Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER
LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ
TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD





Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003-2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC








NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER
LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ
TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD



Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HỒNG PHONG

CN. LƢU PHÚC LỢI













Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

iii
LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực
tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
- TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên
trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Lê Đình Đôn đã hƣớng dẫn và góp ý cho tôi khi tiến hành chủng rệp tại
nhà lƣới.
- CN. Hồ Việt Thế và các anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc

Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã
giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm.
- Chị Tôn Bảo Linh, chị Biện Thị Lan Thanh đã góp ý và giúp đỡ tôi trong quá
trình làm đề tài.
- Toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập
tại trƣờng.
- Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên để con đạt đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay.

Tháng 9 năm 2007

Nguyễn Hồng Phong





iv
TÓM TẮT

NGUYỄN HỒNG PHONG – Lớp DH03SH, Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng
bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phƣơng pháp
RAPD” dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đƣợc thực
hiện tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh và khu nhà lƣới bảo vệ thực vật
khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
Nội dung nghiên cứu gồm:
Đánh giá đa dạng di truyền các giống dứa Cayenne tại Tp. HCM bằng kỹ
thuật RAPD.
Nuôi rệp sáp và tiến hành lây nhiễm virus PMWaV thông qua vector là

rệp sáp.
Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa
Cayenne.
Các kết quả thu đƣợc:
Kết quả cây phân nhóm di truyền cho thấy giữa nhóm Cayenne và đối
chứng Queen có hệ số tƣơng đồng là 0,9. Nhóm dứa Cayenne phân thành
2 nhóm nhỏ: nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan,
nhóm 2 là giống Lâm Đồng. Mức tƣơng đồng giữa 2 nhóm khoảng 0,92.
Kết quả kiểm tra độ tin cậy bằng phần mềm winboot cho thấy cây phân
nhóm di truyền tạo ra là có độ tin cậy cao nhất.
Kết quả nuôi rệp sáp cho thấy rệp có thể phát triển tốt trên bí đỏ và trong
điều kiện 25-26
o
C rệp phát triển tốt hơn trong điều kiện 33-34
o
C.
Đã lây nhiễm đƣợc bệnh héo đỏ đầu lá lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66%
cây có biểu hiện bệnh.
Chƣa phát hiện đƣợc marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh
héo đỏ đầu lá.


v
SUMMARY

Studying genetic diversity and detect markers associated with resistance
to wilt disease in cayenne pineapple by RAPD-PCR
Supervisor: Tran Thi Dung
1
; Luu Phuc Loi

1
, BSc
Student: Nguyễn Hồng Phong
1
1
Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city

Cayenne pineapple is an important crop in Ho Chi Minh city for domestic
consumption and export. But today most varietys have been plant is imports and
have many pests, especially wilt disease. To develop pineapple industry of this
area, its need to research genetic variation of varietys in this area and find the type
of wilt resistance. In this study, we analysed genetic variation of 3 varietys of
Cayenne pineapple in Ho Chi Minh city and found markers associated with wilt
resistant trait by using 32 primer RAPD and received these results:
- 6 primers gave DNA polymorphisms in 3 Cayenne varietys and 2 controls.
OPAC10 have hightest allen number in Cayenne. UPGMA and bootstrap analysis
on the basis of RAPD data clearly showed that 3 Cayenne varietys belong to two
major clusters with 92% similarity. The first cluster includes Thailand and China
varietys with 98% similarity. The Second cluster is Lam Dong variety.
- The results of rearing mealybug show that mealybug can grow on pumpkin
and the development of mealybug at 25 – 26
o
C is better than 33 – 34
o
C.
- Two primers gave most DNA polymorphisms in pineapple when analysed
genetic variation were used to detect marker associated with wilt resistant trait in
Cayenne pineapple. But non marker was detected.

vi
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt .................................................................................................................. iv
Summary ................................................................................................................ v
Mục lục .................................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x
Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. xi
Danh sách các bảng ............................................................................................ xiii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài ........................................................ 2
1.2.1. Mục tiêu ....................................................................................................... 2
1.2.2. Nội dung ....................................................................................................... 2
1.2.3. Yêu cầu ......................................................................................................... 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây dứa ........................................................................... 3
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ................................................................................ 3
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa ............................................................... 3
2.1.2.1. Việt Nam .................................................................................................. 3
2.1.2.2. Thế giới ..................................................................................................... 4
2.1.3. Các nhóm dứa chính ..................................................................................... 5
2.1.3.1. Nhóm Queen ............................................................................................. 5
2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha .................................................................................. 6
2.1.3.3. Nhóm Cayenne .......................................................................................... 7

2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị .................. 7
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị .................................. 7
2.2.2. Chỉ thị hình thái ........................................................................................... 8

vii
2.2.3. Chỉ thị isozyme ............................................................................................ 8
2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA ...................................................................... 9
2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 10
2.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài ......................................... 11
2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di
truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam ............................................................... 12
2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới .......................................................................... 12
2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................................. 13
2.5. Bệnh héo do virus .......................................................................................... 14
2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV ................................................................ 14
2.5.2. Tác nhân lây truyền bệnh ........................................................................... 16
2.5.3. Triệu chứng ................................................................................................ 18
2.5.4. Cách phòng trị ............................................................................................ 19
2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. ............................................. 20
2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật ................................................................... 20
2.6.1.1. Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) ....................................... 21
2.6.1.2. Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng ................. 21
2.6.2. Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh ở thực vật .................. 21
2.6.3. Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh
trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD ...................................................................... 22
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23
3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại
Tp. Hồ Chí Minh .................................................................................................. 23
3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 23
3.1.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 23

3.1.3. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 23
3.1.4. Hóa chất ..................................................................................................... 24
3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24
3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa .............................................................. 24

viii
3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD .................................................................... 26
3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD .................................................................... 28
3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ........ 28
3.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne ......................................... 30
3.2.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 30
3.2.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 30
3.2.3. Dụng cụ ..................................................................................................... 30
3.2.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 31
3.2.4.1. Nuôi rệp ................................................................................................... 31
3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh .............................................................. 31
3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh .......................................... 32
3.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ
đầu lá trên dứa Cayenne ....................................................................................... 33
3.3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 33
3.3.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 33
3.3.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 33
3.3.4. Hóa chất ..................................................................................................... 33
3.3.5. Phƣơng pháp .............................................................................................. 33
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 35
4.1. Đánh giá đa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD ...... 35
4.1.1. Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá dứa ..................................................... 35
4.1.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD ....................................................................... 35
4.1.3. Thực hiện phản ứng RAPD ........................................................................ 36
4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ............ 40

4.2.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne
......................................... 43
4.2.1. Nuôi rệp ...................................................................................................... 43
4.2.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh ................................................................. 45
4.2.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh ............................................. 46
4.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo

ix
đỏ đầu lá trên dứa Cayenne .................................................................................. 48
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 52
5.1. Kết luận ......................................................................................................... 52
5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 54
PHỤ LỤC

x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EB extraction buffer
EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate
OD Optical density
OUT Operational Taxonomic Unit
PCR Polymerase Chain Reaction
PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus
QTL Quantivative Trait Locus
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
TAE Tris – Acetate – EDTA
TE Tris – EDTA
Tm Melting temperature

xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD .............................. 10
Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám
(D. neobrepes) ................................................................................................... 16
Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá ...................................... 18
Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá ...................................................... 19
Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri .................................................... 20
Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis ........................................................ 20
Hình 3.1 Thả rệp lên bí ..................................................................................... 31

Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV ..................................................... 32
Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh ........................................................ 33
Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA dứa .................................................................. 35
Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase ........................................ 36
Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ....................................................... 36
Hình 4.4 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAC10 ............................ 38
Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAH13 ............................ 38
Hình 4.6 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB01 ............................... 39
Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB08 ............................... 39
Hình 4.8 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer S1384................................. 40
Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer V20 .................................... 40
Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD ........................... 41
Hình 4.11 Độ tin cậy của các phân nhóm ........................................................ 42
Hình 4.12 Các kiểu phân nhóm khác ................................................................ 43
Hình 4.13 Rệp phát triển trên bí sau 1 tháng .................................................... 44
Hình 4.14 Chuyển Rệp bằng đèn ...................................................................... 45
Hình 4.15 Rệp phát triển trên dứa bệnh 1 tuần sau khi chủng .......................... 46
Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau lá dứa bệnh .................................................... 46
Hình 4.17 Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng ............................................. 47

xii
Hình 4.18 Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. ................................................... 48
Hình 4.19 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu
hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPAC10 ................................................... 49
Hình 4.20 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu
hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPB08 ...................................................... 49
Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển của rệp ở 25-26
o
C và 33-34
o

C (nhiệt độ phòng) ..... 44


























xiii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất ....................................... 4
Bảng 2.2 Quả tƣơi xuất khẩu ................................................................................... 5
Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu ................................................................................... 5
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase .................. 27
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD. ........................................................... 27
Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ primer. ................................ 28
Bảng 4.1 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa và lan ............................. 37
Bảng 4.2 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa Cayenne và dứa Queen . 37
Bảng 4.3 Hệ số đồng dạng di truyền của 3 giống dứa Cayenne và các đối chứng 41

1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất đƣợc ƣa chuộng
trên thế giới bởi hƣơng vị đặc trƣng và giàu dinh dƣỡng (vitamin, acid hữu cơ…).
Trong các giống dứa chính, dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm của công nghệ chế
biến đồ hộp nên đang đƣợc trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, cây dứa nói
chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chƣơng trình cung cấp giống cây
chất lƣợng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí
Minh. Để phát triển tốt hơn nữa ngành dứa ở vùng này thì điều trƣớc tiên là phải
đánh giá đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống.
Bên cạnh đó, cây dứa Cayenne có nhƣợc điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá
hại, đặc biệt là bệnh wilt – héo đỏ đầu lá. Bệnh này do virus “Pineapple Mealybug
Wilt-associated Virus” (PMWaV) gây ra. Bệnh làm cây dứa tăng trƣởng kém, trái
teo nhỏ, không thành thƣơng phẩm. Bệnh cũng gây tác hại lên hệ thống rễ và làm
vàng lá, gây suy thoái toàn bộ cây. Điều đáng quan ngại là, nhiều cây mang mầm
bệnh ẩn nhƣng bên ngoài vẫn phát triển bình thƣờng gây khó khăn cho việc kiểm
soát bệnh đặc biệt là khâu giống. Về lâu dài, để chống lại bệnh này chỉ còn cách
dùng công nghệ sinh học để tạo ra các giống dứa có tính kháng bệnh.

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính
kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phƣơng
pháp RAPD ” đƣợc thực hiện với hy vọng là cơ sở để thực hiện có hiệu quả việc lai
tạo giống đồng thời tạo cơ sở cho việc chọn ra giống dứa có khả năng kháng tự
nhiên đối với bệnh héo đỏ đầu lá, góp phần bảo vệ năng suất, phẩm chất của cây
dứa, mang lại hiệu quả kinh tế cho nông dân và xã hội.




2
1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Phân tích đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan,
Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh.
Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa
Cayenne.
1.2.2. Nội dung
Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne.
Xác Định marker liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá.
1.2.3. Yêu cầu
Ly trích DNA tổng số từ lá dứa.
Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định sự đa dạng di truyền của các giống
dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa.
Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định band đa hình liên kết tính kháng
bệnh héo đỏ đầu lá dứa.

3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về cây dứa [8]
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc
Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:
Phân lớp: Magnoliophyta
Lớp: Liliopsida
Bộ: Poales
Họ: Bromeliaceae
Giống: Ananas
Loài: Anana comosus
Dứa có nguồn gốc ở Nam mỹ (Brazil, Achentina, Paragoay...). Hiện nay trên
thế giới, cây dứa đƣợc trồng ơ
̉
hầu hết các nƣớc nhiệt đới và một số nƣớc á nhiệt

đới có mùa đông tƣơng đối ẩm. Dứa đƣợc coi là một trong những cây ăn quả nhiệt
đới hàng đầu, loại quả “vua” rất đƣợc ƣa chuộng ở các nƣớc phƣơng Tây.
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa
2.1.2.1. Việt Nam
Ở nƣớc ta, dứa đƣợc trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nƣớc hiện khoảng
40.000 ha với sản lƣợng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh
trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long
An…; miền Bắc là Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Quang, Phú Thọ…; miền Trung có
Nghệ An, Quảng Nam, Bình Định… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh
phía Bắc khoảng 10 tấn/ha, phía Nam khoảng 15 tấn/ha.
Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ. Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu
hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12. Ở miền Nam, dứa
có thể ra hoa quanh năm, song thƣờng tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10. Từ khi
ra hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng.


4
Ngoài ăn tƣơi, quả dứa còn dùng chế biến thành dứa hộp và nƣớc dứa, là những
mặt hàng xuất khẩu lớn. Xác bã quả dứa sau khi chế biến dùng làm thức ăn gia súc và
phân bón. Thân lá dứa làm bột giấy.
2.1.2.2. Thế giới [18]
Sản lƣợng dứa hằng năm của thế giới tăng gấp 3 trong suốt 40 năm từ
3.833.137 tấn năm 1961 đến 13.738.735 tấn năm 2001 (d’Eeckenbrugge và Leal,
2001) và hiện nay đã vƣợt quá 13 tỉ tấn (FAOSTAT, 2001). 5 quốc gia sản xuất dứa
lớn nhất (bảng 2.1) chiếm khoảng 56% sản lƣợng của thế giới. Sản lƣợng của
Brazil, Columbia và Trung Quốc tăng gấp 3 từ 1980, trong khi Philippines và
Indonesia tăng nhẹ (Rieger, 2001).
Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất
Quốc gia Sản lƣợng 1999 (tấn)
Thái Lan 2 353 037

Philippines 1 530 033
Ấn Độ 1 440 000
Trung Quốc 1 231 066
Brazil 1 175 200
Thế giới 13 768 426

Khoảng 70% sản lƣợng dứa trên thế giới đƣợc tiêu thụ trong nƣớc ở dạng quả
tƣơi (d’Eeckenbrugge và Leal, 2001). Costa Rica, Côte d’Ivoire và Philippines có
lƣợng quả tƣơi xuất khẩu chiếm khoảng 63% quả tƣơi xuất khẩu của thế giới. Bảng
2.2 cho biết tình hình xuất khẩu trong năm 1999 của 5 nƣớc xuất khẩu dứa tƣơi
nhiều nhất thế giới.







5
Bảng 2.2 Quả tƣơi xuất khẩu
Quốc gia
Xuất khẩu trong năm
1999 (Tấn)
Costa Rica 353 000
Côte d’Ivoire 183 000
Philippines 127 682
Mỹ 31 521
Ghana 21 849
Thế giới 1 051 706

Sản phẩm dứa chủ yếu là dứa đóng hộp. Trong năm 1999, hơn 1 triệu tấn dứa
đóng hộp đƣợc xuất khẩu, chủ yếu từ Thái Lan, Philippines và Indonesia chiếm
khoảng 76%. Thái Lan là nƣớc xuất khẩu nhiều nhất chiếm 46% lƣợng xuất khẩu
toàn thế giới (FAOSTAT, 2001). Liên minh Châu Âu là 1 thị trƣờng lớn của quả tƣơi,
tiếp sau là Mỹ.
Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu
Quốc gia
Nhập khẩu trong năm
1999 (Tấn)
European Union 330 502
Mỹ 283 090
Nhật 89 866
Canada 32 507
Singapore 19 962
Thế giới 1 031 980

2.1.3. Các nhóm dứa chính [8]
2.1.3.1. Nhóm Queen
Là loại đƣợc trồng chủ yếu ở nƣớc ta hiện nay.
Đặc tính đóng hộp kém, nhƣng dùng để ăn tƣơi và xuất khẩu tƣơi rất tốt.


6
Các đặc điểm về hình thái:
Lá: Đầy gai, lá ngắn hơn Cayenne.
Chồi: Nhiều chồi cuống, chồi nhỏ.
Dạng quả: Hình nón, mắt sâu.
Trọng lƣợng quả trung bình 1 kg.
Lõi nhỏ.
Màu vỏ trái khi chín: Vàng.

Màu ruột khi chín: Vàng.
Hƣơng vị: Ngọt hơn Cayenne, ít chua, ít xơ, xơ ngắn, thơm. Thích hợp cho
tiêu thụ tƣơi.
Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá.
Năng suất kém.
2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha
Loại dứa này cũng có đặc tính đóng hộp kém, nhƣng dùng để ăn tƣơi và xuất
khẩu tƣơi rất tốt.
Các đặc điểm về hình thái:
Lá: Dài, hẹp, có gai.
Dạng quả: Hơi tròn, mắt rộng, dẹp.
Trọng lƣợng quả trung bình từ 1,2-1,5 kg.
Lõi rất lớn.
Màu vỏ trái khi chín: Cam.
Màu ruột khi chín: Trắng đến vàng.
Hƣơng vị: Ngọt, hơi có vị cay chua, nhiều xơ.
Tính đề kháng: Kháng bệnh héo đỏ đầu lá.
Năng suất kém.
2.1.3.3. Nhóm Cayenne
Là loại đƣợc trồng rất phổ biến trên thế giới, đồng thời cũng đƣợc dùng để đóng
hộp nhiều nhất.


7
Các đặc điểm về hình thái:
Lá: Gần nhƣ không có gai, chỉ có một ít gai ở chóp lá.
Chồi: Ít chồi.
Dạng quả: Hình trụ, mắt dẹp, cạn.
Trọng lƣợng quả trung bình từ 2-2,5 kg.
Lõi (cùi dứa) trung bình.

Màu vỏ trái khi chín: Vàng da cam.
Màu ruột khi chín: Vàng nhạt đến vàng.
Hƣơng vị: Ngọt, hơi chua, ít xơ, nhiều nƣớc, mềm.
Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá.
Năng suất cao.
Dứa Cayenne chứa rất nhiều nƣớc, vỏ lại mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển
đi xa. Tuy nhiên, nƣớc lại có tỉ lệ đƣờng cao, vị chua nhẹ (acid trong dứa Cayenne
thấp hơn dứa Queen), mùi thanh, rất hợp khẩu vị ngƣời phƣơng Tây. Mắt dứa
Cayenne lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay. Những ƣu điểm
trên rất thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne
là nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu nhƣ
toàn bộ diện tích dứa Cayenne ở nƣớc ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các
nhà máy chế biến dứa.
Các giống Cayenne đƣợc trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan,
Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả
miền Nam, giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt;
tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận . Giống Cayenne
Lâm Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam , thích nghi với khí hậu nƣớc ta , phẩm
chất tốt nên phát triển trong giai đoạn hiện nay.
2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự
bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của


8
một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền,
do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể,
làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác
với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là

tính đa dạng di truyền (trích dẫn bởi Lê Văn Huy, 2005) [5].
Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các
giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính
trạng bên ngoài. Ngƣời ta thƣờng tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra đƣợc sự khác
nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị.
Có 3 loại chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng:
Chỉ thị hình thái.
Chỉ thị isozyme.
Chỉ thị phân tử.
2.2.2. Chỉ thị hình thái
Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ đƣợc liên kết với một tính trạng hình thái
nào đó mà ngƣời ta có thể phát hiện đƣợc. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại
này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lƣợng chỉ thị ít do không
phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện đƣợc, đồng thời
độ chính xác và độ tin cậy thấp.
2.2.3. Chỉ thị isozyme
Isozyme là các dạng khác nhau của 1 enzyme của một cá thể, có cùng chức
năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tƣơng tự hoặc giống nhau) nhƣng
lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Nói cách khác, isozyme là tất cả các
dạng khác nhau của một enzyme đƣợc mã hoá bởi một locus di truyền. Hoạt tính
của chúng đặc trƣng đối với một cơ chất và trợ chất enzyme nhất định. Chỉ thị
isozyme là chỉ thị sinh hoá. Về di truyền isozyme đƣợc chia làm 2 loại:
Isozyme đơn gene: chịu sự kiểm soát của một gene có thể có các kiểu
phân tử khác nhau do có sự khác nhau về thành phần và trật tự acid amin và có thể
phân tách đƣợc bằng điện di.


9
Isozyme đa gene: tạo ra bởi hai hay nhiều gene.
Dựa vào đặc tính tích điện âm trên bề mặt, khi chiu tác động của dòng điện

một chiều isozyme sẽ di chuyển (trên gel polyacrylamide hoặc gel tinh bột) về cực
dƣơng của điện trƣờng.
Isozyme đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt trong nghiên
cứu đa dạng di truyền của thực vật và động vật, khoảng cách lan rộng của hạt phấn ,
định danh giống, kiểm tra phả hệ…
Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do số
lƣợng chỉ thị có thể phát hiện đƣợc nhiều hơn, tuy nhiên số lƣợng chỉ thị cũng vẫn
ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng.
2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA
Là những chỉ thị đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới
hạn (restriction enzyme) hoặc PCR. Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một
gene nào đó trong nhiễm sắc thể.
Các chỉ thị DNA có nguồn gốc từ hai nhóm:
Chỉ thị dựa vào phƣơng pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphisms).
Chỉ thị dựa vào phƣơng pháp PCR: SSCP (Single – Strand Conformation
Polymorphism), STS (Sequence – Tagged Sites), Microsatellites (SSR – Simple
Sequences Repeat), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism), DAF (DNA Amplification
Fingerpriting) …
Lợi ích của chỉ thị DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:
Đo lƣờng trực tiếp các vật liệu di truyền.
Có rất nhiều chỉ thị DNA trong quần thể.
Phân tích không bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng và giai đoạn phát triển của
đối tƣợng.




10

2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR , bằng cách sử dụng những primer ngắn
(khoảng 10 nucleotide). Nếu 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, khi thực hiện phản ứng
PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều
dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có khác biệt giữa các cá thể thì sẽ có sự thay
đổi về số lƣợng và vị trí bắt cặp ngẫu nhiên nên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các
đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể.

Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD
Ghi chú: - Các mũi tên biểu thị cho các vị trí gắn của primer trên mạch đơn
DNA mẫu. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành:
Sản phẩm A: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai
vị trí 2 và 5.
Sản phẩm B: là sản phẩm PCR khuếch đại.
Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do
hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại.
Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5,
do các primer không có chiều hƣớng vào nhau.
(Nguồn:

Kỹ thuật RAPD ra đời sau kỹ thuật RFLP, tuy khả năng tạo đa hình tƣơng
đƣơng với kỹ thuật RFLP nhƣng quy trình thực hiện đơn giản hơn, chi phí thấp hơn
và thu đƣợc kết quả nhanh hơn nên nhanh chóng có vị trí xứng đáng trong nghiên


11
cứu đa dạng di truyền một số cây trồng một và hai lá mầm nhƣ lúa, chuối, dứa,
bông cải, cà chua, dừa, cacao, điều… Ngoài ra RAPD còn dùng để phát hiện đột
biến , phát hiện chỉ thị phân tử, xây dựng bảng đồ gene.
Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện, thao tác

đơn giản, chi phí thấp, không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng, chất
lƣợng DNA tổng số không đòi hỏi quá tinh sạch, cho đa hình cao và thời gian thực
hiện ngắn.
Những hạn chế của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD không ổn định (độ lặp lại
thấp), cho đa hình cao nhƣng độ tin cậy lại thấp.
2.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài [3]
Tất cả các phƣơng pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể đều cho kết qủa
cuối cùng là các dữ liệu phân tử phức tạp nhƣ các băng vạch trên bảng điện di hoặc
thông tin trình tự DNA, RNA, protein. Để lấy đƣợc các thông tin sinh học từ dữ liệu
thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của máy tính với các phần mềm phân
tích dữ liệu thực nghiệm. Các thông số về độ đa dạng kiểu gene, độ đa dạng kiểu
hình, khoảng cách gene giữa các cá thể đƣợc tính toán theo phƣơng trình của Dice
(1979). Từ các thông tin này, cây phát sinh loài sẽ đƣợc xây dựng khi dùng các
phƣơng pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic),
Neighbor Joining, Transformed distance, Neighbors-relation, Maximum parsimoni
hoặc Maximum likehood, Minimum evolution. Trong các phƣơng pháp trên thì
phƣơng pháp UPGMA là phƣơng pháp đơn giản nhất và đang đƣợc sử dụng phổ
biến nhất.
UPGMA phản ánh mức tƣơng tự kiểu hình giữa các OTU (Operational
Taxonomic Unit) (đại diện cho các cá thể ) với ca
́
c bƣớc sau: Trƣơ
́
c tiên tạo ma trận
tƣơng quan giữa các OTU từ dữ liệu đa hình; với ma trận trên, thuật toán sẽ nhóm
một cặp OTU có khoảng cách nhỏ nhất (có mức tƣơng đồng gene cao nhất) với giá
trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU; sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này đƣợc xem
nhƣ một OTU mới và khoảng cách giữa OTU mới này với một OTU khác là trung
bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong nhóm. Thuật toán tiếp tục

12
nhóm các OTU có khoảng cách nhỏ nhất cho đến khi chỉ còn có hai OTU . Sau cu
̀
ng
là tạo một cây tiến hóa có gốc.
Để đánh giá độ chính xác của cây phân loài thì phƣơng pháp thông dụng nhất
là dựng bootstrap. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là thay đổi các thông số của ma
trận khoảng cách để tạo ra nhiều ma trận khoảng cách khác có cùng kích thƣớc với
ma trận gốc. Mỗi một ma trận tạo ra sẽ lập thành một cây phát sinh loài. Độ tin cậy
của 1 phân nhóm đƣợc đánh giá dựa vào mức độ lập lại của phân nhóm đó.
2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng
di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam [4]
2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới
Hiện nay, nhu cầu sản lƣợng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng
tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lƣợng phù hợp với
nhu cầu thị trƣờng. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã
đƣợc thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại marker (chỉ thị) phân tử
nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những
thành công đƣợc thể hiện qua những nghiên cứu sau:
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và
ctv, 1992). Sự đa dạng di truyền đƣợc tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus
L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas
erctifolius). Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A.
ananassoidies với mức tƣơng quan của A. comonus (0,398) và A.ananassoidies
(0,381). Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có
thể do đột biến.
Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv,
2001) đã cho thấy đƣợc sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas
comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tƣơng đồng để lai.

Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống
(dòng) dứa đƣợc thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của
chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác