Khảo sát lên men, thu nhận, tinh chế và dung hợp Granulocyte Colony Stimulati factor (G-CSF) tái tổ hợp từ E. coli với Polyethylenglycol (PEG)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN











NGUYỄN QUANG HUY









KHẢO SÁT LÊN MEN, THU NHẬN, TINH CHẾ
VÀ DUNG HỢP GRANULOCYTE COLONY STIMULATI
FACTOR (G-CSF) TÁI TỔ HỢP TỪ E. COLI VỚI
POLYETHYLENGLYCOL (PEG)

Chuyên ngành: VI SINH

Mã số: 60 42 40





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO





Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2012


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS Trần Linh
Thước, người thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn thành
luận văn này.

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Đặng Thị Phương Thảo, người cô đã trực
tiếp hướng dẫn khoa học, dạy bảo, giúp đỡ, quan tâm và động viên tinh thần
những lúc em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn GS. Kaeko Kamei, Viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản,
đã luôn tạo mọi điều kiện để em có thể nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn
Thạc sĩ một cách tốt nhất.


Em xin chân thành cảm ơn chị Tú Anh, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ em những lúc
em gặp khó khăn trong công việc cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian
em học tập ở Nhật.

Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn và các em phòng thí nghiệm CNSH
Phân tử và Môi trường, phòng thí nghiệm Lên Men đã gợi mở và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian làm việc và nghiên cứu.

Với lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo đã dạy
dỗ và truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học Đại học và sau Đại học.

Và trên hết, con xin cảm ơn bố mẹ đã nuôi con khôn lớn, cho con nghị lực để
vượt qua khó khăn. Cảm ơn các anh chị luôn yêu thương giúp đỡ em. Gia đình

luôn là điểm tựa vững chắc cho con.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 09 năm 2012

Nguyễn Quang Huy


MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH iii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE
COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF)
3
1.1. Giới thiệu chung 3

1.2. Cấu trúc và hình thái 3

1.3. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động 5

1.3.1. Nguồn gốc 5

1.3.2. Cơ chế hoạt động 6

1.3.2.1. Sự tương tác của G-CSF với thụ thể 6

1.3.2.2. Con đường tín hiệu có liên quan 8

1.4. Hoạt tính sinh học 9

2. PHƯƠNG PHÁP CHỮA BỆNH NEUTROPENIA BẰNG G-CSF 11

2.1. Bệnh Neutropenia 11

2.2. Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF 12

2.3. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 14

3. SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA.COLI 16

3.1. G-CSF dạng thể vùi điển hình 16

3.2. G-CSF dạng thể vùi non-classical (thể vùi không điển hình) 18

4. SẢN XUẤT THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH 22

4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành thể vùi không điển hình

G-CSF 22

4.2. Đánh giá thể vùi không điển hình 24

4.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) 24

4.2.2. Đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi gây biến tính nhẹ 25

4.2.3. Xác định đặc tính của thể vùi bằng kính hiển vi điện tử 25

4.2.4. Xác định xứ thay đổi thể tích thể vùi trong các điều kiện pH 26

5. DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF 27

5.1. Dung hợp protein 27

5.2. Tinh chế protein 31

5.2.1. Sắc ký trao đổi ion 31

5.2.2. Sắc ký lọc gel 34

5.2.3. Đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế 35

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

1. VẬT LIỆU 36

1.1. Thiết bị - dụng cụ 36

1.2. Hóa chất 37

1.2.1. Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh 37

1.2.2. Hóa chất dùng để phá tế bào 37

1.2.3. Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE 38

1.2.4. Hóa chất dùng trong điện di NATIVE-PAGE 39

1.2.5. Hóa chất nhuộm bạc 39

1.2.6. Hóa chất lai Western 39

1.2.7. Hóa chất dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford 40

1.2.8. Hóa chất tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion 40

1.2.9. Hóa chất thử nghiệm hoạt tính G-CSF 40

1.2.10.Hóa chất dùng trong sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC)
40

1.2.11.Hóa chất dùng trong dung hợp protein 40

1.2.12.Hóa chất dùng trong phân tích phổ khối (mass spectrometry) 41

1.3. Môi trường 41

1.4. Nguyên vật liệu 42

1.4.1. Chủng vi sinh vật 42