữa các mẫu dừa cao về số băng đa hình cũng
như sự đa dạng về mặt di truyền. Sự đa dạng trung bình của các cá thể khác nhau từ
0,057 đến 0,196 [62].
1.2.2. Các kỹ thuật khác
Bên cạnh kỹ thuật RAPD, có rất nhiều loại chỉ thị phân tử được sử dụng để
xác định sự khác nhau giữa các dạng thuộc chi Citrus, bắt đầu từ những nghiên cứu
isozyme vào cuối những năm 1970 (Torres và cs, 1978), đa hình chiều dài các đoạn
cắt hạn chế (RFLP) vào những năm 1980 và đầu những năm 1990, và gần đây nhất
là các kỹ thuật AFLP, SSR, ISSR (Fang và Roose,1997; Bretó và cs, 2001; Sankar
và Moore, 2001). Bức tranh tổng thể được dựng lên từ những nghiên cứu này là sự
đa dạng rất lớn từ các nhóm loài tổ tiên thuộc chi Citrus, đặc biệt là quýt và bưởi
[60].
RFLP-đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về

kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn
khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. RFLP
là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. RFLP có ưu điểm là chỉ thị đồng
trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, do kích thước DNA khảo
sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng các chỉ thị tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu
nghiên cứu. Phân tích PCR-RFLP đã được sử dụng thành công khi nghiên cứu đa
dạng di truyền ở rất nhiều loài cây ăn quả như Prunus (Badenes và Parfitt, 1995),
Diospyros (Yonemori và cs, 1998) và Mangifera (Eiadthong và cs, 1999) [32].
Abkenar và cs (2004) đã phân tích PCR-RFLP trên DNA lục lạp (cpDNA) để
xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của 30 mẫu “cây ăn quả Citrus thật” (“true
18
citrus fruit trees”) thuộc dưới tộc Citrinae, họ Rutaceae gồm 6 loài Fortunella spp., 1
loài Eremocitrus sp., 2 dạng Poncirus sp., 1 loài
Clymenia sp., 5 loài Microcitrus spp. và 16 loài Citrus spp. Bốn vùng khuếch
đại trên cpDNA là rbcL-ORF106, psaA-trnS, trnH-trnK và trnD-trnT được phân tích
với 15 enzyme cắt giới hạn khác nhau. Trong số 140 đoạn cắt thu được có 108 đoạn
đa hình và tác giả đã dựa vào kết quả này để xây dựng cây phát sinh của chúng. Kết
quả cho thấy tất cả các loài Microcitrus đều có sự phân hóa với nhau và với các loài
khác. Eremocitrusi nằm trong nhóm với Microcitrus nhưng có kiểu cpDNA khác với
các loài Microcitrus. Trong khi đó Clymenia, Fortunella và Poncirus theo thứ tự tạo
thành các nhóm độc lập, ba chi này gần với Citrus hơn Microcitrus và Eremocitrus.
Các loài Citrus được phân thành 3 nhóm chính và nguồn gốc của các loài Citrus đã
được đề cập đến [32].
SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận
dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận
dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế primer. Các trình tự gần
kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. SSR primer sau đó được sử dụng tương tự
như các RAPD primer. SSR là một chỉ thị đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin
cậy vì vậy đã được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây
trồng như cam chanh (Nunes và cs, 2002; Golein và cs, 2005), táo (Guilford và cs,

1997) và nho (Tomas và Scott, 1993) [47], [48].
Hai mươi mốt chỉ thị trình tự lặp lại đơn giản được Barkley và cs (2006) sử
dụng để xác định đa dạng ở mức độ phân tử từ 370 mẫu (chủ yếu là hữu tính) có
nguồn gốc từ các giống Citrus trong bộ sưu tập các vật liệu giống cây Citrus được
lưu giữ tại Đại học California, Riverside. Tổng số có 275 allele đã được xác định
với trung bình là 11,5 allele trên locus và chỉ số đa hình trung bình là 0,625. Phân
tích đa dạng di truyền đã được thực hiện cho từng chỉ thị SSR, cho toàn bộ quần thể
và cho các loài Citrus. Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các mẫu Citrus và các
mẫu không phải Citrus cũng được xác định bằng xây dựng cây phả hệ. Kết quả
nghiên cứu cho thấy rõ tính đơn gốc ở mức độ loài khi các dữ liệu về bậc phân loại
19
cho dạng lai bị loại bỏ. Hai cây phát sinh này cũng cho thấy nhóm Fortunella nằm
trong chi Citrus nhưng Poncirus là chi tương đồng với Citrus. Hơn nữa, các giống
Citrus có thể được xác định như các quần thể hay các đa quần thể nếu kiểu gen của
chúng cho thấy một sự hòa trộn bởi cách tiếp cận theo mô hình nhóm. Các nghiên
cứu phân tách (khoảng cách và mô hình) đều chứng minh cho giả thuyết rằng chỉ có
một số ít loài tự nhiên trong chi Citrus và hầu hết các dạng khác của Citrus là các
dạng lai giữa các dạng tự nhiên đó [35].
Sự biến dị di truyền của 8 giống cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck) và 6
giống quýt (Citrus reticulata Blanco) đã được đánh giá thông qua phân tích SSR.
Tác giả đã xác định được tổng số 52 dạng allele thông qua 7 cặp primer và số lượng
allele trên cặp primer nằm trong khoảng từ 3-10 (trung bình là 7,42). Giá trị hàm
lượng thông tin đa hình (polymorphic information content-PIC) thay đổi từ 0,505
đến 0,950 và các chỉ thị vi vệ tinh phân biệt các biến dị giữa các giống quýt nhưng
các biến dị ít được quan sát thấy giữa các giống cam. Cây phân loại được xây dựng
cho thấy có một nhóm cam ngọt chính chứa 3 nhóm nhỏ và 4 nhóm quýt đã được
xác định. Đa số các giống cam có độ tương đồng di truyền cao, vì vậy, những đa
hình về mặt hình thái quan sát được giữa các nhóm phải là các biến dị soma và
không được xác định chính xác bằng các chỉ thị phân tử [47].
ISSR là kỹ thuật đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu đa dạng di truyền

(Kantety và cs, 1995; Charters và cs, 1996), và đã được dùng để phân biệt giữa các
giống cây Citrus khó thực hiện bởi các chỉ thị phân tử khác (Fang và Rose, 1997).
Mối quan hệ di truyền giữa các giống chanh thương mại (Citrus limon) đã được
Capparelli và cs (2004) phân tích bằng kỹ thuật ISSR và phân tích dòng chuỗi (flow
cytometry). Hai giống với các đặc điểm khá giống nhau đã được phân biệt bằng
cách sàng lọc với 10 SSR primer
và xác định hàm lượng DNA trong nhân trước khi nhuộm [39].
AFLP-sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp
giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng
20
những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể
dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen.
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ
gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích
và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài và các
primer thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài. Có nhiều tác giả đã sử dụng kỹ
thuật này để phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng như bưởi chùm
(Cervera và cs, 1998), dừa (Pepera và cs, 1998), đu đủ (Kim và cs, 2002), Carya
illinoinensis (Beedanagari và cs, 2005) [37].
Quả không hạt là một tính trạng mong muốn ở những cây thuộc chi Citrus và
là mục tiêu quan trọng trong nhân giống. JinPing và cs (2009) đã sử dụng kỹ thuật
AFLP để tìm ra các chỉ thị phân tử cho quýt không hạt Ponkan (Citrus reticulata
Blanco). Tác giả đã chọn ra được 5 cặp primer có liên quan trực tiếp đến tính trạng
mong muốn sau khi sàng lọc 72 cặp primer, sự bắt cặp này đã được kiểm tra bằng
phân tích AFLP từ các nhóm cá thể. Năm đoạn khuếch đại đã được tạo dòng, phân
tích trình tự và so sánh tương đồng, kết quả cho thấy 4 chỉ thị có sự tương đồng cao
với các gen chức năng, điều này có thể giúp hiểu được cơ chế phân tử của tính trạng
không hạt ở chi Citrus. Dựa trên các thông tin về trình tự, 8 primer đặc hiệu đã được
thiết kế và 2 đoạn AFLP-2 và AFLP-5 đã được chuyển đổi thành công sang dạng
chỉ thị SCAR. Vì vậy, có thể đẩy nhanh các chương trình chọn giống bằng cách

sàng lọc các đột biến không hạt dựa trên các chỉ thị đã được chọn lọc [52].
Chương 2.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
21
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Bưởi Thanh trà: Citrus grandis (L.) Osbeck
Chi: Citrus
Họ cam quýt: Rutaceae
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 32 cá thể bưởi Thanh trà thu được ở các địa
điểm Kim Long, Hương Long, Thủy Biều (làng Trung Thượng và làng Lương Quán)
thuộc thành phố Huế. Trong đó, số lượng mẫu ở mỗi vùng như sau:
- Hương Long có 8 mẫu (2HL, 5HL, 9HL, 11HL, 13HL, 14HL, 15HL và 17HL).
- Kim Long có 4 mẫu (1KL, 2KL, 3KL và 4KL).
- Trung Thượng có 10 mẫu (1TT, 2TT, 5TT, 6TT, 7TT, 8TT, 11TT, 12TT,
14TT và 16TT).
- Lương Quán có 10 mẫu (3LQ, 4LQ, 6LQ, 8LQ, 10LQ, 12LQ, 14LQ,
15LQ, 17LQ và 19LQ).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Luận văn của chúng tôi được tiến hành từ tháng 4/2009 đến tháng 10/2009
tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gene, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ
sinh học, Đại học Huế.
2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái
Chúng tôi tiến hành đánh giá một số đặc điểm hình thái của bưởi Thanh trà
theo phương pháp của Vũ Thị Nhuận và cs (2005).
- Kích thước lá: chiều dài lá, chiều rộng lá, chiều dài cánh lá và chiều rộng
cánh lá được đo qua chỗ rộng nhất bằng thước kẹp.
- Kích thước quả: dùng thước đo chiều cao và chiều rộng của quả.
- Khối lượng quả, khối lượng phần ăn được: dùng cân để xác định.
- Độ dày vỏ: đường kính quả-đường kính phần ăn được của quả.
- Số lượng quả trên cây.

- Số lượng múi trên quả.
22
- Số lượng hạt trên múi.
2.2.2. Phương pháp RAPD
DNA được tách chiết từ lá bưởi Thanh trà theo phương pháp của Ahmed và
cs (2009) có cải tiến: cắt lá bưởi Thanh trà (200 mg) thành từng mảnh nhỏ; đồng
hóa mẫu với 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM
NaCl). Sau đó thêm 50 µL SDS 20%, ủ ở 65
o
C trong 50 phút. Mẫu được chiết 2 lần
với cùng thể tích của hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để
loại bỏ protein và lấy dịch trong chứa DNA hòa tan ở pha trên. Loại polysaccharide
bằng ether hydrate hóa. Kết tủa DNA bằng ethanol 100% lạnh trong 30 phút ở
-20
o
C. Thu kết tủa DNA bằng ly tâm 11.000 vòng/phút, ở 25
o
C trong 12 phút. Rửa
tiểu thể DNA bằng ethanol 70%. Hòa tan tiểu thể bằng nước cất vô trùng, thêm 1
µL RNase, bảo quản ở -20
o
C dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR-RAPD [33].
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được xác định bằng phương pháp quang
phổ trên máy NanoDrop ND-1000 (Thermo, Mỹ).
Chín primer ngẫu nhiên (theo Operon Technologies, CA) đã được sử dụng để
khuếch đại DNA các mẫu lá bưởi Thanh trà (tên và trình tự từng primer được trình
bày ở bảng 2.1) theo phương pháp của Rao và cs (2007): hỗn hợp phản ứng gồm 0,8
pmol mỗi loại primer ngẫu nhiên; 4 mM MgCl
2
, 0,4 mM dNTP mỗi loại, 0,05

units/µL Taq DNA polymerase (Fermentas PCR Master Mix 2×); 25 ng DNA
khuôn mẫu trong tổng số dung tích 25 µL. Khuếch đại PCR theo quy trình: 92
o
C/2
phút; 42 chu kỳ gồm: 92
o
C/1 phút, 36
o
C/1 phút, 72
o
C/2 phút và cuối cùng 72
o
C/10
phút. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên agarose gel 1,4% và nhuộm bằng Ethidium
bromide [59].
Hình ảnh điện di được thu nhận bằng hệ thống thu nhận hình ảnh Gel
Documentation và phân tích bằng phần mềm Quantity one.
Bảng 2.1. Trình tự của các primer sử dụng
STT Primer Trình tự 5'-3' Tài liệu tham khảo
23
1 OPA-02 5'-TGCCGAGCTG-3' Vũ Thị Nhuận và cs, 2005
2 OPA-04 5'-AATCGGGCTG-3' Vũ Thị Nhuận và cs, 2005
3 OPA-18 5'-AGGTGACCGT-3' Shaaban và cs, 2006
4 OPB-05 5'-TGCGCCCTTC-3' Cevik và cs, 2006
5 OPB-10 5'-CTGCTGGGAC-3' Cevik và cs, 2006
6 OPC-02 5'-GTGAGGCGTC-3' Cevik và cs, 2006
7 OPC-04 5'-CCGCATCTAC-3' Cevik và cs, 2006
8 OPAA-10 5'-TGGTCGGGTG-3' Rao và cs, 2007
9 OPAD-10 5'-AAGAGGCCAG-3' Rao và cs, 2007
2.2.3. Phương pháp xây dựng giản đồ phả hệ

Xây dựng giản đồ phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán UPGMA bằng
phần mềm NTSYS 2.0 (Exeter Software, Mỹ) dựa vào sự xuất hiện hay không xuất
hiện của các băng trên phổ điện di sản phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các
primer theo nguyên tắc đánh số "1" nếu có xuất hiện băng và số "0" nếu không xuất
hiện băng.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích Duncan’s test với mức
ý nghĩa p<0,05 bằng chương trình SAS.
Chương 3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái của quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế
Chúng tôi tiến hành điều tra và thu thập mẫu lá Thanh trà ở 3 vùng trên địa
bàn thành phố Huế: Kim Long, Hương Long, Thủy Biều (Trung Thượng, Lương
Quán). Kết quả phân tích các đặc điểm về kích thước lá và quả được trình bày ở
bảng 3.1.
24
Bảng 3.1. Một số đặc điểm hình thái của quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế
TT Chỉ tiêu
Địa điểm
Lương
Quán
Trung
Thượng
Kim Long Hương Long
1 Tuổi cây (năm) 5 - 40 3 - 25 3 - 6 4 - 17
2 Dài lá (cm) 11,88
ba
10,81
b
12,98

a
11,33
b
3 Rộng lá (cm) 6,20
ba
5,40
c
6,44
a
5,74
bc
4 Dài cánh lá (mm) 28,31
b
23,43
c
36,18
a
28,10
b
5 Rộng cánh lá (mm) 17,07
cb
15,40
c
26,35
a
20,67
b
6 Số quả/cây 105,72
a
112,80

a
33,33
b
72,82
ba
7 Chiều cao quả (cm) 11,77
a
11,28
a
11,47
a
11,29
a
8 ĐK quả (cm) 11,76
a
11,28
a
11,47
a
11,29
a
9 KL quả (g) 715,00
a
592,70
a
690,00
a
670,80
a
10 KL phần ăn được (g) 452,60

a
401,00
a
470,00
a
433,10
a
11 Độ dày vỏ (mm) 13,01
a
10,98
a
9,00
a
10,15
a
12 Số múi (múi) 13,14
a
12,73
a
12,67
a
13,00
a
13 Số hạt/quả (hạt) 139,50
a
135,53
a
119,63
a
129,57

a
Chú thích: các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng thể hiện sự sai khác có ý nghĩa
thống kê của các trung bình mẫu với mức ý nghĩa p<0,05 (Duncan’s test).
Nhìn chung, các cây bưởi Thanh trà được trồng từ nhiều vùng khác nhau ở
thành phố Huế có đặc tính hình thái ít sai khác nhau, bưởi Thanh trà có các đặc
điểm chính là: cây cao trung bình từ 5-8 m, cao nhất có thể lên đến 15 m. Lá có
hình oval, màu xanh đậm, kích thước lá trung bình từ 5-15×2-6 cm; cá biệt có
những cây có lá rất to như 2HL kích thước lá lên đến 19×9 cm, tuy nhiên cũng có
những cây có kích thước lá khá nhỏ như 3LQ (7×2 cm). Quả Thanh trà có kích
thước tương đối nhỏ hơn so với các loại bưởi khác và rất nhiều hạt; trung bình mỗi
quả có từ 119-140 hạt, đây chính là nhược điểm rất lớn làm giảm giá trị của bưởi
Thanh trà.
Qua bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy đặc tính hình thái của quả ở các xã thuộc
thành phố Huế không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể do các
đặc điểm hình thái của quả ít chịu sự tác động của nền đất. Trong khi đó, kích thước
lá lại có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các vùng với nhau, ở vùng Lương
25