xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm lâm sàng màng sinh học từ cellulose vi khuẩn trị tổn thương mất da

1


PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài: Xây dựng qui trình sản xuất và thử nghiệm lâm sàng màng sinh học
từ cellulose vi khuẩn trị tổn thương mất da.
Chủ nhiệm đề tài: GS.TS. Nguyễn Văn Thanh
Đồng chủ nhiệm đề tài: TS. Huỳnh Thị Ngọc Lan
Cơ quan chủ trì: ĐH Y Dược TP. HCM
Thời gian thực hiện: 24 tháng
Kinh phí được duyệt: 870 triệu
Kinh phí đã cấp: 600 triệu đồng theo TB số: TB 284 / TBKHCN ngày 11 tháng 12
năm 2007
Mục tiêu
- Xây dựng qui trình sản xuất màng sinh học từ cellulose vi khuẩn phối hợp với
họat chất tái sinh mô của dầu mù u và tinh dầu tràm trà Úc trị tổn thương mất da với
qui mô 1500 màng/ lô.
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm màng
- Thử nghiệm lâm sàng màng sinh học đến hết giai đoạn 2 để làm cơ sở cho
việc điều trị tổn thương mất da bằng màng sinh học.
Nội dung
1. Xây dựng qui trình sản xuất màng trị tổn thương mất da từ cellulose vi
khuẩn phối hợp với hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u và tinh dầu tràm trà Úc:
Chúng tôi xây dựng các tiêu chuẩn về nguyên liệu và xây dựng các qui trình ở qui mô
sản xuất 1500 màng / lô
✦
✦✦
✦ Chuẩn bị nguyên liệu và xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu:
• Nguyên liệu nuôi cấy tạo màng cellulose bán thành phẩm: nguồn nguyên liệu

để nuôi cấy Acetobacter xylinum là nước dừa già, nguồn protein, đường glucose và
các loại muối khoáng, trong đó nguồn nước dừa già cần phải được xử lý và kiểm soát
chất lượng trước khi sử dụng và cần xây dựng tiêu chuẩn nước dừa khô về mặt vi
sinh. Nước dừa đạt tiêu chuẩn sẽ được xử lý cho trong và đưa đi tiệt trùng.

2

• Nguyên liệu tạo màng thành thành phẩm
- Hoạt chất tái sinh mô: chiết xuất từ dầu mù u, xây dựng tiêu chuẩn họat chất
này bao gồm các tiêu chuẩn lý hóa, thành phần acid béo và thử không gây kích
ứng da.
- Tinh dầu tràm trà Úc: xây dựng tiêu chuẩn về tinh dầu tràm trà Úc bao gồm
tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn hay gây nhiễm vết thương và tính kích ứng da.
- Bao nhôm sử dụng để đóng gói
- Các loại hóa chất sử dụng tinh chế màng: hóa chất tinh khiết
✦
✦✦
✦ Xây dựng các qui trình với qui mô sản xuất 1500 màng /lô
• Xây dựng qui trình tạo màng cellulose thô từ vi khuẩn Acetobacter
xylinum qui mô 1500 màng / lô
- Xây dựng qui trình nhân giống vi khuẩn: sử dụng phương pháp nuôi cấy động
với thể tích từ 8 lít đến 30 lít giống. Khảo sát các thông số động học của quá trình
nhân giống để đạt khả năng tăng trưởng khoảng 100 lần, từ đó có thể sử dụng để nhân
giống cho 200 lít đến 400 lít môi trường tạo màng cellulose.
- Xây dựng qui trình nuôi cấy tạo màng cellulose thô: khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Qui trình này thực
hiện trong các hộp nhựa kích thước 22m x 12cm x 10cm. Mỗi mẻ nuôi cấy sử dụng
khoảng 200 hộp nhựa/ mẻ với số màng thu được khoảng 1500 màng kích thước 10 cm
x 10 cm.
• Xây dựng qui trình tinh chế màng cellulose thô qui mô 1500 màng / mẻ:

màng cellulose thô có màu vàng nhạt bên trong còn chứa vi khuẩn Acetobacter
xylinum và các tạp chất của môi trường nuôi cấy. Vì vậy cần phải phá vỡ các tế bào vi
khuẩn và lọai độc tố. Màng cellulose sau khi tinh chế có màu trắng trong, đạt độ tinh
khiết cao, đạt các tiêu chuẩn đã được nghiên cứu để chế tạo màng trị tổn thương mất
da như không kích ứng da, có khả năng cản khuẩn, có độ bền cơ học cao và có khả
năng hút dịch.
• Xây dựng qui trình kiểm tra chất lượng sản phẩm cỡ mẫu 250 mẫu: kiểm
tra chất lượng màng bán thành phẩm, màng thành phẩm theo đúng các tiêu chuẩn chất

3

lượng cơ sở đã đặt ra với các phương pháp kiểm nghiệm đã qui định của Dược điển
Việt nam và các Dược điển có uy tín khác.
• Xây dựng qui trình tạo màng trị bỏng thành phẩm ACETUL: màng
cellulose tinh khiết được phối hợp với hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u và tinh dầu
tràm trà Úc và các tá dược. Màng thành phẩm được đóng gói trong bao PE và bao
nhôm và sau đó tiệt trùng bằng tia gamma.
Theo dõi độ ổn định của sản phẩm: màng ACETUL sẽ được theo dõi các đặc
tính của màng như khả năng kháng khuẩn, khả năng thấm hút dịch, khả năng cản
khuẩn và thành phần hoạt chất tái sinh mô ở điều kiện tự nhiên (nhiệt độ phòng)
trong thời gian 2 năm.
2. Thử nghiệm lâm sàng: thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 và 2
- Lập hồ sơ thử nghiệm lâm sàng và đăng ký với Bộ Y tế
- Thử nghiệm lâm sàng giai đọan 1: thử nghiệm trên 30 người khỏe mạnh nhằm
thiết lập đánh giá sơ bộ về tính an tòan của chế phẩm trên người.
- Thử nghiệm lâm sàng giai đọan 2: thử nghiệm lâm sàng ở qui mô vừa trên 50
bệnh nhân bị bỏng độ 2 nhằm đánh giá hoạt động trị liệu, tính an toàn của thuốc
trên các bệnh nhân, chế độ điều trị thích hợp.

4

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Sử dụng các loại màng che phủ vết thương mất da
Việc điều trị những vết thương mất da nhất là những tổn thương do bỏng thật sự là
một thách đố lớn. Ngay tại Mỹ cũng có đến 12 000 nạn nhân đã chết mỗi năm vì bỏng
hoặc do những nguyên nhân mất da khác. Vào những tháng cao điểm, hàng ngày Viện
bỏng Quốc gia phải điều trị cho khoảng 200 bệnh nhân bị các vết thương do bỏng, tai
nạn giao thông, tai nạn nghề nghịêp. [8] Các tai nạn nêu trên đã tạo ra các thương tích
rất nặng nề. Chấn thương bỏng làm gia tăng sự thẩm thấu nước, protein và các chất
điện giải, dẫn đến tăng tiết dịch, tạo điều kiện gia tăng sự nhiễm trùng vết thương.
Tiến trình lành vết thương mất da tùy thuộc rất nhiều vào quá trình điều trị chăm sóc
vết thương. Một trong những yếu tố quan trọng không thể thiếu trong quá trình điều
trị này là sử dụng các loại vật liệu che phủ vết thương.[72] Đã có nhiều công trình
nghiên cứu chứng minh được rằng một vết thương hay một vết bỏng sẽ chóng lành
khi nó được giữ trong một điều kiện thích hợp, nghĩa là cần có một lớp màng bảo vệ
vết thương (wound dressing). Một lớp màng bảo vệ sẽ có ý nghĩa rất lớn trong việc

giữ cho vết thương tránh khỏi sự nhiễm trùng, có một độ ẩm thích hợp, kích thích
lành sẹo, bảo vệ những tế bào mới hình thành và quan trọng nhất là hạn chế tình trạng
mất nước và chất điện giải liên tục do sự bay hơi từ bề mặt vết thương.[24],[39] Điều
này sẽ giúp cải thiện toàn trạng vết thương. Đáp ứng nhu cầu này, đã có rất nhiều loại
màng được nghiên cứu chế tạo và đã được chứng minh hiệu quả thực tế điều trị.
1.2. Các loại băng sử dụng che phủ vết thương
Băng vết thương phải có một trong những chức năng sau: [25],[52],[74]
(1) Có khả năng hút dịch rỉ và các độc tố trên bề mặt vết thương. (2) Duy trì môi
trường ẩm cho vết thương; (3) Hấp phụ mùi; (4) Cho phép thông khí; (5) Tạo ra sự
cách nhiệt; (6) Có khả năng cản vi khuẩn, bảo vệ vết thương khỏi sự nhiễm khuẩn;
(
7)
Có tác động làm sạch vết thương (loại bỏ mô chết và những tiểu phân lạ); (8)
Không độc, không kích ứng; (9) Lấy ra dễ dàng khỏi vết thương, không gây tổn

5

thương. Dựa trên nguồn gốc vật liệu, người ta chia màng ra làm các loại: băng gạc
thiên nhiên, băng tổng hợp, băng sinh học.
Theo cơ chế tác động có thể phân loại băng như sau: [17],[19]
Bảng 1.1. Phân loại băng vết thương theo cơ chế tác động
Loại băng Đặc tính
Băng truyền thống Các loại băng truyền thống có khả năng che phủ vết thương, kh
ả
năng thấm hút và cản khuẩn kém (băng gạc)
Chế phẩm tương tác Màng tổng hợp và những dạng phần lớn trong suốt, hơi nước v
à
khí oxy có khả năng thấm qua, ngăn cản vi khuẩn
(hyaluronic acid, hydrogel, màng dạng bọt…)

Các ch
ế phẩm có hoạt
tính sinh học
(Bioactive products )
Các loại băng có chứa các chất có hoạt tính làm lành vết th
ương
(hydrocolloids, alginat, collagen, chitosan…)
Băng truyền thống
Băng gạc được làm từ sợi cotton thiên nhiên dưới dạng gạc hoặc vải. Thường dùng
làm lớp che phủ đầu tiên cho vết thương tiết dịch nhiều, vết thương nhầy nhớt, xước
da, vết bỏng nhẹ. Ưu điểm của băng gạc là không gây bít vết thương, thông thoáng,
nhưng gạc cũng có nhiều khuyết điểm như không cản khuẩn, gạc hút dịch rỉ vết
thương nhanh và trở nên khô, gây đau đớn cho bệnh nhân khi thay băng, không có tác
dụng kích thích sự mau lành của vết thương. Băng gạc có thể được phối hợp với các
chất khác như vaselin, chất sát khuẩn …
Băng tổng hợp
Băng tổng hợp còn được xem là những chế phẩm tương tác. Băng tổng hợp gồm các
lọai: băng gạc dạng sợi polymer giống như những loại băng gạc truyền thống, băng
dán vết thương (như băng dán kẽm), các dạng màng polymer.
Các polymer tổng hợp có nguồn gốc từ sản phẩm dầu hỏa. Polymer tổng hợp có nhiều
ưu điểm như có khả năng bám dính, che phủ toàn bộ viền vết thương, dễ dàng sử

6

dụng, nhưng nhược điểm chính là thiếu các đặc tính sinh học như thúc đẩy tiến trình
liền vết thương thông qua kích thích các tế bào liên quan. Những màng này dùng che
phủ vết bỏng sâu và vết loét trên da. Chúng tạo một môi trường trơ kiểm soát nhiệt độ
và độ ẩm của vết thương đồng thời có khả năng cản khuẩn.
Các loại băng có chứa chất kháng khuẩn
Các băng loại này gồm có các dạng như gạc, vải, lưới từ sợi polymer tổng hợp được

tẩm thêm những chất kháng khuẩn như iodin, hợp chất bạc, sulfamid [12],[47],[49].
Những chất này có khả năng sát khuẩn mạnh và phổ rộng. Các loại băng có chứa chất
sát khuẩn thích hợp cho những vết thương ở pha viêm và pha tăng sinh ở những vết
thương nhiễm khuẩn nặng.
Các polymer dưới dạng màng film

Màng film là một loại màng đồng nhất, bao gồm một lớp polymer, mặt bên được phủ
1 chất dính. Các polymer thường sử dụng là: polyurethan, polyethylen,
polycaprolacton Màng film thích hợp cho vết thương nông. Tuy nhiên do thiếu
khoang hấp thu, không cho hơi nước và khí thoát ra, gây tích tụ dịch tiết vết thương
dưới lớp màng, đồng thời cho phép vi khuẩn xâm nhập vào bề mặt vết thương. Chính
vì thế, chúng không phù hợp với vết thương rộng. Một số loại màng film từ
polyurethan như: Tegaderm
®
(3M Health Care Ltd.), Opsite Wound
®
(Smith &
Nephew plc.).
Màng kép
Màng này gồm hai hay nhiều lớp. Lớp ngoài cùng được thiết kế để tạo được độ bền,
độ đàn hồi và kiểm soát sự thoát hơi nước. Trong khi lớp trong được thiết kế để tạo độ
bám dính cao và độ đàn hồi như màng Granuflex, Biobrane. Màng này dễ dàng dính
chặt vào bề mặt vết thương để phát huy tác dụng tăng sinh mô liên kết, mạch máu
nhưng đồng thời lại gây ra nguy cơ nhiễm trùng và kéo dài giai đoạn co hẹp khép kín
miệng vết thương.[13]
Băng thấm và bán thấm tổng hợp: gồm có băng hydrogel và băng hydrocolloid
Băng hydrogel: là một mạng lưới 3 chiều làm từ polymer ưa nước (có thể chứa được
tới 90 % - 95 % nước).[34] Chúng được làm từ các vật liệu như gelatin hoặc

7

polysaccharid liên kết với các polymer. Các polymer thường sử dụng nhất là
polyethylene oxid, polyacrylamid và polyvinylpyrolidin. Màng hút nước và có khả
năng làm mát, làm giảm đau nên thường được sử dụng sơ cứu khi bị bỏng nhiệt. Trên
các vết thương khô, màng hydrogel có khả năng tạo môi trường ẩm ướt làm cho vết
thương mau lành. Một số loại màng hydrogel có chứa các hoạt chất có tác động trên
tiến trình lành vết thương như màng Carrasorb
®
chứa acetylat mannan có tác dụng
kích thích các yếu tố như IL – 1, TNF - ; màng Tegaderm
TM
có chứa acid hyaluronic
và chondrotin sulfat liên kết với glucosaminoglycan. Những chất nền này có tác dụng
kích thích sự tạo thành mô hạt và làm tăng sự biểu bì hóa.[41]
Băng Hydrocolloid: là hỗn hợp các thành phần dính và đàn hồi. Trong đó carboxy
methyl cellulose được dùng làm tác nhân hút dịch rỉ vết thương phổ biến nhất. Một số
sản phẩm trên thị trường như: Duoactive
®
(Convatec Co.), Absocure
®
(Nitto Medical
Corp.), Duoderm. Các loại băng này không dính chặt vào nền vết thương nên khi thay
băng sẽ không làm tổn thương biểu bì. Ngoài ra sau khi thấm hút dịch từ vết thương
loại băng tổng hợp này sẽ tạo ra môi trường ẩm có lợi cho vết thương.[29],[30],[31]
Màng có cấu trúc hạt: một số loại màng còn có cấu trúc từ các hạt tự nhiên phối hợp
với sợi polymer như calcium alginat, chitin, dextran polymer, vải từ than hoạt.
Màng alginat: thành phần là alginat natri chiết xuất từ tảo nâu. Alginat natri tan trong
nước, có thể chuyển thành muối calci không tan. Màng được dùng trị bỏng, viêm loét
chân và vết thương nhiễm trùng do chấn thương. Một số sản phẩm màng alginat trên
thị trường hiện nay như: KaltoStat

®
(Convatec Co.), Sorbsan
®
(Alcare Company).
[28],[62],[70]
Màng chitin: chitin là một hợp chất cao phân tử cấu tạo bởi N-acetyl D- Glucosamin
là thành phần chính của lớp vỏ loài giáp xác. Chitin được làm thành nhiều dạng như
dạng xốp, sợi như cotton, dạng lớp, dạng sợi đan lại. Nhược điểm là màng không
thấm hút dịch và dính vào vết thương.[21],[53]
Màng maltodextrin: maltodextrin có cấu trúc D- glucose polysaccharide. Tính ưa
nước của dạng bột này làm cho chúng bị lôi cuốn vào sâu bên trong vết thương và hòa
tan các dịch rỉ bám vào vết thương từ đó làm gia tăng khả năng thấm hút dịch.[78]

8

Các loại băng tổng hợp vô định hình
Hydrogel vô định hình: thành phần giống băng hydrogel, ngoại trừ polymer không
liên kết để tạo thành phiến, chứa một lượng nhỏ collagen, alginate và phức hợp
carbohydrate. Chúng tạo độ ẩm cho vảy khô của vết thương và tạo điều kiện thuận lợi
giúp vảy tự phân hủy. Do độ nhớt của hydrogel ưa nước nên khó giữ chúng trên vết
thương. Tuy nhiên, chúng có tốc độ phủ đầy biểu mô và đóng kín vết thương có thể so
sánh với băng hydrocolloid.
Băng tổng hợp dạng hơi: tạo thành lớp màng mỏng có khả năng thấm khi xịt vào vết
thương.
Băng tổng hợp dạng bọt: tạo thành màng xốp khi sử dụng. Đặc tính chính của màng
xốp là độ xốp, sự cách ly và tăng sự bám dính vết thương. Những polymer như
polyurethane dùng để tạo bọt bền sau khi tiếp xúc với vết thương. Những vật liệu này
lấp đầy những khoang trên vết thương. Chúng mềm, có bề mặt xốp, có khả năng thấm
hút khi tiếp xúc với vết thương. Dịch rỉ và mảnh vụn tế bào được hấp thu và giữ lại
trong màng xốp. Sự trao đổi hơi nước và khí được điều chỉnh bằng sự thay đổi thể tích

từng phần của polymer và mật độ liên kết. Một bất lợi của dạng này là sức bền căng
kém và thiếu cấu trúc toàn vẹn.
Màng sinh học: màng sinh học có nguồn gốc từ mô tự nhiên, gồm nhiều dạng, có thể
là sự kết hợp giữa collagen, elastin và lipid. Hiện nay, nhiều loại polymer sinh học
như collagen, fibrin, fibronectin, acid hyaluronic đã được dùng làm màng che phủ vết
thương trên da. [32]
Không giống như polymer tổng hợp, polymer sinh học trơ với vết thương do đó chúng
đóng vai trò quan trọng trong tiến trình làm lành vết thương trên da. Màng sinh học có
các khả năng: (1) Giữ ẩm tốt; (2) Giảm sự mất protein và chất điện giải của dịch tiết
vết thương; (3) Cản khuẩn; (4) Giảm đau; (5) Tái tạo mô, giảm thời gian làm lành vết
thương, đặc biệt vết thương sâu và rộng; (6) Ức chế sự tạo thành nguyên bào sợi quá
mức, giảm sự co rút vết thương. Một số loại màng sinh học điển hình như màng
collagen, màng ối đông khô

9

Màng collagen được thiết kế dưới dạng gel (Collasate
®
, …) dạng màng sợi hoặc
không sợi, dạng hạt (Collamend
TM
Veterinary Products Laboratory, Phoenix, AZ…),
cấu trúc lỗ xốp. Sử dụng màng collagen dạng sợi từ bò cho thấy bề mặt vết thương trở
nên khô do bị mất nước vì vậy màng không còn tác động như một màng thấm hút.
Với dạng cấu trúc lỗ xốp cho phép mô mới được tái tạo ngay trong vật liệu, theo thời
gian các mô bị tổn thương và mô cấy tiếp xúc chặt chẽ với nhau và không thể tách rời.
Cuối cùng mô cấy sẽ bị thoái hoá và dần dần được thay thế bằng mô sẹo bình thường.
Để tạo collagen dạng xốp, người ta đông khô collagen type I được xử lý trước bằng
cách khử nước, chiếu xạ hoặc bằng các chất hoá học như carbodiimid, glutaraldehyd,
formaldehyd, hoặc diisocyanat. Tuy nhiên, sự có mặt của các tác nhân trên hoặc các

chất giải phóng từ sự phân hủy có thể làm cản trở tiến trình lành vết thương. Màng
collagen có thể được phối hợp với kháng sinh. [65]
Màng ối đông khô: cho tác dụng tốt và đã được ứng dụng trên lâm sàng. Màng ối có
một số tác dụng trong điều trị vết thương mất da:[7]
- Có tác dụng kích thích mô hạt để chuẩn bị cho ghép da tự thân
- Kích thích biểu bì hóa đối với vết thương nông.
- Tăng sinh mạnh mẽ mao mạch mới cải thiện nền ghép để tiếp nhận tốt da ghép.
- Giữ cho vết thương ẩm.
- Hấp thu các dịch rỉ, giảm mất dịch, điện giải, protein, năng lượng do bốc hơi.
- Có hiệu quả kháng khuẩn tương đương mảnh ghép da tự thân
1.3. Chọn lựa các loại băng thích hợp cho vết thương
Không có một loại băng đơn giản nào có thể thích hợp cho tất cả các loại vết thương
cũng như tất cả các giai đoạn trong tiến trình lành vết thương. Vì vậy có thể sử dụng
một số loại băng khác nhau phối hợp để giúp cho quá trình lành vết thương ở những
giai đoạn khác nhau trong tiến trình lành vết thương mất da.
Việc lựa chọn các loại băng do các bác sĩ điều trị quyết định dựa vào tính chất của vết
thương và tính chất của loại băng. Giá cả của các loại băng cũng có thể ảnh hưởng
đến việc lựa chọn này. Bảng 1.2. cho một số ví dụ về việc lựa chọn băng trong điều
trị vết thương mất da. [19],[73]

10

Bảng 1.2. Các loại băng thích hợp cho một số dạng vết thương
Loại vết thương
Loại băng

Vết thương s
ạch, tiết
d
ịch nhiều hoặc trung

bình
•
Băng gạc paraffin
•
Băng dạng sợi tổng hợp

Vết thương s
ạch, khô,
tiết dịch ít
•
Băng plastic dạng film có lỗ
• Băng d
ạng film có khả năng thấm
hút và thông thoáng

Vết thương s
ạch, có
tiết dịch và tạo mô hạt
•
Hydrocolloid
•
Băng dạng bọt xốp
•
Alginat

Vết thương b
ị che phủ
bởi lớp nhày, có nhi
ễm
trùng

•
Hydrocolloid
•
Hydrogel
•
Băng tẩm chất kháng khuẩn

Vết th
ương khô và
đóng vảy
•
Hydrocolloids
•
Hydrogels

1.4. Sử dụng cellulose vi khuẩn chế tạo màng trị tổn thương mất da
Một số loài vi khuẩn thuộc các chi khác nhau có khả năng tổng hợp cellulose (gọi là
bacterial cellulose) như Acetobacter, Achromobacter, Aerobacter, Rhizobium. Trong
các loài trên, Acetobacter xylinum là vi khuẩn tạo cellulose hữu hiệu nhất.
1.4.1. Đặc tính của cellulose vi khuẩn
1.4.1.1. Cấu trúc

11

Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của cellulose vi
khuẩn. Các kỹ thuật phân tích phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp
xác định dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn. [45]
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn, đường kính sợi bằng 1/100 đường kính của
sợi cellulose thực vật. So sánh đường kính của sợi cellulose vi khuẩn với đường kính
của các sợi nhân tạo cho thấy kích thước của sợi cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn cả

kích thước của sợi tổng hợp hóa học nhỏ nhất.


Hình 1.1. Cellulose vi khuẩn Hình 1.2. Cellulose thực vật

(x 20 000 lần) (x 200 lần)
Nguồn: Brown R.M. (1999), Pure Appl. Chem. 71 (5) [14]
Bảng 1.3. Đường kính của các loại sợi
Loại sợi Kích thước
Tóc
100 µm
Bông vải
10 µm
Gỗ thông
10 µm
Sợi tổng hợp
10 µm
Sợi tổng hợp kỹ thuật cao
1 µm
Sợi collagel
0,1 µm
Cellulose vi khuẩn
0,01µm

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucosepyranose nối
với nhau bởi nối β -1,4 glucan. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy BC có cấu trúc
giống cellulose thực vật. Tuy nhiên cấu trúc cao phân tử và các đặc tính của BC khác
với cellulose thực vật. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành các
sợi sơ cấp (subfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng hình thành
các dải (ribbon). Các dải có chiều dày 3- 4 nm, chiều rộng, 4,1-117 nm [14],[37],[79].

12

Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30 000 – 75 000
nm hay gỗ bạch dương (betula) là 14 000 – 40 000 nm. Những dải vi sợi cellulose mịn
có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được liên kết
bởi những liên kết hydro. BC khác với cellulose thực vật bởi chỉ số kết chặt, về mức
độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000 đến 6000.[37] Một vài
trường hợp đạt tới 16 000 – 20 000 [40] trong khi mức polymer hóa ở thực vật là
13000 – 14 000.
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy.[33],[43],[81] Ở điều
kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp lớp cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy và
được gọi là S-BC (static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những
lỗ xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống
sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên
các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế
bào A.xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ
nhánh ít hơn các sợi BC được tạo ra từ môi trường nuôi cấy động hình thành A - BC
(Agitated – BC). A- BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hình sao và các sợi
dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới với nhau trong môi
trường giống như mô hình kẻ ô, có cả 2 hướng song song và vuông góc. [27],[67],[68]





Hình 1.3. Cellulose trong nuôi Hình 1.4. Cellulose trong nuôi
cấy động cấy tĩnh
Nguồn: Takayasu T., Fumihiro Y.(1997), Pure & Applied Chemistry, 69(11), [68]
Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC được quan

sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét. Những sợi S-BC kéo dài và chồng lên
các sợi khác theo chiều đan chéo nhau, những sợi A-BC thì rối rắm và cong. Ngoài ra

13

bề mặt cắt ngang của sợi A-BC khoảng 0,1 – 0,2 µm lớn hơn sợi S-BC (0,05 – 0,1
µm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết
tinh của chúng khác nhau.
1.4.1.2. Tính chất cellulose vi khuẩn
BC có độ bền cơ học, hóa học cao và có khả năng cản vi khuẩn.[63],[77] Với tính
chất này màng BC đã được chế tạo làm màng lọc cản khuẩn. Khả năng hút nước của
BC lớn hơn rất nhiều so với cellulose thực vật (so sánh với sợi bông, cao hơn gần 200
lần). Khả năng này còn tùy thuộc vào trạng thái của cellulose. Cellulose ở trạng thái
ẩm ướt có khả năng hút nước cao hơn ở trạng thái khô (khoảng 10 lần). Nhưng nếu
làm khô BC bằng phương pháp đông khô thì khả năng giữ ẩm sẽ tốt hơn BC làm khô
tự nhiên.[57]










Biểu đồ 1.1. So sánh khả năng thấm hút của các dạng BC và sợi vải
Nguồn:
Diete K. et al. (2001).Prog. Polym. Sci. 26
2626

26,
[29]

Biểu đồ 1.1. So sánh khả năng thấm hút của các dạng BC và sợi vải
Nguồn:
Diete K. et al. (2001).Prog. Polym. Sci. 26
2626
26,
[22]
Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lignin,
có thể bị phân hủy bởi một số enzym [46]: CBH I

và EG II

là hỗn hợp 2 enzym
cellulase

được tinh chế từ Tricoderma viride với tên thương mại là Meicelase (Meiji
Seika, Tokyo, Japan) có khả năng thủy phân BC. Có thể kiểm soát được kích thước,
BC dạng ướt
BC
đông khô

BC dạng khô tự nhiên
S
ợi vải


14

cấu trúc (dạng A - BC hay S - BC) và chất lượng của cellulose (kiểm sốt cellulose
kết tinh) trong q trình ni cấy tạo cellulose.
1.4.2. Ni cấy A. xylinum thu nhận BC
1.4.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện ni cấy A. xylinum

Nguồn carbon:
A. xylinum
sử dụng carbon từ nhiều nguồn đường khác nhau, tùy
thuộc vào chủng mà nguồn đường có thể thay đổi. Những loại đường hay được sử
dụng nhất là: glucose, fructose, mannitol, sorbitol… Nguồn carbon cho hiệu suất
thấp hơn là glycerol, galactose, saccharose, …[51],[60]
Nguồn nitơ: mơi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là mơi
trường do Hestrin và Schramm thiết lập có chứa cao nấm men và trypton. Đã có nhiều
nghiên cứu thay đổi nguồn trypton như nước ngâm ngơ (corn steep liquor)[52], nguồn
nitơ này được cho là có hiệu quả nhất, cho tốc độ tăng trưởng và năng suất sinh tổng
hợp cellulose cao so với các nguồn nitơ khác.
Bảng 1.4
. Ảnh hưởng của nguồn carbon trên hiệu suất tạo BC
Nguồn carbon Hiệu suất tạo BC
(%)
Nguồn carbon Hiệu suất tạo
BC (%)
Monosaccharid Alcohols
D-Glucose 100 Ethanol 4
D- Fructose 92 Ethylen glycol 1
D- Galactose 15 Diethylene glycol 1
D- Mannose 3 Propylen glycol 8
D- Xylose 11 Glycerol 93
L- Arabinose 14 Myo- inositol 17
L- Sorbose 11 D- Arabiol 620

Disaccharid
D- Mannitol 380
Lactose 16
Acid hữu cơ

Maltose 7 Citrat 20
Saccharose 33 L- Malat 15
Cellobiose 7-11 Succinat 12
Polysaccharid

Loại khác

Tinh bột 18 Glucono - lacton 62



Hiệu suất tổng hợp với nguồn Glucose được coi là 100%

Các chất kích thích tăng trưởng

15

Các vitamin pyrodoxin, biotin, acid nicotinic, p- aminobenzoic acid (pABA), được
xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi
pentothenat và riboflavin cho kết quả ngược lại.
1.4.2.2. Các yếu tố lý hóa ảnh hưởng đến quá trình tạo BC
pH: vi khuẩn A. xylinum phát triển tốt trong điều kiện môi trường pH thấp. Người ta
thường bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy và thấy rằng có sự gia tăng hiệu
suất tổng hợp cellulose. Hầu hết pH bằng 5 hoặc 6 là dùng trong nghiên cứu nhưng để
sản xuất công nghiệp thì pH trong khoảng 4 - 4,5 lại cho kết quả tốt hơn vì giảm được

sự tạp nhiễm.
Nhiệt độ: nhiệt độ tốt nhất cho sản xuất BC là 25
o
C - 30
o
C. Ở nhiệt độ thấp quá trình
tăng trưởng xảy ra chậm, ở nhiệt độ cao quá trình tăng trưởng bị ức chế, quá trình sinh
sản bị đình trệ và hiệu suất tạo cellulose giảm nhiều. Ở 24
o
C sản lượng cellulose cao
hơn 50 % trong suốt 72 giờ nuôi cấy nhưng nhiệt độ đó không thích hợp cho sản xuất
quy mô công nghiệp.
Tác động của oxy: A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí, vì vậy cần điều kiện thông khí
trong quá trình nuôi cấy. Trong thực tế tốc độ thông khí quyết định năng suất tổng
hợp cellulose. Trong nuôi cấy động, sử dụng cánh khuấy để cung cấp oxy là phù hợp
và cho sản lượng cellulose cao. Trong nuôi cấy tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt
rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng.[42],[76]
Điều kiện nuôi cấy: khi nuôi cấy động, BC ở dưới dạng huyền phù phân tán và chúng
có hình những hạt tròn như viên bi hay hình elip, có khi là những hạt bông hình sao.
Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh Acetobacter xylinum tạo ra cellulose tích lũy
thành màng dày trên bề mặt môi trường. Màng BC thu được dẻo dai, có màu trắng
trong hơi ngả màu vàng, chứa rất nhiều môi trường.
Theo các nhà nghiên cứu, các phương pháp nuôi cấy động sẽ cho năng suất BC cao
hơn vì cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động, đồng thời BC tạo thành còn có
khả năng thấm hút nước tốt hơn BC từ phương pháp nuôi cấy tĩnh. Tuy nhiên trở ngại
ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến Cel
-
một cách ngẫu nhiên sau một thời

16

gian nuôi cấy động. Các chủng này sẽ không còn khả năng sản sinh BC nữa vì thế làm
hiệu suất BC giảm đáng kể sau đó.[27]
Danuta Ciechánska (2004)[21] đã thêm chitosan vào suốt quá trình sinh tổng hợp
màng BC, kết quả tạo thành một loại BC mới, trong đó glucosamin và N-
acetylglucosamin kết hợp chặt chẽ với những bó sợi cellulose. Loại màng mới này có
ưu điểm giữ ẩm tốt hơn, giải phóng mono và disaccharid dưới tác dụng của lysozym,
tác dụng kìm khuẩn với vi khuẩn gram (+) và gram (-). Đây sẽ là lựa chọn mới trong
điều trị bỏng và những vết thương sâu, khó lành.
Maren Grunert và William T Winter đã thành công trong việc tạo thành những tinh
thể cellulose siêu nhỏ từ BC (Baterial Cellulose Nanocrystal) [50]. Những tinh thể
này đặc biệt bền. Ngoài ưu điểm chịu được lực rất lớn nhưng lại dễ dàng bị vi khuẩn
phân hủy, những tinh thể này còn có ưu điểm là rẻ tiền.
1.4.2.3. Các nguồn nguyên liệu thường dùng để nuôi A. xylinum thu nhận BC
Các nguồn nguyên liệu truyền thống thường được sử dụng trong sản xuất BC từ A.
xylinum như: nước dừa già, rỉ đường, nước mía, nước ép trái cây…[5] Tùy theo nguồn
nguyên liệu mà sản lượng BC tạo thành sẽ cao hay thấp. Theo một số nghiên cứu cho
thấy Acetobacter xylinum nuôi cấy trên môi trường nước dừa già cho BC cao hơn trên
môi trường nước cốt dừa hay rỉ đường. Nhưng môi trường nước ngâm ngô cho lượng
BC cao nhất (Takayasu Tsuchida và Fumihiro Yoshinaga-1997).[68]
Nước dừa già: nước dừa già là môi trường thường được sử dụng nuôi cấy A. xylinum
thu BC ở những nước nhiệt đới có trồng nhiều dừa. Nước dừa già là nguồn nguyên
liệu được thu nhận ở các nhà máy sản xuất dầu dừa. Nước dừa già chứa nhiều chất
dinh dưỡng và các yếu tố tăng trưởng như hexitol, cytokinin, myoinositol, sorbitol…
Bảng 1.5. Thành phần nước dừa già [40]
Thành phần % Thành phần %
Nước (%) 94,99 Đồng (mg/100 g) 0,04
Protein(%) 0,72 Mangan (ng/100 g) 0,142
Lipid tổng số (%) 0,2
Selenium (µg/100 g)

1,0
Tro (%) 0,39 Vitamin C (mg/100 g) 2,4

17

Đường tổng (%) 2,61 Thiamin (mg/100 g) 0,03
Calcium(mg/100g) 24,0 Riboflavin ( mg/100 g) 0,057
Sắt (mg) 0,29 Niacin (mg/100 g) 0,08
Mangesium(mg/100g) 25,0 Panthotenic acid (mg/100 g) 0,043
Phosphor (mg/100g) 20,0 Vitamin B
6
(mg/100 g) 0,032
Kali (mg/100g) 250,0
Folate (µg/100 g)
3,00
Natrium (mg/100g) 105,0 Acid béo no (g/100 g) 0,176
Kẽm (mg/100g) 0,10 Acid béo không no (g/100 g) 0,01

Nước mía: nước mía là một môi trường tốt để lên men vi sinh vật. Nước mía cũng có
thể được sử dụng làm nguyên liệu tốt để sản xuất BC nhưng cần tính đến hiệu quả
kinh tế.
1.4.2.4. Sử dụng BC chế tạo màng sinh học điều trị vết thương mất da: màng BC
thu được sau khi nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu sử dụng làm da nhân tạo nhờ có một
số tính chất đặc biệt như khả năng hút dịch, khả năng cản khuẩn, được sử dụng trong
những trường hợp bị bỏng nặng.[26],[35],[61],[64],[77] Hơn nữa, người ta thấy
dường như BC còn có khả năng làm cho các tế bào da phát triển. Với những ưu điểm
này, màng BC được sản xuất và bán ra thị trường và được sử dụng trong điều trị các
loại vết thương mất da (chế phẩm BioFill
®
, Gengiflex

®
, Bioprocess
®
). [55]


Nguồn: Oscar M. Alvarez, Mayank P.,(2004), Wounds, Health Management Publication,
(7). [56]


Hình 1.5. Sử dụng màng BC điều trị vết thương
A) Màng BC trước khi sử dụng; B) Sử dụng màng BC trong tuần 1;
C) Hình thành biểu bì hóa ở vết thương đắp màng BC

A
B C

18

Người ta đã nghiên cứu tẩm nano bạc vào màng BC nhằm tạo cho màng có hoạt tính
kháng khuẩn. Trong nghiên cứu này NaBH
4
được thêm vào để làm giảm sự hấp thu
ion Ag
+
vào màng, chỉ cho dạng nano Ag
o
thấm vào màng.[69] Màng BC có tẩm nano
bạc có hoạt tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli và Staphylococcus aureus.
1.5. Một số dược liệu được sử dụng phối hợp trong điều trị vết thương

1.5.1. Dầu mù u
Dầu mù u có tên khác: Huile de Fahara, Huile de Kanami, Huile de Tamanu.
Dầu mù u được ép từ hạt của cây mù u Calophyllum inophylum L., Clusiaceae. Dầu
mù u thô có màu xanh đen, còn lẫn nhiều tạp chất, nhựa. Sau khi tinh chế, dầu có màu
vàng, vị đắng, mùi đặc trưng của dầu mù u. Dầu mù u thô có chứa khoảng 72 % dầu
béo và 28 % nhựa, có loại chứa tới 90,3 % dầu béo và 9,7 % nhựa.[23]
Các nhóm lipid có trong dầu mù u [66]: triacylglycerol (TAG) là nhóm lipid có hàm
lượng cao trong tất cả các mẫu dầu thô của nhân hạt C. inophyllum (76,7 %). Sau đó
là diacylglycerol (DAG) (5,1 %) và acid béo tự do (FFA) (7,0 %). Sự có mặt của
monoacylglycerol (MAG) và FFA trong dầu có thể do sự thủy phân từng phần TAG
trong quá trình bảo quản hạt.
Bảng 1.6. Phân loại lipid trong dầu mù u
Glycerid % Viết tắt %
Acid béo tự do FFA 5,10
Monoacylglycerol MAG <0,1
Diacylglycerol DAG 7,00
Triacylglycerol TAG 76,70
Không xác định 11,2
Acid béo có trong dầu mù u: thành phần acid béo có trong hạt mù u được trình bày
trong Bảng 1.6. Trong một tài liệu khác, thành phần % trung bình acid béo từ dầu mù
u cũng được nghiên cứu, kết quả tuy khác nhưng tỷ lệ giữa các acid này hầu như
không đổi.

19

Bảng 1.7. Hàm lượng acid béo có trong dầu mù u
Tên acid béo % Tên acid béo %
Acid myristic < 0,1 Acid arachidic 1,1 ± 0,4
Acid palmitic 11 ± 0,8 Acid gondoic 0,4 ± 0,1
Acid palmitoleic 0,10 Acid behenic 0,4 ± 0,1

Acid stearic 13,4 ± 0,8 Acid erucic 0,10
Acid oleic 50 ± 1,7 Acid lignoceric 0,20
Acid linoleic 21,7 ± 1 Acid nervonic 0,20
Acid linolenic 0,5 ± 0,2
Acid eicosenoic

0,72

Tác dụng sinh học của dầu mù u
 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm: dầu và nhựa mù u có khả năng kháng
khuẩn tương đương nhau đối với 2 chủng Staphylococcus aureus và Bacillius subtilis.
Calophylloid có khả năng ức chế toàn bộ sự tăng trưởng của vi trùng lao
Mycobacterium tuberculosis H37 – RV.
 Độc tính tế bào: không độc đối với gen, không gây ung thư, không độc theo
đường uống, không kích ứng da, không hoặc kích ứng yếu đối với mắt .
 Tác dụng mau lành vết thương in vivo: những nghiên cứu thực nghiệm về sự
lành sẹo của dầu mù u đã được Jeason thực hiện trên thú chịu một sự kích thích ở da
và đi đến kết luận rằng, dầu mù u được đắp nhiều giờ trên vết bỏng cho phép tránh
được sự hoại tử ở những vết thương nặng. Khoa Chỉnh hình Bệnh viện Chợ Rẫy và
Viện Y Dược học dân tộc khảo sát tác dụng mau lành sẹo của dầu Mù u cho thấy vết
thương mất da, lộ xương sẽ nhanh chóng được che phủ khi bôi dầu.[2]
 Một số công dụng khác của dầu mù u: tác dụng chống huyết khối, tác dụng
kháng viêm và mau lành vết thương, tác dụng chống loạn nhịp tim, tác dụng ức chế
trên HIV, tác dụng chống gốc tự do, chống oxy hóa, tác dụng đối với tia UV, điều trị
viêm dây thần kinh.
1.5.2. Hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u

20

Hoạt chất có tác dụng kích thích sự tái sinh mô giúp cho vết thương mau lành được

chiết từ dầu mù u là các acid béo. Phân tích thành phần hóa học các acid béo này cho
thấy có chứa hàm lượng lớn acid béo không no đặc biệt là một số các acid béo đặc
biệt mà các loại dầu thực vật khác không có như acid Eicosenoic.(Bảng 1.8) Cơ chế
làm lành vết thương của acid béo này là làm gia tăng sự phát triển các nguyên bào sợi
nên làm tăng sinh mô hạt và tác động lên sự tái tạo lớp thượng bì. Kết quả các thử
nghiệm khả năng làm mau lành vết thương, với hàm lượng 50 % hoạt chất tái sinh mô
trong chế phẩm cũng đủ có tác dụng mau lành vết thương tốt.
Bảng 1.8. Thành phần của hoạt chất tái sinh mô
Acid béo Thành phần %
Palmitic
Palmitoleic
Margaric
Stearic
Oleic
Linoleic
Linolenic
Arachidic
Eicosenoic
Behenic
13,830
0,200
0,103
14.750
39.980
29.350
0.209
0.800
0,2510
0.295

1.5.3. Tinh dầu tràm trà Úc
Tinh dầu tràm trà Úc (viết tắt là T.T.O.) là tinh chất dầu được cất kéo theo hơi nước từ
Melaleuca alternifolia, một loại cây tràm ở Úc. T.T.O. tinh khiết không màu hoặc
màu vàng nhạt, có mùi thơm dễ chịu đặc trưng. T.T.O. là một hỗn hợp phức tạp của
gần 100 thành phần gồm monoterpen, sesquiterpen hydrocarbon và alcol của nó.
Thành phần chính là terpinen – 4 – ol, chiếm hơn 30 %. T.T.O. đã được sử dụng ở Úc
hơn 80 năm để điều trị nhiễm khuẩn da cũng như các nhiễm khuẩn khác. Thời gian
gần đây nó đang trở nên nổi tiếng vì cho hiệu quả kháng khuẩn tốt hơn so với nhiều
kháng sinh thương mại đã có.[16],[71]

21

Nghiên cứu cho thấy thành phần tan trong nước của T.T.O., đặc biệt là terpinen – 4 –
ol và
−
α
terpineol có thể điều hòa chức năng tế bào một cách chọn lọc trong suốt quá
trình viêm, đặc biệt là hoạt động của bạch cầu đơn nhân, và sự đáp ứng cục bộ có thể
kiểm soát các phản ứng viêm đối với những tác nhân bên ngoài tác động lên da.
T.T.O. có khả năng hoạt hóa bạch cầu trung tính phát huy tối đa tác dụng trong phản
ứng viêm cấp tính và giới hạn những tác nhân lạ, đồng thời ức chế sự sản sinh những
chất trung gian gây viêm của bạch cầu đơn nhân và sự sản sinh superoxid, từ đó ngăn
cản sự tổn thương mô do oxy hóa, hiện tượng này có thể được thấy trong nhiều tình
trạng viêm mãn tính. [38]
Tính kháng khuẩn, kháng nấm của T.T.O. đã được chứng minh và có phổ kháng
khuẩn rất rộng (MRSA, Pseudomonas aeruginosa, Streptococci, ).[15],[18] T.T.O.
được dùng trị mụn trứng cá, viêm da, viêm khớp, vết côn trùng cắn, nhiễm trùng
đường hô hấp, đau nhức cơ, bị bỏng, T.T.O. có tính gây tê nhẹ và đặc biệt có tính
sát khuẩn làm giảm nguy cơ nhiễm trùng. Khi điều trị, có thể bôi trực tiếp T.T.O. lên
vết bỏng, hoặc có thể dùng dưới dạng kem sát khuẩn không dính (non – grease

antiseptic cream). [20],[44]
Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các thành phần của T.T.O. trên một số vi
khuẩn cho thấy chỉ có terpinen - 4 - ol ức chế được sự phát triển của Pseudomonas
aeruginosa. Trong khi đó Bacteroides fragilis, Candida albicans, và Clostridium
perfringens bị ức chế bởi tất cả các thành phần T.T.O. Terpinen – 4 – ol ức chế tất cả
12/12 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Linalool và
−
α
terpineol ức chế hầu hết vi khuẩn
thử nghiệm ngoại trừ P. aeruginosa. Thành phần ức chế kém nhất là
ρ
- cymeme, chỉ
ức chế được 4/12 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Thử nghiệm về khả năng sát khuẩn và
tính nhạy cảm của da cho thấy T.T.O. có khả năng sát khuẩn trên các vi khuẩn thử
nghiệm Strept. hemolyticus và P. aeruginosa sau 10 phút.[34],[36] Ở nồng độ sử dụng
10 %, T.T.O. không gây kích ứng da. T.T.O. đã và đang được sử dụng như một liệu
pháp phụ trong điều trị viêm tủy xương và những vết thương nhiễm khuẩn mãn tính
trong những thử nghiệm lâm sàng nhỏ gần đây.

22

Nghiên cứu về tác dụng kháng Candida của terpinen – 4 – ol và 1,8 – cineol trong
T.T.O. cho kết quả MIC 90 của terpinen – 4 – ol là 0,06 % (v/v) và của 1,8 – cineol là
4 % (v/v). Nhóm nghiên cứu này kết luận rằng terpinen – 4 – ol được xem là thành
phần chính cho hoạt tính kháng nấm in vitro và in vivo của T.T.O. Từ đó cho thấy hợp
chất tinh khiết này hứa hẹn vai trò to lớn trong điều trị nhiễm Candida âm đạo.
[48],[58],[59]

23

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu
Xây dựng tiêu chuẩn của nguồn nguyên liệu chủ yếu sử dụng để chế tạo màng gồm:
(1) Tiêu chuẩn nước dừa (2) Tiêu chuẩn hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u. (3) Tiêu
chuẩn sinh học của tinh dầu tràm trà Úc.
2.1.1. Xây dựng tiêu chuẩn nước dừa
a. Đối tượng nghiên cứu: nước dừa lấy từ trái dừa khô. Dừa khô có vỏ màu nâu, cơm
dừa đã dày, cứng. Nước dừa lấy ra khỏi trái sau các khoảng thời gian: mới lấy, sau
1giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ.
b. Bố trí thí nghiệm
Qui mô: thử nghiệm trên 5 mẫu nước dừa ở 5 thời điểm như trên, thử nghiệm lặp lại
5 lần.
Thời gian thực hiện: tháng 1/ 2008.

Địa điểm: BM Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. HCM
c. Phương pháp nghiên cứu
Nguyên tắc: nước dừa có nguồn chất dinh dưỡng phong phú, là môi trường thuận lợi
cho nhiều loại vi khuẩn phát triển. Nước dừa khi còn ở trong trái, được lớp vỏ dày bảo
vệ nên gần như vô khuẩn. Tuy nhiên khi đập ra khỏi trái và tiếp xúc với môi trường
bên ngoài nước dừa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Các tạp khuẩn khi nhiễm vào nước dừa sẽ
nhanh chóng sử dụng các nguồn dinh dưỡng, trong đó đặc biệt quan trọng là các yếu
tố vi lượng cần thiết cho sự phát triển của Acetobacter xylinum. Chính vì vậy chúng
tôi xây dựng tiêu chuẩn nước dừa khô dựa trên tiêu chuẩn về độ nhiễm khuẩn cho
phép, mà ở độ nhiễm khuẩn này không ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi
khuẩn Acetobacter xylinum.
Phương pháp: khảo sát độ nhiễm khuẩn của nước dừa bằng cách đếm sống tổng số vi
khuẩn hiếu khí trong 1ml bằng phương pháp pha loãng và trải bản thạch.
Tiến hành
Pha loãng nước dừa thành các nồng độ 1/ 10, 1/ 100, 1/ 1000, … Lấy 0,2 ml ở mỗi
nồng độ cho vào một hộp petri. Thạch đếm được đun chảy và để nguội đến 45
o
C rồi

24

đổ vào hộp, lắc xoay tròn hộp để trộn vi khuẩn với thạch cho đều (khoảng 30 vòng),
để cho đông đặc. Ấp hộp thạch ở 37
o
C trong 72 giờ. Ở độ pha loãng thích hợp mỗi vi
khuẩn sẽ phát triển thành 1 khóm vi khuẩn. Chọn hộp có từ 30 - 300 khóm để đếm
tổng số khóm.
Kết quả: tính kết quả theo công thức:
tổng số vi khuẩn/ ml nước dừa = tổng số khóm x độ pha loãng x 5
d. Chỉ tiêu theo dõi

- Tổng số vi khuẩn sống / 1ml nước dừa
e. Sản phẩm nội dung cần đạt: giới hạn tổng số vi khuẩn / ml nước dừa để sử dụng
làm nguồn nguyên liệu tạo màng BC
2.1.2. Xây dựng tiêu chuẩn hoạt chất tái sinh mô
a. Đối tượng nghiên cứu
- Hoạt chất tái sinh mô chiết từ dầu mù u.
b. Bố trí thí nghiệm
Qui mô
- Thử nghiệm trên 5 mẫu hoạt chất tái sinh mô được chiết từ dầu mù u để xác định các
chỉ tiêu lý hóa và tác dụng sinh học.
Thời gian: tháng 2-9/2008
Địa điểm: BM Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. HCM, Trung tâm dịch
vụ phân tích thí nghiệm, Sở Khoa học và Công nghệ TP. HCM , Bộ môn Dược lý
Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. HCM
c. Phương pháp nghiên cứu
c
1.
Các thử nghiệm hóa lý
Xác định các chỉ tiêu lý hóa: đo tỷ trọng, xác định các chỉ số: chỉ số iod, chỉ số acid,
chỉ số xà phòng, chỉ số ester, chỉ số peroxyd, chất không xà phòng hóa. (Phụ lục)

Xác định thành phần acid béo: dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC, do
Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở Khoa học và Công nghệ TP. HCM thực
hiện.
c
2.
Các th
thth
thử nghiệm sinh học

25

Ph
PhPh
Ph
ương pháp t
h
hh
h
ử nghiệm độc tính bán cấp của hoạt chất tái sinh mô
Đánh giá độc tính bán cấp của hoạt chất tái sinh mô trên thú vật thử nghiệm sau khi
cho thú vật dùng thuốc liên tục trong thời gian hai tháng.
- Thú vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng chủng DDY, thuần chủng, khỏe mạnh, không
dị tật, giới tính ngẫu nhiên, trọng lượng 18 g – 22 g, do viện Pasteur cung cấp.
Chuột mua về để ổn định 2 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm. Đảm bảo điều kiện
nuôi trong suốt thời gian thử nghiệm với thức ăn là cám viên do viện Pasteur cung cấp
và giá sống.
Phương pháp:
• Số lượng chuột sử dụng: 160 con chia thành 2 lô, mỗi lô 80 con. Tỉ lệ đực cái ở
mỗi lô tương tự nhau.
• Liều dùng và đường dùng: ở lô thử nghiệm, tiêm dưới da 0,01ml hoạt chất tái sinh
mô/ 10g chuột/ ngày, thời gian sử dụng là 2 tháng. Lô chứng tiêm dưới da 0,01 ml
NaCl 0,9 % / 10 g chuột.
• Thời gian theo dõi: 2 tháng.
Đánh giá kết quả:
• Theo dõi thể trọng và tổng trạng chung: quan sát hình thái bên ngoài chuột trong
thời gian thử nghiệm như sự linh hoạt, ăn uống, phân…Theo dõi trọng lượng chuột
mỗi 5 ngày.
• Xét nghiệm máu: thực hiện các xét nghiệm vào thời điểm giữa và cuối đợt thử
nghiệm bao gồm:

- Xét nghiệm huyết học: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu.
-
Xét nghiệm sinh hóa: bao gồm các chỉ số đánh giá chức năng gan (Transaminase:
SGOT, SGPT; bilirubin trực tiếp và gián tiếp) và các chỉ số đánh giá chức năng thận
(BUN, creatinin)
Các xét nghiệm được thực hiện ở Khoa xét nghiệm Sinh hóa và Huyết học, Bệnh viện
Chợ Rẫy TP Hồ Chí Minh
• Về tổ chức học: mổ chuột quan sát đại thể giữa và cuối đợt thử nghiệm và khi
chuột chết có nghi vấn trong quá trình thử nghiệm. Mổ chuột lấy gan, thận, quan sát