Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azotobacter – thử nghiệm trên cây trồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
****





ĐỖ HOÀNH QUÂN




PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC
TÍNH TĂNG TRƯỞNG, CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI KHUẨN
AZOTOBACTER – THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY TRỒNG


LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ NGÀNH: 60.42.30






HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011


i

Lời cảm ơn

Trong khoảng thời gian hơn một năm làm luận văn tốt nghiệp, ngoài những nỗ lực
của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía các thầy cô trong Khoa Sinh
học, các thầy cô trong bộ môn Sinh hóa và quý công ty TNHH Gia Tường, giờ đây tôi đã
hoàn thành luận văn tốt nghiệp với rất nhiều cảm xúc khác nhau. Tôi xin trân trọng gửi
lời cảm ơn đến:
Quý thầy cô trong Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh hóa đã nhiệt tình giảng dậy, truyền
đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, là chìa khóa giúp em trong việc
hoàn thành đề tài nghiên cứu tốt nghiệp.
PGS. TS. Phạm Thị Ánh Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng
cho em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài tốt nghiêp.
ThS. Nguyễn Như Nhứt, Trưởng chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường – Bình
Dương, người luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Cảm ơn các anh chị và các bạn trong Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường luôn
bên cạnh động viên giúp đỡ tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Con xin tỏ lòng thành kính, biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ và gia đình luôn tạo mọi
điều kiện tốt nhất để con được học hành và là điểm tựa vững chắc cho con vượt qua mọi

khó khăn trong cuộc sống.

Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2011
Đỗ Hoành Quân


ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


A. Azotobacter
IAA Indol acetic acid
ATP Adenosin triphosphate
ADP Adenosin diphosphate
rH
2
Lưu lượng khí hydrogen
pO
2
Áp suất khí oxygen
PCR Polymerase chain reaction
OD Optical density
CFU Colony froming units
TB Giá trị trung bình
SD Độ lệch chuẩn thực nghiệm.


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ 4
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter 11
Bảng 3.3. Giá trị pH của các mẫu đất 44
Bảng 3.4. Đặc điểm và hình dạng khuẩn lạc của các chủng phân lập được 45
Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 20 chủng phân lập 51
Bảng 3.6. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của 20 chủng Azotobacter
phân lập trên môi trường Ashby 52
Bảng 3.7. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 trên
các môi trường nuôi cấy khác nhau 59
Bảng 3.8. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
cố định được trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 61
Bảng 3.9. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi
nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 62
Bảng 3.10. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
cố định được khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 63
Bảng 3.11. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy
trên các loại đường với các nồng độ khác nhau 65
Bảng 3.12. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau 68
Bảng 3.13. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi
trường cố bổ sung ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau 70
Bảng 3.14. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn
2+
và ion Cu

2+

ở các nồng độ khác nhau 71
Bảng 3.15. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi
nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 74
Bảng 3.16. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 75


iv

Bảng 3.17. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi
cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau 77
Bảng 3.18. Hàm lượng nitơ cố định được (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07
khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau. 79
Bảng 3.19. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại
các thời điểm nuôi cấy khác nhau 81
Bảng 3.20. Hàm lượng nitơ tổng cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07
tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 82
Bảng 3.21. Hàm lượng nitơ cố định được và sự tồn tại của các
chủng Azotobacter trong đất sau 45 ngày 84
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng Az 03 và Az 07
lên sự phát triển của cây cải xanh 85

v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Biểu đồ 3.1. Hàm lượng nitơ tổng của 20 chủng Azotobacter
cố định được trên môi trường Ashby 53
Biểu đồ 3.2. Khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07
trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 60
Biểu đồ 3.3. Khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07
trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 61
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của pH lên khả năng tăng trưởng
của hai chủng Az 03 và Az 07 63
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH lên khả năng cố định nitơ
của hai chủng Az 03 và Az 07 64
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả
năng tăng trưởng của chủng Az 03 66
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả
năng tăng trưởng của chủng Az 07 66
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng
cố định nitơ của chủng Az 03 68

Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng
cố định nitơ của chủng Az 07 69
Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 70
Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 71
Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 72
Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của ion Mn
2+
và ion Cu
2+
ở các nồng độ khác nhau
lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 72



vi

Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng trưởng
của chủng Az 03 và Az 07 74
Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng cố định nitơ
của chủng Az 03 và Az 07 75
Đồ thị 3.13. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng
tăng trưởng của chủng Az 03 77
Đồ thị 3.14. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng
tăng trưởng của chủng Az 07 78
Đồ thị 3.15. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng
cố định nitơ của chủng Az 03 79
Đồ thị 3.16. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng
cố định nitơ của chủng Az 07 80
Đồ thị 3.17. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng trưởng
của chủng Az 03 và Az 07 81
Đồ thị 3.18. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng cố định
nitơ của chủng Az 03 và Az 07 83

Mở đầu

- 1 -

MỞ ĐẦU
 Đặt vấn đề

Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí
N
2
với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp
được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững
trong phân tử N
2
, tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được.
Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực
hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của
nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém,
gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc
nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào
trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu.
Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng
cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase.
Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn
đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá
trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N
2
trong không khí thành NH
3

dưới tác dụng
của enzyme nitrogenase. Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng
khoáng của thực vật (NO
3
-
, PO
4
3-
, K
+
, Fe
2+
), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa
sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…). Loài vi sinh vật trên
phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng
hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng
giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những
khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng.
Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn
Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”.

Mở đầu

- 2 -

 Mục tiêu của nghiên cứu:
Tuyển chọn được chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ các chủng
phân lập, nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng và cố định đạm của các chủng chọn lọc, từ
đó ứng dụng trong lĩnh vực trồng trọt.

 Nội dung thực hiện:
- Phân lập chủng Azotobacter từ các mẫu đất ở Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai,
Long An, Tiền Giang, Bến Tre.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập.
- Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao.
- Định danh đến loài các chủng chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và cố định nitơ của
chủng chọn lọc.
- Thử nghiệm hiệu quả của các chủng chọn lọc trên cây cải xanh (Brassica Juncea).

PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU







Tổng quan tài liệu

- 3 -

1.1. Đai cương về nitơ
1.1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên
Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và
ngay cả với các loài vi sinh vật. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, riêng trong không khí,
nitơ chiếm 78,16% thể tích. Người ta ước tính rằng, trong bầu khí quyển bao trùm lên
một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ. Lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng
tới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa được nó). Trong cơ
thể các loài sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0.4 x 10
9
tấn nitơ. Trong các trầm tích
chứa 4 x 10
15
tỷ tấn nitơ [36].
Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất, một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần còn
lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết và xác trả
lại đất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử

thành đạm ở dạng hữu hiệu [6].
Trên thực tế trong tuần hoàn này đạm bị mất đi khá nhiều. Phần lớn phân người và
gia súc theo nước chảy ra biển do tưới, do mưa mà số lượng lớn đạm trong đất bị rửa
trôi, cuối cùng chảy vào biển. Số đạm này, một phần được trả lại bằng phân bón có
nguồn gốc từ sản phẩm của biển, nhưng phần rất lớn là ở dạng mà thực vật hầu như
không thể sử dụng được [6].
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử N
2
, dạng nguyên tử kép (N
2
)
được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần
nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO
3
-
và NH
4
+
. Để sử dụng
được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính là hóa học và sinh học [6].
 Hóa học: Kể từ năm 1920, biện pháp công nghiệp Haber-Bosch đã giúp con
người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ rất cao
(450 - 500
o
C), áp suất lớn gấp 400 lần áp suất khí quyển và Fe
3+
là chất xúc tác [40]. Các
hợp chất nitơ được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và
ổn định. Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm được tổng hợp hóa học cho nông
nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác hại vô cùng to

lớn, vì trung bình chỉ có 40-50% lượng đạm bón được cây hấp thu, phần còn lại gây ô
nhiễm môi trường đất, nước, không khí… từ đó gây hại, thậm chí là tiêu diệt các vi sinh
Tổng quan tài liệu

- 4 -

vật có lợi. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn đối với cá, động
vật thân mềm và con người. Một ví dụ cụ thể ở những người sống ở nông thôn và sử
dụng giếng nước chứa nitrat cao thì thường có hiện tượng oxy kết hợp với hemoglobin
(gọi là hiện tượng Methemoglobinemia) điều này gây hại đến tế bào máu. Ngoài ra, việc
lạm dụng phân đạm tổng hợp hóa học còn gây tác hại cho đất (như đất bị bạc màu, chua,
chai…) hay ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm (như việc tồn dư các hợp chất chứa
đạm như NO
3
-
, NH
4
+
) [6].
 Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện
được một quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả
năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng phân
bón vi sinh chứa các vi sinh vật trên vẫn đảm bảo cho năng suất cây trồng đồng thời hạn
chế sử dụng phân bón hóa học làm cho sản phẩm sạch và an toàn hơn, lượng nitrat giảm
đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất
do hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh
dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [8].
Bảng 1.1. Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ [6].
Cách cố định nitơ
Hàm lượng nitơ cố định

(10
12
g/năm)
Không phải con đường sinh học
(Non-biologital)
80
Công nghiệp (Industrial) 50
Sự cháy (Combustion) 20
Chớp hay sét (Lightning) 10
Con đường sinh học (Biologital) 175
Đất nông nghiệp 90
Đất rừng và không phải nông nghiệp 50
Biển 35


Tổng quan tài liệu

- 5 -

1.1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục,
ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các
chất khô của thực vật dao động từ 1-3%. Tuy
hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai
trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống
sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất
của cây trồng [3].
Sự thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém,
chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá
vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm

hoạt động quang hợp nên năng suất giảm [3, 10].
Thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành
năng suất của cây trồng. Cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ
đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có thu hoạch [3, 9].
1.1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên
1.1.3.1. Quá trình khoáng hóa
Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể vi
sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều
kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn này có sự tham gia của các
chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia
vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO
3
-
), một dạng thích hợp
để cho cây trồng hấp thu [38].





Hợp chất hữu cơ
Vi khuẩn amon hóa
NH
4
+

NH
4
+

NO
2
-

Vi khuẩn nitrat hóa
Nitrosomonas
NO
2
-

NO
3
-

Nitrobacter
a b

Hình 1.1. Cây lúa, không bón đạm (a);
có bổ sung đạm (b).
Tổng quan tài liệu

- 6 -

1.1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa
Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác
dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ [38].


1.1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử
Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống

cộng sinh ở rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do sẽ biến đổi N
2
trong không khí
thành NH
3
, từ NH
3
sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và
đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh,
ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới
hoạt động) [38].















Hình 1.2. Chu trình nitơ trong tự nhiên [37]


NO

3
-

Vi khuẩn phản nitrat hóa
N
2
N
2
+ H
2
Nitrogenase
Vi khuẩn cố định đạm
NH
3
H
2
O
NH
4
+

Không khí
Tổng quan tài liệu

- 7 -

1.2. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ
1.2.1. Phân loại
Vi khuẩn cố định nitơ được phân ra thành ba nhóm nhỏ: nhóm vi khuẩn sống cộng
sinh, nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ. Tuy

nhiên, sự phân biệt giữa ba nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố định đạm sống
tự do và nhóm vi khuẩn cố định đạm tương tác với thực vật thì vẫn chưa được mô tả một
cách rõ ràng và một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm [6,10].
* Vi khuẩn sống cộng sinh: là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủ
theo kiểu hai bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh
dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển
hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu. Hiện tượng cộng sinh giữa vi
khuẩn và cây họ Đậu được xem là tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi
khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết các vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn gram
âm , có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu, hay là những thành viên xạ khuẩn
thuộc chi Frankia – là vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây
thân gỗ, cây hai lá mầm và cây bụi. Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu
được phân loại thành chi Rhizobium, do đó, những vi khuẩn này thường được nói đến
như là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia). Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ
Đậu được phân thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium,
Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium [6,10].
* Vi khuẩn cố định nitơ tự do: là những vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực
vật mà không xâm nhập vào cơ thể của chúng theo hướng cộng sinh chuyên biệt. Trong
số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter, Pseudomonas và Clostridium
[6,10].
* Vi khuẩn cố định nitơ tương tác: là những vi sinh vật tham gia vào quá trình trao
đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc của rễ thực vật. Để
phân biệt được vi sinh cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ thì chủ
yếu dựa vào mức độ tương tác. Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình cố định
nitơ bởi những vi sinh vật sống tự do nhưng lại chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi cây trồng.
Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố định nitơ
Tổng quan tài liệu

- 8 -

đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác
bắt buộc. Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa cố định
nitơ cộng sinh và nitơ tự do. Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn
sống tự do trong vùng lân cận rễ cây thực vật đến những vi sinh vật sống nội sinh trong
mô tế bào thực vật. Để quá trình cố định nitơ của vi sinh vật tương tác có thể diễn ra cần
những yêu cầu sau đây [10]:
+ Thực vật ký chủ
+ Chất nền thực vật
+ Môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động.
+ Quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng.
Một số vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác điển hình như:
Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbasspirillum và
Klebsiella [10].
1.2.2. Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ
Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ
cung cấp đạm cho cây trồng. Bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết đến
với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như:
- Kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC
deaminase (1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase), hay tạo ra các hormone
thực vật như auxin, cytokinin và gibberellin. Đặc biệt các chủng Azotobacter kích thích
sự nẩy mầm của hạt và giúp phát triển hệ rễ của cây trồng [18, 22].
- Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, cạnh
tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh
sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ [18,20, 22].
- Ngoài ra, chúng còn giúp cây trồng hấp thu hiệu quả các ion như sắt, kẽm và các
nguyên tô vi lượng khác [24].

Tổng quan tài liệu

- 9 -

1.3. Vi khuẩn Azotobacter
1.3.1. Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại Bergey (2005), Azotobacter được chia thành 7 loài:
A. chroococcum, A. beijerinckii, A. vinelandii, A. salinestris, A. paspali, A.
nigricans, A. armeniacus.
- A. chrococcum (Beijerinck, 1901): tế bào hình que thẳng đến hình elíp, kích thước
đường kính 1,6 x 2,5 m và 3-5 m chiều rộng, tạo nang xác, có khả năng di động được,
có tiên mao. Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường.
Có khả năng đồng hóa mannitol, tinh bột, glucose…. Khuẩn lạc mờ đục, lồi, hầu hết các
chủng đều nhầy, trơn và bóng [14, 23].
- A. beijerinskii (Lipman, 1904): tế bào có kích thước 2,4 x 5,0 m, có khả năng tạo
nang xác, không có lông roi, không di động được. Khi già có màu vàng hoặc màu nâu
sáng. Sắc tố không khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol, không
đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri [14, 23].
- A. vinelandii (Lipman, 1903): tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng tạo
nang xác, có tiên mao, có khả năng di động. Loài này sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh
quang, sắc tố này khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannitol và Sodium
benzoat [14, 23].
- A. salinestris

(Page và Shivprasad, 1991) tế bào có hình cầu que (cocobacilli),
kích thước 2 x 3-4 m khi tế bào còn non, khi già có hình cầu với bán kính từ 3-5 m,
nhiều dạng và thường tìm thấy dạng kết đôi hoặc dạng chuỗi (6-8 tế bào), tạo nang xác.
Tế bào di động bởi chu mao (Peritrichous flagella) dài 9-10 m. Tế bào già thì không di
động, có khả năng tăng trưởng tốt ở dãy nhiệt độ 30-36
0

C. Nhiệt độ cố định nitơ tốt nhất
là 35
0
C, tế bào phát triển trong khoảng pH 6.2 – 8.0 và tối ưu ở pH 7.2. Khả năng sử
dụng nguồn carbon bao gồm fructose, galactose, glucose, sucrose, mannitol, melibiose,
0.25% sodium benzoate và tinh bột. Nguồn nitrate và amomonium được sử dụng như
nguồn nitơ. Sắc tố màu nâu nhạt đến nâu đen được tạo thành bởi hầu hết các chủng khi
chúng phát triển trên môi trường vô đạm và thông khí tốt [14, 23].
Tổng quan tài liệu

- 10 -
- A. paspali (Dobereiner, 1966): đặc điểm hình thái giống với các chủng loài
Azotobacter khác, nhưng tế bào dài hơn, kích thước tế bào thường 5 – 10 µm, có thể dài
tới 60 µm. Tế bào di động bởi chu mao (peritrichous flagella). Khuẩn lạc thường mờ đục
với đường mép liên nhau hoặc lượn sóng, thường không nồi và bề mặt nhám. Có thể sử
dụng ammonium nhưng không sử dụng được glutamate như là nguồn nitơ duy nhất cho
sự tăng trưởng. Theo Thompson và Skerman (1979),Nguồn carbon sử dụng được bao
gồm maltose, trihalose, raffinose, mannitol [14, 23].
- A. nigricans (Krasil’ nikov, 1949): Tế bào hình que đầu tròn, không di động và
không có tiêm mao. Khuẩn lạc thường trơn, nhưng có thể thay đổi do lượng
polysaccharide ngoại bào. Hầu hết tế bào mờ đục nhưng có thể trong mờ. Sắc tố được
tạo ra thường có màu đỏ tím. Tăng trưởng yếu hoặc không tăng trưởng ở 37
0
C.
Ammonium và nitrate được sử dụng như là nguồn nitơ thích hợp. Loài này mang gen nif
và vnf nhưng không có anf, có khả năng tổng hợp nitrogenase-1 và nitrogenase-2 [14,
23].
- A. armeniacus (Thompson và Skerman, 1981): đặc điểm hình thái của loài này
giống hầu hết các chủng khác. Tế bào di động bằng chu mao, khuẩn lạc mờ đục, rất nhầy
và bề mặt nhám nhiều hơn các chủng khác. Sắc tố tan trong nước màu nâu đen đến đỏ

tím [14, 23].


(a) (b) (c)
Hình 1.3. Tế bào sinh dưỡng các chủng Azotobacter [14]
A. chrococcum (a), A. nigricans (b), A. paspali (c)
1.3.2. Tổng quan về Azotobacter
Azotobacter thuộc chi vi khuẩn gốc rễ sống tự do, không sinh bào tử nhưng tạo bào
xác (cyst) giúp chúng chống chịu được với điều kiện khô hạn và bất lợi. Chúng được tìm
Tổng quan tài liệu

- 11 -
Tên loài
Đặc điểm
thấy trong đất trung tính đến kiềm, trong môi trường nước và trên một số thực vật.
Azotobacter được quan tâm nhiều do chúng có khả năng cố định nitơ phân tử từ không
khí thành ammonia. Quá trình cố định này được thực hiện nhờ hệ nitrogenase [17].
Chủng đầu tiên thuộc chi Azotobacter được phân lập từ đất là chủng Azotobacter
chrococcum ở Holland vào năm 1901. Kể từ đó các loài vi khuẩn này đã được nghiên
cứu bởi nhiều tác giả. A. chrococcum và A. algilis được nghiên cứu bởi Beijerinck
(1901). Trong nhiều năm tiếp theo thì các loài thuộc nhóm vi khuẩn Azotobacter khác đã
được tìm thấy trong đất và xung quanh vùng rễ như A. vinelandii (Lipman, 1903), A.
beijernckii (Lipman, 1904), A. nigricans (Krassilnikov, 19490), A. paspali (Dobereiner,
1966); A. armenicus (Thompson và Skerman, 1981), A. salinestris (Page và Shivprasad,
1991). Các loài vi khuẩn cố định nitơ này rất quan trọng trong ngành nông nghiệp và
môi trường [23]
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter [14]

A.
chroococcum
A.
armeniacus
A.
beijerinckii

A.
nigricans
A.
paspali
A.
salinestris
A.
vinelandii
Sắc tố tan trong nước
Vàng xanh
Xanh
Nâu đen
Nâu đen đến đỏ tím
Đỏ tím
Khử nitrate thành nitite
Nguồn carbon
D-Glucuronate
D-Galacturonate
Glutarate
Glycolate
Phenol
Rhamnose

Caproate
Caprylate
meso-Inositol
Malonate

-
-
-
-
-
+

-
-
-
-
-
-
+
-
-
+

-
-
-
+
+
-

-
+
d
-
-
-
-
+
+
-

-
-
-
-
-
+

+
+
-
-
d
-
-
-
+
-

-

-
d
+
d
+

-
-
-
-
-
-
-
-
-
d

+
-
-
-
+
-

-
-
-
-
-
-

-
-
-
-

-
-
+
-
-
+

+
nd
nd
nd
nd
-
nd
nd
nd
nd

+
d
-
-
d
+

-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
Tổng quan tài liệu

- 12 -
Propan-1-ol
Trehalose
Tinh bột thủy phân
Di động
Chu mao (Petitrichous flagella)
Sự cố định nitơ xẩy ra ở pH
5.0-5.5
6.0
6.5-9.5
10
Các gen cố định nitơ
nif
vnf
anf
Phát triển ở nhiệt độ:
9
0

C
14
0
C
18
0
C
32
0
C
37
0
C
Sản xuất polysaccharide ngoại bào
Peroxidase
Urease
Oxidase
Tạo H
2
S từ:
Thiosulfate
Cysteine
Sử dụng như nguồn carbon duy nhất
Fuctose, glucose, acetate, pyruvate,
fumarate, malate, succinate,
α-oxoglutarate, lactate, DL-gluconate,
hoặc methylcarbinol.
Sucrose
Propionate
β-Phenylpropionate

n-Butyrate
Glutarate
DL-β-Hydroxybutyrate
Benzoate
Trehalose
Melibiose
Maltose
-
+
+
+
+

-
-
+
+

+
+
-

-
d
+
+
d
+
d
+

+

d
-


+


+
+
d
+
-
d
d
d
+
+
-
+
+
+
+

-
-
+
d

d
nd
nd

-
-
d
+
d
d
d
+
d

-
-


+


d
d
-
+
d
+
-
+
+

+
d
d
d
-
-

d
+
+
+

+
+
-

d
+
+
+
-
d
d
+
+

d
-

+


+
+
-
+
-
+
+
d
+
d
d
+
d
-
-

d
d
+
+

+
+
-

d
d

+
+
-
+
d
+
+

d
-


+


+
-
-
d
-
d
-
+
d
d
-
-
-
+
+

-
d
+
+

+
+
+

-
+
+
+
+
-
-
+
+

+
d


+


+
-
-

-
-
-
-
-
-
-
nd
nd
nd
+
+

-
d
+
-

d
d
nd

-
-
-
d
+
d
+
+

nd

nd
nd


+


+
nd
nd
nd
nd
nd
+
nd
+
nd
+
-
-
+
+

-
+
+
+

+
+
+

-
+
+
+
+
d
+
+
+

+
d


+


+
+
+
+
+
d
+
-
+

+
Tổng quan tài liệu

- 13 -
Ghi chú:
(d) Kết quả dựa trên biểu hiện kiểu hình (sự tăng trưởng hoặc hoạt động của
nitrogenase)
(nd) Không xác định
(S) Nhậy cảm (susceptible) với kháng sinh
(R) Kháng (resistant) kháng sinh
1.3.3. Đặc điểm hình thái
Azotobacter là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que đầu tròn (rods with rounded
ends) đến hình trái xoan (ellipsoidal) hoặc hình cầu (coccoid), hình dạng của chúng tùy
thuộc vào môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy. Trên môi trường vô đạm
Winogradsky với glucose là nguồn carbon, tế bào còn non của các chủng khác nhau xuất
hiện rất giống nhau: hình que kích thước 1.6-2.7 x 3.0-7.0 µm, khi già chúng có khuynh
Raffinose
Propan-1-ol
Butan-1-ol
Glycerol
Mannitol
Sorbitol
Tính nhạy cảm với chất kháng sinh:
Streptomycin, 0.2 µg/ml
Tetracycline, 2 µg/ml
Chloramphenicol, 25 µg/ml
Sulfanilamid, 25 µg/ml
Penicillin G, 5 U/ml
Phenol, 0.05 %
Sodium benzoate, 0.5 %

Sodium fluoride, 0.01 M
HgCl
2
, 10 µg/ml
Iodacetate, 1 mM
Erythromycin, 2 µg/ml
Neomycin hoặc kanamycin, 1 µg/ml
Sinh bào xác
Sinh vỏ nhầy
Tỷ lệ %G+C trong DNA
+
d
+
d
+
+

S
d
d
d
d
R
d
d
d
S
S
S
+

+
65.8 –
67.5
d
-
d
-
+
+

S
R
d
R
S
S
R
R
R
S
R
S
nd
+
63.5 –
65.0

d
d
+

d
d
d

S
d
d
d
d
d
d
R
d
S
d
S
+
+
66.0 –
66.2
d
d
d
-
d
d

S
d
R

d
R
d
R
d
d
S
R
S
+
+
64.5
-
d
-
-
-
-

S
R
d
S
R
d
d
R
R
S
D

S
nd
+
63.2 –
64.6
nd
nd
nd
-
nd
nd

S
nd
R
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
S
nd
+
65.19 –
65.98
d
+

+
+
+
+

S
d
R
d
d
R
R
R
d
S
R
S
+
+
64.9 –
66.5
Tổng quan tài liệu

- 14 -
hướng chuyển thành hình trái xoan
đến hình cầu, một số có dạng chuỗi
và dạng sợi như A. paspali tạo thành
dạng sợi dài có chiều dài lên đến 60
µm [14].
Theo Tchan và New (1984), khi

chúng phát triển trên môi trường có
bổ sung chiết nấm men – peptone
agar thường tạo ra các tế bào biến
dạng [14].
Azotobacter tăng trưởng dưới điều kiện cố định nitơ thường có kích thước nhỏ hơn
khi phát triển trên môi trường có ammonia. Azotobacter thường tồn tại ở dạng đơn, hoặc
đôi hoặc thành từng nhóm không đều (A. paspali), hiếm khi tồn tại dạng chuỗi [14]. Khi
già, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng
hình cầu, tế bào được bao bọc bởi một lớp vỏ nhầy khá dày, vỏ nhầy đó chứa khoảng
75% là chất hydrid của uronic acid và chỉ chứa khoảng 0,023% nitơ và sinh chất xuất
hiện nhiều hạt lổn nhổm, đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… [19].
Khuẩn lạc của Azotobacter thường trơn, bóng, đục, lồi và nhầy. Khi còn non khuẩn
lạc có màu trắng đục, sau đó dần dần chuyển sang màu vàng hoặc nâu đen. Tuy nhiên
các đặc điển trên có thể thay đổi trong một số trường hợp. Như A. vinelandii, các khuẩn
lạc biến thể nhỏ hơn có thể xuất hiện do sự tạo thành polysaccharide ngoại bào giảm. A.
armeniacus thỉnh thoảng tạo ra những khuẩn lạc trong mờ (translucent) và khuẩn lạc A.
paspsli dạng viền gợn sóng (undulate edged) và lồi không đều (unevenly convex) với bề
mặt xám hoặc nhám. Trên môi trường có sucrose hoặc raffinose, tùy thuộc vào chủng
giống thì có sự tạo thành các homopolysaccharide, chúng có thể khuếch tán ra xung
quanh khuẩn lạc. Theo Thompson và Skerman (1979) loài A. chrococcum và một số
chủng thuộc loài A. beijerinckii và A. nigricans tạo ra các homopolysaccharide khuếch
tán từ cả hai loại đường trên, trong khi đó loài A. meniacus và một số chủng thuộc loài
Hình 1.4. Tế bào sinh dưỡng chủng A. paspali
Tổng quan tài liệu

- 15 -
A. beijerinckii và A. nigricans khác tạo ra các homopolysaccharid khuyếch tán khi môi
trường có bổ sung nguồn sucrose [14].

(a) (b)
Hình 1.5. Một số dạng khuẩn lạc Azotobacter
chủng A. beijerinskii (a); chủng A. vinelandii (b)
1.3.4. Đặc tính di động
Azotobacter có khả năng di động với tiêm mao (flagella) hoặc không di động. Sự sắp
xếp của tiêm mao có rất nhiều tranh cãi nhưng theo quan sát của Hofer, Krasilnikov và
cộng sự bằng kính hiển vi thì hầu hết Azotobacter có lông roi nằm ở bên; ngoại trừ A.
insique có tiêm mao nằm ở một cực. Kích thước trung bình khoảng 2,0 - 7,0 µm

và 1,0 -
2,5µm, đôi khi có chiều dài đạt đến 10-12 µm [19]. A. beijerinckii và A. nigricans thì
không di động. Các chủng khác thì di động bằng chu mao (peritrichous flagella). A.
vinelandii OP là chủng vi khuẩn di động
nhanh, với vận tốc trung bình đo được là
74 µm/giây (Haneline et al., 1991). Nồng
độ oxy và một số chất được tìm thấy làm
tăng tốc độ di chuyển của tế bào như là
những chất có chức năng dẫn dụ. Các chất
này như là fructose, glucose, xylitol,
mannitol, hexose, hexitol, pentiol, pentose,
disaccharide và các đường amino [14].
Hình 1.6
.
Hai tế bào

A. chroococcum bắt cặp
(diplococcus) di động bằng chu mao [23]
Tổng quan tài liệu

- 16 -

1.3.5. Sự hình thành bào xác (cyst)
Bào xác được hình thành ít hơn 1% số tế bào ở cuối pha ổn định khi nuôi cấy trên
glucose hoặc mannitol. Sự hình thành nang bào xác (encystment) có thể lớn hơn 90%
sau khi bổ sung butan-l-ol hoặc β-hydrobutyrate vào môi trường nuôi cấy (Lin và Sadoff,
1968). Sự có mặt isopropanol có thể tốt hơn cho chủng A. chrococcum (Marengo, 1983)
[25]. Trong thời gian kết bào xác thì hầu
hết các hoạt động trao đổi chất bị ngưng
lại. Chúng có sức chịu đựng khô hạn và
sự hủy hoại do tác nhân vật lý và hóa
chất tốt hơn đáng kể so với tế bào sinh
dưỡng (Socolofsky và Wyss, 1962). Khi
nghiên cứu cấu trúc siêu vi, cho thấy
chúng được cấu thành từ một cơ quan
trung ương (central body)
có chứa β-hydrobutyrate bao quanh bởi lớp trong và lớp ngoài giống màng bao
(capsule), với alginate là thành phần chủ yếu. Sự lắng đọng vật liệu của vỏ và các thành
phần màng trong trường hợp không phân chia tế bào tạo ra lớp màng bao bên ngoài
(exine coat) (Hitchins và Sadoff, 1970). Các túi bên trong di chuyển ra phía màng ngoài
nơi chúng hình thành một lớp màng ở bên trong. Các túi này có thể đã được tạo ra trong
thời gian tế bào sinh dưỡng (Vela và cộng sự, 1970). Quan sát này cung cấp những bằng
chứng cho thấy bào xác chỉ đơn giản là tế bào sinh dưỡng ở trạng thái nghỉ ngơi và
chúng không giống bào tử vi khuẩn. Theo Lin và Sadoff (1969), thành phần của lớp
màng bao bên ngoài ở A. vinelandii bao gồm: 32% carbohydrate, 28% protein và 30%
lipid [14, 25].
1.3.6. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
1.3.6.1. Khả năng sử dụng nguồn carbon
Khả năng sử dụng đa dạng nguồn carbon của loài Azotobacter là rất quan trọng đối
công việc nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt, nguồn carbon có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả của việc cố định nitơ phân tử [14]. Azotobacter có thể sử dụng các hợp chất alcohol
(ethanol, propanol, butanol, 2,3-butylene glycol, glycerol, sorbitol, mannitol, inositol);

Hình 1.7
.
Dạng bào xác của chủng chủng Azotobacter

Tổng quan tài liệu

- 17 -
acid hữu cơ (acetic, propionic, butyric, valeric, malic, lactic, malonic, …) và các loại
mono-, di-, tri- và polysaccharide (glucose, fructose, sucrose, maltose, lactose, trihalose,
raffinose, dextrin, tinh bột, glycogen) là nguồn carbon [14, 25, 16]. Một số nguồn carbon
được sử dụng ở tất cả các loài, trong khi các nguồn carbon khác chỉ được sử dụng ở một
số loài. Kể từ khi Thompson và Skerman (1979) công bố, đã có thêm vài nghiên cứu
khác về việc sử dụng nguồn carbon của các loài, trong đó, ấn phẩm của Manulal. Theo
De La Vega và cộng sự (1991), sucrose bị suy thoái (degrade) bởi enzyme invertase
ngoại bào ở A. chrococcum ATCC 4412, trong khi ở A. vinelandii UW (ATCC 13705),
sự suy thoái ấy lại do enzyme invertase nội bào.

Chen và cộng sự (1993) thấy rằng, A.
chrococcum (ATCC 9043) và A. vinelandii UW sử dụng không chỉ được các hợp chất
thơm (aromatic compounds) benzoate và 4-OH-benzoate mà còn catechol, naphthalene,
procatechuate và 4-toluate. A. chrococcum biểu hiện dioxygenase chỉ phân cắt ở vị trí
ortho khi tăng trưởng trên naphthalene và 4-toluate và chỉ cắt ở vị trí meta của các hợp
chất thơm khác (Thompson và Skerman, 1979). A. vinelandii biểu hiện enzyme phân cắt
cả vị trí ortho và meta (Chen và cộng sự, 1993). Điều thú vị là tỉ lệ tăng trưởng và hoạt
tính nitrogenase gần như cao hoặc cao hơn khi nguồn carbon là các hợp chất thơm –
benzoate và naphthalene, đặc biệt đối với A. chrococcum và A. vinelandii. Trong số các
chủng phân lập từ đất ở gần Leiceter nước Anh được tăng sinh làm giàu trên
monochloroacetate, một chủng – RC26 – có nhiều đặc điểm nuôi cấy và sinh lý mà xếp
nó trong chi Azotobacter (Diez et al., 1995). Chủng này có thể khử một số hợp chất
halogen khác nhau được sử dụng như là thuốc trừ sâu sinh học giống với loài

Pseudomonas đã xác định [14].
Việc sử dụng các nguồn carbon như trên rất có ý nghĩa trong việc định danh loài, như
loài A. chrococcum có khả năng đồng hóa tốt lactose và glycerol, trong khi A.
beijerinckii lại sử dụng tốt mannitol và tinh bột. A. agile dường như chỉ sử dụng hạn chế
một số nguồn carbon nào đó, chúng lựa chọn nguồn carbon hơn các loài khác, chúng
không sử dụng mannitol và benzoate [34]. A. insigne bị giới hạn bởi ethanol và acid hữu
cơ đặc biệt là formic acid và benzoic acid [19].