Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của Chitinase từ mủ cây cao su Hevea brasiliensis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*****





NGUYỄN QUANG NHÂN





NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH VÀ
XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHITINASE TỪ
MỦ CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS




Chuyên ngành: Hoá sinh
Mã số: 1.07.05


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. NGUYỄN ANH DŨNG






THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2009

LỜI CẢM ƠN

Để có được như ngày hôm nay, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
được biết bao sự quan tâm, chăm sóc, dạy dỗ và giúp đỡ của cha mẹ, thầy cô và
bạn bè.
Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Thầy
PGS. TS. Nguyễn Anh Dũng. Thầy luôn hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho em để em có thể hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên và Bộ môn Sinh học Thực vật Trường Đại học Tây
Nguyên. Các thầy cô luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong
suốt thời gian làm đề tài.
Tôi cũng xin cám ơn những người bạn đã luôn giúp đỡ và động viên tôi
rất nhiều, đặc biệt là bạn Trần Quốc Tuấn, bạn Nguyễn Văn Bốn, chò Trònh Thò
Bích Ngọc, chò Nguyễn Kim Ngân.
Tôi xin cảm ơn các bạn, các em làm việc tại bộ môn Sinh hóa và bộ môn
Sinh học Thực vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm.
Tôi xin cảm ơn anh Sơn cùng các anh chò làm việc tại phòng Kỹ thuật,
nông trường Phú Xuân, TP Buôn Ma Thuột đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá
trình lấy mẫu tại nông trường.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Má và Anh Chò

Hai. Ba Má và Anh Chò vẫn luôn quan tâm, chăm sóc, động viên và là chỗ dựa
tinh thần cho con, cho em.
Một lần nữa tôi xin cảm ơn tất cả mọi người, xin nhận ở nơi tôi lòng biết
ơn chân thành và lời chào trân trọng nhất.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2009
NGUYỄN QUANG NHÂN

- i -
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ v
LỜI MỞ ĐẦU vi
Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
I.1. Sơ lược về chitin và chitinase 1
I.1.1. Chitin 1
I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 5
I.1.2.1. Phân loại chitinase 6
I.1.2.2. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9
I.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase 12
I.1.2.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 15
I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase 16
I.1.2.6. Ứng dụng của chitinase 17
I.2. Cây cao su Hevea brasiliensis và chitinase trong mủ cao su 20
I.2.1. Cây cao su 20
I.2.2. Mủ cao su 24

I.2.3. Hevamin 32

Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37
II.1. Vật liệu 37
II.2. Phương pháp 37
II.2.1. Phương pháp ly tâm mủ thu nhận lutoid 37
II.2.2. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ 38
II.2.3. Kết tủa protein bằng muối trung tính 38
II.2.4. Thẩm tích 39
II.2.5. Xác đònh hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry 40
II.2.6. Xác đònh hoạt độ chitinase theo phương pháp đònh lượng đường khử với thuốc thử DNS
42
II.2.7. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel Sephadex 45
II.2.8. SDS-PAGE 46
II.2.9. Xác đònh nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase 50
II.2.10. Xác đònh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 50
II.2.11. Xác đònh nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 51
II.2.12. Ảnh hưởng của ion kim loại 51

Phần III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
III.1. Quy trình tách chiết, thu nhận chitinase thô từ mủ cao su 52
III.1.1. Quy trình ly tâm tách mủ, thu hồi lutoid và phá vỡ lutoid để giải phóng chitinase
52
III.1.2. Quy trình tủa để thu nhận chitinase thô 52
III.1.2.1. Tủa bằng cồn để thu nhận chitinase thô 52
III.1.2.2. Tủa bằng acetone để thu nhận chitinase thô 54
III.1.2.3.Tủa bằng muối ammonium sulfate để thu nhận chitinase thô 55
III.2. Quy trình tinh sạch chitinase bằng phương pháp lọc gel Sephadex 58
III.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase trước lọc gel 58
III.2.2. Kết quả đo OD 280nm các phân đoạn lọc gel ở 3 giống cao su 59

III.2.3. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase sau lọc gel 61
III.2.4. Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase thu được qua lọc gel 63
III.2.5. Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su 63
III.2.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các giống cao su qua lọc gel 64
III.3. Xác đònh các tính chất của chitinase 67
III.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 67
III.3.2. Ảnh hưởng của pH 69
III.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 71
III.3.4. nh hưởng của các ion kim loại 73
III.3.5. Quy trình thu nhận enzyme chitinase từ mủ cao su 76

Phần IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78
IV.1. Kết luận 78
IV.2. Đề nghò 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80
PHỤ LỤC 84

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


ΔOD Biến thiên mật độ quang
BSA Bovine serum albumin, albumin bò
Dd Dung dòch
DNS acid 3,5-dinitrosalicylic
GlcNAc N-Acetyl-β-D-Glucosamine
HT Hoạt tính
HTR Hoạt tính riêng
Latex Mủ cao su
Laticifer Tế bào cây chứa nhựa mủ
NAGase β-N-Acetylglucosaminidase

OD Mật độ quang học
Serum Dòch lỏng trong mủ cao su
UI Đơn vò hoạt độ (International Unit - đơn vò quốc tế)










- ii -

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

BẢNG Trang
Bảng 3.1: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase khi tủa bằng cồn 53
Bảng 3.2: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase khi tủa bằng acetone 54
Bảng 3.3: Hàm lượng, hoạt tính, hoạt tính riêng chitinase tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
55
Bảng 3.4: So sánh các tác nhân tủa với cùng lượng mẫu ban đầu 57
Bảng 3.5: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su trước lọc gel 58
Bảng 3.6: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su sau lọc gel 62

Bảng 3.7: Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase qua lọc gel 63
Bảng 3.8: Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su 64
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase ở giống GT1 67
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase ở giống PB235 67
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase ở giống RRIM600 68
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase ở giống GT1 69
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase ở giống PB235 70
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase ở giống RRIM600 70
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 72
Bảng 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống PB235 72
Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống RRIM600 72
Bảng 3.18: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống GT1 74
Bảng 3.19: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống PB235 75
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống RRIM600 75






- iii -

DANH MỤC CÁC HÌNH

HÌNH Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của chitin 1
Hình 1.2: Cấu trúc chuỗi α-chitin 2
Hình 1.3: Cây cao su Hevea brasiliensis 22
Hình 1.4: Hình chụp mủ cao su dưới kính hiển vi điện tử 27
Hình 1.5: Cấu trúc của hevamine 33

Hình 1.6: Cấu trúc bậc 2 của hevamine A 34
Hình 1.7: Cấu trúc TIM barrel ở hevamine 35
Hình 2.1: Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase 42
Hình 2.2: Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS 42
Hình 3.1: Khối lượng phân tử của các protein trong các mẫu thơ và mẫu tinh của 3 giống cao su 65
Hình 3.2: Sơ đồ quy trình sơ bộ thu nhận chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis 77













- iv -

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

ĐỒ THỊ Trang
Đồ thò 3.1: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su GT1 60
Đồ thò 3.2: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su PB235 60
Đồ thò 3.3: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su RRIM600 61
Đồ thò 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 67
Đồ thò 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 69
Đồ thò 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 71

Đồ thò 3.7: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống PB235 74









- v -

LỜI MỞ ĐẦU
Chitin là thành phần chính trong thành tế bào nấm và vỏ ngoài của côn
trùng, giáp xác. Chitin bò phân cắt bởi chitinase tạo thành các sản phẩm có N-
acetylglucosamine và oligomer N-acetyl-glucosamine có nhiều ứng dụng trong y
dược học, nông nghiệp. Ngoài ra, chitin còn có thể được dùng trong thuốc trừ
nấm, trừ sâu bệnh, côn trùng sinh học và không gây ô nhiễm môi trường. Việt
nam đang là nước nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu thủy sản hàng đầu châu Á.
Sản lượng tôm của Việt nam hằng năm hơn 1.000.000 tấn. Đây là nguồn nguyên
liệu dồi dào để sản xuất chitin, chitosan và các sản phẩm khác có giá trò. Vì vậy
việc sử dụng chitinase để tận dụng nguồn chitin khổng lồ thải ra từ công nghiệp
chế biến thủy sản vừa giảm ô nhiễm môi trường vừa tạo thành các sản phẩm có
ích có ý nghóa khoa học và thực tiễn cao.
Chitinase có thể thu nhận từ thực vật, động vật (tuyến tiêu hóa của cá,
mực) và vi sinh vật (Aspergillus fumigatus, Bacillus sp.). Tuy nhiên việc sản xuất
chitinase đặt biệt là chitinase tinh sạch đòi hỏi nhiều đầu tư về vốn lẫn về mặt
kỹ thuật và tốn nhiều công sức. Cho nên hiện nay việc sản xuất enzyme này còn
nhiều hạn chế và giá thành của chitinase trên thò trường là rất đắt.
Theo một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong mủ của cây cao su có

chứa một loại chitinase gọi là hevamine. Ở Việt Nam, diện tích trồng cây cao su
hiện nay khoảng hơn 500.000ha và trong thời gian tới có thể tăng lên 800.000ha,
đây là một nguồn cung cấp chitinase đầy tiềm năng và rẻ tiền. Đề tài này hướng
tới mục tiêu tách chiết, tinh sạch, xác đònh tính chất và tiến đến mô hình hóa
việc sử dụng enzyme hevamine trong thủy phân chitin để thu nhận N-
acetylglucosamine và oligomer của chúng. Hiện nay, chưa có các đề tài trong
nước nghiên cứu về chitinase từ mủ cao su hay hevamine. Do đó, thành công của
đề tài này sẽ góp phần mở ra một hướng mới trong việc sản xuất chitinase ở
Việt Nam, một enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng.
- vi -
- 1 - Phần I: Tổng quan tài liệu
Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.1. SƠ LƯC VỀ CHITIN VÀ CHITINASE
I.1.1. Chitin
• Cấu tạo chitin
Chitin có công thức hóa học (C
8
H
13
NO
5
)
n
trong đó C chiếm 47,29%, H
chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là
một chất rắn màu trắng vô đònh hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và
phương pháp thu nhận.
Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là
một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi
là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-

O-glycoside.
Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ. Sự khác nhau này biểu
hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngượïc xen kẽ nhau, ở
Hình 1.1: Cấu trúc của chitin
Nguyễn Quang Nhân
- 2 - Phần I: Tổng quan tài liệu
β-chitin thì cùng hướng và ở δ-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược.
Dạng chiếm nhiều nhất là α-chitin.








Hình 1.2: Cấu trúc chuỗi
α
-chitin
• Phân bố và số lượng
Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành
phần chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và
bào tử nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes.
Ở những loài động vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác),
Onychophora (nhóm có móng), Myriapoda (đa túc) và Arachnida (nhện), chitin
đóng vai trò là bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein. Tỉ lệ chitin :
protein thông thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay đổi trong suốt quá trình
phát triển và khác nhau giữa các loài. Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ
thể và màng bao chất dinh dưỡng. Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn
thể (Mollusca), trùng đốt (Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria). Ở các

loài thực vật, chitin và đường amin đóng vai trò không quan trọng trong quá trình
trao đổi chất hay về cấu trúc hình thái.
Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất
trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin). Chitin là đứng ở vò trí thứ hai sau
cellulose. Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều điểm về cấu tạo và
Nguyễn Quang Nhân
- 3 - Phần I: Tổng quan tài liệu
chức năng. Về chức năng, chitin và cellulose đều là những polysaccharide cấu
trúc. Về cấu trúc phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm
OH ở C
2
được thay thế bằng một nhóm acetylamine. Chitin có thể thay thế một
phần hay toàn bộ cellulose hoặc glucan trong thành tế bào nấm và vài loại tảo.
• Đặc điểm khác

Chitin không tan trong nước, dung dòch kiềm loãng và thuốc thử
Schweitzer. Chitin có thể tan trong một số dung dòch như HCl đậm đặc, HNO
3
,
acid fomic khan và một số muối trung tính. Nếu đun nóng chitin trong dung dòch
kiềm mạnh, một phần nhóm N-acetyl bò khử (deacetyl hóa) tạo thành chitosan.
Ngược lại, trong dung dòch HCl đậm đặc, quá trình thủy phân chitin xảy ra ở các
nối
-1,4-glycoside làm [β α]
D
từ -14
o
dần đổi sang +56
o
, sau đó là sự thay đổi ở

các nhóm acetyl. Độ nhớt của chitin trong dung dòch acid nitric là 14,3.10
-3
đối
với chitin nguyên chất từ vỏ cua, 13,1.10
-3
đối với chitin từ nấm. Các giá trò này
xấp xỉ như nhau chứng tỏ trọng lượng của chúng gần như nhau.
Trong việc đònh tính cũng như so sánh chitin từ những nguồn thực vật,
động vật khác nhau, phương pháp nhiễu xạ tia X có lẽ là phương pháp vật lý duy
nhất có ý nghóa và có giá trò. Trong khi đó, các phương pháp đònh lượng chitin
đều có độ chính xác giới hạn, những điều kiện cần thiết cho việc tinh chế chitin
có khả năng làm thay đổi polysaccharide này, vì vậy khó đạt được chitin tinh
khiết. Ngoài ra, người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl-
D-Glucosamine nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) trích từ nấm.
• Ứng dụng
Với kỹ thuật chế biến hiện đại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một
tiềm năng to lớn đặc biệt là trong các lónh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế
biến thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm.
Nguyễn Quang Nhân
- 4 - Phần I: Tổng quan tài liệu
Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai
cho thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…). Chitin làm
chất mang trong cố đònh enzym hay cố đònh tế bào, làm chất mang tạo các giá
thể trồng cây cảnh. Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có độ bền dai, đàn hồi, có
thể tạo thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan để
bảo quản các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thòt
nguội, lạp xưởng…) còn làm nguyên liệu để cố đònh enzyme hay cố đònh tế bào
vi sinh vật. Chitosan được đánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y
học như: băng bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương
tự tiêu huỷ, nhân tố ổn đònh liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư,

chất làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn
dòch.
Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình
tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan
trọng. Các đơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)
và glucosamine (GlcN), là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn
tính, viêm ruột và viêm dạ dày [15]. Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng
có hoạt tính kháng khối u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên
glycolipid và glycoprotein có vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng
dụng khác.
Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng đã được xuất bản
cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế đã được lưu hành tại Mỹ. Các công
trình nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng đã xuất hiện ở
nhiều nước trên thế giới. Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong
đó có Mỹ và Nga đã tập trung lại 3 năm một lần để trao đổi các bài báo, nghiên
cứu khoa học mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng. Những điều đó cho
Nguyễn Quang Nhân
- 5 - Phần I: Tổng quan tài liệu
thấy chitin và các dẫn xuất của chúng rất được quan tâm trên thế giới vì khả
năng ứng dụng rất rộng cùng với những đặc tính đặc biệt của chúng.
Hàng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới.
Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu
là phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ được thải ra hằng ngày từ ngành
công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản. Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm
thẻ), cua và các loài giáp xác trên biển là nguồn cung cấp chitin tốt nhất. Trong
vỏ tôm cua, chitin chiếm từ 20-50% trọng lượng khô, khoảng 12% trong tôm
nước ngọt, còn lại là các chất vô cơ, chủ yếu là carbonate calci. Nếu tận dụng
được nguồn cung cấp chitin này thì vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tạo
thành các sản phẩm thực sự có giá trò.

I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14)
Chitinase (còn gọi là [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid
glucanohydrolase]) là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân N-
acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên
kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp
nhau trong chitin.
Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, động vật không
xương sống, động vật có vú, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân
khớp và nấm cần chitinase trong sự phân chia tế bào để tăng trưởng. Chitinase
được tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm. Đối với nấm sợi,
chitinase tham gia nhiều chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử,
phát triển khuẩn ty và tự phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, đồng hóa chitin và ký
sinh. Ở vi khuẩn, chitinase được tạo ra để sử dụng chitin làm nguồn carbon và
Nguyễn Quang Nhân
- 6 - Phần I: Tổng quan tài liệu
năng lượng. Ở thực vật, chitinase là một phần của phản ứng chống lại sự xâm
nhiễm và stress, phối hợp hoạt động với các protein phòng vệ khác [9].
Chitinase thương phẩm có giá rất đắt, đặc biệt là chitinase đã tinh sạch.
Vì thế việc sử dụng enzyme thô trở thành thay thế thú vò trong việc tạo ra
GlcNAc và các oligomer có nguồn gốc chitin [15].

I.1.2.1. Phân loại chitinase
• Dựa vào cấu trúc phân tử:
Chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân
đường):
- Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có
cấu trúc xác đònh gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở nhiều loại sinh vật
như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ
yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase,
chitobiase và N-acetylglucosaminidase. Trong họ này, chitinase từ các

prokaryote chỉ có 2 motif trình tự ngắn được bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid
glutamic được bảo tồn) giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các
gốc giống nhau). Tuy nhiên, cả 2 loại chitinase đều có cùng domain xúc tác
barrel (βα)
8
. Trong cả 2 enzyme, rãnh gắn cơ chất đều nằm ở đầu C của sợi β
trong cấu trúc barrel (βα)
8
và gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vò trí
tương đương. Không giống với các glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có
cơ chế phản ứng bất thường bao gồm việc tác động lên nhóm N-acetyl của cơ
chất trên nguyên tử C anomer. Việc này dẫn đến việc tạo ra chất trung gian bao
gồm vòng pyranose của glucosamine kết hợp với vòng 5 oxazoline.
Nguyễn Quang Nhân
- 7 - Phần I: Tổng quan tài liệu
- Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở
thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà
Lan (Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn
Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme
(EC 3.2.1.17) của động vật và phage, bao gồm motif cuộn α + β và hoạt động
thông qua cơ chế nghòch chuyển.
Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong
khi côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase
18.
• Dựa vào trình tự amino acid:
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự đònh vò của enzyme, điểm đẳng điện,
peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5
nhóm:
- Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu
cysteine chứa khoảng 40 acid amin (giống với vùng đầu N ở hevein và các

enzyme khác có ái lực đối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc
tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)(peptid nhận
biết). Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ
chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác. Các vùng gắn chitin này
không phải luôn đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính xúc tác
enzyme mà chúng cần để tạo các đặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở
nhiều loài khác nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C giúp đònh vò
chitinase trên thành tế bào nấm men, đóng vai trò trong việc phân tách tế bào
mẹ khỏi các tế bào chò em. Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase
này nằm trong không bào và được cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus
Nguyễn Quang Nhân
- 8 - Phần I: Tổng quan tài liệu
[13]. Chitinase nhóm I của thuốc lá có vùng đầu C giàu cystein đóng vai trò là
vùng gắn chitin [24].
- Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác
có trình tự amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở
đầu N và peptid nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi
khuẩn. Chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein
nhóm II thuộc loại protein kháng bệnh và được tế bào tiết ra dưới nhiều điều
kiện stress khác nhau.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II,
nhưng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang
hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh
và được tiết ra ngoại bào.
- Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm,
41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm
I và khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có đoạn giàu cysteine
nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng
gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến

hóa ở thực vật bậc cao.
• Dựa vào phản ứng phân cắt:
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-
chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên
tạo các đoạn oligosaccharide, đã được nghiên cứu từ dòch chiết môi trường nuôi
cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M
1
=36kDa,
pI
1
=5,3±0,2 và M
2
=40kDa, pI
2
=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8).
Nguyễn Quang Nhân
- 9 - Phần I: Tổng quan tài liệu
Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) t
ừ
đầu khơng khử
tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme
này được thu từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2).
N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme
phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-
glucosamin.
Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N-acetyl-D-
glucosamin.
Ngoài ra, đối với chitosan - dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase
(EC 3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tương

ứng.

I.1.2.2. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase
• Chitinase vi khuẩn
Vi khuẩn sản sinh enzyme chitinase nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng.
Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase để có thể phân cắt được các loại
chitin đa dạng trong tự nhiên. Nh
ư vậy, chitinase vi khuẩn đóng vai trò quan trọng
trong
chu trình chitin trong tự nhiên.
Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium,
Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là ở nhóm
Streptomycetes.
Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy
nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitin-cơ
chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase,
đồng thời ổn đònh hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn
Nguyễn Quang Nhân
- 10 - Phần I: Tổng quan tài liệu
tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn
carbon cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển.
• Chitinase nấm
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho
enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, … đặc biệt là ở
các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus …
Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò
quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt
trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là
thành phần chính của vách tế bào nấm.
• Chitinase thực vật

Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su
(Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum
vulgare), lúa mạch đen, cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, đậu Hà Lan, đậu nành, củ
từ … và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase.
Chitinase thực vật tồn tại chủ yếu ở các mô nhất đònh hoặc cơ quan sinh sản như
hạt giống, củ, hoa và được cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân gây hại trên
thực vật. Bên trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với các
enzyme chống bệnh khác. Ví dụ các endochitinase mang tính base trong lá đậu
tập trung trong không bào và có chứa hầu hết các hoạt tính chitinase nội bào.
Nhờ vậy, không bào thực vật được xem tương tự như tiêu thể ở động vật. Bởi vì
bản thân thực vật không có chứa cơ chất của những enzyme phân giải như
chitinase và β-1,3-glucanase, sự tồn tại của những enzyme này cho thấy chúng
có vai trò kháng khuẩn, kháng nấm ký sinh gây bệnh và cả côn trùng.
Các protein kháng khuẩn (pathogenesis-related protein) khác nhau được
phân lập từ thực vật bao gồm thionin, protein bất hoạt ribosome, defensin,
Nguyễn Quang Nhân
- 11 - Phần I: Tổng quan tài liệu
β-1,3-glucanase và chitinase.
nsLTP và các enzyme phân giải như
Nhiều
chitinase, giống như các protein khác đóng vai trò bảo vệ, có thể chòu được các
protease ngoại bào, hoặc mang tính acid hoặc mang tính base (thông thường các
protein mang tính acid được tiết vào apoplast hoặc môi trường ngoại bào, trong
khi dạng base thường tập trung nội bào trong các không bào). Trình tự của các
chitinase acid giống với các chitinase base, chỉ khác ở chỗ chúng không có vùng
đầu N hevein.
Xét về đặc tính phân cắt, chitinase thực vật thường là endochitinase phân
cắt ngẫu nhiên. Một số chitinase thực vật có hoạt tính lysozyme cắt liên kết β-
1,4 giữa acid N-acetylmuramic và các gốc N-acetylglucosamine trong
peptidoglycan. Ví dụ như chitinase phân lập từ đu đủ, Rubus hispidus và

Parthenocissus quinquefolia.
• Chitinase động vật
Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ
tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân
mềm, chân đốt (ví dụ trong dòch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu
nhận được enzyme chitinase. Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase
được tiết ra từ tuyến tụy và dòch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu
bọ, trong dung dòch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ.
Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dòch biểu bì của giun
tròn trong suốt quá trình phát triển và dòch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào
thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài
(cuticle) trong quá trình biến thái hay lột xác.



Nguyễn Quang Nhân
- 12 - Phần I: Tổng quan tài liệu
I.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase
• Trọng lượng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng
phân tử khoảng 25-40kDa [23]. Một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng
40-90kDa. Enzyme chitinase của các loài thân mềm, chân đốt, động vật có
xương (cá, lưỡng cư, thú) có trọng lượng phân tử cao hơn, khoảng 120kDa. Trọng
lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng
biến đổi rộng, từ 30 đến 120kDa. Một số enzyme chitinase có trọng lượng phân
tử thấp có thể được tạo ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một phần
protein.
• Điểm đẳng điện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trò pI thay đổi rộng: 3,0-10,0 ở thực vật bậc cao
và tảo, 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, 3,5-8,8 ở vi sinh vật.

Hệ số hấp thu E
280
mg/ml=1,24; phổ hấp thu chỉ là bước sóng đơn 280μm.
Hằng số Michaelis: 0,010-0,011 (g/100ml).
• nh hưởng của nhiệt độ
Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động
là 40
o
C, ngoại trừ Aspergillus niger tổng hợp enzyme chitinase hoạt động trên cơ
chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50
o
C. Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc
thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt độ tối ưu khác nhau. Thí
dụ, nhiệt độ tối ưu của chitinase từ khoai tây ngọt là 25
o
C [12]. Ở các enzyme từ
củ từ Diosscorea opposita THUNB nhiệt độ tối ưu là 45-70
o
C [5].
Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus
licheniformis phân lập trong suối nước nóng cho thấy có khả năng chòu đựng
nhiệt độ cao đến 80
o
C. Mặt khác, chitinase từ côn trùng (tằm…) không ổn đònh ở
Nguyễn Quang Nhân
- 13 - Phần I: Tổng quan tài liệu
nhiệt độ 40
o
C vì côn trùng phát triển ở nhiệt độ 25
o

C. Do đó, nhiệt độ tối ưu của
enzyme chitinase côn trùng không cao.
• nh hưởng của pH
Giá trò tối ưu của enzyme chitinase từ 4-9 đối với các chitinase ở thực vật
bậc cao và tảo, enzyme chitinase ở động vật có vú là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là
3,5-8,0.
Theo các nhà khoa học, pH tối thích của enzyme chitinase có thể có sự
phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên
cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin, enzyme chitinase của
Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng 6,3, giá trò này ở khoai tây ngọt
Ipomoea batatas là 5,0 [12]. Ở các enzyme từ củ từ Diosscorea opposita THUNB
pH tối ưu là 3,5-4,0 [5]. Tùy mục đích phân tích, những cơ chất hòa tan như
glycol chitin và N-acetyl-chitooligosaccharide được sử dụng thay thế cho chitin.
pH tối ưu của enzyme chitinase khi cơ chất là glycol chitin thuộc khoảng pH
kiềm yếu. Hoạt tính enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bò ức chế ở pH<4,5, ngoại
trừ chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống vẫn hoạt động ở pH 3,0.
• Chất tăng hoạt – chất ức chế
- Allosamidin
Allosamidin là một pseudotrisaccharide gồm 2 đơn vò N-acetylallosamin
gắn với nhau nhờ liên kết β-1,4 và một nhóm allosamizoline. Nhóm
allosamizoline tương tự như chất trung gian phản ứng oxocarbonium, cấu tạo bao
gồm 1 cyclopentane và một vòng aminooxazoline. Về cấu tạo, allose chỉ khác
glucose ở C3 trong đó nhóm hydroxyl nằm thẳng trong allose và nằm ngang
trong glucose.
Allosamidin là chất ức chế chitinase đầu tiên được phân lập từ khuẩn ty
của Streptomyces sp. No.1713. Allosamidin và những dẫn xuất của nó ức chế
Nguyễn Quang Nhân
- 14 - Phần I: Tổng quan tài liệu
enzyme chitinase được tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật (Piromyces
communis, Streptomyces sp và Streptomyces olivaceoviridis). Ngoài ra,

allosamidin cũng được phát hiện có khả năng gắn kết với các enzyme chitinase
thực vật như hevamine và ức chế các enzyme chitinase thực vật (đa số thuộc họ
Glycohydrolase 18). Điển hình nó ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID 50 (liều
lượng 50% chất ức chế là 44,7μM). Nói chung, allosamidin ức chế mạnh
chitinase họ 18 và không ức chế protein lòng trắng trứng gà hay lysozyme người.
Về cơ chế ức chế, allosamidine ức chế chitinase theo cơ chế cạnh tranh
nhóm allosamizoline gắn vào tâm của trung tâm hoạt động chitinase, giả làm
chất trung gian phản ứng oxocarbonium nằm giữa C1 của N-acetyl-D-glucosamin
và oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2 trong quá trình thủy giải. Trong đó điện
tích dương ở C1 được ổn đònh bằng oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2.
Allosamidin khá đắt và khó tổng hợp. Mặc dù các oligomer carbohydrate
và những dẫn xuất của chúng có thể dùng để thiết kế chất ức chế glycoside
hydrolase, chúng thường khó tổng hợp và quá lớn để đi qua màng tế bào.
- Các ion kim loại
Các ion kim loại Hg
2+
, Ag
+
là những chất ức chế. Đối với ion Cu
+
, có 2
dạng enzyme chitinase: một bò ức chế và một được tăng cường nhờ Cu
2+
được
tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật như Pseudomonas aeruginosa.
- Các chất khác
Dipeptide CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên được
tổng hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208. CI-4 ức chế việc phân tách
tế bào Saccharomyce cerevisiae và ngăn cản sự tạo khuẩn ty của nấm bệnh
Candida albicans ở người. Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 vì chúng có

cấu trúc giống chất trung gian phản ứng. Các chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh
Nguyễn Quang Nhân
- 15 - Phần I: Tổng quan tài liệu
hưởng đến chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền kí sinh trùng
sốt rét (Plasmodium falciparum) từ vật chủ đến côn trùng.
2 peptide ức chế glycoside hydrolase khác là argifin và argadin có thể ức
chế chitinase ở nồng độ nano hay micro mole. Các peptide này gắn trực tiếp lên
các gốc ở tâm hoạt động của enzyme và chiếm các vò trí -1, +1 và +2. mặc dù
những chất ức chế này là peptide nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường
như acetyl hay vòng thơm.
Ngược lại, huyết thanh albumin có vai trò làm tăng hoạt động của enzyme
chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ đầu của phản ứng.
• Sự ổn đònh
Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn đònh trong trạng thái đông lạnh
khoảng 2 năm. Sự ổn đònh của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ
chất là chitin. Chúng bò khử hoạt tính nhanh chóng ở 37
o
C trong trường hợp
không có mặt chitin. Chu kỳ bán hủy ở 37
o
C là 40 ngày và ở 5
o
C là 230 ngày.
Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 20
o
C là k=0,145/h.

I.1.2.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase
• Chitin
Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Ở lớp vỏ côn trùng và

giáp xác, chitin được gắn kết với protein. Trong một vài trường hợp, lớp biểu bì
này được làm cứng bởi các liên kết chéo với polysaccharide khác (cellulose,
mannan, glucan…). Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein, cấu trúc
polymer hiện diện ở vách tế bào vi khuẩn.



Nguyễn Quang Nhân
- 16 - Phần I: Tổng quan tài liệu
• Các dẫn xuất của chitin
Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như
glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfate, 4-methylumbellferyl-
tri N-acetylchitotrioside (MUC-phát huỳnh quang).
Enzyme chitinase không hoạt động trên các cơ chất: chitin nitrat,
cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin.

I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và
chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng
phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)
2
do
hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Hầu hết chitinase
thuộc loại này.
Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng
hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)
n
với n≥3] từ đầu không khử và chỉ phóng
thích diacetylchitobiose (GlcNAc)
2

.
β-N-acetylhexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách
liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetylglucosamin.
Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-
chitooligosaccharide làm cơ chất. Các oligosaccharide thường được thủy phân
bên trong trên một vài vò trí xác đònh hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số enzyme
chitinase có khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không. Cũng có 2
dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo
disaccharide và trisaccharide, một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharide
và tetrasaccharide. Tóm lại, chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên.

Nguyễn Quang Nhân