Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu điều tra nguồn Ribonuclease từ nội tạng của động vật nhằm tìm hiểu khả năng khai thác để sử dụng làm thuốc

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
đặt vấn đề
Từ xa xa nhân loại đã trải qua biết bao các loại dịch bệnh, nhất là các
bệnh do virus gây ra. Ngày nay, khi nền kinh tế ngày càng phát triển, xã hội
ngày càng văn minh thì vấn đề sức khoẻ của con ngời lại càng đợc quan tâm
hơn trớc, bởi sự xuất hiện liên tục của hàng loạt các loại dịch bệnh mới cùng
sự diễn biến phức tạp của chúng. Mặc dù khoa học -công nghệ đều có những
tiến bộ vợt bậc nhng nhiều bệnh nan y nh ung th, AIDS, viêm đờng hô hấp
(SARS), bệnh bò điên, bệnh thanvẫn là mối đe doạ của toàn nhân loại.
Điều này đòi hỏi phải có sự phối hợp của nhiều ngành thuộc nhiều lĩnh vực
khác nhau trong một quốc gia cũng nh giữa các quốc gia với nhau trong công
tác phòng chống bệnh tật.
Việc sử dụng enzyme ribonuclease làm thuốc chữa bệnh đã đợc phôi
thai cách đây hàng nửa thế kỉ. Đó là vào cuối những năm 50 của thế kỉ XX
một số nhà khoa học đã phát hiện ra hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính
cytotoxin) của các ribonuclease và nghĩ tới khả năng sử dụng nuclease để
chữa bệnh do virus.
Hiện nay một trong những hớng nghiên cứu quan trọng đang đợc tiến
hành trên thế giới là kiếm tìm nguồn RNase tự nhiên có hoạt tính gây độc tế
bào (hay hoạt tính cytotoxin) và chuyển các RNase từ dạng không hoạt tính
cytotoxin thành các dạng có hoạt tính cytotoxin, nhất là với các enzyme tip
tụy, để làm thuốc điều trị ung th. Hơn nữa, ngày càng có nhiều nghiên cứu
thông báo về vai trò của nhiều loại ribonuclease trong hệ thống phòng thủ và
tự vệ của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn và virus. Tuy
nhiên ribonuclease từ nội tạng của động vật còn ít đợc nghiên cứu. Để góp
phần tìm hiểu thêm về các nguồn RNase tự nhiên ở nớc ta, trong nội dung giới
hạn của khoá luận này tôi xin đợc đề cập tới ribonuclease tách từ nội tạng của
một số động vật. Khoá luận mang tiêu đề:
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
1
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

Nghiên cứu điều tra nguồn Ribonuclease từ nội tạng của động vật
nhằm tìm hiểu khả năng khai thác để sử dụng làm thuốc
Mục đích của khoá luận là: nghiên cứu xác định phân bố hoạt tính
ribonuclease trong các nội tạng của một số động vật nhằm tìm hiểu về các
nguồn enzyme động vật này và khả năng tách chiết để tạo các chế phẩm
RNase phục vụ cho các mục đích sử dụng khác nhau.
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
2
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
Chơng I
Tổng quan tài liệu
1.1. KháI quát chung về nhóm ribonuclease
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Ribonuclease là nhóm enzyme có phân bố rộng rãi trong tự nhiên,
đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của acid nucleic, thực
hiện chức năng tiêu hoá, chống virus, tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ
thể V o n m 1950, ba nh khoa h c: Salganik (Liên Xô), Bernet (c) v
Clerk (B) ã tin h nh nh ng th nghim u tiên v kh nng cha các bnh
virus bng RNase [21]. Kt qu bc u cho thy các enzyme n y có kh
nng kìm hãm s phát trin ca mt s loi virus gây bnh nh ospovaxin,
herpes, adenovirus (cha ADN) hay virus viêm não, viêm ty, virus cúm
(cha ARN)
Nhng nm 1960 -1970, RNase ty bò (RNase A, EC 3.1.27.5) tr
th nh mô hình m u trong các công trình nghiên cu enzyme hc nh u th
v ngun tip cn, kh nng tinh ch d d ng c ng nh kích thc phân t
nh (~14 kDa). RNase A cng l enzyme u tiên c xác nh trình t
amino acid (Stein, Moor v c ng s, 1960) v l enzyme th ba c xác
nh cu trúc (sau Lysozyme v Carboxypeptidase A). N m 1972, gii thng
Nobel hóa hc c trao cho Stanford Moore, William Stein v Christian
Anfinsen vi nhng công trình nghiên cu v RNase ca h. Nm 1984,

Bruce Merrifield vinh d nhn gii thng cao quý n y v i công trình nghiên
cu cng liên quan n RNase A [20]. T nhng nm cui thp kỉ 80 tới nay,
nhiều nghiên cứu cơ bản v nghiên cứu theo h ớng ứng dụng RNase đã đợc
tiến h nh song song v phối hợp chặt chẽ với nhau, đặc biệt l sau khi có các
bằng chứng khoa học cho thấy enzyme n y có biểu hiện hoạt tính gây độc tế
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
3
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
b o (Cytotoxin).
1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất
Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các
chất xúc tác khác cũng nh giữa enzyme này với enzyme khác. Nhóm nuclease
tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của các acid nucleic. Chúng đợc
đặc trng bởi tính đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau.
Hầu hết các RNase tìm thấy ở động vật có xơng sống đều có tính đặc
hiệu pyrimidine. Nó phân cắt liên kết C5-O-P ng sau pyrimidine (ca base
cytocil v uracil u tiên) m không phân cắt liên kết C5-O-P đứng sau
purine để tạo thành dẫn xuất pyrimidine-2,3-phosphate vòng. Sau ó các sn
phm vòng n y c tích ly hoc b thy phân th nh các nucleotide-3'-
phosphate bng cách phân ct liên kt C2'-O-P. RNase cng xúc tác thy phân
tạo nên các phosphate vòng cytidin-2,3-phosphate và uridin-2,3-phosphate.
Nhng phosphate vòng n y l ti n cht ca các mononucleotide pyrimidine
c tìm thy trong quá trình tiêu hóa ARN. Phù hp vi tính chất c hiu
n y l các RNase không tác ng n các phosphate vòng adenosin-2',3'-
phosphate v guanosin-2',3'-phosphate. C ng xut phát từ tính đặc hiệu
pyrimidine, RNase chỉ thuỷ phân các acid polythymidylic, polyuridylic,
polypseudouridylic v acid polyguanylic [7, 24].
1.1.3 Cấu trúc phân tử
Trong thế kỉ XX, RNase từ tụy bò (RNase A) đợc coi là mô hình mẫu
và đợc nghiên cứu nhiều nhất, đầy đủ nhất về cấu trúc hoá học, tính bền vững,

quá trình bao gói, cơ chế xúc tác cũng nh hớng tiến hoá phân tử. Nhờ vậy
chúng ta có thêm thông tin về các enzyme thành viên thuộc siêu họ RNase
ngoại tiết (hay siêu họ RNase A). Hiện nay hơn 100 thành viên thuộc siêu họ
RNase A đã đợc biết đến bao gồm tất cả các RNase ngoại tiết thuộc ngành
động vật có xơng sống, từ lớp lỡng c cho đến lớp thú. Hầu hết các enzyme
thành viên thuộc siêu họ này khác nhau ít nhiều về trình tự amino acid nhng
lại giống nhau về cấu trúc không gian (dạng monomer), trung tâm hoạt động
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
4
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
và các tính chất xúc tác [20, 24].
RNase A đợc tiết từ các tế bào ngoại tiết tuyến tụy bò để phân huỷ
một lợng lớn ARN đợc tạo bởi những vi sinh vật khu trú trong dạ cỏ. Nó có
khi lng phân t nh (~14 kD) vi 124 gc amino acid trong các chui
polypeptide, 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein có mặt
trong cấu trúc n y (không có Trytophan). Công thức phân tử dạng không tích
điện l C
575
H
907
N
171
O
192
S
12
với Mr = 13 686 Da. Về hình dạng, RNase A giống
quả thận, các gốc của trung tâm hoạt động nằm trong vùng hốc (cleft) -l
vùng lõm của quả thận. Cấu trúc bậc hai điển hình của RNase bao gồm 4
phiến cấu trúc đối song song ngợc chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn ngắn.

Trong phân tử có 4 cầu nối disunfide đợc hình th nh từ 8 gốc cystein ở các vị
trí 26-84; 40-95; 58-110 v 65-72. Các cầu nối n y có thể bị phá vỡ bởi -
mercaptoethanol d thừa, tạo thành 8 nhóm -SH tự do l m phân tử enzyme bị
duỗi ra v mất hoạt tính xúc tác [20].
Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều cấu tạo từ một mạch
polypeptide, tức là có cấu trúc monomer, chỉ có một ngoại lệ là RNase trong
tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 -dimer. BS-RNase đợc tách ra ở
dạng dimer, trong đó hai tiểu đơn vị thành phần (subunit) đợc nối với nhau bởi
hai cầu disunfide. ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp
gồm hai cấu trúc bậc 4 hoàn toàn khác nhau, đợc ký hiệu là M=M (không có
sự trao đổi chéo các đoạn mạch đầu N giữa 2 tiểu đơn vị thành phần) và MxM
(có sự trao đổi chéo trên: một đoạn mạch peptide ngắn đầu N của mỗi tiểu đơn
vị này sẽ liên kết với phần cấu trúc thân chính của tiểu đơn vị kia) [13].
1.1.4. Cơ chế xúc tác
Phản ứng hoá học do RNase xúc tác là phản ứng thuỷ phân liên kết
phosphodiester trong phân tử acid nucleic. Quá trình thuỷ phân ARN do
RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm acid chung
với sự tham gia của 2 gốc His-12 và His-119:
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
5
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
- Giai đoạn 1: Phản ứng diễn ra nhanh, phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản
phẩm trung gian là phosphate vòng mà không giải phóng nhóm acid. Trong
giai đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H
+
ở vị trí 2') còn His-119 đóng vai trò là acid chung (proton hoá nhóm đi khỏi
RNA-O-).
- Giai đoạn 2: Diễn ra chậm hơn và giải phóng nhóm acid thứ hai
thuộc gốc phosphate trong quá trình thuỷ phân dẫn xuất phosphate vòng.
Trong giai đoạn này vai trò của 2 gốc His-12 và His-119 lại ngợc lại: His-119

tơng tác với H
2
O theo cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12
đảm nhận việc proton hoá nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2' [7, 20, 24].
1.2. Các chức năng sinh học của ribonuclease
1.2.1. Chức năng tiêu hoá
Trong cơ thể con ngời cũng nh trong cơ thể động vật bậc cao, tuyến
tụy có một vai trò vô cùng quan trọng đối với quá trình tiêu hoá. Các acid
ribonucleic có trong thức ăn bị phân giải ở tá tràng dới tác động của RNase do
tuyến tụy tiết ra. RNase sẽ thuỷ phân các ARN thành các mononucleotide,
phosphate vô cơ và oligonucleotide. Sau đó các dạng này mới tiếp tục bị các
enzyme khác trong hệ tiêu hoá phân giải thành các dạng mới giúp cơ thể dễ
hấp thụ [24].
1.2.2. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN
Một vai trò rất quan trọng của RNase trong tế bào là tham gia trực tiếp
vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN [16, 20, 24]. Điển hình trong vai trò
này phải kể đến RNase H. RNase H thuỷ phân mạch ARN trong thành phần
phân tử lai (heteroduplex) ARN-ADN tạo thành các đoạn có đầu cuối 5'-P và
3'-OH. Enzyme n y không thể hiện hoạt tính với cả ds-và ss-ARN (ARN có
cấu trúc mạch kép và cấu trúc mạch đơn). RNase H chính của ngời (HI) đợc
tách từ các tế bào tăng bạch hồng cầu K562, đây là một loại tế bào ung th.
RNase H đợc phân ra làm 2 loại: RNase HI và RNase HII [24].
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
6
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
- RNase HI đóng vai trò loại bỏ ARN mồi trong quá trình sao chép
ADN. RNase này có Mr = 89 kDa, cần cation hoá trị 2 cho hoạt tính xúc tác,
pH tối u trong khoảng 8,0 8,5 khi có mặt 10 mM Mg
2+
cho thực hiện chức

năng của nó.
- RNase HII có Mr = 33 kDa và đợc tách chiết từ nhau thai, tham gia
vào quá trình sao mã (tổng hợp ARN) [24], để thực hiện chức năng của mình
nó cần ion Mg
2+
, pH tối u trong vùng 8,5 -9.
1.2.3. Tham gia vào quá trình chế biến và chín của ARN
Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hoá phức
tạp với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau [24]. Một trong những
RNase đó là RNase P. Enzyme này có mặt ở cả sinh vật thuộc nhóm đơn giản
nh vi khuẩn cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn
(Eucaria). RNase P là một enzyme có hai thành phần chính là ARN và protein
gắn với nhau, trong đó tiểu đơn vị protein chiếm trọng lợng phân tử nhỏ còn
tiểu đơn vị ARN đóng vai trò là TTHĐ và chiếm trọng lợng chủ yếu trong
thành phần enzyme. ARN có cấu trúc bậc 2 và có thể biểu hiện hoạt tính ngay
cả khi không có tiểu phân tử protein [8].
RNase P giữ vai trò thuỷ phân liên kết phosphodiester trên phân tử tiền
chất tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp protein. Ngoài ra RNase P còn cắt mARN đặc hiệu trình tự bằng
cách dùng các trình tự định hớng để liên kết với cơ chất qua các liên kết cặp
đôi base, sau đó cắt rồi phân li sản phẩm [8,24].
1.3. Các chức năng sinh học mới của ribonuclease
1.3.1. Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus
Phản ứng miễn dịch của cơ thể xảy ra để chống lại các yếu tố gây
bệnh xâm nhập vào cơ thể nh các vi sinh vật (vi khuẩn, virus), độc tố vi sinh
vật, các phân tử lạ Đến nay, chúng ta đã tìm ra đợc nhiều loại RNase có khả
năng tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus nh RNase L, RNase bạch
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
7
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

cầu a axit ECP và EDP, Onconase, BS-RNase
RNase L là endonuclease đợc tế bào tổng hợp cảm ứng bởi interferon,
đợc hoạt hoá bởi 2', 5'-oligoriboadenylate (các gốc A liên kết với nhau bằng
các liên kết 2', 5'-phosphodiester) và đợc phosphoryl hoá, có Mr = 83,5 kDa.
RNase L thuỷ phân cả ARN của vi khuẩn và của tế bào theo các trình tự UpN,
ApU trong cùng một mạch của ARN tạo thành sản phẩm có các đầu cuối 3'-
phosphate và 5'-OH. Hoạt động của enzyme này cần sự có mặt của các ion
Mg
2+
và ATP. RNase L bị ức chế bởi protein-inhibitor đặc hiệu RL-I (là
protein cản trở thực hiện cơ chế chống virus của interferon) [24].
Ngoài RNase L đã nêu trên, còn nhiều RNase khác có hoạt tính chống
virus nh ECP, EDN của bạch cầu [18, 22] BS-RNase [22] và cả Onconase
[22]. Chúng có hoạt tính kháng khuẩn, thể hiện hoạt tính cytotoxin,
neurotoxin và helmintotoxin. EDN là glycoprotein, trong trình tự amino acid
của nó, có 5 trình tự glycosyl hoá tại Asn (tại các vị trí 17, 59, 65, 84 và 95).
ECP là một protein rất kiềm (với điểm đẳng điện pI = 10,8), có 3 điểm
glycosyl hoá bởi oligosacchatide phức tạp giống với EDN [24].
1.3.2. Hoạt tính cytotoxin
Hoạt tính cytotoxin là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng của
RNase. Trong số hơn 100 enzyme thuộc siêu họ RNase A đợc biết cho đến nay,
chỉ có BS-RNase (enzyme từ tinh dịch bò) và các RNase từ 3 loài ếch: ếch báo
phơng Bắc Rana pipiens, ếch bò Rana catesbeiana và ếch đồng Nhật Bản Rana
japonica -là có hoạt tính cytotoxin [12, 16, 20, 25]. Cơ sở của hoạt tính
cytotoxin là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein ức chế (RI) trong bào
tơng [6, 10, 14, 15, 20], nhờ đó RNase dễ dàng phân cắt cơ chất ARN đặc hiệu
trong tế bào, giúp hiệu quả diệt khối u đợc nâng cao. Hai enzyme có hoạt tính
cytotoxin đợc nghiên cứu nhiều là Onconase (ONC) và BS-RNase:
-Onconase là một protein đợc tinh sạch từ trứng và phôi sớm của
loài ếch Rana pipiens có hoạt tính chống ung th. Protein này còn đợc kí hiệu

Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
8
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
là P 30. Đó là một protein-monomer, có phân tử cấu tạo từ một chuỗi
polypeptide với Mr = 12 000 Da và có tính tơng đồng cao với RNase A [25].
-Onconase bám vào tế bào với 2 lực bám khác nhau: một lực bám
có K
d
= 6,2x10
-6
và một lực bám có K
d
= 2,5x10
-7
. ủ ở 4
0
C làm tăng tỉ lệ
Onconase bám vào tế bào tỉ lệ với nồng độ bám ở 37
0
C và cũng làm tăng độ
mẫn cảm của tế bào với hoạt tính gây độc của Onconase. Các dẫn liệu này cho
thấy rằng bớc mà Onconase bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào là bớc khởi
đầu cho sự thể hiện độc tính của nó. Hoạt tính này có thể bị ức chế bởi NaN
3
và 2-deoxyglucose. Hoạt tính gây độc tế bào của nó gấp 10 lần Monensin.
Hoạt tính RNase rất cần thiết cho sự thể hiện độc tính vì khi Onconase đợc
alkyl hoá hoạt tính ribonucleolytic của nó chỉ còn lại 2% so với hoạt tính này
của enzyme ban đầu và khả năng ức chế sự tổng hợp protein tế bào của
Onconase đã đợc alkyl hoá cũng bị giảm đi tơng ứng 100 lần. Không giống
nh RNase A, Onconase không bị ức chế bởi protein ức chế RNase có trong tế

bào chất (RI), chất ức chế RNase từ nhau thai (PRI) [16, 25].
Onconase bám trên bề mặt các tế bào nhờ các thụ thể, chúng xâm
nhập vào trong tế bào và thực hiện quá trình phân huỷ ARN của tế bào đó, nhờ
đó ức chế quá trình tổng hợp protein và làm cho tế bào bị chết [25].
-BS-RNase đợc tách chiết từ tinh dịch bò, chúng là một dạng đồng
đẳng dimer của RNase A từ tụy bò, có độc tính với các tế bào của động vật có
vú. Trái ngợc với BS-RNase dimer, dạng monomer của BS-RNase lại không có
độc tính và bám chặt với chất ức chế của RNase trong tế bào chất. BS-RNase
dimer đi vào trong tế bào theo phơng thức hấp thụ chứ không phải là nội nhập
bào qua trung gian thụ thể tế bào và sau đó không tơng tác với chất ức chế của
RNase trong tế bào chất, thể hiện hoạt tính phân huỷ ARN của tế bào [13].
Hoạt tính gây độc tế bào của BS-RNase có liên quan đến cấu trúc bậc
bốn của nó: chỉ dạng BS-RNase dimer có hoạt tính cytotoxin, còn dạng BS-
RNase monomer hoàn toàn không độc với tế bào [13].
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
9
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp gồm hai cấu
trúc bậc bốn hoàn toàn khác nhau, có thể biến đổi qua lại: M=M và MxM
(Picolli và cộng sự 1992). Sự biến đổi thuận nghịch của M=M và MxM là kết
quả của sự biến đổi của các chuỗi xoắn ở đầu tận cùng N giữa các tiểu đơn
vị nh là nó đã diễn ra trong suốt quá trình dimer hoá nhân tạo RNase A [15].
Hoạt tính cytotoxin của dạng MxM cao hơn của dạng M=M vì nó tồn tại bền
vững trong môi trờng khử của bào tơng. Thay thế Cys-31 hay Cys-32 bằng Ser
không ảnh hởng đến hoạt tính enzyme, nhng làm giảm lợng của dạng MxM ở
trạng thái cân bằng và giảm hoạt tính cytotoxin [13].
Hiện nay, ngoài các RNase tự nhiên có hoạt tính chống ung th ngời ta
đã tạo ra nhiều dạng biến thể (variant) của RNase A và RNase tụy ngời mang
hoạt tính cytotoxin, kể cả ở dạng dimer [6, 15] và monomer [5, 9, 14].
1.3.3. Các chức năng sinh học khác

Ngoài những chức năng chính đã kể trên đây, RNase còn biểu hiện
nhiều hoạt tính khác đặc trng cho từng loại tế bào, từng loại mô trong các cơ
quan khác nhau của cơ thể:
- RNase 5 (Angiogenin) tham gia vào sự hình thành mao mạch -kích
thích sự phát triển mao mạch mới [24].
- BS-RNase gây ức chế miễn dịch [13].
- Một số RNase thể hiện độc tính chọn lọc: hoạt tính kháng khuẩn
(ECP, EDP), kháng giun, kháng côn trùng [24].
Bên cạnh các RNase, trong cơ thể ngời còn có một số protein biểu hiện
hoạt tính ribonucleolytic nh Lactoferrin, ABzyme
-Lactoferrin có trong sữa, huyết thanh và dịch ngoại tiết (mật, nớc
mắt), Mr = 80 kDa. Chức năng sinh lý chính của Lactoferrin trớc đây đợc cho
là vận chuyển sắt. Tuy nhiên, protein này còn có hoạt tính kháng khuẩn, kích
thích phân chia tế bào, tham gia điều hoà quá trình tạo nguyên bào tủy xơng
và có các tính chất kích thích miễn dịch. Protein này có 3 dạng iso khác nhau
là Lf-, Lf- và Lf-. Ngời ta đã chỉ ra rằng 2 trong 3 isoform của Lactoferrin
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
10
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
(Lf- và Lf-) không liên kết sắt, mà là các RNase đặc hiệu pyrimidine (tạo
các sản phẩm với đầu cuối 3'-phosphate và 5'-OH). pH tối u của phản ứng là
7,5
ữ
8,0, isoform thứ 3 (Lf-) liên kết sắt và không có hoạt tính RNase [24].
-Các kháng thể thuỷ phân ARN: cách đây không lâu các nhà khoa
học đã chỉ ra rằng, trong máu của các bệnh nhân mắc chứng lao ban đỏ và cả
nhiều loại bệnh tự miễn khác có mặt các kháng thể thuỷ phân ARN hay
ABzyme. Các ABzyme cũng đã phát hiện thấy có trong sữa ngời. Giả định
rằng, các kháng thể này là các antiidiotip thứ cấp (cấp II) bắt chớc trung tâm
hoạt động của RNase. Hoạt tính thuỷ phân ARN của kháng thể còn cha đợc

đặc trng kỹ với các cơ chất chuẩn, nhng đã rõ rằng trong các kháng thể này có
cả các protein giống và khác nhau, đã phát hiện đợc các hoạt tính tơng ứng với
tính đặc hiệu cuả RNase 1 (RNase tip tụy) trong các chế phẩm Ig. Ngoài ra
còn tìm thấy các tip hoạt tính RNase khác đợc kích thích (hoạt hoá) bởi ion
Mg
2+
[24].
Cho đến nay vẫn cha rõ về vai trò sinh lí của hoạt tính ribonucleolytic
của lactoferrin và ABzyme. Có thể giả định rằng các protein này cũng có một
vai trò nào đó trong phản ứng tự vệ của cơ thể. Giả định này rất phù hợp với
các dẫn liệu về việc phát hiện đợc nhiều protein có hoạt tính RNase với chức
năng tự vệ ở cả vi sinh vật và thực vật, nh các ribotoxin -sarcin từ nấm mốc
Aspergillus giganters, antigen Asp f1 của Aspergillus fumigatus góp phần đa
dạng hoá nguồn RNase tự nhiên tạo cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng
trong điều trị bệnh.
1.4. các Rnase thuộc siêu họ rnase a ở ngời
Nhiều công trình nghiên cứu về RNase tiến hành ở trên các nhóm sinh
vật từ dạng có cấu tạo đơn giản nh vi khuẩn đến các vi sinh vật bậc cao nh con
ngời đã cho thấy sự muôn hình muôn vẻ của các enzyme thuộc nhóm này.
Trong một cá thể có thể tồn tại nhiều dạng RNase khác nhau, ví dụ ở vi khuẩn
E.coli có tới 20 loại RNase [19], trong nọc rắn hổ mang ấn Độ chứa 2 dạng
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
11
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
RNase liên hợp phân li (phụ thuộc vào nồng độ NaCl) [17]. Các kết quả
nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam cho thấy tồn tại ít nhất 2 dạng RNase trong
nọc rắn hổ mang Việt Nam [3].
ở ngời, tới nay đã phát hiện đợc 9 enzyme khác nhau thuộc siêu họ
RNase. Chúng đợc đánh số từ 1 đến 9 để phân loại dựa trên sự khác biệt về
cấu trúc và chức năng sinh học. Các gen mã hoá cho các protein này liên kết

với nhau trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể số 14 [24]. Dới đây là những đặc
điểm chính của nhóm RNase ở ngời thuộc siêu họ RNase A.
1.4.1. RNase 1
RNase này có nhiều ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể ngời nhng
đợc biểu hiện ở mức cao trong tuyến tụy và trong các tế bào nội bì, từ đó nó đ-
ợc tiết vào tá tràng và huyết tơng của máu. Nó cũng đợc biểu hiện trong tinh
hoàn, buồng trứng, não, tuyến sữa, và các mô khác nhau và còn đợc tìm thấy
trong các dịch cơ thể khác nh sữa, nớc tiểu, nớc bọt và tinh dịch. RNase 1 là
một protein kiềm cấu tạo từ 128 gốc amino acid, trình tự amino acid tơng
đồng tới 70% so với RNase [24]. Ngoài chức năng chính là tiêu hoá -thuỷ
phân các ARN trong thức ăn và ARN của các vi khuẩn đờng ruột, RNase 1 đã
có thêm chức năng chống virus bắt nguồn từ các tính chất enzyme đặc biệt của
nó. Nhờ có khả năng liên kết, phân huỷ ds-ARN và phân huỷ ARN trong
thành phần phân tử lai ARN-ADN (hoạt tính hybridase) mà RNase 1 ngăn cản
đợc sự sao chép của HIV trong các tế bào bạch cầu nuôi cấy bằng thực
nghiệm.
1.4.2. RNase 2 (EDN eosinophil derived neurotoxin)
RNase 2 là một độc tố thần kinh có nguồn gốc từ các tế bào bạch cầu -
a acid nên còn đợc gọi là EDN. Đây là 1 trong 2 protein của tế bào lympho
với hoạt tính ribonucleolytic cần cho hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính
chống virus của bạch cầu a acid. Một số gốc amino acid nh: Gly-2, Lys-66,
Lys-7, Arg-10, Phe-120, Asp-14 bị thay đổi không bảo thủ đóng vai trò quan
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
12
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
trọng về chức năng, các gốc amino acid His-12, His-119, Lys-41 và nhiều gốc
khác đợc giữ lại tạo nên TTHĐ của phân tử protein [24].
1.4.3. RNase 3 (ECP eosinophil cationic protein)
RNase 3 là protein kiềm mang điện dơng của tế bào bạch cầu a acid,
điểm đẳng điện của protein này là pI = 10,8 và tơng đồng tới 70% với RNase

2. Ngoài hoạt tính chống virus ECP còn là RNase ngời đầu tiên có hoạt tính
kháng khuẩn, thể hiện các hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxin), kháng giun
(helmintotoxin) và độc với tế bào thần kinh (neurotoxin). Hoạt tính nuclease
của ECP thấp hơn nhiều so với RNase 2 nhng các đặc tính xúc tác bình thờng
thì gần nh không đổi so với RNase 2. Tuy vậy hoạt tính ribonucleolytic của
ECP lại không cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn [24].
1.4.4. RNase 4
RNase 4 có trình tự amino acid tơng đồng 43% với RNase 1, 31% với
RNase 2 và 30% với RNase 3. Enzyme này cũng tơng đồng với RNase gan bò
và gan lợn tới 90%, điều này chứng tỏ tính bảo thủ của RNase là rất lớn [24].
1.4.5. RNase 5 (Angiogenin)
Angiogenin có trọng lợng phân tử là 14 400 Da và giống RNase tới
65% về trình tự amino acid, 3 trong 4 cầu nối disunfide và các gốc amino acid
chức năng chủ yếu trong TTHĐ của RNase vẫn đợc bảo tồn ở Angiogenin. So
với RNase 1, 2 và 4 thì trình tự amino acid của Angiogenin tơng đồng lần lợt
là 35%, 27%, và 39%. RNase 5 có tính đặc hiệu yếu với cơ chất chuẩn của
RNase nhng bù lại, hoạt tính ribonucleolytic của Angiogenin lại rất quan
trọng trong việc hình thành các mạch máu mới. Các Angiogenin là một nhóm
các chất kháng khuẩn mới ở ngời.
1.4.6. RNase 6 (RNase K6)
RNase 6 tồn tại chủ yếu ở thận và một ít các cơ quan khác nh nhau
thai, tim, phổi. Gen mã hoá protein này dài 120 Kb và mARN tơng ứng có
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
13
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
trong các tế bào bạch cầu trung tính (neutrophyl) và các bạch cầu đơn nhân
máu ngoại vi. Trong các RNase ngời thì RNase 6 gần với 2 protein của tế bào
bạch cầu acid nhất.
1.4.7. RNase 7
RNase 7 là enzyme kiềm tính hoạt động mạnh (pI = 10,1) có Mr =14 546

Da, tham gia vào phòng thủ ở tuyến đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm của các
tác nhân gây bệnh từ bên ngoài vào cơ thể qua mô biểu bì. Nó đợc biểu hiện mạnh
trong các tế bào da, biểu mô của đờng hô hấp và đờng ruột. RNase này từ da có
hoạt tính kháng vi sinh vật rất hiệu nghiệm: Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Propionibacterium acnes và Candida albicans. RNase 7 cũng tham
gia vào hệ miễn dịch không đặc hiệu, bảo vệ đờng hô hấp [11].
1.4.8. RNase 8
RNase 8 gồm 154 amino acid với đoạn peptide tín hiệu dài 27 amino
acid; 8 gốc Cys; 1 gốc Lys và 2 gốc His nằm trong TTHĐ của enzyme. Phân
tử RNase có trình tự amino acid rất giống với RNase 7 (tơng đồng 78%) và
khác nhiều với RNase 5 nhất (tơng đồng 29%). Gen mã hoá cho RNase 8 liên
kết với 7 gen mã hoá cho 7 RNase còn lại trên NST số 14. Phân tử mARN mã
hoá enzyme này có kích thớc khoảng 1 Kb chỉ tìm thấy ở nhau thai ngời mà
không có ở một mô nào khác. Hoạt tính ribonucleolytic của RNase 8 thấp hơn
hoạt tính của các RNase 1 -3, 6 và 7 phát hiện trớc đó [26]. Chức năng sinh
học chính là bảo vệ thai nhi khỏi các tác nhân gây bệnh vi sinh vật.
1.4.9. RNase 9
RNase 9 là enzyme cuối cùng trong siêu họ RNase ở ngời đợc biết đến
cho tới nay. Tuy cha xác định đợc rõ chức năng sinh học nhng vì có phổ biểu
hiện rất rộng nên RNase 9 đợc cho là tham gia vào sự phòng thủ của cơ thể
chống lại các tác nhân gây bệnh.
1.5. các yếu tố ảnh hởng đến hoạt tính Rnase
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
14
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
Hoạt tính của RNase phụ thuộc vào nhiều yếu tố hoá lí nh: nhiệt độ, pH,
môi trờng, chất ức chế, chất hoạt hoá, các tác nhân biến tính Sự thay đổi hàm
lợng hay nồng độ các yếu tố trên dù rất nhỏ cũng gây ảnh hởng ít nhiều đến
hoạt tính chung của RNase trong tế bào.
1.5.1. Nhiệt độ

Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong phản ứng thuỷ phân ARN. Khi
nhiệt độ tăng, các nguyên tử của phân tử enzyme thu đợc một năng lợng lớn
hơn nên có xu hớng chuyển động nhanh hơn. Năng lợng mà chúng thu đợc có
thể đủ để thắng các tơng tác yếu vốn quyết định cấu trúc của các protein hình
cầu dẫn đến một sự biến đổi hình thể protein và do đó làm giảm hoạt tính của
enzyme. Nếu nhiệt độ cao quá enzyme sẽ bị biến tính, ít có khả năng phục hồi
hoạt độ. ở nhiệt độ thấp dới 0
0
C, hoạt độ enzyme tuy giảm nhng vẫn có thể
tăng lên khi đa về nhiệt độ bình thờng. Hầu hết các RNase có nhiệt độ thích
hợp khoảng 40-70
0
C. Ví dụ: RNase tụy có nhiệt độ tối u là 60
0
C; RNase tinh
khiết tách từ nọc rắn hổ mang Naja naja vùng Guntur ấn Độ hoạt động tốt ở
37-60
0
C với nhiệt độ tối u là 37
0
C [17]; một số enzyme rất bền với nhiệt nhng
hoạt tính không tăng tuyến tính với nhiệt độ nh RNase nọc rắn hổ mang đen
của Việt Nam: ở 25-49
0
C hoạt tính enzyme đợc tăng cờng, từ 59-90
0
C thì hoạt
tính enzyme giảm đáng kể và tới 100
0
C thì hoạt tính lại cao nhất [1, 2]. Một số

enzyme khác thì kém bền nhiệt, ví dụ: RNase trong nọc rắn hổ mang vùng
Trung á Liên Xô (Naja oxiana) bị mất 50% hoạt tính khi đun cách thuỷ 5
phút ở 50
0
C và mất hoàn toàn hoạt tính khi xử lý nh vậy ở 70
0
C [4, 23].
1.5.2. pH môi trờng
pH môi trờng có ảnh hởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hởng
đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme cũng nh độ bền của protein enzyme. Các
nghiên cứu trớc đây về RNase cho thấy hầu hết các enzyme này thể hiện hoạt
tính cao nhất ở vùng pH 6 đến pH 9, nhng pH thích hợp nhất cho RNase hoạt
động là từ 7 đến 8. Nếu pH quá cao hay quá thấp hoạt tính RNase đều bị giảm
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
15
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
hay biến mất. Ví dụ, RNase tụy bò có pH
opt
= 7,7; RNase nấm men rợu có
pH
opt
= 7,6 [7, 24].
1.5.3. Các chất kìm hãm (Inhibitor)
RNase có mặt trong mọi cơ thể sống kể cả ở ngời và đóng vai trò quan
trọng trong rất nhiều quá trình nền tảng của tế bào do đó hoạt tính của nó đợc
kiểm soát chặt chẽ bởi một hệ thống điều hoà tinh vi, đó là các chất kìm hãm
có bản chất protein do chính tế bào sản sinh ra. Các protein kìm hãm
ribonuclease (RI) có nhiều trong dịch bào của động vật có vú, phân bố ở nhiều
mô và giữ vai trò bảo vệ tế bào khỏi độc tính của các RNase.
RI có khối lợng phân tử khoảng 50 000 Da, chiếm 0,01-0,1% tổng số

protein trong bào tơng. Riêng ở nhau thai và não tỉ lệ này lớn hơn, tơng ứng là
0,1% và 0,08% [10, 20, 24].
Phân tử RI có ái lực mạnh với RNase, chúng tạo phức với nhiều thành
viên thuộc siêu họ RNase A theo tỉ lệ 1:1. Mỗi phân tử RI chứa từ 30-32 gốc
Cys dạng khử nên môi trờng khử nh dịch bào rất phù hợp để duy trì hoạt tính
RI. Việc oxy hoá một gốc Cys sẽ kéo theo sự oxy hoá các gốc còn lại. Khi bị
oxy hoá, RI mất khả năng liên kết với RNase và nhanh chóng bị thuỷ phân bởi
protease trong tế bào.
Tuy nhiên, khả năng bảo vệ tế bào của RI cũng bị hạn chế bởi một số
enzyme. Chẳng hạn, BS-RNase có cấu trúc bậc 4 dạng dimer có thể thoát khỏi
sự kiểm soát của RI nên độc với tế bào. Chỉ khi hai cầu nối disunfide bị khử,
dạng dimer này chuyển thành hai tiểu đơn vị BS-RNase monomer bị RI kìm
hãm nên mất hoàn toàn hoạt tính. Hầu hết các thành viên thuộc siêu họ RNase
A có cấu trúc monomer đều bị kìm hãm bởi RI có trong dịch bào, ngoại trừ
Onconase. Onconase nằm ngoài vùng kiểm soát của RI nhờ những đặc trng về
mặt cấu trúc với vòng ngoài của phân tử protein bị cắt ngắn, đa số các gốc của
phân tử RNase A tiếp xúc với RI đợc thay thế bởi các gốc không đồng dạng ở
Onconase. Do vậy, enzyme này có cơ hội biểu hiện hoạt tính cytotoxin.
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
16
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
Một số chất kìm hãm khác cũng có mặt trong tế bào nh các polimer
mang điện âm, một số chất ức chế lấy từ tế bào gan chuột, nhân tế bào sao
biển, trứng của loài Chaetopterusp, từ lá cây tử đinh hơng các ion kim loại
nhất là các ion kim loại hoá trị 2 cũng có khả năng ức chế RNase.
1.5.4. Các chất hoạt hoá
RNase muốn hoạt động tốt đợc thì sự có mặt của các chất hoạt hoá
(activator) là rất cần thiết. Các chất hoạt hoá giúp tăng cờng hoạt tính thuỷ
phân của RNase trong giới hạn nồng độ xác định và thờng có bản chất hoá
học khác nhau:

- Các ion kim loại, ví dụ Mg
2+
cần cho hoạt động của RNase P, Mg
2+
hoặc Mn
2+
cần cho hoạt động của RNase 1.
- Các hợp chất hữu cơ nh 5,6-dimethylbenzimidazole, benzynimidazole,
các chất tẩy rửa tích điện dơng cũng có khả năng làm tăng hoạt tính RNase.
- Các amino acid tự nhiên có trong cơ thể nh glycine, histidine cũng
hoạt hoá RNase.
Các chất trên hoạt hoá RNase theo những cơ chế khác nhau nhng cùng
thống nhất ở khả năng kết hợp trực tiếp với phân tử RNase, làm thay đổi cấu
trúc không gian của nó theo hớng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc giúp loại
trừ tiếp các yếu tố kìm hãm khỏi môi trờng phản ứng [24].
1.6. Khả năng ứng dụng của ribonuclease trong y học
RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong y học.
Ngoài chức năng tiêu hoá và tham gia vào các hoạt động sao mã, phiên mã,
sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng
chống virus, vi khuẩn, kháng giun
Các nghiên cứu y - sinh học cho thấy luôn tồn tại mối quan hệ giữa nồng
độ và cả hoạt tính của các RNase trong các dịch bào và dịch cơ thể với các
trạng thái bệnh lí của nhiều loại bệnh khác nhau: nồng độ enzyme tăng là kết
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
17
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
quả của phản ứng cơ thể chống lại bệnh tật. Đôi khi chính RNase lại là tác
nhân gây bệnh vì chúng gây độc cơ thể [24].
Ví dụ :
-Bệnh tăng bạch cầu tuỷ mãn tính, hội chứng mệt mỏi kinh niên đã

phát hiện thấy lợng RNase 1 tăng lên trong các tế bào máu ngoại vi.
-Nồng độ RNase huyết thanh tăng khi sử dụng prednison và khi đói,
giảm khi sử dụng steroid dị hoá. Vì vậy tăng lợng RNase trong máu có thể là
marker (dấu hiệu) về trạng thái dinh dỡng nghèo.
Những ứng dụng trực tiếp của RNase trong điều trị bệnh virus cho ngời
và vật nuôi đã đợc tiến hành ở Liên Xô vào những năm 70 của thế kỉ trớc [21].
Trong liệu pháp ngời ta có thể sử dụng các chất hoạt hoá (activator) hoặc các
chất ức chế (inhibitor) của RNase, thậm chí cả những RNase và dạng hợp thể
của RNase để trị bệnh [24]. ức chế hoạt tính RNase là cần thiết trong điều trị
dị ứng và các hội chứng ngộ độc thần kinh. Chất ức chế không chọn lọc
enzyme phosphodiesterase là teophilin hay chất ức chế chọn lọc rolipram có
tác dụng giải phóng các neurotoxin ECP, EDN từ các bạch cầu acid giúp giảm
hiệu ứng ngộ độc thần kinh. Chất ức chế RNase của ngời làm giảm hiệu ứng
gây dị ứng của các tác nhân gây dị ứng có hoạt tính RNase ở một số loại thực
vật.
Các activator của RNase có thể đợc sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng
virus. Hoạt hoá RNase L cần thiết để ức chế sinh sản của nhiều virus trong tế
bào. Các chất đồng đẳng phosphothoiat của 2,5-oligoadenylate (hoạt hoá
hiệu quả RNase L) ngăn chặn phát triển nhiễm trùng virus. Các inhibitor của
RNase L đang đợc thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng, các chế phẩm hoạt hoá
RNase L nh oragen và poli-I.poli-(C12U), bảo vệ tế bào khỏi nhiễm trùng
virus. Oragen ức chế quá trình nhân đôi ADN virus trong các đại thực bào
màng bụng in vitro và trong gan chuột nhiễm virus viêm gan chuột (MHV)-in
vivo. Sau liệu pháp bằng poly-I.poli-(C12U) thói quen nhận biết của bệnh
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
18
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
nhân với hội chứng mệt mỏi kinh niên đợc cải thiện tốt lên [24].
RNase cũng nh các hợp thể của chúng là các chế phẩm thuốc. Ví dụ: sử
dụng RNase tụy chữa viêm não do ve. Các RNase có hoạt tính cytotoxin nh

Onconase enzyme có hoạt tính thấp, nhng xâm nhập vào các tế bào ung th
rất hiệu quả và làm tổn thơng các rARN. Một số thông tin cho biết rằng:
RNase trong nớc tiểu của phụ nữ đang mang thai có hoạt tính chống ng th.
Các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các chế phẩm thuốc là hợp
phần của RNase có khả năng nhận biết các mạch nucleotide trải dài trong một
phạm vi và có tính đặc hiệu với một tip ARN nhất định. Các RNase tự chúng
có tính đặc hiệu rất thấp. Ngời ta còn sử dụng RNase H thuỷ phân ARN. Nhờ
tác động của enzyme này có thể hớng vào những trình tự nhất định nhờ các
oligonucleotide bổ trợ tơng ứng.
Những năm gần đây, ngoài việc tìm đợc một số RNase nguồn gốc tự
nhiên có nhiều đặc tính quí báu (nh Onconase, BS-RNase) các nhà khoa học
còn tập trung sản xuất ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống
ung th nhờ việc vận dụng thành công các kĩ thuật và phơng pháp CNSH hiện
đại ở mức độ phân tử. Dạng biến thể của RNase đợc tạo ra bằng cách thay thế
một hay vài gốc amino acid cần cho tơng tác protein-enzyme hoặc tạo thêm
liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự nhạy cảm với
chất ức chế hay các protease trong tế bào. Các biến thể của RNase cũng đợc
tạo ra bằng cách gắn đặc hiệu vào RNase những phân tử protein liên kết đặc
hiệu với những tế bào nhất định cho phép tạo ra những toxin chọn lọc hiệu
quả.
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
19
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
CHƯƠNG II
vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1. vật liệu và hoá chất
2.1.1. Vật liệu
-Các mô động vật mua ở chợ vào lúc sáng sớm khi còn tơi. Nội tạng
của lợn và chó mua ở Chợ 19/5, riêng nội tạng của dê phải đặt mua từ Đan Ph-
ợng - Hà Tây mang về Chợ Ngọc Hà. Sau đó, các mô này đợc mang về bảo

quản trong tủ lạnh.
-ARN nấm men mua của hãng Sigma.
2.1.2. Thiết bị và hoá chất
-Thiết bị: cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ, máy quang phổ,
máy chạy sắc kí, máy đo pH
-Hoá chất: CM cellulose, Glycine (Gly) của hãng Sigma, các hoá
chất khác nhau nh (NH
4
)
2
SO
4
, NaOH, HCl đều đạt độ sạch phân tích do
phòng Sinh hoá Thực vật Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam cung cấp.
2.2. các phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp xác định hoạt tính RNase
-Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bớc sóng 260 nm. Độ hấp phụ
(OD
260
) phụ thuộc vào nồng động của ARN. Khi có mặt, RNase sẽ thuỷ phân
ARN thành các oligonucleotide do đó mật độ quang học tăng lên. Dựa vào sự
thay đổi OD
260
ta đo đợc hoạt tính enzyme.
-Một đơn vị hoạt tính enzyme là lợng enzyme xúc tác thuỷ phân ARN
làm tăng OD sau 1 phút phản ứng là 1 đơn vị OD.
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
20
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

-Hoạt tính RNase đợc đo trực tiếp trên máy quang phổ UV -visable
Spectrophotometer UV -1601 của hãng Shimadzu và đợc tính theo công thức sau:
A = OD
30''
(+E) -OD
0''
(-E) . k -OD (E).
Trong đó:
+ OD
0''
(-E) là độ hấp phụ của (1000 -x) àl dung dịch cơ chất
(ARN) khi cha cho x àl dịch enzyme vào.
+ OD
30''
(+E) là độ hấp phụ của dịch hỗn hợp phản ứng tính từ thời
điểm sau 30'' kể từ khi có x àl dung dịch enzyme vào dung dịch cơ chất.
+ k là hệ số hiệu chỉnh: tại thời điểm 0'', giá trị OD
260
đã cho chỉ là
độ hấp phụ của (1000 -x) àl dung dịch cơ chất, giá trị thực của hỗn hợp phản
ứng tính tại thời điểm 0'' phải là độ hấp phụ của 1000 àl dung dịch cơ chất do
vậy k đợc xác định nh sau: đo OD
260
của (1000 -x) àl dung dịch cơ chất, kí
hiệu là OD
0''
S
. Sau đó thêm vào x àl dung dịch đệm pha cơ chất, giá trị đo đợc
kí hiệu là OD
0''

S+buf
, khi đó:
k = OD
0''

S+buf
/ OD
0"
S
Cuvet đối chứng đợc dùng để cân bằng là cuvet chứa (100 -x -y) àl
dung dịch đệm trong đó y là thể tích lợng dịch cơ chất cho vào thí nghiệm.
Hoạt tính riêng của enzyme (A
0
) đợc xác định bằng: số đơn vị hoạt
động của enzyme/mg protein [1]. Protein đợc xác định bằng phơng pháp
quang phổ [22].
2.2.2. Phơng pháp chiết rút enzyme
Mô động vật (20g hoặc 30g) đợc nghiền bằng máy xay sinh tố trong
100 ml hoặc 150 ml dung dịch H
2
SO
4
0,25N hay dung dịch đệm PBS 10mM
pH 7,2. Sau đó dịch nghiền đợc li tâm với tốc độ 11 000 vòng trong 15 phút ở
4
0
C để loại cặn và thu dịch li tâm, gọi là dịch chiết mô
Trờng hợp nghiền mô trong dung dịch acid, ký hiệu là: DCTL
a
,

Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
21
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
DCLL
a
, DCGLa, DCPL
a
,

DCLC
a
,

DCGC
a
,

DCPC
a
, DCGD
a
, DCPD
a
. Còn khi
nghiền mô trong dung dịch đệm PBS, ký hiệu là: DCTL
b
, DCLL
b
, DCGL
b

,
DCPL
b
,

DCLC
b
,

DCGC
b
,

DCPC
b
, DCGD
b
, DCPD
b
.
2.2.3. Tủa phân đoạn protein
Tủa phân đoạn protein bằng muối ammonium sulfate là một phơng
pháp rất phổ biến trong tách chiết tinh sạch để nghiên cứu tính chất của
protein, bởi vì khả năng kết tủa của một protein phụ thuộc nhiều vào hình
dạng và kích thớc phân tử của nó. Để tìm vùng nồng độ muối tối u để tủa
RNase từ một số nội tạng của lợn, chó và dê chúng tôi tiến hành phơng pháp
phân đoạn protein từ dịch chiết tủa ở các vùng nồng độ muối khác nhau trong
khoảng từ 0%-80% bão hoà.
Từ các dịch chiết (trong acid hay trong đệm PBS) đã tiến hành thu 4
phân đoạn protein tủa trong các khoảng nồng độ muối khác nhau đạt các mức

độ muối bão hoà khác nhau.
Với cả hai loại dịch chiết trong acid và trong đệm PBS đều thu 4 phân
đoạn protein tủa trong các vùng nồng độ muối tơng ứng là: 0-20%, 20-40%,
40-60%, 60-80% bão hoà.
2.2.4. Phơng pháp nghiên cứu ảnh hởng của nhiệt độ lên hoạt tính của
RNase
- Cơ sở: xử lí nhiệt là một phơng pháp biến tính chọn lọc qua đó loại
bỏ những protein tạp biến tính ở nhiệt độ cao và giữ lại các enzyme bền nhiệt
hơn bằng cách li tâm. Phơng pháp đợc sử dụng rộng rãi và tơng đối hiệu quả
để phân tách và làm sạch enzyme.
- Tiến hành: chuẩn bị 8 ống eppendorf chứa cùng một lợng thể tích
(150-300 àl) dịch enzyme. Đem xử lí nhiệt các mẫu trên bằng cách đun cách
thuỷ trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau: 25
0
C (t
0
phòng), 40
0
C,
50
0
C, 60
0
C, 70
0
C, 80
0
C, 90
0
C, 100

0
C. Sau đó các mẫu đợc làm lạnh ngay bằng
nớc đá đang tan rồi li tâm chế độ 11 000 vòng/phút trong 15 phút ở 4
0
C, thu
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
22
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
dịch li tâm và xác định hoạt tính.
2.2.5. Phơng pháp nghiên cứu ảnh hởng của pH dung dịch đệm lên hoạt
tính của RNase
pH dung dịch đệm ảnh hởng rõ rệt tới phản ứng thuỷ phân của enzyme
vì nó ảnh hởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme cũng nh độ bền của phân
tử protein - enzyme. Để tìm pH
opt
của các chế phẩm RNase, chúng tôi tiến
hành đo hoạt tính của enzyme theo phơng pháp đã mô tả ở trên trong hỗn hợp
đệm Gly, Citrate, Phosphate 10 mM có dải pH = 1 ữ 10.
2.2.6. Phơng pháp sắc kí trao đổi ion CM-Cellulose
-Cơ sở: phơng pháp sắc kí trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng t-
ơng tác tính điện ion -ion giữa protein-enzyme tan trong dung dịch đệm loãng
với nhựa trao đổi ion (chất mang). Phơng pháp này không chỉ là một khâu
quan trọng trong quá trình tách chiết mà còn giúp đánh giá đợc một vài tính
chất hoá lí của enzyme quan tâm.
-Tiến hành: trong điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng nhựa trao
đổi ion là Carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose). Chất mang này là cationit
(mang, tích điện âm).
Sắc kí trao đổi ion đợc tiến hành theo phơng pháp thủ công trên cột có
kích thớc 1,6x15 cm. Chất mang đợc cân bằng với dung dịch đệm citrate 10
mM, pH = 5,2 và sắc kí cũng đợc tiến hành trong đệm này.

Về bản chất quá trình chạy sắc kí trao đổi ion trên chất mang
CM-cellulose gồm các bớc chính nh sau:
+ Chuẩn bị mẫu enzyme lên cột: một lợng enzyme pH = 5,2 rồi li
tâm trong 10 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút ở 4
0
C, lấy phần dịch li tâm chứa
enzyme để cho lên cột.
+ Cân bằng cột sắc kí bằng dung dịch đệm trên rồi cho mẫu lên cột
và thu các phân đoạn trớc gradient nồng độ (tổng thể tích các phân đoạn này
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
23
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
tuỳ thuộc vào thể tích tự do của cột trao đổi ion và thờng bằng một thể tích cột
gel). Tiếp đó tiến hành chạy gradient nồng độ NaCl 0-1 M trong đệm citrate
10 mM, pH = 5,2 và thu mỗi phân đoạn 3 ml. Tốc độ dòng chảy qua cột duy
trì ở giá trị 1 ml/phút.
+ Sau gradient nồng độ có thể dùng 2 -3 thể tích NaCl 1,5 M trong
đệm citrate 10 mM, pH = 5,2 và thu tiếp các phân đoạn 3 ml. Cuối cùng tái
sinh cột bằng 3 thể tích NaCl 2 M trong đệm citrate 10 mM, pH = 5,2 và rửa
lại cột cũng bằng đệm trên.
Sau khi kết thúc sắc kí tiến hành xác định hoạt tính RNase (lấy 50 àl
mỗi phân đoạn để đo hoạt tính) và đo nồng độ protein trong tất cả các phân
đoạn thu đợc.
2.2.7. Phơng pháp xác định hàm lợng protein
Phơng pháp xác định hàm lợng protein cũng sử dụng máy đo quang
phổ (Do OD ở bớc sóng 280 nm). Tuỳ vào mục đích thí nghiệm, ta có thể sử
dụng các dung dịch đệm khác nhau.
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
24
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

Chơng III
kết quả và thảo luận
RNase từ nội tạng của động vật ở nớc ta cho đến nay vẫn cha đợc nghiên
cứu nhiều vì vậy trong giới hạn khóa luận này chúng tôi bớc đầu đã tiến hành
thu nhận dịch chiết mô và phân đoạn protein trong các dịch chiết nhận đợc,
sau đó xác định hoạt tính enzyme trong dịch chiết mô và trong các phân đoạn
protein từ mỗi loại dịch chiết khác nhau. Từ kết quả nhận đợc rút ra sự phân
bố hoạt tính enzyme và phân bố protein, trên cơ sở đó rút ra kết luận phân
đoạn nào có thể dùng làm nguồn enzyme. Và sau đó là nghiên cứu một số
tính chất hóa lí và xúc tác cơ bản (tính bền nhiệt, pH
opt
) của enzyme này và
nghiên cứu khả năng làm sạch RNase từ một số chế phẩm bằng phơng pháp
sắc kí trao đổi ion.
3.1. kết quả phân đoạn protein từ dịch chiết mô
3.1.1. Chiết rút RNase
Có nhiều loại môi trờng có thể chiết rút enzyme từ các nguồn RNase
khác nhau trong đó có cả RNase có trong nội tạng động vật. Môi trờng chiết
rút enzyme có thể là: các dung dịch đệm Tris-HCl có pH trong vùng trung tính
đêm Citrate, dung dich H
2
SO
4
, các dung dịch saccaroza đẳng trơng, u trơng
hay nhợc trơng. Tuỳ từng mục đích mà sử dụng môi trờng chiết rút thích hợp
[22].
Trong phạm vi của khoá luận này chúng tôi sử dụng dung dịch H
2
SO
4

0,25 N và đệm PBS 10 mM, pH = 7,2 để chiết rút RNase từ các mô khác nhau.
Dung dịch H
2
SO
4
0,25 N có tác dụng vô hiệu hoá các enzyme thuỷ phân có
trong lizosom (bào quan giàu enzyme trong các tế bào động vật). Theo nhiều
tài liệu thì dung dịch axit này đã đợc nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để
nghiền mô của động vật nhằm tách nhiều enzyme trong đó có RNase [1, 22].
Dung dịch đệm PBS 10 mM có pH và thành phần ion (chứa K
+
, Na
+
) gần
giống với điều kiệntrong tế bào.
Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01
25