nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (zea mays l.) phục vụ chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC











NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG TÁI SINH
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN





LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC









NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG TÁI SINH
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH






THÁI NGUYÊN - 2014


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

i
LỜI CAM ĐOAN
học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả
trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận
văn này.
Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Vũ Thanh Thanh, khoa Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học
- Đại học Thái Nguyên là ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xi
-
.
-
thu .
,
nghiên cứu.
, ngày 13 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn


Ngô



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
1
2
2
4. Ý nghĩa khoa học 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Sơ lƣợc về cây ngô 3
3
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây ngô 6
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 7
10
1.2.1. Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới 10
1.2.2. Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam 14
1.3.Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi trƣờng
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô 14
1.3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng 14
của thành phần môi trƣờng 17
1.3.3. in vitro 19
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
21
2.2. Hóa chất và thiết bị 21


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

iv
2.3. Phạm vi nghiên cứu 22
2.4. Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu 22
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 22
2.5.1. Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 23
2.5.2. Tạo mô sẹo từ phôi và thân non 24
2.5.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 26
2.5.4. Nghiên cứu điều kiện đƣa cây in vitro ra ngoài môi trƣờng 26
2.6. Xử lý số liệu 27
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 28
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tuổi phôi đến khả năng tái sinh cây
trực tiếp từ phôi non 28
30
non 35
non 36
2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 38
-proline đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 41
3
đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 44
2,4-D

48
3.4. Nghiên cứu
phôi non 51
kiện đƣa cây in vitro ra ngoài môi trƣờng 54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
I. Kết luận 55
II. Đề nghị 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 63


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
STT
Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
1
BAP
6 – benzylaminopurine
2
đtg

3
IAA
Indole-3-acetic acid
4
IBA
Indole-3-butyric acid
5
MS
Murashige & Skoog, 1962
6
NAA
1 - naphthaleneacetic acid
7
Nxb

8
N6
Chu et al., 1975
9
2,4-D
2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn
2009 - 2011 7
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012 9
21
28
Bảng 3.2.
cây từ phôi
32
34
LVN 25, LVL 61, LVN 66, LVN 99, 36
hƣởng của 2,4-D
39
Bảng 3.6 -
43
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của AgNO

3

45


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

vii
-
48
51

in vitro sau 54


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

5
3.1. ở ổi phôi đế từ phôi
non 885
29
3.2. ở đế
từ phôi non
LVN 885 32
35
3.4. ở
885

37
của 2,4-D
40
3.6. Mô 885
- 41
-
44
3.8. Ảnh hƣởng của AgNO
3

46


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ix
25,
LVN 61, LVN 66, LVN 99, LVN 885
AgNO
3
46
-
25, LVN 61,
49
3.11. 99, LVN 885
- 50
52
o phôi
53
1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU
1.
Cây ngô (Zea mays L.) là cây lƣơng thực giàu dinh dƣỡng có vai trò
quan trọng trong nền kinh tế t .
- -
hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Cây ngô đƣợc gieo
. Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngô
diện tích 177,38 triệu ha, [56
.
Những năm gần đây, nhờ việc sử dụng phƣơng pháp chuyển gen đã tạo
ra nhiều giống ngô mới có giá trị dinh dƣỡng cao [38], [53]; có khả năng
chống chịu với các điều kiện môi trƣờng hạn,
, …
. Thực tế
nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy in vitro gô
. Mặt khác, nguồn vật
liệu , quá trình tái sinh ngô thƣờng chỉ đƣợc
thực hiện thông qua sự tái sinh phôi hoặc mô sẹo [41]. Trong đó, mô sẹo đƣợc
hình thành từ phôi non hay từ lát cắt của thân cây non.
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu
môi trường tái sinh của một số giống ngô (Zea mays L.) phục vụ chuyển gen”.
2.
Xác định đƣợc các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ

mô sẹo của 5 giống ngô.
3.
- Xác định thành phần môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để tái sinh cây trực
tiếp từ phôi non của 5 giống ngô.
- Xác định thành phần môi trƣờng phù hợp để tạo mô sẹo từ phôi non
và thân non của 5 giống ngô.
- Xác định môi trƣờng phù hợp để tái sinh cây từ mô sẹo hình thành từ
phôi non của 5 giống ngô.
- in vitro .
4. Ý nghĩa khoa học
-
.

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về cây ngô


Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Hòa
thảo (Poaceae), bộ Hòa thảo (Poales
[55].
Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc cây ngô dựa trên những
kết quả nghiên cứu khảo cổ học, di truy
.
[7], [56]. Ở Việt Nam,
cây ngô có nguồn gốc từ Trung Quốc, đƣợc trồng vào khoảng thế kỷ XVII, do

(theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn).

năm 1920, Sturtevantel đi
(c ) sau đây [6]:
1- Ssp amilaceae - ngô bột
2- Ssp indentata - ngô răng ngựa
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3- Ssp indurate - ngô đá rắn
4- Ssp everta - ngô nổ
5- Ssp saccharata - ngô đƣờng
6- Ssp ceratina -
7- Ssp tunicate -
Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô còn
đƣợc phân loại theo nông học, sinh thái học, thời gian sinh trƣởng và thƣơng
phẩm [10].

-
phận sau: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt.

: rễ
mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ mầm (rễ tạm thời, rễ hạt) mọc từ trụ lá
mầm, chức năng chính của rễ này là hút nƣớc, thức ăn khi cây còn non
-
dƣới lên trên. Rễ đốt giúp cây hút nƣớc và dinh dƣỡng. Rễ chân kiềng (rễ
chống) mọc quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây
chống đổ, bám chặt vào đất, tham gia hút nƣớc và thức ăn cho cây. Thân
cây đặc và khá chắc, chia nhiều lóng (dóng) to dần từ dƣới lên, nằm giữa

các đốt và kết thúc bằng bông cờ.
5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và đối xứng xen kẽ nhau, hình dải 50 - 100
cm, rộng 5 - 10 cm. Căn cứ vào vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngô đƣợc chia
thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi.
 Hoa ngô
; hoa cái mọc sát nhau, đƣợc bao bằng lá bắc to, vòi nhụy dài,
quả dĩnh, hạt xếp thành hàng, các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông đƣợc
bao bọc trong một số lớp lá và đƣợc bao chặt vào thân [2], [10].


Hạt ngô gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân
hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron nằm dƣới vỏ
hạt và bao lấy nội nhũ
. Phôi ngô
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

chiếm 1/3 thể tích của hạt, gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội
nhũ và phôi), lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [12].
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây ngô
Ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàn
cầu, ngô đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa gạo. Nhƣng ngô lại giàu dinh dƣỡng
hơn lúa mì và lúa gạo, góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới,
đặc biệt các nƣớc thuộc châu Mỹ La Tinh.

đƣợc ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọn
giống, công nghệ sinh học, cơ giới hóa, điện khí hóa và tin học vào công tác
nghiên cứu và sản xuất [12].
. Với tỷ -
nguyên liệu cho công nghiệp. gƣời ta đã sản xuất
khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực
phẩm, công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ
ngô xu
. Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức
ăn tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho gia
súc, đặc biệt là bò sữa -
-
tỷ
tỷ lệ này rất cao nhƣ Mỹ 76%, Bồ Đào Nha 91%,
Malaysia 91% (CIMMYT, 2001).
, cần khoảng 4 triệu
tấn ngô mỗi năm. Riên 2,33
[57]
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ilin, Streptomicin,
sản xuất axit acetic.
nhƣ aceton, nhựa hóa học. Phôi ngô chứa 17,2 - 56,8% lipid nên có thể
dùng để ép dầu [2].
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
1.1.3.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Ngô là cây trồng có địa bàn phân bố rộng, đƣợc gieo trồng khắp trên
thế giới với sản lƣợng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lƣơng thực nào. Năm

1961, năng suất ngô trung bình trên thế giới chỉ đạt 20 tạ/ha thì đến năm
2011 đã l 51,84 tạ/ha, tăng gấp 1,5 lần. Ngô đƣợc trồng ở hầu hết các nơi
trên thế giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi và Châu Á. Do điều
kiện khí hậu, thổ nhƣỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lƣợng và
năng suất ngô ở các khu vực có sự chênh lệch nhau, điều đó đƣợc thể hiện ở
bảng 1.1 [54].
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2009 - 2011
Khu vực
Diện tích (triệu ha)
Năng suất (tạ/ha)
Sản lƣợng (triệu tấn)
2009
2010
2011
2009
2010
2011
2009
2010
2011
Châu Âu
13,8
14,1
16,45
60,7
60,6
65,99
84,0
85,6

108,5
Châu Á
53,5
53,7
54,81
43,8
45,8
49,41
234,5
246,1
270,9
Châu Mỹ
61,4
63,1
64,5
71,9
71,0
67,96
441,5
447,9
438,4
Thế giới
158,8
161,9
170,39
51,6
52,1
51,84
819,7
844,4

883,4
(Nguồn FAOSTAT, 2012)
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Qua bảng 1.1 cho thấy, châu Mỹ
. Châu Mỹ chiếm 37,85% diện tích và 49,65%
sản lƣợng. thứ hai là châu Á với diện tích trồng ngô chiếm 32,2% diện
tích trồng ngô thế giới nhƣng năng suất thấp chỉ đạt 49,41 tạ/ha (năm 2011)
và xếp ở vị trí thứ ba. Châu Âu có năng suất khá cao nhƣng diện tích trồng
ngô rất thấp, chiếm chƣa đến 10% diện tích trồng ngô thế giới, do đó sản
lƣợng chỉ đạt 12,28% tổng sản lƣợng thế giới. Trong những năm gần đây,
diện tích trồng ngô ở châu Á và châu Âu đang mở rộng,
cho sản lƣợng ngô của châu Âu tăng vọt thêm 26,8% chỉ trong 1 năm (2010 -
2011). Ngƣợc lại, ở Châu Mỹ diện tích trồng ngô tăng nhƣng năng suất và sản
lƣợng giảm.
Những năm gần đây áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên
tiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên năng suất và sản
lƣợng ngô thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các nƣớc có nền kinh tế phát
triển thâm canh và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất.
Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống ngô chuyển
gen năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh cũng góp phần
sản lƣợng ngô thế giới.
1.1.3.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Ngô đƣợc đƣa vào nƣớc ta cách đây khoảng 300 năm và trở thành cây
lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây
thêm tiến bộ kỹ thuật, đặc biệt là về giống, cây ngô đã có những bƣớc tăng
trƣởng đáng kể về diện tích, sản lƣợng và năng suất.
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Năng suất
(tạ/ha)
1975
0,267
0,28
10,51
1990
0,432
0,67
15,54
2000
0,730
2,01
27,47
2006
1,033
3,85
37,31
2007
1,096
4,30

39,26
2008
1,440
4,57
31,75
2009
1,089
4,37
40,14
2010
1,126
4,61
40,90
2011
1,121
4,84
43,13
2012
1,118
4,80
42,95
(Nguồn: FAOSTAT 2013 [55])
. Năm 1975,
diện tích ngô chƣa đến 300 nghìn ha, năng suất 10,51 tạ/ha.
Nếu nhƣ năm 1990, năng
(3,85 triệu tấn).
trồng ngô lai, kết hợp áp dụ
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

lai và đang ở giai đoạn đầu đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, nuôi cấy
bao phấn và noãn) [2], [12].
Bên cạnh những thuận lợi và thành tựu đã đạt đƣợc, ngành
. Sản lƣợng ngô
trong nƣớc không đủ phục vụ cho con ngƣời và phát triển ngành chăn nuôi.
Hàng năm, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lƣợng lớn ngô để chế biến thức ăn
gia súc. Vì vậy, việc nghiên cứu tạo giống ngô có năng suất cao, khả năng
chống chịu tốt, đồng thời đáp ứng yêu cầu chất lƣợng là nhiệm vụ rất quan
trọng và cấp thiết đối với các cơ quan nghiên cứu, chọn tạo giống.

1.2.1. Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới
Nuôi cấy in vitro cây ngô đƣợc bắt đầu từ rất sớm vào những năm
1930, khi Lampe và Mills nuôi cấy nội nhũ và phôi non trong môi trƣờng có
bổ sung dịch chiết khoai tây nhƣng mô chỉ sinh trƣởng có giới hạn [48]. Larue
(1949) đầu tiên nuôi cấy liên tục trong một thời
gian dài phôi non và phôi ngô trƣởng thành để xác định nhu cầu dinh dƣỡng
cho sinh trƣởng và phát triển.
Tái sinh cây từ phôi non hoặc bộ phận khác của những loài ngũ cốc lần
đầu tiên đƣợc miêu tả trong những năm 1960 đến 1980 [49]. Phôi non đƣợc
sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ngô. Lu
sử dụng phôi có kích thƣớc 1 - 1,5 mm thu đƣợc sau 2 tuần thụ phấn cấy
vào môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 0,25 - 2,0 mg/l và sucrose 3 - 12% [37].
Năm 1975, Green và Phillips
ngô [32].
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ai loại mô sẹo của phôi : mô sẹo loại I có đặc

điểm cứng, đặc, nhỏ, màu trắng - vàng và có thể sản sinh ra các loại mô khác
giống nhƣ phôi soma. mô sẹo thƣờng tăng trƣởng chậm hoặc khó
nuôi cấy trong thời gian dài. Mô sẹo loại II đƣợc quan sát trong 1 số loại ngô
có các đặc điểm đặc trƣng là mô sẹo
. Chúng có tỷ lệ phôi hóa cao,
, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh cây trực tiếp từ phôi cao
hơn tỷ lệ tái sinh thông qua mô sẹo [20].
Giai đoạn đầu của quá trình tái sinh phôi ngô là giai đoạn phôi soma
trƣởng thành nảy mầm đƣợc cảm ứng bởi nồng độ sucrose cao (60 g/l) trong
điều kiện không có ánh sáng và không có chất điều hòa sinh trƣởng. Giai
đoạn thứ hai của quá trình tái sinh in vitro cây ngô là giai đoạn phát triển chồi
và rễ, đƣợc cảm ứng tốt khi giảm nồng độ đƣờng sucrose [28].
Năm 1989, Vain đánh giá ảnh hƣởng của ethylene trong nuôi cấy in
vitro, sử dụng AgNO
3
nhƣ chất ức chế hoạt động của ethylene. tỷ lệ
tạo dạng II ( xốp, vàng, cho tỷ lệ tái sinh cao) đƣợc nâng cao
khi phôi non đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS chứa AgNO
3
từ 5 đến 20
mg/l. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng tái sinh của trong môi
trƣờng có AgNO
3
tăng cao hơn [47].
Năm 2004, Zhang nghiên cứu 15 dòng ngô Tangsipingtou thuần bằng
nuôi cấy in vitro để đánh giá ảnh hƣởng của kiểu gen, môi trƣờng, chất kích
thích sinh trƣởng và phƣơng pháp tạo mô sẹo có nguồn gốc từ phôi non và tái
sinh cây. cho thấy cả 15 dòng có thể tạo , sự già hóa của
khả năng tái sinh cây giảm đến một mức độ nhất định [52].
Shohael (2003) nghiên cứu 3 dòng ngô CML-161; CML-323;

CML-327. Phôi non đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng N6, tỷ lệ tạo 56,33
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

- 72,0%. Kết quả cho thấy môi trƣờng đạt tỷ lệ cao nhất (72,0%) là
môi trƣờng N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, hydrolysate casein 200 mg/l và
2,4-D 1,0 mg/l [42].
Năm 2004, Huang và Wei
7 dòng ngô
-
-
tƣơng đối cao
(19,8 - 32,4%), đặc biệt dòng Mo17 đạt 25,6% [34].
Binott (2005) nuôi cấy phôi non từ 12 dòng ngô bố mẹ thuần chủng và
con lai tƣơng ứng của chúng để đánh giá khả năng tạo , phôi hóa và tái
sinh cây. Hạt non thu ở các giai đoạn 10, 15, 18, 21 và 24 ngày tuổi sau khi
thụ phấn và đƣợc khử trùng bề mặt. Phôi non đem cấy trên môi trƣờng tạo
bao gồm N6 bổ sung 2,4-D 0 - 2 mg/l, L-proline 2,87 g/l, hydrolysate
casein 0,1 g/l, glycine 2 g/l, sucrose 30 g/l và gelrite 3 g/l. nồng độ 2 mg/l
hình thành từ 80 đến 90% đối với phôi non của con lai và từ 50 đến
80% đối với phôi non của dòng bố mẹ. Khả năng phôi hóa đƣợc tiến hành ở 6
dòng thuần và 4 dòng lai. chỉ 4 dòng thuần và 3 dòng lai
tái sinh [34].
Năm 2011, Gorji nghiên cứu dòng ngô thuần khả năng tạo mô
sẹo và tái sinh cây. Kết quả trong môi trƣờng N6 tần số tạo cao nhất
khi bổ sung dicamba 2 mg/l, trong môi trƣờng MS có bổ sung 2,4-D ở nồng
độ 1 mg/l. Môi trƣờng N6 bổ sung dicamba thúc đẩy quá trình tạo cao
13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

hơn so với môi trƣờng N6 bổ sung 2,4-D. Tỷ lệ hình thành rễ cao nhất khi đƣa
chồi vào môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l NAA. Trên môi trƣờng MS có bổ
sung BAP 1 mg/l và IAA 0,5 mg/l thúc đẩy tần số hình thành chồi cao, tỷ lệ
tái sinh cây đạt từ 53 - 67% [31].
Nguyên liệu đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy tái sinh ngô
phục vụ mục đích chuyển gen là phôi chƣa trƣởng thành [27], [28], [35], [50].
Tuy nhiên, việc tạo phôi chƣa trƣởng thành là một quá trình khắt khe, cần thời
gian để trồng cây, thụ phấn, tách các phôi chƣa trƣởng thành. Cây mẹ trồng
theo mùa và mẫu cấy đƣợc thu vào một khoảng thời gian nhất định mới cho
kết quả tái sinh tốt [29], [31]. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các nguyên liệu
khác dễ dàng thu nhận hơn là một trong những thách thức lớn để có thể tiến
hành chuyển gen nhanh và hiệu quả hơn [24].
Trong tái sinh ngô, các thân non chƣa trƣởng thành lần đầu tiên đƣợc
sử dụng bởi Songstad [46]. Trên môi trƣờng N6 trung bình bổ sung 2,4-D, L-
proline và AgNO
3
từ nguyên liệu thân non hình thành mô sẹo loại II trên các
dòng mô hình nhƣ A188 và B73. Ƣu điểm của việc sử dụng các thân non
chƣa trƣởng thành là có thể nuôi cấy trong vòng 6 - 7 tuần, không cần đợi đến
giai đoạn sinh sản, thụ phấn, thụ tinh, phôi phát triển. Đây là nguyên liệu lí
tƣởng nhất vì mẫu cấy không cần thông qua quá trình giảm phâm và thụ tinh,
giảm đƣợc sự biến đổi di truyền.
3 mg/l

-
-
-
0 - 3% [44].

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.2.2. Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam
ngô, đó là: “nghiên cứu môi
trƣờng nuôi cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen ở ngô
(Zea mays [11].
Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trƣờng N6 bổ sung 2,4-D 7 mg/l; casein 100
mg/l; L-prolin 2,88 mg/l; sucrose 40 g/l; agar 8 g/l cho tạo cao
nhất. 25 - 27 ngày đối với vụ đông,
phôi 18 - 20 ngày đối với vụ hè.
dòng
2 dòng
ngô HR8 và HR9 đạt lần lƣợt là 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9%
và 21,4% [14].
Nguyễn Văn Đồng (2009), tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ
phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngô
ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năn

[4].
1.3. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi
trƣờng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô
1.3.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng