ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
Phần 1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI
1.1. Chất thải nguy hại
1.2. Quản lý chất thải nguy hại tại Việt Nam
1.3. Xử lý sinh học chất thải nguy hại
Phần 2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌ CHẤT THẢI
NGUY HẠI
2.1. Vi sinh vật và kỹ thuật phân tử ứng dụng trong sử lý sinh học chất thải nguy hại
2.2. Tiềm năng sử dụng các phương pháp sinh thái học vi sinh vật mức độ phân tử để
xử lý sinh học chất thải nguy hại
Phần 3 KẾT LUẬN
TAI LIỆU THAM KHẢO
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học có thể được định nghĩa là “ứng dụng nguyên lý kỹ thuật và
khoa học trong việc xử lý các vật liệu bằng tác nhân sinh học để cung cấp sản phẩm
và phục vụ”. (Cator,2000). Trong lịch sử, công nghệ sinh học đầu tiên sử dụng nấm
men để lên men bia, rượu, váuwr dụng vi khuẩn để tạo sữa chua. Năm 1972, là năm
sinh ra công nghệ DNA tái tổ hợp đã đưa công nghệ sinh học tới một tầm cao mới và
hình thành một nền công nghiệp mới. sự tiến bộ trong công nghệ sinh học đã thực sự
được ghi nhận. Trong vòng 4 năm khám phá ra kỹ thuật DNA tái tổ họp, các vi sinh
vật chuyển gen (GMOs) đã tạo ra insulin nguời, interferon, và hocmon sinh trưởng
người. Ngày nay, công nghệ DNA tái tổ hợp và các sản phẩm của nó như GMOs được
ứng dụng rông rãi trong công nghệ sinh học môi truờng (Glick và Pasternark,1988;
Cowan,2000). Xử lý sinh học chất thải nguy hại là một trong những lĩnh vực phát
triển mạnh nhất trong công nghệ sinh học môi trường. Sử dụng xử lý sinh học chất
thải nguy hại để làm sạch môi trường rất được phổ biến nhờ chi phí thấp và được con
người chấp nhận. Thực sự, xử lý sinh học chất thải nguy hại đạt hiệu quả cao, nhanh
hơn nữa khi được hỗ trợ bởi kỹ thuật phân tử vốn đã được phát triển trong nhiều lĩnh
vực khác nhau trong công nghệ sinh học. Những năm 1990 là thập kỷ cho sinh thái vi
sinh vật phân tử phát triển. Việc áp dụng kỹ thuật phân tử giúp các nhà khoa học nhận

ra rằng cộng đồng vi sinh vật trong môi trường tụ nhiên có thể phục vụ tốt hơn nhiều
các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Sử dụng các phương pháp sinh thái học phân
tử, như tách chiết DNA trực tiếp từ mẫu môi trường, điên di gel gradient biến tính
(DGGE), phương pháp PCR, phương pháp lai phân tử, chúng ta có thể nghiên cứu
quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy chất thải trong môi trường. Những phương
pháp này hứa hẹn sự hiểu biết điều khiển tốt hơn các quá trình công nghệ sinh học
môi trường, nhờ đó cho phép việc xử lý sinh học môi trường bị ô nhiễm và các chất
thải độc hiệu quả và ít tốn kém hơn.

Phần 1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI
1.1. Chất thải nguy hại
1.1.1.Định nghĩa
- Theo UNEP
Chất thải độc hại là những chất thải (không kể chất thải phóng xạ) có hoạt tính
hóa học, hoặc có tính độc hại, cháy nổ, ăn mòn gây nguy hiểm hoặc có thể gây nguy
hiểm đến sức khỏe hoặc môi trường khi hình thành hoặc tiếp xúc với các chất thải
khác.
Chất thải không bao gồm trong định nghĩa trên:
+ Chất thải phóng xạ được xem là chất thải độc hại nhưng không bao gồm trong
định nghĩa này bởi vì hầu hết các quốc gia quản lý và kiểm soát chất phóng xạ
theo qui ước, điều khoản, qui định riêng.
+ Chất thải rắn sinh hoạt có thể gây ô nhiễm môi trường do chứa một ít chất thải
nguy hại tuy nhiên nó được quản lý theo hệ thống chất thải riêng. Ở một số
quốc gia đã sử dụng thu gom tách riêng chất thải nguy hại trong rác sinh hoạt.
- Theo Luật bảo vệ môi trường
CTNH là chất thải chứa yếu tố độc hại, phóng xạ, dễ cháy, dễ nổ, dễ ăn mòn,
dễ lây nhiễm, gây ngộ độc hoặc đặc tính nguy hại khác (khoản 11, điều 3, chương 1
Luật Bảo Vệ Môi Trường).
QLCTNH gồm các hoạt động liên quan đến việc phòng ngừa, giảm thiểu, phân
loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ, xử lý (kể cả tái chế, thu hồi), tiêu huỷ CTNH

(khoản 1, điều 2, chương 1 Thông Tư 12/2006/TT-BTNMT).
1.1.2.Đặc tính của chất thải nguy hại
- Chất có khả năng gây cháy: chất có nhiệt độ bắt cháy <60
0
C, chất có thể cháy
do ma sát, tự thay đổi về hóa học. Những chất gây cháy thường gặp là xăng,
dầu, nhiên liệu, ngoài ra còn có cadmium, các hợp chất hữu cơ nhu benzen,
etybenzen, toluen, hợp chất hữu cơ có chứa clo…
- Chất có hoạt tính hóa học cao: Các chất dễ dàng chuyển hóa hóa học; phản ứng
mãnh liệt khi tiếp xúc với nước; tạo hỗn hợp nổ hay có tiềm năng gây nổ với
nước; sinh các khí độc khi trộn với nước; các hợp chất xyanua hay sunfit sinh
khí độc khi tiếp xúc với môi trường axit, dể nổ hay tạo phản ứng nổ khi có áp
suất và gia nhiệt, dễ nổ hay tiêu hủy hay phản ứng ở điều kiện chuẩn; các chất
nổ bị cấm.
- Chất có tính ăn mòn: Là những chất trong nước tạo môi trường pH < 3 hay pH
> 12,5; chất có thể ăn mòn thép. Dạng thường gặp là những chất có tính axit
hoặc bazo…
- Chất có tính độc hại: Những chất thải mà bản thân nó có tính độc đặc thù được
xác định qua các bước kiểm tra. Chất thải được phân tích thành phần trong các
pha hơi, rắn và lỏng. Khi có thành phần hóa học nào lớn hơn tiêu chuẩn cho
phép thì chất thải đó được xếp vào loại chất thải nguy hại. Chất độc hại gồm:
Các kim loại nặng như thủy ngân, cadmium, asenic, chì và các muối của chúng;
dung môi hữu cơ như toluen, benzen, axeton, cloroform…; Các chất có hoạt
tính sinh học (thuốc sát trùng, trừ sâu, hóa chất nông nghiệp…); Các chất hữu
cơ rất bền trong điều kiện tự nhiên nếu tích lũy trong mô mỡ đến một nồng độ
nhất định thì sẽ gây bệnh (PCBs: Poly Chlorinated Biphenyls).
- Chất có khả năng gây ung thư và đột biến gen: Dioxin (PCDD), Asen,
cadmium, benzen, các hợp chất hữu cơ chứa clo…
1.1.3.Nguồn gốc phát sinh chất thải nguy hại
Theo khoảng 2, Quyết định số 23/2006/QĐ-BTNMT, ngày 26/12/2006, Chất

thải nguy hại phát sinh từ 19 nhóm:
1) Chất thải từ ngành thăm dò, khai thác, chế biến khoáng sản, dầu khí và than.
2) Chất thải từ ngành sản xuất hoá chất vô cơ.
3) Chất thải từ ngành sản xuất hoá chất hữu cơ.
4) Chất thải từ ngành nhiệt điện và các quá trình nhiệt khác.
5) Chất thải từ ngành luyện kim.
6) Chất thải từ ngành sản xuất vật liệu xây dựng và thuỷ tinh.
7) Chất thải từ quá trình xử lý, che phủ bề mặt, tạo hình kim loại và các vật liệu
khác.
8) Chất thải từ quá trình sản xuất, điều chế, cung ứng, sử dụng các sản phẩm che
phủ (sơn, véc ni, men thuỷ tinh), chất kết dính, chất bịt kín và mực in.
9) Chất thải từ ngành chế biến gỗ, sản xuất các sản phẩm gỗ, giấy và bột giấy.
10)Chất thải từ ngành chế biến da, lông và dệt nhuộm.
11) Chất thải xây dựng và phá dỡ (kể cả đất đào từ các khu vực bị ô nhiễm).
12) Chất thải từ các cơ sở tái chế, xử lý, tiêu huỷ chất thải, xử lý nước cấp sinh
hoạt và công nghiệp.
13) Chất thải từ ngành y tế và thú y (trừ chất thải sinh hoạt từ ngành này).
14) Chất thải từ ngành nông nghiệp, lâm nghiệp và thuỷ sản.
15) Thiết bị, phương tiện giao thông vận tải đã hết hạn sử dụng và chất thải từ
hoạt động phá dỡ, bảo dưỡng thiết bị, phương tiện giao thông vận tải.
16) Chất thải hộ gia đình và chất thải sinh hoạt từ các nguồn khác.
17) Dầu thải, chất thải từ nhiên liệu lỏng, chất thải dung môi hữu cơ, môi chất
lạnh và chất đẩy (propellant).
18) Các loại chất thải bao bì, chất hấp thụ, giẻ lau, vật liệu lọc và vải bảo vệ.
19) Các loại chất thải khác.
1.1.4.Phân loại
Trên thực tế, có nhiều hệ thống phân loại chất thải nguy hại. Hệ thống phân
loại theo tiêu chuẩn Việt Nam phân loại theo các đặc tính của chất thải, TCVN
6706:2009 chia CTNH thành 7 nhóm sau:
Bảng 1: Hệ thống phân loại CTNH theo TCVN 6706:2009

TT
Mã số
BASEL
Nhóm loại Mô tả tính chất nguy hại
1
1.1
1.2
1.3
1.4
H 3
H 4.1
H 4.2
H 4.3
Chất thải dễ bắt lửa, dễ cháy (C)
Chất thải lỏng dễ cháy
Chất thải dễ cháy
Chất thải có thể tự cháy
Chất thải tạo ra khí dễ cháy
Chất thải lỏng có nhiệt độ bắt cháy dưới
60
o
C
Chất thải không là chất lỏng, dễ bốc cháy
khi bị ma sát trong điều kiện vận chuyển,
khi bị ẩm, bị ướt thì xảy ra tự phản ứng và
bốc cháy, cháy ở nhiệt độ và áp suất khí
quyển.
Chất thải có khả năng tự bốc cháy do tự
nóng lên trong điều kiện vận chuyển bình
thường, hoặc tự nóng lên do tiếp xúc với

không khí và có khả năng bốc cháy.
Chất thải khi gặp nước, tạo ra phản ứng
giải phóng khí dễ cháy hoặc khí tự cháy.
2
2.1
2.2
H 8 Chất thải gây ăn mòn (AM)
Chất thải có tính axit
Chất thải có tính ăn mòn
Chất thải (bằng phản ứng hóa học) gây ra
sự ăn mòn khi tiếp xúc với vật dụng, bình
chứa, hàng hóa hoặc mô sống của động
vật, thực vật.
Chất thải lỏng có pH bằng hoặc nhỏ hơn 2.
Chất thải thể lỏng có thể ăn mòn thép với
tốc độ lớn hơn 6,35 mm/năm ở nhiệt độ
55oC.
3 H 1 Chất thải dễ nổ (N) Là chất rắn hoặc lỏng hoặc hỗn hợp rắn –
lỏng tự phản ứng hóa học tạo ra nhiều khí,
nhiệt độ và áp suất có thể gây nổ.
4 Chất thải dễ bị ô xi hóa (OH)
4.1
4.2
H 5.1
H 5.2
Chất thải chứa các tác nhân oxy
hóa vô cơ
Chất thải chứa peoxyt hữu cơ
Chất thải có chứa clorat, pecmanganat,
peoxyt vô cơ, nitrat và các chất oxy hóa

khác khi tiếp xúc với không khí, tích lũy
oxy thì kích thích cháy các chất hoặc vật
liệu khác.
Chất thải hữu cơ có cấu trúc phân tử - O –
O - không bền với nhiệt độ nên có thể bị
phân hủy và tạo nhiệt nhanh.
5
5.1
5.2
5.3
H 6.1
H 11
H 10
Chất thải gây độc cho người và
sinh vật (Đ)
Chất thải gây độc tính cấp
Chất thải gây độc chậm hoặc
mãn tính
Chất thải sinh ra khí độc
Chất thải có chứa chất độc có thể gây tử
vong hoặc tổn thương trầm trọng khi tiếp
xúc qua đường tiêu hóa, hô hấp hoặc qua
da với liều nhỏ.
Chất thải có chứa các chất gây ảnh hưởng
độc chậm hoặc mãn tính, hoặc gây ung thư
do tiếp xúc qua đường tiêu hóa, hô hấp
hoặc qua da.
Chất thải chứa chác thành phần mà khi tiếp
xúc với không khí hoặc tiếp xúc với nước
thì giải phóng ra khí độc đối với người

hoặc sinh vật.
6 H 12 Chất thải độc hại cho hệ sinh
thái (ĐS)
Chất thải chứa các thành phần mà có thể
gây ra tác động có hại nhanh hoặc từ từ đối
với môi trường thông qua tích lũy sinh học
và/hoặc gây ảnh hưởng đến các hệ sinh
vật.
7 H 6.2 Chất thải lây nhiễm bệnh (LN) Chất thải có chứa các vi sinh vật sống hoặc
độc tố của chúng, được biết hoặc nghi ngờ
là có các mầm bệnh có thể gây bệnh có
người và cho gia súc.
1.1.5.Ảnh hưởng của chất thải nguy hại
Tác động của một vài chất thải nguy hại đến môi trường:
 Khí SO
2
+ SO
2
là chất khí không màu, có mùi hăng và cay khi nồng độ trong khí
quyển là 1ppm. Sunfurơ là một trong những nguồn ô nhiễm chính trong khí
quyển và gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người, độ bền vật liệu và là nhân
tố chính gây nên mưa axit theo cơ cấu sau:
SO
2
+ H
2
O > H
2
SO
3

H
2
SO
3
> H
+
+ HSO
3
-
> 2H
+
+ SO
3
2-
SO
3
2-
+ H
2
O > H
2
SO
4
+ Hơi axit gặp lạnh sẽ ngưng tụ thành sương mù axit, chúng tồn tại lơ lửng
trong không khí hoặc hấp thụ thêm hơi nước tạo thành những giọt axit
loãng H
2
O - H
2
SO

4
và đó là nguyên nhân gây nên những cơn mưa axit.
+ SO2 tương đối nặng nên thường ở gần mặt đất, ngang với tầm sinh hoạt của
con người. Sunfurơ có khả năng hoà tan trong nước cao hơn các khí gây ô
nhiễm khác, nên dễ phản ứng với các cơ quan hô hấp của người và động
vật. Khi hàm lượng thấp SO
2
làm sưng niêm mạc, khi hàm lượng cao (>0,5
mg/m
3
) SO
2
gây tức thở, ho, viêm loét đường hô hấp.
+ Khi có mặt đồng thời SO
2
và SO
3
, chỉ cần nồng độ thấp chúng cũng sẽ có
tác động hợp lực, phản ứng sinh lý phát sinh mạnh hơn so với phản ứng của
từng chất riêng biệt, thậm chí gây co thắt phế quản mạnh và ở nồng độ cao
có thể dẫn đến nguy hiểm chết người.
 Các hợp chất chứa Halogen
+ Khi hít phải Cl, nó sẽ đi vào phế quản, phế nang. Clo sẽ tiếp xúc với các
chất nhày ướt ở mô sống của cơ thể, tạo ra HClO vượt qua màng tế bào và
phá hủy các tế bào, Cl tạo nên dẫn suất nitơ clo hóa.
+ Các hợp chất khí chứa halogen chỉ cần ở nồng độ rất nhỏ cũng đã gây độc,
nhiễm độc nặng và có khả năng gây ô nhiễm trên phạm vi rộng lớn.
+ HF gây bệnh sụn xương, viêm phế quản, tổn thương răng. HF hạn chế độ
sinh trưởng của cây, làm rụng quả, lép quả.
+ HCl làm giảm độ bóng mỡ của lá, gây thương tổn cho cây trồng, tổn thương

vật nuôi và làm giảm lượng sữa.
 Các hợp chất hữu cơ
+ Các hợp chất hữu cơ thường rất độc với cơ thể người và vật. Một số hợp
chất hữu cơ như Bezen và PAH (hợp chất cacbuahydro thơm đa nhân) có
thể là nguyên nhân gây bệnh ung thư.
+ Một số chất hữu cơ halogen là xúc tác cho quá trình phân hủy ozon ở tầng
bình lưu. Một số chất hữu cơ hoạt tính khác, lại xúc tiến cho quá trình phân
hóa vật chất và đặc biệt một số chất hữu cơ gây ô nhiễm do mùi như các
mecaptan và alđêhyt. Mùi này gây cảm giác khó chịu và đôi khi còn kèm
theo cả nhiễm độc và là nguyên nhân gây bệnh cho người.
+ Dioxin và furan là những chất rất độc. Ở hàm lượng thấp cũng gây các bệnh
về da, phụ nữ có thai khi tiếp xúc với với các chất này sẽ sinh con thiếu
tháng hoặc quái thai. Nhiễm độc nặng sẽ gây nên các bệnh về gan, máu, kể
cả ung thư và dẫn đến tử vong. Động vật bị nhiễm Dioxin và Furan sẽ giảm
trọng lượng tới 50% và sẽ chết trong vòng 2 – 3 tuần.
 Kim loại nặng
+ Kim loại nặng là khái niệm để chỉ các kim loại có nguyên tử lượng cao,
thường có độc tính đối với sự sống, và thường có liên quan đến vấn đề ô
nhiễm môi trường. Nguồn gốc phát thải của kim loại nặng có thể là tự nhiên
(như asen-As), hoặc từ hoạt động của con người, chủ yếu là từ công nghiệp
(các chất thải công nghiệp) và từ nông nghiệp, hàng hải (tràn dầu)…
+ Việc sử dụng nhiều loại chế phẩm trong công nông nghiệp làm nước và đất
ở nhiều vùng, nhất là trong cặn lắng của các dòng sông, bị nhiễm kim loại
nặng ở mức độ rất cao.
+ Có một số hợp chất kim loại nặng thụ động và đọng lại trong đất, song có
một số hợp chất có thể hoà tan dưới tác động của nhiều yếu tố khác nhau,
nhất là do độ chua của đất, của nước mưa. Điều này tạo điều kiện để các
kim loại nặng có thể phát tán rộng vào nguồn nước ngầm, nước mặt và gây
ô nhiễm đất.
+ Một số chất tẩy rửa gia dụng có chứa các tác nhân tạo phức mạnh (như

EDTA, NTA) khi thải ra đã góp phần làm tăng khả năng phát tán của kim
loại nặng.
+ Các kim loại nặng có mặt trong nước, đất qua nhiều giai đoạn khác nhau
trước sau cũng đi vào chuỗi thức ăn của con người. Chẳng hạn các vi sinh
vật có thể chuyển thuỷ ngân (Hg) thành hợp chất metyl thủy ngân
(CH
3
)
2
Hg, sau đó qua động vật phù du, tôm, cá mà thuỷ ngân đi vào thức
ăn của con người. Sự kiện ngộ độc hàng loạt ở Vịnh Manimata (Nhật Bản)
năm 1953 là một minh chứng rất rõ về quá trình nhiễm thủy ngân từ công
nghiệp vào thức ăn của con người.
+ Khi đã nhiễm vào cơ thể, kim loại nặng có thể tích tụ lại trong các mô.
Đồng thời với quá trình đó cơ thể lại đào thải dần kim loại nặng. Nhưng các
nghiên cứu cho thấy tốc độ tích tụ kim loại nặng thường nhanh hơn tốc độ
đào thải rất nhiều. Thời gian để đào thải được một nửa lượng kim loại nặng
khỏi cơ thể được xác định bằng khái niệm chu kỳ bán thải sinh học, ví dụ
với thuỷ ngân chu kỳ này vào khoảng 80 ngày, với cadimi là hơn 10 năm.
Điều này cho thấy cadimi tồn tại rất lâu trong cơ thể nếu bị nhiễm phải.
Bảng 2: Tác hại của một số kim loại nặng
Độc tố kim loại
nặng
Mức độ nguy
hại
Triệu chứng/Hậu quả lâu dài
Arsenide – Asen
(III)
XXXXX
Arsenide – Asen

(V)
X
Lead – Pb – Chì XXX
Trẻ em: Chậm phát triển thể chất, trí tuệ và tinh
thần
Người lớn: Gây hại thận và tim mạch
Cadmium – Cd –
Cadmi
XXX
Ngắn hạn: Tiêu chảy, tổn thương gan
Dài hạn: Gây bệnh thận, tim mạch, gan
Nickel – Ni –
Niken
XX Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan
Nickel – Ni –
Niken
XX Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan
Selenium – Se XX
Rụng tóc, móng tay chân, ngón tay, ngón chân
và vấn đề tim mạch
Antimony – Sb XX
Tăng Cholesterol trong máu và giảm đường
huyết
Barium – Ba –
Bari
XX Tăng huyết áp
Cyanide (free) –
Syanua
XX Nguy hại hệ thần kinh
Chromium –

Cr(VI) – Crôm
XX Gây dị ứng, mẩn ngứa
Manganese – Mn
– Mangan
X
Chuyển màu nước từ nâu – đen gây cặn đen và
vị tanh
Iron – Fe – Sắt X Màu cam đỏ trong nước, có váng sắt, vị tanh
Floride – F – Flo X Gây xỉn răng, ố vàng
Copper – Cu –
Đồng
X Vị tanh, váng màu xanh
Hg – Thủy ngân X Gây xỉn da, chấm nâu trong lòng trắng mắt
Aliuminium – Al
– Nhôm
X Nước đổi màu
Zinc – Zn – Kẽm X Vị tanh
Sự kiện bị ngộ độc cadimi trên thế giới là sự kiện cũng xảy ra ở Nhật Bản với bệnh
Itai - Itai nổi tiếng có liên quan đến ô nhiễm nguồn nước bởi cadimi.
Cadimi dễ dàng tạo ra các tương tác với protein và chuyển vào gan, thận. Thuỷ
ngân và chì lại dễ đi vào hệ thần kinh do tạo thành các hợp chất alkyl ái lipit. Các
kim loại nặng như chì, cadimi có thể tập trung trong xương, ức chế emzym axit 5-
amino-levulin và gây bệnh thiếu máu. Cadimi có khả năng đuổi kẽm khỏi một số
emzym và gây bệnh máu heamatopoiesis, v.v…
1.2. Quản lý chất thải nguy hại tại Việt Nam
Nước ta đang trong quá trình chuyển đổi từ nền kinh tế kế hoạch tập trung
sang nền kinh tế thị trường. Với mục tiêu phấn đấu đến năm 2020, về cơ bản Việt
Nam sẽ trở thành một nước công nghiệp hóa và tất yếu là sự đô thị hóa ở các thành
phố lớn. Theo dự báo, đến năm 2020 tỷ lệ đô thị hóa của nước ta sẽ đạt 45% tương
ứng với quy mô dân số đô thị năm 2020 là khoảng 46 triệu người. Với quy mô đô thị

hóa của nước ta, gia tăng dân số và công nghiệp hóa như trên thì lượng chất thải nói
chung và chất thải nguy hại nói riêng sẽ tăng lên nhanh chóng. Việc xử lý chất thải
nguy hại này sẽ là một áp lực rất lớn với công tác bảo vệ môi trường ở nước ta hiện
nay và trong tương lai.
Theo số liệu điều tra của Cục Môi trướng, riêng tổng lượng chất thải rắn nguy
hại (CTRNH) phát sinh hàng năm chủ yếu tại 3 khu vực kinh tế trọng điểm chính là
Hà Nội, Hải Phòng, Quảng Ninh ở phía Bắc, thành phố Hồ Chí minh, Đồng Nai, Bà
Rịa - Vũng Tàu ở phía Nam và Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi ở miền Trung.
Trong đó, CTRNH phát sinh ở khu vực kinh tế trọng điểm phía Nam khoảng 80.332
tấn/ năm, lớn gấp 3 lần khu vực phía Bắc và lớn gấp 20 lần lượng phát sinh ở khu vực
miền Trung.
Theo Thống kê của Cục Môi trường, tổng lượng CTRNH phát sinh hàng năm
trên toàn quốc là 152.000 tấn, bao gồm chất thải của các ngành công nghiệp nhẹ
(60.000 tấn), hóa chất (45.000 tấn), cơ khí luyện kim (26.000 tấn), y tế (10.000 tấn),
chất thải sinh hoạt đô thị (5.000 tấn) và chất thải chế biến thực phẩm, điện - điện tử có
số lượng ít nhất trong số các ngành trên (2.000 tấn) nhưng lại chứa các chất hữu cơ
khó phân hủy như PCB và kim loại nặng, đó là các chất đặc biệt nguy hại tới sức khỏe
con người và môi trường.
Bên cạnh các chất thải của các ngành trên còn có chất thải từ thuốc bảo vệ thực
vật (BVTV) tồn lưu. Theo số liệu của Cục Môi trường và các sở công nghiệp địa
phương, chỉ trong 2 năm 2000 - 2001 , tổng lượng thuốc BVTV tổn lưu trên phạm vi
61 tỉnh/ thành phố là khoảng 300 tấn, trong đó thuốc BVTV dạng lỏng là 9.7.374 lít
thuốc BVTV dạng bột là 109.145 kg; các bao bì chứa thuốc BVTV 2.137.850 (bao
gồm cả hộp, chai và lọ).
Lượng chất thải rắn y tế phát sinh trên phạm vi toàn quốc theo ước tính của Bộ
Y tế năm 2001 là khoảng 12.500 tấn/ năm. Theo số liệu điều tra của Bộ Y tế cho thấy,
hiện nay có khoảng 61 lò đốt chất thải y tế được lắp đặt trên toàn quốc, trong đó có 41
lò đã đăng ký thẩm định và có 20/41 lò đạt đủ các yêu cầu về mặt kỹ thuật. Tính đến
tháng 6 năm 2002, tổng công suất xử lý của các lò là 30 tấn/ ngày. Tuy nhiên, tại
nhiều cơ sở y tế, CTRNH vẫn còn bị để lẫn với các chất thải khác tại khu vực chôn lấp

và được chôn lấp tại các bãi rác sinh hoạt.
CTRNH sẽ phát sinh ngày càng tăng trên phạm vi toàn quốc đến năm 2020,
phụ thuộc vào các yếu tố như; dân số đô thị, trình độ văn minh, phong tục tập quán
cũng như thói quen sinh hoạt và tiêu dùng của từng vùng, nhịp độ phát triển kinh tế và
GDP bình quân đẩu người.
Lượng CTR đô thị và khu công nghiệp ở nước ta sẽ tăng ở mức tối thiểu là 0,9
kg/ người/ngày, cho tới năm 2010 và chỉ số này sẽ là 1,3 kg/ người/ ngày tới năm
2020.
Số lượng CTRNH phát sinh ở Việt Nam được các chuyên gia xác định là chưa
nhiều nên mức độ ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người và môi trường chưa lớn.
Tuy nhiên, trong tương lai, với sự gia tăng dân số và nhu cầu tiêu dùng cùng nhịp độ
phát triển kinh tế lớn, số lượng CTRNH ở Việt Nam ước tính sẽ tăng lên gấp 5 lần, đạt
846.000 tấn vào năm 2010 và đạt 1.548.000 tấn vào năm 2020 (số liệu dự báo của Bộ
Xây dựng).
Nếu không được quản lý tốt, lượng CTRNH này sẽ tác động đến con người,
môi trường và trở thành một gánh nặng kinh tế lớn.
Theo một số chuyên gia môi trường, do thiếu đầu tư ngân sách của các cấp
chính quyền và các bộ, ngành trong quản lý chất thải, hiện nay, ngoại trừ Hà Nội, Hải
Phòng, thành phố Hồ Chí Minh và Đà Nẵng, các tỉnh thành phố còn lại đều chưa có
các bãi chôn lấp chất thải đảm bảo vệ sinh môi trường. Trong khi đó, cả nước chưa có
tỉnh, thành phố nào có đủ khả năng xử lý toàn bộ CTRNH phát sinh trên địa bàn.
Thực tiễn công tác quản lý CTRNH trong nước và quốc tế cho thấy, các nước
muốn tiến hành công nghiệp hóa đều phải đầu tư xây dựng các trung tâm xử lý tập
trung các CTRNH. Các cơ sở phát sinh CTRNH sẽ chuyển CTRNH của mình đến các
trung tâm này để xử lý và phải trả chi phí cho việc xử lý. Việt Nam cũng đi theo
hướng này để xử lý CTRNH phát sinh trong quá trình phát triển kinh tế - xã hôi. Tuy
nhiên cho đến nay, chúng ta vẫn chưa xây dựng được các khu xử lý tập trung các
CTRNH . Đã có những dự án bắt đầu được triển khai, Đồng Nai đang là tỉnh đi tiên
phong về vẩn đề này. Trong khi chờ đợi có các khu xử lý tập trung CTRNH, hầu hết
các cơ sở sản xuất kinh doanh phát sinh CTRNH đều phải tạm thời tồn trữ CTRNH.

Và đây chỉ là một biện pháp tình thế. Vì vậy việc xây dựng các khu xử lý tập trung
các CTRNH đã và đang trở thành một trong những vấn đề rất cấp bách của công tác
quản lý chất thải.
Theo ông Phạm Khôi Nguyên – Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường, việc
xử lý CTRNH có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp như: xử lý cơ học, xử lý hóa
lý, xử lý nhiệt, chôn lấp Hiện nay một số nước như Na Uy, Thụy Điển, Nhật Bản,
Hàn Quốc , ngoài việc áp dụng các phương pháp trên đã nghiên cứu áp dụng phương
pháp thiêu đốt chất thải bằng lò nung clinke. Qua khảo sát của Cục Môi trường và Dự
án VCEP cùng một số cơ quan liên quan , đây là một phương pháp có một số ưu điểm
về mặt kinh tế và kỹ thuật. Phương pháp này đã tận dụng được nhiệt độ rất cao và thời
gian lưu cháy dài của lò nung clinke để phá vỡ các cấu trúc bền vững của CTRNH.
Hầu hết các loại chất thải hữu cơ dạng rắn và lỏng, kể cả các chất thải có chứa PCB
đều có thể thiêu đốt trong lò nung clinke. Tuy nhiên các chất thải này cần phải qua
cung đoạn chế thành nhiên liệu, chất phụ gia đạt các tiêu chí nhất định trước khi đưa
vào lò nung clinke. Việc thiêu đốt CTRNH trong lò cklinke có thể áp dụng cho rất
nhiều loại chất thải nguy hại như: các dung môi hữu cơ, dầu thải chứa PCB, sơn, keo,
dán vecni, plastic kể cả PVC, lốp cao su Quá trình cháy trong lò clinke sẽ phá hủy
cấu trúc của các chất nguy hại, tro xỉ còn lại tham gia vào cấu trúc thành phần xi măng
mà không gây ảnh hưởng tới thành phần của xi măng.
Ngoài ra, còn có các phương pháp xử lý CTRNH như trung hòa để xử lý chất
thải có tính axit hay kiềm ; xử lý nước thải để loại bỏ các chất vô cơ kim loại, xyanua,
sunfit trong nước thải và cả các chất hữu cơ; xử lý chất thải nguy hại lỏng/rắn bằng
cách rửa đất, chiết dung môi, lọc, hỏa luyện kim, thủy luyện kim, chưng cất. Hoặc
phương pháp cố định hóa: ổn định hóa/ hóa rắn. Quy trình này áp dụng cho CTRNH
chứa kim loại nặng hay kim loại trong chất thải phải được gắn với một chất nền không
rò rỉ. Người ta cũng có thể dùng công nghệ xứ lý sinh học: dùng vi sinh vật gây xúc
tác phản ứng hóa học định trước để chuyển hóa chất nguy hại, độc hại sang dạng đỡ
nguy hiểm hơn.
Chi phí cho xử lý chất thải nguy hại tùy thuộc vào thành phần, nồng độ chất
thải, phương pháp, công nghệ và thiết bị xử lý. Vì vậy, đối với từng loại CTNH khác

nhau , chi phí xử lý cũng rất khác nhau. Theo số liệu của Công ty Sam sung Hàn
Quốc, chi phí trung bình cho xử lý CTNH tại công ty này khoảng 80 - 90 USD/ tấn.
Tại Việt Nam, Cục Môi trường đang phối hợp với một số cơ quan liên quan tổ chức
xử lý thí điểm thuốc BVTV, chi phí xử lý dự tính là khoảng 50 triệu đồng/ tấn bằng
phương pháp xử lý đốt; từ 30 - 35 triệu đồng/ tấn bằng phương pháp hóa sinh.
Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường khẳng định hướng xử lý CTNH tập
trung bằng cách quy hoạch các trung tâm xử lý CTRNH tại các đô thị và khu công
nghiệp. Chính phủ đã dự kiến ưu tiên xây dựng hai trung tâm xử lý CTRNH tại hai
khu vực kinh tế trọng điểm phía Bắc và phía Nam. Tuy nhiên, sau 3 năm thực hiện
chiến lược này, khu vực miền Trung do được đầu tư nhiều dự án phát triển kinh tế nên
khả năng phát sinh CTRNH gia tăng và vì vậy cần thiết phải xây thêm một trung tâm
xử lý CTRNH tại khu vực này.
1.3. Xử lý sinh học chất thải nguy hại
Chất thải nguy hại được xử lý bằng các phương pháp như: phương pháp hóa học
và vật lý; phương pháp nhiệt; phương pháp chôn lấp trong đó có phương pháp xử lý
sinh học. Chất thải nguy hại được xử lý bằng phương pháp sinh học ở điều kiện hiếu
khí và yếm khí như chất thải thông thường. Tuy nhiên, bổ sung các chủng loại vi sinh
phải thích hợp và điều kiện tiến hành được kiểm soát chặt chẽ hơn.
- Quá trình hiếu khí: quá trình xử lý sinh học hiếu khí là quá trình hoạt động của
vi sinh vật chuyển chất hữu cơ thành các hợp chất vô cơ (quá trình khoáng hoá)
trong điều kiện có oxy. Sản phẩm của quá trình là CO
2
, H
2
O.
- Quá trình yếm khí: quá trình xử lý sinh học yếm khí là quá trình khoáng hoá,
nhờ vi sinh vật ở điều kiện không có oxy. Công nghệ xử lý sinh học yếm khí
tạo thành sản phẩm khí sinh học CH
4
chiếm phần lớn, CO

2
và H
2
, N
2
, H
2
S,
NH
3
.
Thông thường biện pháp sinh học ít và khó áp dụng để xử lý chất thải nguy hại do
tác động độc hại của độc thất đến cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, ở hàm lượng và loại
thuốc BVTV nhất định, có thể sử dụng vi sinh để xử lý.
Xử lý thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học là quá trình dùng vi sinh
vật để khử các chất thải độc hại nhờ các quá trình phân huỷ do sinh vật thực hiện, biến
đổi các chất ô nhiễm thành các sản phẩm ít độc hại như: CO2, H2O và một số chất
khác. Tuy nhiên, hiệu suất, tốc độ phân huỷ chất ô nhiễm thường thấp, thời gian xử lý
kéo dài. Để tăng tốc độ xử lý các chất ô nhiễm, người ta đã tối ưu hoá các điều kiện
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như: độ ẩm, nhiệt độ, pH, nồng độ oxy, và
một số cơ chất cần thiết
Điều kiện môi trường tối ưu cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tất, tạo điều
kiện cho quá trình tiêu huỷ thuốc bảo vệ thực vật trong đất đạt hiệu quả cao là:
- pH của môi trường ủ vi sinh giới hạn trong khoảng 4 - 10; các vi khuẩn nấm mốc ưa
môi trường axit.
- Dinh dưỡng trong đất ủ đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và
phát triển của sinh vật, hàm lượng Nhỏ đạt từ 100 - 1000 mg/kg đất thì gây cản trở
phát triển của vi sinh. Ngược lại hàm lượng Nào từ 0 - 110 mg/kg lại thúc đẩy quá
trình phân huỷ của vi sinh.
- Nồng độ thuốc bảo vệ thực vật nhiễm trong đất cũng phải nằm trong giới hạn cho

phép.
- Yếu tố độ ẩm trong đất ủ: khi độ ẩm đạt toàn phần thì tốc độ phân huỷ thuốc bảo vệ
thực vật là cao nhất.
- Độ thoáng khí: việc bổ sung ôxy trong quá trình phân huỷ vi sinh thuốc bảo vệ
thực vật có ảnh hưởng nhất định đến hiệu suất quá trình, điều này đặc biệt rõ rệt khi
xử lý phân huỷ thuốc bảo vệ thực vật loại lân hữu cơ. Ngoài ra cần chú . đến các chất
độc sinh học trong đất không được vượt quá giới hạn cho phép làm cản trở quá trình
vận động của sinh vật.
Bảng 3: Tóm tắt thuận lợi và khó khăn của xử lý sinh học chất thải nguy hại
Phần 2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XỬ LÝ
SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI
2.1. Vi sinh vật và kỹ thuật phân tử ứng dụng trong sử lý sinh học chất thải nguy
hại
Xử lý sinh học chất thải nguy hại dựa trên sự phân hủy chất ô nhiễm hoặc lợi
dụng khả năng trao đổi chất của vi sinh vật. Biện pháp này phụ thuộc vào hoạt động
chao đổi chất của vi sinh vật sử dụng, tối ưu hóa điều kiện cho sự phát triển và phân
hủy tại chỗ. Trong nhiều chiến lược xử lý sinh học chất thải nguy hại được thương
mại hóa, tập đoàn vi sinh vật sử dụng được xử lý như những “ hộp đen” không gồm
việc phân tích các cá thể vi sinh vật hợp thành và cố gắng tìm hiểu được chúng hoạt
động thực sự như thế nào hoặc là nếu chúng có mối quan hệ cộng sinh với nhau. Một
trong những vấn đề làm đau đầu các nhà khoa học trong việc xử lý sinh học chất thải
nguy hại là làm thế nào để nhận biết và mô tả được quần thể vi sinh vật sống tại vị trí
bị ô nhiễm. Các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật truyền thống các vi sinh vật phân
hủy chất ô nhiễm bao gồm phân lập, phân loại và đặc điểm sinh thái học. Nuôi cấy là
một phương pháp truyền thống để xác định các loài vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật
đặc trưng cho một loài được phân lập từ hỗn hợp nuôi cấy và mọc trên một môi
trường đã được tiệt trùng trong thiết bị đã được điều chỉnh nhiệt độ. Các kỹ thuật phụ
thuộc vào nuôi cấy như Biolog- mặt sinh lý học ở mức quần thể (CLPP ) cũng được
sử dụng để ước tính khả năng trao đổi chất ngoài vị trí của các thành viên trong quần
thể vi sinh vật phân lập từ các nguồn môi trường khác nhau. CLPP cung cấp một chỉ

số đa dạng trao đổi chất hiện có trong môi trường với lượng cơ chất đã định trước có
thể bị trao đổi (Juck và cộng sự, 2000). Những nghiên cứu như vậy có thể không đạt
được, tuy nhiên phản ánh được sự đa dạng vi sinh vật và các hoạt động diễn ra. Thực
sự, ít hơn 1% tất cả các vi sinh vật đã từng hoặc có thể được nuôi cấy trong phòng thí
nghiệm (Trevors,1997; Watanable và Baker,2000). Tập hợp vi sinh vật bao gồm công
nghệ sinh học môi trường như bùn hoạt tính và đất/trầm tích, là phức hệ, cho phép
chúng tác động lên đa dạng chất ô nhiễm. Vào đầu những năm 1990, khi kỹ thuật
phân tử được phát triển để tìm hiểu sinh thái vi sinh vật, các nhà nghiên cứu bắt đầu
phân tích các cộng đồng vi sinh vật thích hợp cho sự phân hủy chất ô nhiễm trong môi
trường (các vi sinh vật thân thiện với môi trường- ERMs) (Watanable và Baker,2000).
Vì vậy bắt đầu nghiên cứu tập hợp vi sinh vật sử dụng sinh học phân tử , như tách
AND đích từ mẫu môi trường và sau đó khuyếch đại xác định trình tự gen đặc hiệu.
Sau khi nhận diện, trình tự gen có thể đem so sánh với một dữ liệu lớn gồm rRNA
16S, trình tự các sinh vật được phân lập ban đầu. Hình 1 tổng kết các bước chính
trong việc mô tả tập hợp vi sinh vật trong mẫu môi trường bằng kỹ thuật phân tử,
nhưng ở hình 1 là kết quả có được khi sử dụng các phương pháp phân rử này để xác
định mối quan hệ phát sinh loài trong quần thể vi khuẩn phân hủy hydrocacbon.
Để phân tích các quần thể vi sinh vật, một số sự kết hợp các kỹ thuật phân tử đã
được áp dụng, như: Điện chuyển gel gradient biến tính (DGGE), PCR, TRFLP, lai
acid nucleic (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) (Hazen và Jimenez,1988; Harry và
cộng sự, 2000). Những kỹ thuật này có những thuận lợi hơn những phương pháp
truyền thống vốn thiếu tính đặc hiệu và nhạy cảm cần thiết trong việc điều khiển xử lý
sinh học chất thải nguy hại. Các phương pháp dựa trên phân lập và xác định acid
nucleic của các cá thể mục tiêu khắc phục được những vấn đề này. Chúng có tiềm
năng có ích cho việc phát hiện và điều khiển sự duy trì thường xuyên và phân tán của
các vi sinh vật tự nhiên và các vi sinh vật phóng thích vào môi trường (Atlas và cộng
sự,1992). Sự kết hợp các phương pháp phụ thuộc vào nuôi cấy ( phương pháp truyền
thống) và không phụ thuộc vào nuôi cấy cũng như các kỹ thuật phân tử, hóa sinh cho
ta một con đường linh động để thiết lập đa dạng vi sinh vật trong mẫu môi trường.
Tính đặc hiệu cao, nhạy của phương pháp PCR phát hiện ra những trình tự DNA đặc

hiệu trong các mẫu môi trường phức tạp đã đóng góp quan trọng vào bước tiến tìm
hiểu về vi sinh học môi trường (Holben và Tjedje,1998; Holben và cộng sự,1988;
Pickup,1991; Bej và Mahbubani,1992; Amann và cộng sự 1995; Onuki và cộng sự,
2000).
Mục đích của các nhà khoa học môi trường không chỉ để hạn chế các chất ô
nhiễm, mà xa hơn là để làm sạch các vùng bị ô nhiễm để tránh sự lan truyền dần các
chất ô nhiễm tới xung quanh hoặc trên bề mặt nguồn nước.
Hình1 :
Tách chiết DNA
Các kỹ thuật tách chiết DNA trực tiếp hiện nay đóng một phần quan trọng vào
việc nghiên cứu sinh thái vi sinh vật. Chúng rất hữu ích để xác định sự có mặt của các
vi khuẩn gốc và các vi khuẩn được đưa vào môi trường, GMOs hoặc GEMs là những
sinh vật đã được chuyển gen (Torsvik,1980; Steffan và cộng sự, 1988; Sommerville
và cộng sự, 1989; Tsai và Olson,1991; Saano và Lindstrom,1995). Với một phân
đoạn lớn, thường khoảng 90-99% các tế bào vi sinh vật có trong mẫu môi trường
không thể được nuôi cấy trên môi trường vi sinh. Những vi sinh vật nào tồn tại được
có thể chỉ thu hồi lại được một phần từ các mẫu môi trường nhờ các phương pháp
truyền thống. Việc phát hiện ra chúng thông qua các kỹ thuật phân tử thường yêu cầu
phải có hiểu biết thực sự về sintêh thái vi sinh vật trong bất kể môi trường nào.
Hai kỹ thuật khác nhau để phân lập DNA từ đất có thể thực hiện:
- Phương pháp tách chiết tế bào và giải trình tự, hoặc
- Phương pháp phân tích trực tiếp
Hình 2:
Trong kỹ thuật đầu, việc tách chiết các tế bào vi sinh vật từ đất thực hiện trước
khi chiết rút DNA, trong khi công nghệ thứ 2 DNA được tách chiết trực tiếp từ đất.
Hầu hết các phương pháp được miêu tả dựa trên sự tách chiết DNA từ môi trường
nước, đất, và trầm tích (Ogram và cộng sự, 1987; Atlas, 1992; Saano và
Lindstrom,1995; Zhou và cộng sự ,1996). Các phương pháp đều có cùng mục đích:
lượng DNA tinh khiết được tách chiết có hàm lượng cao thuận lợi cho việc xác định
sử dụng sinh học phân tử . Lượng DNA tinh khiết và được tách chiết có thể nhận biết

được trên gel agarose và so sánh với ngân hàng DNA. Nồng độ DNA được biểu thị
bằng nanogram/ gram trầm tích (đất) khô hoặc nanogram/ml nước (Pickup,1991). Kỹ
thuật phân tích trực tiếp này thuận lợi cho việc thu hồi DNA từ vi sinh vật hấp thụ
mạnh và ít bị đào thải bằng phương pháp tách chiết tế bào. Kỹ thuật phân tích trực tiếp
này cũng gặp phải trở ngại do mùn và độ pH trong đất được tách chiết.
Tất cả các phương pháp đều có mục đích thu được lượng DNA cao và đủ độ tinh
khiết cho việc phân tích phân tử bằng phương pháp lai DNA-DNA, phương pháp phân
tích đa dạng chiều dài các đoạn giới hạn cuối (TRFLP) hoặc phương pháp khuyếch
đại bằng phản ứng chuỗi polymerase. Các hợp chất mùn và đất sét trong nhiều mẫu
đất ức chế quá trình phân tích, và sự có mặt của chất keo collid làm cho việc tách chiết
DNA gặp vấn đề. Vì lý do này, thêm một bước tinh sạch trong sơ đồ quy trình phân
lập DNA là rất cần thiết (Sambrook và cộng sự,1989; Dijkmans và cộng sự,1993;
Volossionk và cộng sự,1995).
Việc phân lập DNA điển hình gồm các bước sau (Sambrook và cộng sự,1989;
Pickup,1991): 1. Phá hủy tế bào; 2. Tách DNA từ các thành phần tế bào như
polysaccharit và protein; 3. Tinh sạch DNA chiết rút từ các phần đất và các thành
phần như các axit humic, đất sét, hoặc ion; 4. Kết tủa DNA.
Như đã từng công bố 300ng DNA và gần 100 ng DNA có thể chiết rút từ 10 g
đất (Saano và Lindstrom,1995). Một vài phương pháp thu hồi DNA và kết quả chuyển
đổi của nó được chỉ ra trong bảng 4. Quá trình tinh sạch có thể kết hợp siêu li tâm
CsCl-EtBr , hydroxylapatite, hoặc sắc ký ái lực, chiết tách chloroform/ phenol, kết tủa
etanol, thẩm tách, hoặc xử lý bằng polyvinylpoly-pyrrolidone (PVPP) (Sambrook và
cộng sự,1989; Pickup,1991). Trong nhiều trường hợp, sơ đồ tinh sạch tiêu chuẩn
không thao tác được với mọi mẫu môi trường, và điều kiện yêu cầu phải thích ứng với
một cách phân tích riêng biệt. Một số tạp chí gần đây đã cho thấy tiến bộ của của sự
phát triển các phương pháp phân lập DNA (Holben và cộng sự,1988; Sayler và
Layton,1990; Pickup,1991).
Bảng 4:
PCR- phản ứng chuỗi polymerase
Sử dụng phương pháp PCR trong vi sinh học môi trường được công bố bởi Bej

và Mahbubani (1992). Sự phát triển kỹthuật này đã là một khám phá chính ra phương
pháp luận trong sinh học phân tử. Phương pháp này đang được sử dụng trong nhiều
phòng thí nghiệm liên tâm đến sinh học phân phân tử từ việc chuẩn đoán đến nghiên
cứu sự tinh khiết. Với tính đặc hiệu cao, nhạy PCR có thể phát hiện ra các trình tự
DNA đặc trưng của mẫu môi trường hỗn hợp, điều này đã đóng góp rất hữu ích vào sự
tiến bộ hiểu rõ về vi sinh vật học môi trường và các lĩnh vực cần nghiên cứu ( như
phát hiện ra các bệnh do vi sinh vật gây ra, chuẩn đoán bệnh, phát hiện đột biến, sự
hình thành các mẫu dò DNA và sinh sản vô tính từ sản phẩm PCR) (Pillai và cộng sự,
1991; Toze,2000; Watson và Blackwell,2000). Ứng dụng quan trọng nhất thu được từ
phương pháp này là nâng cao khả năng phát hiện ra các đầu dò trong các chuỗi gen
đặc trưng. Bằng cáh khuyếch đại một chỗi mục tiêu, PCR tăng khả năng phát hiện ra
những trình tự hiếm gặp trong hỗn hợp DNA tách ra từ mẫu môi trường. PCR là một
kỹ thuật khuyếch đại DNA lớn, hứa hẹn một phương pháp đặc hiệu, nhạy để kiểm soát
cá vi sinh vật trong môi trường (Steffan và Atlas,1991). Một quá trình PCR điển hình
đòi hỏi một số lượng các chu trình khuyếch đại chuỗi DNA đặc trưng. Mỗi chu trình
gồm 3 giai đoạn: Biến tính, bắt cặp, tổng hợp. Một chu kỳ thường kéo dài 3 đến 5
phút. Mỗi bước trong suốt quá trinh khuyếch đại thường thực hiện được là nhờ thiết bị
block nhiệt được cài đặt trương trình và tự động.
Nhìn chung, phương pháp PCR gồm chu kỳ lặp lại giữa một nhiệt độ cao với
nhiệt độ biến tính DNA, một nhiệt độ tương đối thấp cho phép các primer gắn hoàn
toàn vào vùng DNA mục tiêu, và một nhiệt độ trung bình cho phép các primer kéo dài
ra hoặc sao chép.
Trong các nghiên cứu về môi trường, phương pháp PCR được sử dụng để phát
hiện ra các vi sinh vật, như các vi sinh vật được tháo tác gen (GMOs, GEMs), các
bệnh, các sinh vật chỉ định. Steffan và Atlass (1998) sử dụng PCR để khuyếch đại các
vùng đặc biệt dài 1.0-kilobase (kb) vốn là một phần trong chuỗi dài 1.3-kb của bộ gen
vi khuẩn phân hủy thuốc diệt cỏ Pseudomonas cepacia AC11000 giúp tăng tính nhạy
của phương pháp dot-blot các sinh vật. DNA vi khuẩn được phân lập từ mẫu trầm tích
(cát, bùn ). Sau quá trình khuyếch đại, P.cepacia AC1100 có thể được phát hiện ngay
ở nồng độ 1 tế bào/ g bùn. Điều này làm tăng độ nhạy gấp 10

3
lần so với mẫu không
được khuyếch đại. Chaudhry và cộng sự . (1989) cũng đã sử dụng phương pháp PCR
để phát hiện các vi sinh vật được thao tác gen như Pennisetum purpureum. Kết quả
phát hiện ra GMOs trong mẫu môi trường nhờ kỹ thuật PCR có trong nghiên cứu của
Jansson (1995) và Prosser (1994).
Vai trò quan trọng khác khi sử dụng kỹ thuật PCR là phân tích chuỗi RNA
ribosom để nhận diện và mô tả đặc điểm phát sinh loài của các vi sinh vật. Điều này
rất thuận lợi trong quá trình nghiên cứu sinh thái vi sinh vật. Xác định phát sinh loài
và tìm ra các vi sinh vật quan tâm ngay tại chỗ mà không cần nuôi cấy, công bố bởi
Amam và công sự (1995). Số lượng thông tin thu được hiện nay mà liên quan đến các
vùng khác nhau và được duy trì cao giữa rRNA 5S và 16S cho phép sự lựa chọn khá
đơn giản vị trí mục tiêu của các primer để khuyếch đại chuỗi gen rRNA mong muốn
(Olsen vầ cộng sự,1986; Lin và cộng sự,1997; Laupara và cộng sự,2000). Manz và
cộng sự (1994) đã chỉ ra làm thế nào các mẫu dò oligosachrit đặc hiệu có thể ứng
dụng xử lý tại chỗ các quần thể vi sinh vật trong mùn hoạt tính của 2 cây xử lý nước
thải . Trong bài báo khác, các tế bào vi khuẩn trong đất và mùn được phát hiện nhờ
phương pháp PCR (Tsai và Olson,1991). Jansson và cộng sự (2000) đã tổng kết sự
phát triển mà sử dụng các maker sinh học ( một trình tự DNA đưa vào cơ thể sinh vật
vốn khác nhau ở kiểu gen và kiểu hình để quản lý hiệu quả xử lý sinh học chất thỉa
nguy hại.
Một ví dụ khác sử dụng kỹ thuật phân tử trong xử lý sinh học chất thải nguy hại
là nhờ đặc tính của quần thể vi khuẩn trao đổi metan có tại vị vị bề mặt nước bị nhiễm
trichloroethylene (Bowman và công sự, 1993). Các vị trí bị nhiễm hydrocacbon
chlororinate, trichloroethylene (TCE), tetrachloroethylene (PCE) có thể đe dọa đến an
toàn nguồn nước uống. Sự khoáng hóa hoàn toàn TCE tạo ra CO2 có thể đạt được nhờ
kết hợp hoạt động trao đổi metan và trao đổi dị dưỡng của quần thể vi sinh vật. Từ lúc
vi sinh vật trao đổi metan được đưa vào tự nhiên, chúng được xem là phương tiện xử
lý sinh học chất thải ngay tại chỗ bị ô nhiễm. Đặc điểm của vi khuẩn trao đổi metan
bao gồm phân hủy TCE thực hiện nhờ tách chiết DNA và giải trình tự đầu dò của gen

( gen sMMD của enzyme methane monooxygenase ) trong mẫu môi trường.
Chuỗi gen rRNA 16S
Phương pháp nhận biết này có thể áp dụng được với vi khuẩn cổ như vi khuẩn
và Eukarya . Nó dựa vào xác định vị trí phát sinh loài của sinh vật chưa biết được
trong sô các sinh vật đã biết. Chuỗi này được xem là tốt nhất cho việc xác đinh tiến
hóa của loài vì nó được bảo tồn cao giữa các loài (Head và công sự,1998).
Có thể thu nhận chuỗi rRNA16S bằng rất nhiều cách. Một trong những cách
thông dụng và hiệu quả nhất là PCR, có thể tạo bản sao của chuỗi rRNA16S .Sau đó
chuỗi này được so sánh với trình tự của các vi sinh vật khác nhau có trong dữ liệu.
Woese và cộng sự (1990) đã xây dựng cấu trúc của 3 lớp vi sinh vật ( vi khuẩn cổ, vi
khuẩn, eukarya ) trong mối quan hệ với thành phần khác dựa trên sự khác nhau giữa
các nucleotide trong chuỗi rRNA16S của chúng. Các cặp trình tự từ các vi sinh vật
khác nhau được sắp xếp, và sự khác nhau trong trình tự các nucleotide được tính toán.
Số điểm khác nhau tạo cơ sở để xây dựng quá trình tiến hóa giữa các loài. Hơn nữa,
biết được vị trí phát sinh loài của một vi sinh vật không cần nuôi cấy, chưa được biêt
đến đôi khi có thể cho phép suy ra được đặc tính sinh lý của nó nhờ đó đưa ra điều
kiện nuôi cấy để phân lập nó.
Phần 3 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH THÁI HỌC VI
SINH VẬT MỨC ĐỘ PHÂN TỬ ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI NGUY HẠI

Để tiến hành xử lý sinh học tại một khu vực thì mối quan hệ giữa ảnh hưởng
của việc xử lý và những tác động lên hệ sinh thái cần được làm sáng tỏ. Do đó, việc
phân tích các quần thể vi sinh vật chiếm một phần không thể thiếu trong xử lý sinh
học tại chỗ. Nhưng cho đến nay, việc phân tích này luôn là một thách thức đối với các
nhà sinh vật học do phần lớn các vi khuẩn trong môi trường tự nhiên không thể được
nhân giống (nuôi) bằng các kỹ thuật thông thường trong phòng thí nghiệm mà cần bổ
sung kỹ thuật nuôi cấy để có thể hiểu sâu hơn về cấu trúc và tính động lực của các
quần thể vi sinh vật này (5,6). Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện và
xác định vi sinh vật bằng các marker phân tử xác định ngày càng được sử dụng
thường xuyên trong các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật, phương pháp này có thể

được sử dụng trong xử lý sinh học tại chỗ.
Phát hiện và giám sát vi khuẩn đích
Sự phát hiện và giám sát các vi khuẩn đích, liên quan trực tiếp đến sự suy thoái
của các chất gây ô nhiễm, là rất cần thiết để theo dõi và tối ưu hóa của quá trình xử lý
sinh học. Các phát hiện ở mức độ đơn bào của các vi sinh vật cụ thể cũng được công
nhận là một kỹ thuật hiệu quả để phái hiện và liệt kê các vi khuẩn xác định trong một
phức hợp các quần thể vi sinh vật (45- 47). Các kỹ thuật phát hiện ở mức độ đơn bào
gồm:
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ (FISH) với RNA ribosom (rRNA) được
gắn các đầu dò oligonucleotide (oligonucleotide probes) đã được sử dụng thành công
trong các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật.
Các phân tử rRNA bao gồm các vùng bảo tồn cao xen kẽ với các vùng biến đổi
(48,49). Do đó các chuỗi rRNA thường được sử dụng để xây dựng các cây phân loại,
các trình tự của một số nhóm và loài vi khuẩn nhất định từ đó được xác định (50-52)
FISH liên quan đến sư lai hóa của tín hiệu huỳnh quang – các đầu dò
oligonucleotide đã được đánh dấu nội bào rRNA. Những tế bào có sự lai hóa đặc biệt
với các đầu dò có thể được nhận diện và đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang. Hiệu
quả hơn nữa, phân tích bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy cho phép xác định và
đếm một lượng lớn các các tế bào trong một thời gian ngắn (1.000 tế bào/giây) (45).
Tuy nhiên,vể độ nhạy của kỹ thuật FISH, khi sử dụng chuẩn FISH với FITC
đơn (mono-FITC) – các đầu dò được đánh dấu phát tín hiệu mạnh chỉ khi các tế bào
hoạt động trao đổi chất và do đó chứa một lượng lớn các rRNA (53-55).
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ HNPP - FISH, sử dụng 2-hydroxy-3-
naphthoic axit 2’-phenylanilide phosphate (HNPP) và Fast Red TR. Kỹ thuật này có
tín hiệu huỳnh quang gấp 8 lần so với FITC - FISH
Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ sử dụng các đầu dò oligonucleotide được
đánh dấu ở Cy3 cũng có hiệu quả để làm tăng độ nhậy(59,60).
Hình 3: Nguyên tắc của các kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ.
Kỹ thuật PCR tại chỗ.

Kỹ thuật PCR này có thể khuếch đại và phát hiện các gen mục tiêu ở bên trong
các tế bào vi khuẩn riêng biệt.
Kỹ thuật này cho phép phát hiện các gen chức năng cụ thể có trong một bản sao
đơn lẻ (single coppy) hoặc trong một lượng nhỏ các bản sao (low copy numbers) ở các
tế bào nguyên vẹn mà bằng kỹ thuật FISH không thể phát hiện được (61). Ví dụ như
Kurokawa và cộng sự (62) đã chỉ ra độ đa dạng và sự phân bố của các vi khuẩn mang
gen sltII trong nước sông bằng kỹ thuật PCR tại chỗ.
Bên cạnh đó, sử dụng kết hợp giữa phiên mã ngược tại chỗ với PCR tại chỗ, có
thể nghiên cứu biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn đáp ứng với các điều kiện môi
trường. Chen và cộng sự (63) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện Pseudomonas
putida F1 biểu hiện gen tod C1 trong nước biển tiếp xúc với hơi toluene.
Hình 4: Nguyên tắc của PCR tại chỗ. (In situ PCR)
Bên cạnh sự phát hiện ở mức độ đơn bào, phương pháp PCR định lượng sử
dụng số lượng lớn ADN từ quần thể các vi sinh vật trong tự nhiên có thể là một cách
tiếp cận hiệu quả để giám sát các vi khuẩn đích. Nghiên cứu của Nakamura và cộng
sự (10) đã thành công trong việc giám sát lượng Ralstonia eutropha KT-1 ở thử
nghiệm tăng sinh học trong TCE –nước mặt bị ô nhiễm bằng phương pháp PCR định
lượng với LightCycler
TM
(Roche) đích theo trình tự lặp đối xứng ngoài gen (REP)
Giám sát thay đổi trong đa dạng vi sinh vật
Quần thể vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong chu trình địa hóa sinh
học và góp phần vào việc duy trì hệ sinh thái (2-4). Do đó, điểu tra ảnh hưởng của xỷ
lý sinh học dựa trên quần thể vi sinh vật là cần thiết để chứng minh tính an toàn trong
xử lý sinh học tại chỗ. Các phương pháp giám sát thay đổi trong đa dạng vi sinh vật
gồm:
Điện di trên gel biến tính gradient (Denaturing gradient gel electrophoresis –
DGGE) của PCR khuếch đại phần rDNA 16S được sử dụng như một công cụ tiện lợi
và mạnh mẽ để xác định sự khác nhau về thời gian hoặc không gian trong quần thể vi
sinh vật và để giám sát sự thay đổi trong đa dạng quần thể vi sinh vật (64-71).

PCR - khuếch đại các phần 16S rDNA từ một quần thể vi sinh vật, về cơ bản có
cùng kích thước, có thể tách thành các dải đơn riêng rẽ trong quá trinh điện di trên gel